Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej
26 lipca 2024
Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.
Limfocyty T to komórki odpornościowe, które chronią nasz organizm przed chorobami zakaźnymi i nowotworami. Grasica jest narządem, który wytwarza limfocyty T i selekcjonuje rozwijające się limfocyty T zgodnie z własnymi składnikami organizmu. Interesuje nas, w jaki sposób grasica wytwarza i selekcjonuje limfocyty T, które są ochronne dla naszego organizmu, a jednocześnie tolerancyjne dla organizmu.
Nasze laboratorium przyczyniło się do analizy komórek nabłonka grasicy, które odgrywają kluczową rolę w produkcji i selekcji limfocytów T w grasicy. Analiza komórek nabłonka grasicy na poziomie pojedynczej komórki pomogła nam lepiej zrozumieć molekularny mechanizm rozwoju i selekcji komórek T. Komórki nabłonka grasicy są bardzo zróżnicowane i mają złożoną strukturę, co sprawia, że ich izolacja jest trudna.
Obecna technologia izolowania zawiesin pojedynczych komórek jest ograniczona i wymaga poprawy. Mimo to izolacja pojedynczych komórek nabłonka grasicy pogłębia naszą wiedzę na temat maszynerii molekularnej zaangażowanej w ich rozwój i funkcję. Mamy nadzieję, że nasze badanie przyczyni się do lepszego zrozumienia procesu wytwarzania i regeneracji komórek odpornościowych.
Wierzymy, że posłuży ona jako ważny kamień węgielny dla poprawy zdrowia ludzkiego. Po zebraniu grasicy od myszy umieść ją w pięciu mililitrach RPMI 1640 zawierających 10 milimolowych HEPE, w 60-milimetrowym plastikowym naczyniu na lodzie. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj zakrzywionej pęsety z cienką końcówką, aby usunąć krew, tkanki inne niż grasica i tłuszczowe.
Pokrój grasicę na małe kawałki nożyczkami do preparowania. Przenieś kawałki grasicy do 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry jednego miligrama na mililitr kolagenazy i dypazy oraz jedną jednostkę na mililitr DNazy w RPMI 1640 zawierającej 2% FBS. Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.
Następnie wymieszać zawiesinę za pomocą trzymililitrowej plastikowej pipety transferowej i kontynuować inkubację przez około 30 minut lub do momentu, gdy fragmenty tkanki przestaną być widoczne. Dodaj pięć mililitrów pięciomilimolowego EDTA w HBSS zawierającym 1% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę o grubości 60 mikronów do nowej rurki o pojemności 50 mililitrów.
Odwiruj zawiesinę o sile 350 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach bufora FACS. Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Po zebraniu grasicy od nowonarodzonej myszy użyj zakrzywionej pęsety z cienką końcówką, aby usunąć krew, tkanki inne niż grasica i tłuszczowe.
Przenieś grasicę do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 0,2 mililitra RPMI 1640 zawierającej 10 milimolowych HEPES. Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów, wyrzuć pożywkę, a następnie dodaj 0,5 mililitra 0,5 miligrama na mililitr kolagenazy i dypazy oraz jedną jednostkę na mililitr Dnazy w RPMI 1640 zawierającej 2% FBS. Inkubować probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Podczas inkubacji delikatnie wymieszać za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Po 10 minutach dodaj 0,5 mililitra pięciomilimolowego EDTA do HBSS zawierającego 1% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 60 mikronów do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.
Dodaj do probówki dziewięć mililitrów RPMI 1640 zawierających 10 milimolowych HEPES. Odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze 350G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i ponownie zawieś osad w jednym do trzech mililitrów buforu FACS. Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
Na początek dodaj 16 razy 10 do mocy 6 noworodków lub postnatalnych komórek grasicy myszy w pięciomililitrowej probówce z okrągłym dnem z polistyrenu. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 mikrolitrach stężenia roboczego przeciwciała monoklonalnego anty-FC receptora w buforze FACS.
Inkubować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj po 40 mikrolitrów przeciwciała monoklonalnego anty-CD45, przeciwciała monoklonalnego anty-EpCAM, przeciwciała monoklonalnego anty-Ly-51 i UEA-1 w buforze FACS. Wymieszaj zawartość probówki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut.
Po inkubacji dodać dwa mililitry buforu FACS. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 350G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i ponownie zawiesić osad w jednym mikrolitrze roztworu Ghost Dye violet 510. Wymieszaj zawartość probówki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.
Teraz dodaj dwa mililitry buforu FACS i odwiruj zawiesinę komórek przed utrwaleniem komórek jednym mililitrem 2% aldehydu paraform przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 3,5 mililitra PBS do probówki. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 700 G przez osiem minut w czterech stopniach Celsjusza i przeniknąć komórki jednym mililitrem wewnątrzkomórkowego buforu do utrwalania i przepuszczalności.
Wymieszaj zawartość probówki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji odwirować zawiesinę komórkową i dodać jeden mililitr buforu przepuszczalnego. Ponownie odwirować zawiesinę, przed dodaniem 100 mikrolitrów każdego z roboczych stężeń przeciwciała anty-beta5t lub przeciwciała anty-CCL21.
Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Dodać jeden mililitr buforu permeabilacyjnego i odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 700 G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz dodaj 100 mikrolitrów roboczych stężeń anty-króliczych IgG i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po dodaniu buforu permeabilizacyjnego odwirować zawiesinę komórkową. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu FACS i dobrze wymieszać. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 60 mikronów przed analizą cytometryczną przepływową.
