Name: Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę przygotowania jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy oraz barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów rozwoju i selekcji limfocytów T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Izumi Ohigashi za przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program ZIA BC 011806 National Institutes of Health, National Cancer Institute i Center for Cancer Research.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Raka (ASP21-431, ASP21-432 i EIB-076-3).
1. Przygotowanie zawiesiny komórek grasicy
UWAGA: Ontogeneza myszy wpływa na efektywność enzymatycznego uwalniania TEC z grasicy. Trzy metody w zależności od wieku myszy są opisane poniżej.
<ol>
	<li>Dla myszy po urodzeniu w wieku powyżej 3 tygodni
	<ol>
		<li>Zbierz grasicę (dwa płaty grasicy) z jednej myszy. Umieść grasicę w 5 ml RPMI1640 zawierającej 10 mM HEPES w plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm na lodzie.</li>
		<li>Usuń krew, tkanki inne niż grasica i tłuszcz za pomocą zakrzywionej pęsety z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym. Pokrój grasicę na małe kawałki (o wielkości około 1-2 mm) nożyczkami do preparowania.</li>
		<li>Przenieś kawałki grasicy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml 1 mg/ml kolagenazy/dypazy i 1 U/ml roztworu DNazy w RPMI1640 zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml. Inkubować przez kolejne 20 minut, na wypadek, gdyby fragmenty tkanek były nadal widoczne.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml. Inkubować przez kolejne 10 minut, jeśli fragmenty tkanek są nadal widoczne.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml. Dodaj 5 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę 60 μm i do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu FACS (1x HBSS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] i 0,1% NaN3).</li>
		<li>Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla nowonarodzonych myszy w wieku od 1 do 2 tygodni
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 1.1.1.</li>
		<li>Usuń krew i tkanki inne niż grasica za pomocą pęsety preparacyjnej pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieś grasicę do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl RPMI1640 z 10 mM HEPES i pokrój grasicę na małe kawałki (o wielkości około 1-2 mm) nożyczkami do preparowania.</li>
		<li>Pozwól, aby fragmenty grasicy osiadły na dnie probówki, a następnie delikatnie usuń zawiesinę za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Przenieś kawałki grasicy do 5 ml polipropylenowej probówki okrągłodennej zawierającej 2 ml 0,5 mg/ml kolagenazy/dypazy i 1 U/ml roztworu DNazy w RPMI1640 zawierającej 2% FBS. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml, a następnie za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml wyposażonej w plastikową końcówkę w celu dalszej homogenizacji.</li>
		<li>Dodaj 2 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez siatkę nylonową o grubości 60 μm i do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml RPMI1640 zawierającego 10 mM HEPES.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu FACS.</li>
		<li>Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla myszy embrionalnych i nowonarodzonych myszy w wieku do 1 tygodnia życia
	<ol>
		<li>Zbierz grasicę (dwa płaty grasicy) z jednej myszy. Umieść grasicę w plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm i usuń krew, tkanki inne niż grasica i tłuszcz za pomocą zakrzywionej pęsety z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Umieść grasicę w 0,2 ml RPMI1640 zawierającej 10 ml HEPES w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wylać płyn za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml 0,5 mg/ml kolagenazy/dypazy i 1 j./ml roztworu DNazy do RPMI1640 zawierającej 2% FBS. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z plastikową końcówką.</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 60 μm i do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Dodać 9 ml RPMI1640 zawierającego 10 mM HEPES.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 1-3 ml buforu FACS.</li>
		<li>Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywna metoda: trawienie liberazą
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 1.1.1 i 1.1.2.</li>
		<li>Pozwolić, aby fragmenty grasicy osiadły na dnie probówki, a następnie delikatnie usunąć zawiesinę za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl. Przenieś kawałki grasicy do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 1 ml 0,5 U/ml liberazy i 1 U/ml DNazy w RPMI1640 zawierającej 10 mM HEPES. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z plastikową końcówką. Inkubować przez kolejne 15 minut, na wypadek, gdyby fragmenty tkanek były nadal widoczne.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z plastikową końcówką. Dodaj 1 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę 60 μm i do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 18 ml RPMI1640 zawierającej 10 mM HEPES.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 350 × g, 4 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu FACS (1x HBSS zawierający 1% BSA i 0,1% NaN3).</li>
		<li>Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie komórek grasicy przeciwciałami
<ol>
	<li>Umieść 16 × 106 komórek w probówce okrągłodennej o pojemności 5 ml z polistyrenu. Odwirować komórki w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 10 μl stężenia roboczego przeciwciała monoklonalnego receptora anty-Fc (mAb, klon 2,4G2) do buforu FACS, aby zablokować niespecyficzne wiązanie barwiącej IgG z receptorem Fc na powierzchni komórki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj po 40 μl każdego ze stężeń roboczych mAb anty-CD45 (specyficznych dla komórek krwiotwórczych; np. znakowanych BV421), anty-EpCAM mAb (specyficznych dla komórek nabłonkowych; np. znakowanych PE-Cy7), anty-Ly51 mAb (wykrywających cTEC; np. znakowanych AF647) i aglutyniny Ulex europaeus I (UEA-1) (wykrywającej mTEC; np. znakowanej AF594) w buforze FACS. Równolegle przygotuj probówki na jednokolorowe barwione komórki i niebarwione komórki do ustawienia cytometru przepływowego.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Dobrze mieszać co 10 minut. Dodać 2 ml buforu FACS.</li>
	<li>Odwirować komórki o stężeniu 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Dodać 1 μl Ghost Dye Violet 510 (w celu odróżnienia komórek żywotnych od martwych w analizie cytometrycznej przepływowej komórek utrwalonych i przepuszczalnych). Użyj nierozcieńczonego odczynnika Ghost Dye; Dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut; Dobrze mieszaj co 10 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu FACS. Odwirować komórki 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Utrwal komórki, dodając 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) do PBS i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 3,5 ml PBS do probówki i odwirować komórki o stężeniu 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 1 ml wewnątrzkomórkowego buforu do utrwalania/permeabilizacji i inkubację w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować komórki w temperaturze 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać po 100 μl każdego z roboczych stężeń przeciwciała anty-beta5t lub przeciwciała anty-CCL21 lub 40 μl roboczych stężeń przeciwciała anty-Aire (np. AF488) w 1x bufor permeabilizacyjny, dobrze wymieszać i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować komórki w temperaturze 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 2.14.</li>
	<li>Dodać 100 μl stężeń roboczych anty-króliczej IgG (np. znakowanej AF555) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować komórki w temperaturze 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez siatkę nylonową 60 μm przed analizą cytometryczną przepływową.</li>
</ol>

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

<ol><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+diversity+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of diversity in thymic epithelial cells.</a> Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).</li>
<li>Hozumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+indispensable+in+thymic+environment+specific+for+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development.</a> J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).</li>
<li>Koch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+the+essential%2C+nonredundant+ligand+for+Notch1+during+thymic+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment.</a> J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).</li>
<li>Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+thymic+cortical+epithelial+cells+expressing+the+thymoproteasome+subunit+%CE%B25t%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t.</a> Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).</li>
<li>Gommeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+regulates+positive+selection+of+a+subset+of+CD4%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).</li>
<li>Viret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+contributes+to+the+diversification+of+the+functional+endogenous+CD4+T+cell+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire.</a> J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire.</a> Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+orchestrates+a+thymic+program+of+self-antigen+expression+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance.</a> Cell. 163 (4), 975-987 (2015).</li>
<li>Takaba, H., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+T+cell+selection+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of T cell selection in the thymus.</a> Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).</li>
<li>Lammers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehf+and+Fezf2+regulate+late+medullary+thymic+epithelial+cell+and+thymic+tuft+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development.</a> Front Immunol. 14, 1277365(2024).</li>