Profile cytometrii przepływowej kolagenazy i lapozy trawione przez komórki grasicy od myszy w wieku zero dni i myszy dwutygodniowych wykazały, że ponad 90% sygnałów cząstek stałych reprezentowało żywe komórki. Sygnały fluorescencyjne żywotnych komórek były reprezentowane przez CD45 i EpCAM. W stadiach noworodkowych cTEC występowały częściej niż mTEC, ale po urodzeniu dominowały mTEC ze względu na niską skuteczność uwalniania cTEC.
Utrwalanie i przenikanie komórek pozwala na wykrycie cząsteczek wewnątrzkomórkowych w TEC. Ekspresję beta5t wykryto w większości cTEC, ale nie w mTEC. CCL21 wykryto we frakcji mTEC, ale nie w cTEC.
Dla porównania, powietrze ulegało ekspresji w subpopulacji mTEC.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły przygotowania zawiesin pojedynczych komórek nabłonka grasicy myszy oraz ich późniejszej analizy przy użyciu cytometrii przepływowej. Zrozumienie charakterystyki tych komórek jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat rozwoju i selekcji limfocytów T.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Limfocyty T to kluczowe komórki odpornościowe, które chronią organizm przed chorobami.
- Gruczoł grasicy odpowiada za produkcję i selekcję limfocytów T.
- Komórki nabłonkowe grasicy odgrywają kluczową rolę w rozwoju limfocytów T.
- Analiza pojedynczych komórek pomaga w zrozumieniu mechanizmów selekcji limfocytów T.
Cel badania
- Analiza komórek nabłonkowych grasicy na poziomie pojedynczych komórek.
- Zrozumienie mechanizmów molekularnych uczestniczących w rozwoju limfocytów T.
- Udoskonalenie technik izolacji różnorodnych komórek nabłonkowych grasicy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z komórek nabłonkowych grasicy myszy.
- Barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych.
- Analiza cytometryczna dla szczegółowego badania.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik izolacji.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja zróżnicowanych komórek nabłonkowych grasicy.
- Pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów rozwoju limfocytów T.
- Cytometria przepływowa dostarczyła informacji o ekspresji cząsteczek wewnątrzkomórkowych.
- Opracowanie protokołów dla przyszłych badań z zakresu biologii limfocytów T.
Wnioski
- Badanie przyczynia się do zrozumienia funkcji komórek nabłonkowych grasicy.
- Protokoły mogą zostać zastosowane w dalszych badaniach z zakresu immunologii.
- Zdobyta wiedza może prowadzić do postępów w terapiach opartych na limfocytach T.
Często Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek oraz barwienie wewnątrzkomórkowe limfocytów nabłonkowych grasicy (TEC) myszy umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów rozwoju limfocytów T na poziomie komórkowym. Niniejszy schemat postępowania wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w programach odkrywczych ukierunkowanych na immunologię, szczególnie w obszarach, gdzie kluczowe są procesy selekcji i tolerancji zależne od TEC. Wiarygodna analiza cytometryczna subpopulacji TEC dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych na wczesnym etapie oraz zapewnia ciągłość translacyjną w strategiach modulacji odporności.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną cząsteczek ekspresowanych przez TEC, które biorą udział w selekcji i tolerancji limfocytów T.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie wkładu TEC korowych i rdzeniowych w kształtowanie repertuaru immunologicznego.
- Dostarcza danych ilościowych służących do priorytetyzacji celów terapeutycznych oraz oceny wiarygodności biologicznej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie standaryzowanych zawiesin pojedynczych komórek dla powtarzalnych analiz cytometrii przepływowej.
- Ułatwia niezawodną detekcję markerów wewnątrzkomórkowych, takich jak beta5t i CCL21, w określonych podgrupach TEC.
- Zapewnia skalowalność analiz i porównywalność między badaniami dla platform profilowania komórek odpornościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez charakteryzację mechanizmów zależnych od TEC, które leżą u podstaw tolerancji immunologicznej.
- Wspiera ciągłość procesów od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów modulacji odpornościowej.
- Stanowi podstawę do opracowania biomarkerów powiązanych z funkcją TEC i selekcją limfocytów T.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejsza metoda wpisuje się w proces od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę subpopulacji TEC oraz ich sygnatur molekularnych.
- Biologia odkrywcza: Rozwija testowanie hipotez dotyczących zależnej od TEC selekcji limfocytów T oraz mechanizmów tolerancji.
- Przesiewowanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki cytometrii przepływowej dla ekspresji markerów TEC.
- Analityka: Zapewnia dane w rozdzielczości pojedynczych komórek do analizy porównawczej subpopulacji TEC i częstości występowania markerów.
- Badania translacyjne: Łączy wiedzę o mechanizmach z modelami przedklinicznymi modulacji odpornościowej i tolerancji.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Oferuje reużywalny protokół izolacji i analizy TEC do wykorzystania w programach B+R w dziedzinie immunologii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach selekcji limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację TEC oraz barwienie wewnątrzkomórkowe w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych przepływów pracy w cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczenie rzetelnych danych na temat mechanizmów immunologicznych sterowanych przez TEC.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów modulacji immunologicznej z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane mechanizmy komórkowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu dysocjacji tkanek, cytometrii przepływowej oraz protokołów barwienia wewnątrzkomórkowego.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanej aparatury cytometrycznej i oprogramowania analitycznego.
- Niezbędna jest standaryzacja procedur przygotowania komórek i barwienia między zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Może być wymagana adaptacja metody dla myszy w różnym wieku lub różnych częstotliwości występowania subpopulacji TEC.
- Ograniczona wydajność odzysku TEC (1% cTEC, 10% mTEC) może ograniczać przepustowość i wielkość próby.