<li>Ushio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+diverse+thymic+medullary+epithelial+cells+interplay+to+direct+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance.</a> Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).</li>
<li>Kozai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+CCL21+in+establishment+of+central+self-tolerance+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells.</a> J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).</li>
<li>Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+%CE%B2+receptor+regulates+the+development+of+CCL21-expressing+subset+of+postnatal+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells.</a> J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).</li>
<li>Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularity+of+thymic+epithelial+cells+in+the+postnatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse.</a> J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).</li>
<li>Hirakawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+parameters+of+the+developing+thymic+epithelium+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse.</a> Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).</li>
<li>Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+epithelial+cell+morphology+control+thymic+organ+size+during+atrophy+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration.</a> Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+%CE%B1+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).</li>
<li>Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+thymic+cortical+epithelial+cells+developmentally+regulate+the+expression+of+a+B-lineage+transformation-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen.</a> Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).</li>
<li>Farr, A. G., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+fucose-specific+lectins+bind+medullary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells.</a> J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).</li>
<li>Wells, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transient+ablation+and+single-cell+RNA-sequencing+reveals+the+development+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells.</a> eLife. 9, e60188(2020).</li>
<li>Hubert, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+anti-Aire+antibody+reveals+aire+expression+is+restricted+to+medullary+thymic+epithelial+cells+and+not+expressed+in+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery.</a> J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).</li>
<li>Nishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lineage+tracing+of+Aire-expressing+cells+reveals+a+requirement+for+Aire+in+their+maturation+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program.</a> J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).</li>
<li>Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR+alpha-expressing+mesenchyme+regulates+thymus+growth+and+the+availability+of+intrathymic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches.</a> Blood. 109 (3), 954-960 (2007).</li>
<li>Cosway, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+thymus+medulla+specialization+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Redefining thymus medulla specialization for central tolerance.</a> J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).</li>
<li>Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+thymic+epithelium+and+an+improved+method+for+its+propagation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro.</a> Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ohigashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+conversion+of+thymocyte-attracting+cells+into+self-antigen-displaying+cells+in+embryonic+thymus+medulla+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium.</a> eLife. 12, RP92552(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Kolagenaza, z lub bez Dispase, jest szeroko stosowana do trawienia grasicy myszy w celu przygotowania TEC 4,5,9,18,21. Liberaza, która zawiera mieszankę proteaz, w tym kolagenazę, jest również używana do trawienia grasicy w celu wytworzenia TEC17,22. Stosowanie kolagenazy i liberazy daje zasadniczo rów...

Grasica jest nabłonkowym organem mezenchymalnym, który wspomaga rozwój i selekcję repertuarową limfocytów T. W mikrośrodowiskach korowych i rdzeniastych w grasicy komórki nabłonka grasicy (TEC) odgrywają kluczową rolę w kierowaniu rozwojem i selekcją limfocytów T. Powszechnie przyjmuje się, że TEC korowe (cTEC) w korze grasicy, przede wszystkim przyczyniają się do indukcji wczesnego rozwoju limfocytów T i pozytywnej selekcji nowo wytworzonych tymocytów eksprymujących receptor antygenu komórek T (TCR). W przeciwieństwie do tego, rdzeniaste TEC (mTEC) w rdzeniu grasicy są niezbędne do przyciągania pozytywnie wybranych tymocytów z kory i ustanowienia centralnej samotolerancji poprzez eliminację samoreaktywnych limfocytów T i generowanie regulatorowych limfocytów T1,2. Te funkcje TEC we wspieraniu rozwoju i selekcji limfocytów T są pośredniczone przez różne cząsteczki wyrażane w cTEC i mTEC.
Należą do nich ligand 4 podobny do Delta (DLL4), ważny dla specyfikacji linii limfocytów T komórek macierzystych)3,4, beta5t (znany również jako Psmb11, ważny dla pozytywnej selekcji limfocytów T CD8)5,6, oraz Prss16 (znany również jako specyficzna dla grasicy proteaza serynowa lub TSSP, ważny dla pozytywnej selekcji limfocytów T CD4)7,8 wyrażony w cTEC, oraz regulator autoimmunologiczny (Aire, ważny dla rozwiązłej ekspresji własnych genów)9,10, Fez family zinc finger 2 (Fezf2, ważny dla rozwiązłej ekspresji genów niezależnych od Aire'a i generowania komórek kępek grasicy)11,12,13,14oraz ligand chemokinowy motywu C-C 21 (CCL21, ważny dla migracji rdzenia i akumulacji pozytywnie wybranych tymocytów)14,15,16 wyrażony w mTEC. Cytometria przepływowa umożliwia ilościowe wykrywanie tych funkcjonalnie istotnych cząsteczek w TEC, ułatwiając ocenę zarówno rozwoju, jak i funkcji cTEC i mTEC. Ponieważ wiele cząsteczek w TEC ulega ekspresji głównie w komórkach, takich jak cytoplazma (np. składnik proteasomu beta5t) i jądro (np. regulator transkrypcji Aire), korzystna jest ilościowa analiza cząsteczek wewnątrzkomórkowych w cTEC i mTEC przy użyciu cytometrii przepływowej.
TEC są rzadkie u grasicy. Samica myszy w wieku 5 tygodni ma około 1 × 106 cTEC i około 2,5 × 106 mTEC, podczas gdy kora grasicy zawiera około 3 × 108 tymocytów CD4 + CD8 +, a rdzeń grasicy zawiera około 5 × 107 tymocytów CD4+CD8 i CD4-CD8+ i CD4-CD8+<sup class="xref">17. Dlatego zdecydowana większość (>99%) komórek w grasicy to komórki krwiotwórcze, w tym tymocyty, a nie TEC, u młodych dorosłych myszy. Co więcej, TEC są ściśle związane z sąsiednimi komórkami (np. Tymocytami) i architektonicznymi składnikami zewnątrzkomórkowymi (np. kolagenem) w grasicy, więc uwolnienie TEC do zawiesiny komórkowej wymaga trawienia proteazy grasicy. Konwencjonalne metody trawienia enzymatycznego dają tylko niewielką część TEC; około 1% (1 ×10 4) i 10% (2 × 105) odpowiednio dla cTEC i mTEC z 5-tygodniowej myszy grasicy17,18,19. Niska skuteczność uwalniania TEC z grasicy jest prawdopodobnie spowodowana podatnością TEC na enzymy proteolityczne i naprężenia mechaniczne oraz ścisłym powiązaniem TEC z sąsiednimi komórkami, szczególnie między cTEC a tymocytami CD4+CD8+20. W związku z tym wyniki analizy pojedynczych komórek mysich TEC, w tym analizy cytometrii przepływowej i analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, oparte na obecnych metodach przygotowania komórek za pośrednictwem trawienia enzymatycznego, są reprezentatywne tylko dla niewielkiej części TEC i dlatego są dalekie od kompleksowości. Niemniej jednak, pomimo takich ograniczeń w enzymatycznym pozyskiwaniu TEC, analiza cytometryczna przepływowa mysich TEC w zawiesinie pojedynczej komórki jest nadal przydatna do analizy ilościowej funkcjonalnie istotnych cząsteczek w cTEC i mTEC. W zawiesinie komórkowej TEC zdefiniowano jako komórki dodatnie dla cząsteczki powierzchni nabłonka EpCAM (CD326) i ujemne dla cząsteczki powierzchni hematopoetycznej CD45. W obrębie EpCAM+CD45-TEC poziomy ekspresji na powierzchni komórki cząsteczek Ly51 (znanych również jako BP-1 i CD249) oraz zdolność wiązania aglutyniny Ulex Europaeus I (UEA1) (głównie wiązanie z glikoproteinami i glikolipidami zawierającymi fukozę połączoną z α) zostały wykorzystane do fenotypowego oznaczania cTEC (Ly51wysokiUEA1niski) i mTEC (Ly51niskiUEA1wysoki). Tutaj opisujemy nasze protokoły eksperymentalne dotyczące konwencjonalnego przygotowania jednokomórkowej zawiesiny mysich TEC i barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej, koncentrując się na analizie ilościowej wewnątrzkomórkowych cząsteczek beta5t, CCL21 i Aire w świeżo przygotowanych mysich TEC.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza/Dypaza&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Fioletowy 510&nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0870-T500</td><td></td></tr><tr><td>BV421 przeciwciało monoklonalne anty-mysie CD45, klon 30-F11</td><td>BD Horizon</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 przeciwciało monoklonalne anty-myszy Ly51, klon 6C3</td><td>BioLegend</td><td>108312</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 przeciwciało monoklonalne EpCAM/CD326, klon G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118216</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex europaeus aglutynina I (UEA1)</td><td>Wektor Laboratoria</td><td>DL-1067-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało monoklonalne przeciw myszom Aire, klon 5H12</td><td>eBioscience</td><td>53-5934-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne królika anty-mysie Psmb11 / beta5t, klon CPTC-PSMB11 (mysz) -1</td><td>NIH NCI</td><td>CPTC-PSMB11 (mysz) -1</td><td>https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal</td></tr><tr><td>Anty-mysie przeciwciało poliklonalne CCL21 / exodus 2</td><td>Bio-Rad</td><td>AAM27</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anty-królicze IgG kozie przeciwciało rekombinowane kozy łańcucha ciężkiego</td><td>Invitrogen</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD32 / CD16 &ndash; Oczyszczone (przeciwciało blokowe Fc)</td> <td>Leinco Technologies</td><td>C247</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa 60 mikronów</td><td>Dostawa komponentów</td><td>W31436</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Blok</td><td></td>ciepła</tr><tr><td>Celometr Auto 2000 Licznik żywotności komórek</td><td>Nexcelom</td><td>Żywotne liczenie</td><td></td>komórek</tr><tr><td>LSRFortessa Analizator komórek</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>Cytometr przepływowy</td><td>Pięć laserów (355, 408, 488, 595 i 637 nm)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACSDiva wersja 9.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>Analiza</td><td></td>cytometryczna przepływowa</tr><tr><td>FlowJo 10.9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>Analiza</td><td></td>danych cytometrii przepływowej</tr><tr><td></td><td>Szybkość rozcieńczenia przeciwciał (stężenie robocze)</td>Bufor <td></td><td>rozcieńczający</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD32/CD16 &ndash; Oczyszczone (przeciwciało blokowe Fc)</td><td>1:40</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anty-mysie przeciwciało monoklonalne CD45</td><td>1:25</td><td>FACS Bufor</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-mysie przeciwciało monoklonalne EpCAM/CD326</td><td>1:100</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anty-mysie przeciwciało monoklonalne Ly51</td><td>1:100</td><td>FACS Bufor</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Aglutynina I (UEA1)</td><td>1:400</td><td>Bufor FACS Anty-mysie</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało poliklonalne CCL21 / exodus 2 królik</td><td>1: 200</td><td>1x Bufor</td><td></td>permeabilizacyjny</tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw myszom Psmb11 / beta5t, klon CPTC-PSMB11 (mysz) -1</td><td>1: 1000</td><td>1x Bufor</td><td></td>permeabilizacyjny</tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anty-królicze przeciwciało rekombinowane kozy o ciężkim łańcuchu IgG</td><td>1:400</td><td>1x Bufor buforowy</td><td></td>permeabilizacji</tr><tr><td></td><td>Przeznaczenie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 zawierające 10 mM HEPES&nbsp;</td><td>Do RPMI1640 do przygotowania</td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>zawierających 2% FBS</td><td>Do przygotowania</td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>bufor FACS (1x HBSS zawierający 1% BSA&nbsp; i 0,1% azydek sodu)</td><td>Do przygotowania komórek i barwienia</td><td></td><td></td>przeciwciał</tr><tr><td>1 mg/ml Kolagenaza/Dispaza i 1U/ml roztworu DNazy w RPMI1640 zawierającego 2% FBS</td><td>Do trawienia</td><td></td><td></td>enzymatycznego</tr><tr><td>2% PFA w PBS</td><td>Do utrwalania</td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>Bufor do utrwalania/permeabilizacji (1 część koncentratu do utrwalania/przepuszczalności z 3 częściami rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności)</td><td>Do utrwalania komórek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor permeabilizacyjny (1 część koncentratu 10X z 9 częściami wody destylowanej)</td><td>Do barwienia przeciwciał międzykomórkowych&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Komórki nabłonkowe grasicy (TEC) odgrywają istotną rolę w promowaniu rozwoju i selekcji repertuarowej limfocytów T. Korowe TEC (cTEC) w korze grasiczej indukują wczesny rozwój limfocytów T i pozytywną selekcję tymocytów korowych. W przeciwieństwie do tego, rdzeniaste TEC (mTEC) w rdzeniu grasicy przyciągają dodatnio wybrane tymocyty z kory i ustanawiają samotolerancję w limfocytach T. Różnorodne cząsteczki, w tym DLL4 i beta5t wyrażane w cTEC, a także Aire i CCL21 wyrażane w mTEC, przyczyniają się do funkcji grasicy, wspierając rozwój i selekcję limfocytów T. Analiza cytometryczna przepływowa funkcjonalnie istotnych cząsteczek w cTEC i mTEC jest przydatna do lepszego zrozumienia biologii TEC, mimo że obecne metody przygotowania jednokomórkowych zawiesin TEC mogą odzyskać tylko niewielką część TEC (około 1% dla cTEC i około 10% dla mTEC) z grasicy młodych dorosłych myszy. Ponieważ wiele z tych funkcjonalnie istotnych cząsteczek w TEC jest zlokalizowanych w komórkach, opisujemy nasze protokoły przygotowania jednokomórkowej zawiesiny mysich TEC i barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej.

Analiza wymaga zastosowania cytometru przepływowego umożliwiającego detekcję co najmniej sześciu kanałów fluorescencji (dla CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye oraz beta5t, CCL21 i/lub Aire), a także parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter). Reprezentatywne profile cytometryczne komórek grasicy trawionych kolagenazą/dispazą pochodzących od myszy w wieku 0 dni oraz myszy w wieku 2 tygodni przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1 oraz <strong class="xfi...

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

Limfocyty T to komórki odpornościowe, które chronią nasz organizm przed chorobami zakaźnymi i nowotworami. Grasica jest narządem, który wytwarza limfocyty T i selekcjonuje rozwijające się limfocyty T zgodnie z własnymi składnikami organizmu. Interesuje nas, w jaki sposób grasica wytwarza i selekcjonuje limfocyty T, które są ochronne dla naszego organizmu, a jednocześnie tolerancyjne dla organizmu.Nasze laboratorium przyczyniło się do analizy komórek nabłonka grasicy, które odgrywają kluczową rolę w produkcji i selekcji limfocytów T w grasicy. Analiza komórek nabłonka grasicy na poziomie pojedynczej komórki pomogła nam lepiej zrozumieć molekularny mechanizm rozwoju i selekcji komórek T. Komórki nabłonka grasicy są bardzo zróżnicowane i mają złożoną strukturę, co sprawia, że ich izolacja jest trudna.Obecna technologia izolowania zawiesin pojedynczych komórek jest ograniczona i wymaga poprawy. Mimo to izolacja pojedynczych komórek nabłonka grasicy pogłębia naszą wiedzę na temat maszynerii molekularnej zaangażowanej w ich rozwój i funkcję. Mamy nadzieję, że nasze badanie przyczyni się do lepszego zrozumienia procesu wytwarzania i regeneracji komórek odpornościowych.Wierzymy, że posłuży

preparation-single-cell-suspension-mouse-thymic-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie na tle typu dzikiego lub transgenicznych pod kątem receptora limfocytów T.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i...

Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Poznaj metodę przygotowania jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy oraz barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów rozwoju i selekcji limfocytów T.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów