Name: Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę SE-FRET do monitorowania aktywności kanałów LRRC8/VRAC w komórkach HeLa podczas zmian osmotycznych. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie regulacji kanałów anionowych w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy C.F. Kaminskiemu za uprzejmy dar plazmidu kodującego konstrukcję CFP-18aa-YFP, A. Klemmerowi za pomoc techniczną oraz wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Staubera, którzy przyczynili się do rozwoju tej metody.

FRET-Based Method to Monitor LRRC8 Channel Activity Without Electrophysiology

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Mikroskopia FRET jest dobrze ugruntowaną, szeroko stosowaną techniką do badania interakcji między białkami. W związku z tym metody oparte na FRET mogą być stosowane w wielu laboratoriach o zróżnicowanej specyfice. Rearanżacje konformacyjne podczas bramkowania były monitorowane dla szerokiego zakresu kanałów jonowych za pomocą testów opartych na FRET (przykłady patrz referencje 34,50,51,52,53,60,61,62,63,64,65,66,67), w niektórych przypadkach w połączeniu z elektrofizjologią we fluorometrii patch-clamp 68,69,70,71. FRET może być używany do badania zależności struktura-funkcja tych kanałów jonowych lub do monitorowania ich aktywności niezależnie od transportu jonów. Przedstawiona metoda może mieć wyraźną przewagę nad elektrofizjologią, ponieważ umożliwia monitorowanie aktywności kanałów LRRC8/VRAC in situ.
Krytyczne kroki w protokole obejmują posiew komórek w celu osiągnięcia optymalnej konfluencji dla transfekcji i obrazowania, co w idealnym przypadku ułatwia łatwe rozróżnianie komórek do późniejszej analizy. Skuteczna kotransfekcja różnych podjednostek ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej lokalizacji subkomórkowej; na przykład nadmiar podjednostki nie-LRRC8A doprowadzi do zwiększonej lokalizacji retikulum endoplazmatycznego (ER)4. W związku z tym może być konieczne dostosowanie proporcji plazmidów. W zależności od systemu, nowo wygenerowane pary FRET powinny być weryfikowane, np. poprzez bielenie akceptorowe. Binning i czas ekspozycji muszą być zrównoważone względem siebie, aby umożliwić optymalną rozdzielczość czasową i przestrzenną dla pytania badawczego. Binning umożliwia krótsze czasy naświetlania, a tym samym zmniejsza potencjalne blaknięcie czujnika FRET przy jednoczesnym zmniejszeniu rozdzielczości przestrzennej. W związku z tym, jeśli konfiguracja doświadczalna wymaga, np. subkomórkowej dyskryminacji aktywności LRRC8/VRAC, należy unikać binningu. Pytanie badawcze w równym stopniu determinuje liczbę i interwał cykli w serii poklatkowej. Interwał ma znaczenie tylko wtedy, gdy wymagana jest kinetyka zmian FRET (a tym samym aktywacja/dezaktywacja LRRC8/VRAC); W przeciwnym razie można również wykonać proste nagrania "przed i po". Długość eksperymentu zależy od procesu fizjologicznego. Idealnie, aktywność LRRC8/VRAC po bodźcach powinna być monitorowana do momentu ustabilizowania się SE-FRET. Czynniki te można określić w eksperymentach pilotażowych. Współczynniki korekcyjne do obliczenia rzeczywistego sygnału SE-FRET muszą być określone dla wszystkich warunków. Nieprawidłowo wyznaczone współczynniki korekcyjne mogą prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania intensywności SE-FRET. Wreszcie, po ustaleniu stabilnej linii bazowej, odstęp czasu między obrazami musi być wystarczająco krótki, aby uchwycić interesujący nas proces fizjologiczny.
Metoda ta ma pewne ograniczenia. Jednym z nich jest to, że zmiany intensywności FRET między LRRC8, choć odzwierciedlają ruchy LRRD, niekoniecznie odpowiadają transportowi jonów lub osmolitów przez pory. Wynika to jasno ze zmian FRET obserwowanych w homomerach LRRC8A45 pomimo ich minimalnych prądów 4,32,72. Blokery porów kanałów LRRC8/VRAC mogą nie wpływać na sygnał FRET, co sprawia, że metoda ta nie nadaje się do poszukiwania konkretnych modulatorów kanałów. Co więcej, poziomy ekspresji nadekspresji białek LRRC8 mogą wpływać na obserwowane procesy fizjologiczne, zwłaszcza że znakowane C-końcowo białka LRRC8 wykazują aktywność podstawową14.
Aspektem, który można uznać za ograniczenie lub zaletę w zależności od konkretnego pytania badawczego, jest to, że w tej metodzie selektywnie mierzone są tylko podjednostki LRRC8 wyrażane ektopowo. Tak więc poziomy tła białek endogennych prawie nie zakłócają pomiarów. Z drugiej strony, nadekspresja białek może nie zachowywać się jak endogenne kanały LRRC8 o potencjalnie różnym składzie podjednostek i stechiometrii. Na przykład różne bodźce, takie jak utlenianie, mogą mieć przeciwstawne efekty modulacyjne na różnie skomponowane kanały LRRC836. Zmieniając stosunki między podjednostkami o współekspresji, ich stechiometrię i ogólną przewodność jonówmożna dostosować 14,73, ale ich natywny skład, z prawdopodobnie często więcej niż dwoma paralogami w jednym kompleksie21, nie jest jasny i może się różnić w zależności od typu komórki 74,75,76. Ponadto wykazano, że fuzja białek fluorescencyjnych z cytozolowymi C-końcami białek LRRC8 zwiększa podstawową aktywność kanału LRRC8 / VRAC w oocytach Xenopus 14, prawdopodobnie dlatego, że duże znaczniki modulują konformację LRRD, która może regulować otwarcie kanału 14,44,45. Dlatego rozmiar białek fluorescencyjnych, łącznik i ich orientacja mogą nie tylko wpływać na wydajność FRET, ale także na aktywność kanału. Jednak, co ważne, kanały VRAC białek LRRC8 połączone z białkami fluorescencyjnymi pozostały wrażliwe na stymulację hipotoniczną14, umożliwiając ich wykorzystanie jako czujników FRET45.
Zalety tej nieinwazyjnej metody monitorowania aktywności kanału LRRC8/VRAC za pomocą mikroskopii świetlnej w porównaniu z innymi metodami obejmują: (i) Umożliwia obserwację LRRC8/VRAC w komórkach lub przedziałach zwykle niedostępnych dla elektrofizjologii. Obejmuje to organelle wewnątrzkomórkowe, na których można znaleźć kompleksy LRRC8 lub być ukierunkowane na 45,77,78. (ii) Skład cytozolowy pozostaje niezmieniony przez metodę, podczas gdy podczas pomiarów klamry krosowej całej komórki cytozol jest w dużej mierze zastępowany roztworem pipety, co może wpływać na szlaki sygnałowe, jak obserwowano w przypadku aktywacji LRRC8 / VRAC indukowanej przez octan forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA)45. (iii) Daje możliwość obserwacji aktywacji LRRC8 / VRAC z rozdzielczością subkomórkową, taką jak rozróżnianie aktywności na krawędziach natarcia i spływu podczas migracji komórek, gdzie - ograniczone do ograniczonych przestrzeni - VRAC został zaangażowany79,80. (iv) Umożliwia ciągłe monitorowanie aktywności LRRC8 / VRAC podczas rozszerzonych procesów fizjologicznych, takich jak różnicowanie miocytów56.
Chociaż metoda ta wiąże się z ograniczeniami i wyzwaniami, jest obiecująca dla dalszych badań, w tym potencjalnych zastosowań w modelach zwierzęcych. W połączeniu z innymi metodami badania tej rodziny kanałów jonowych i osmolitowych, ten test oparty na FRET może znacząco przyczynić się do rozwikłania mechanizmów aktywacji i zbadania różnorodnych funkcji fizjologicznych kanałów LRRC8 w ich natywnym środowisku.

Kanały jonowe zbudowane z heteromerów białek z rodziny LRRC8 (leucine-rich repeat containing 8) występują we wszystkich komórkach kręgowców i uczestniczą w szerokim spektrum funkcji fizjologicznych1,2. Kanały LRRC8, po raz pierwszy zidentyfikowane jako anionowe kanały regulowane objętościowo (VRACs) lub objętościowo wrażliwe kanały prostujące na zewnątrz (VSOR), odgrywają kluczową rolę w komórkowym regulacyjnym zmniejszeniu objętości (RVD)3,4. Ułatwiają one usuwanie jonów chlorkowych i organicznych osmolitów, czemu towarzyszy odpływ wody w odpowiedzi na obrzęk osmotyczny. Poza rolą w odpowiedzi na stres osmotyczny, ich udział w regulacji objętości komórki powiązano z proliferacją i migracją komórek, apoptozą, spermiogenezą oraz integralnością nabłonka5,6,7. Wykazano, że zmiana potencjału błonowego po aktywacji LRRC8/VRAC przyczynia się do różnicowania miotubul8 oraz wydzielania insuliny przez komórki β trzustki9,10,11. Co więcej, kanały LRRC8 przewodzą różne osmolity organiczne, takie jak purynergiczne cząsteczki sygnałowe ATP i cGAMP lub pobudzający aminokwas glutaminian, co angażuje te kanały w komunikację międzykomórkową w układzie odpornościowym lub w interakcje glej-neuron12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Kanały LRRC8 przewodzą nawet ksenobiotyki, takie jak barwnik fluoresceina, antybiotyk blastycydyna S czy lek przeciwnowotworowy cisplatyna23,24,25.
Istnieje wiele doniesień na temat transdukcji sygnału prowadzącej do aktywacji LRRC8/VRAC26,27,28. Mechanizm ten pozostaje jednak niejasny, a literatura przedstawia szeroki zakres potencjalnych mechanizmów, które mogą zależeć od konkretnego procesu fizjologicznego. Obejmują one zmiany siły jonowej cytozolu, interakcje z cytoszkieletem, skład błony, białka G, stan redoks oraz kaskady fosforylacyjne2,27,29,30,31.
Kanały LRRC8/VRAC zawierają LRRC8A jako niezbędną podjednostkę3,4, która musi tworzyć heteromery z co najmniej jednym z paralogów LRRC8B-E, aby sformować fizjologicznie funkcjonalne kanały4,14,32. Skład podjednostek determinuje właściwości biofizyczne kanału, takie jak prostowanie i zależna od depolaryzacji inaktywacja4,29,32,33,34, specyficzność substratowa15,17,20,21,24,35 oraz niektóre szlaki aktywacji36,37. Struktury uzyskane za pomocą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) wykazują, że homomery LRRC8A, jak i heteromery, montują się jako heksamery38,39,40, podczas gdy chimery LRRC8A/LRRC8C tworzące funkcjonalne kanały są heptamerami41. Część N-końcowa wszystkich białek LRRC8 składa się z czterech helis transbłonowych, a część C-końcowa zawiera domenę z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRD). Dostępne struktury kompleksów LRRC8 dostarczają dowodów na to, że domeny LRRD, które rozciągają się do cytosolu3,4,23, mogą ulegać reorganizacji konformacyjnej podczas bramkowania kanału34,42,43. Teza ta jest potwierdzona odkryciem, że fuzja białek fluorescencyjnych z końcem C prowadzi do podstawowej aktywności kanału14 oraz że wiązanie nanociał z domenami może modulować aktywność kanału44. Ponadto zmiany konformacyjne końców C wykazano za pomocą wewnątrzkompleksowego transferu energii rezonansowej Förstera (FRET)45.
Najbardziej powszechną metodą badania aktywności kanałów jonowych są pomiary elektrofizjologiczne46, które były szeroko stosowane w badaniach nad VRAC przed ich identyfikacją molekularną47. Istnieją jednak różne dodatkowe sposoby pośredniego monitorowania aktywności VRAC, w tym pomiar transportowanych przez nie substratów – jonów halogenkowych lub organicznych osmolitów – lub ich wpływu na objętość komórki48. W rzeczywistości identyfikacja białek LRRC8 jako VRAC opierała się na teście wykorzystującym wygaszanie białka fluorescencyjnego wrażliwego na halogenki49 przez jony jodowe wnikające do komórki przez aktywowane VRAC3,4. Inna metoda monitorowania aktywności kanałów LRRC8/VRAC wykorzystuje ruch domen cytozolowych, który – podobnie jak w przypadku innych kanałów jonowych50,51,52,53 – można obserwować poprzez zmiany w FRET45. W tym celu białka fluorescencyjne służące jako pary FRET, takie jak cyjanowa białko fluorescencyjne (CFP)/mCerulean3 jako donor oraz żółte białko fluorescencyjne (YFP)/mVenus jako akceptor, zostały połączone z końcami C-terminalnymi białek LRRC8 (Rycina 1). Wewnątrzkompleksowy FRET między podjednostkami LRRC8 został wykazany w eksperymentach z fotowybielaniem akceptora45. Aby uniknąć destrukcyjnej metody fotowybielania, zmiany FRET w czasie monitorowano za pomocą FRET z emisją uwrażliwioną (SE-FRET), gdzie mierzy się zasadniczo emisję uwrażliwioną akceptora po pobudzeniu donora, wynikającą z nakładania się widma emisji donora na widmo pobudzenia akceptora. Zastosowanie hipotoniczności zewnątrzkomórkowej, będącej bodźcem do aktywacji LRRC8/VRAC, spowodowało odwracalny spadek intensywności SE-FRET45. Co istotne, jednoczesne pomiary whole-cell patch-clamp i monitorowanie FRET podczas traktowania roztworem hipotonicznym wykazały, że ten spadek FRET rzeczywiście odzwierciedla aktywację LRRC8/VRAC45. Metoda ta, która pozwala uniknąć naruszania błony plazmatycznej lub zmiany środowiska wewnątrzkomórkowego przez roztwór w pipecie, stanowi alternatywę dla monitorowania aktywności LRRC8/VRAC. Jest ona szczególnie użyteczna w warunkach fizjologicznych, gdzie kluczowe jest zachowanie natywnego cytozolu, niezbędna jest rozdzielczość subkomórkowa lub wymagana jest długotrwała obserwacja aktywności kanałów.
W niniejszym materiale przedstawiamy protokół badania LRRC8/VRAC z wykorzystaniem odczytu opartego na metodzie FRET. Protokół opisuje sposób prowadzenia i transfekcji komórek, pozyskiwanie obrazów próbek i kontroli, analizę danych oraz obliczanie wartości SE-FRET (sensitized emission FRET).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat systemu par FRET dla LRRC8. mCerulean3 przedstawiono w kolorze cyjanowym, a mVenus w żółtym. Po otwarciu VRAC odległość (i/lub orientacja przestrzenna) między fluoroforami ulega zmianie, co skutkuje zmniejszeniem transferu energii między donorem (Don) a akceptorem (Acc), a w konsekwencji obniżeniem obserwowanego sygnału FRET.&#160;Utworzono przy użyciu BioRender.com.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Prezent od C.F. Kamińskiego (University of Cambridge, Wielka Brytania)</td></tr><tr><td>Cykloheksymid (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Koło filtra emisji (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynia do hodowli zwierząt 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Rak szyjki macicy u ssaków/ Uzyskane z Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (chlorek potasu)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>Źródło światła LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automatyczny licznik komórek</td><td>logo biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logo biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (chlorek magnezu)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop THUNDER Imager na żywo</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (chlorek sodu)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw HC PL APO 63x/1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna penicylina (krok pióra)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik martwicy nowotworu (TNF)-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzji grawitacyjnej sterowany</td><td>zaworem ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (lrrc8/vrac) przy użyciu transferu energii rezonansowej förstera z emisją uczuloną (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Członkowie rodziny białek LRRC8 tworzą heteromeryczne kanały jonowe i osmolitowe, odgrywając rolę w licznych procesach fizjologicznych. Jako kanały anionowe o regulowanej objętości (VRAC)/wrażliwe na objętość kanały korygujące na zewnątrz (VSOR), są aktywowane po pęcznieniu komórek osmotycznych i pośredniczą w wytłaczaniu chlorków i osmolitów organicznych, co prowadzi do wypływu wody, a tym samym kurczenia się komórek. Poza rolą w regulacji objętości osmotycznej, VRAC są zaangażowane w procesy komórkowe, takie jak różnicowanie, migracja i apoptoza. Poprzez ich wpływ na potencjał błonowy i transport różnych cząsteczek sygnałowych, bogate w leucynę powtórzenia zawierające 8 (LRRC8) kanałów odgrywają rolę w komunikacji neuron-glej, wydzielaniu insuliny i odpowiedzi immunologicznej. Mechanizm aktywacji pozostał nieuchwytny. Kanały LRRC8, podobnie jak inne kanały jonowe, są zwykle badane przy użyciu metod elektrofizjologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykrywania aktywacji kanału LRRC8 poprzez pomiar wewnątrzkompleksowego transferu energii rezonansu rezonansowego Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET) między białkami fluorescencyjnymi połączonymi z C-końcowymi domenami powtórzeń bogatymi w leucynę podjednostek LRRC8. Metoda ta daje możliwość badania aktywacji kanałów in situ bez wymiany środowiska cytozolowego oraz podczas procesów takich jak różnicowanie komórek i apoptoza.

Dzięki tej metodzie opartej na FRET można monitorować aktywność LRRC8/VRAC podczas stymulacji osmotycznej, a spadek SE-FRET koreluje ze stopniem hipotoniczności środowiska zewnętrznego45. Reprezentatywne wyniki aktywacji kanałów indukowanej hipotonicznością przedstawiono również tutaj (Rysunek 3 i Rysunek 4). Ponadto można obserwować aktywację LRRC8/VRAC przez różne bodźce izoosmotyczne, takie jak manipulacja sygnalizacją diacyloglicerolu45 lub podczas aktywacji miocytów56.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Profile SE-FRET. (A) Pozorne profile SE-FRET z 5 niezależnych eksperymentów. Dane przedstawiają średnią ± SD dla N = 2 do N = 7 komórek na pole widzenia (FOV). (B) Średnia ± SD dla wszystkich komórek (N = 31 komórek). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ponieważ kanały LRRC8/VRAC biorą również udział w apoptotycznym zmniejszeniu objętości24,57, obserwacja aktywności kanałów po indukcji apoptozy stanowiłaby kolejne zastosowanie opisanej tutaj metody. W związku z tym, protokół monitorowania SE-FRET w komórkach HeLa wykazujących ekspresję LRRC8A-mCerulean3 i LRRC8E-mVenus przeprowadzono podczas stosowania leków indukujących apoptozę za pośrednictwem receptorów śmierci. Wcześniej wykazano, że czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α oraz cykloheksymida (CHX) wywołują prądy VRAC w ciągu kilku minut58. Po dodaniu 2 ng/mL TNF-α i 1 µg/mL CHX w buforze izotonicznym odnotowano silny spadek SE-FRET (Rycina 5). Po zastąpieniu buforu medium hipertonicznym, mimo zawartości TNF-α i CHX, wartości SE-FRET powróciły do poziomu bliskiego wartości bazowej (Rycina 5A), co odpowiada zmniejszeniu prądów VRAC w hipertonicznym roztworze kąpieli podczas leczenia ligandem Fas indukującym apoptozę58. Traktowanie komórek DMSO, rozpuszczalnikiem dla TNF-α i CHX, nie spowodowało redukcji SE-FRET. TNF-α + CHX nie wpłynął na SE-FRET konstruktu CFP-18aa-YFP, będącego tandemową konstrukcją EYFP i ECFP służącą jako kontrola FRET59, co potwierdza specyficzność względem LRRC8/VRAC (Rycina 5B).
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg" /> 
Rysunek 5: Izosmotyczna aktywacja VRAC indukowana apoptozą zapośredniczoną przez receptory śmierci. (A) Znormalizowane wartości SE-FRET w komórkach HeLa wykazujących ekspresję LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen (n = 8 szalek, 23 komórki) w funkcji czasu. Po 15 cyklach w izotonicznym buforze obrazującym (linia bazowa), roztwór kąpieli zastąpiono izotonicznym buforem uzupełnionym o 2 ng/mL TNF-α i 1 µg/mL cykloheksymidu (CHX) przez 30 cykli, a następnie zastosowano hipertoniczny bufor obrazujący z TNF-α i CHX przez 20 cykli. Surowa średnia wartość SE-FRET dla każdego ROI i punktu czasowego została znormalizowana do średniej wartości bazowej (izotonicznej) dla odpowiedniego ROI. (B) Ilościowe oznaczenie znormalizowanych wartości SE-FRET w komórkach HeLa wykazujących ekspresję LRRC8A/E, jak w A, z roztworem izotonicznym zawierającym DMSO jako kontrolę nośnika dla CHX (n = 5 szalek, 12 komórek) lub buforem izotonicznym zawierającym induktory apoptozy, jak w A (n = 8 szalek, 23 komórki), lub w komórkach HeLa wykazujących ekspresję CFP-18aa-YFP z induktorami apoptozy (n = 3 szalki, 9 komórek). Dane przedstawiają średnią z ostatnich 10 punktów czasowych w odpowiednim buforze dla poszczególnych komórek (symbole) oraz średnią dla wszystkich komórek ± SD; ** p &#60; 0.01 zwykła jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie post-hoc test wielokrotnych porównań Tukeya. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Elektrofizjologia to złoty standard w badaniu aktywności kanałów jonowych. Istnieje jednak wiele alternatywnych podejść, w tym metod optycznych. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania aktywności bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego 8-kanałowe (LRRC8) kanały anionowe utworzone przy użyciu metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między podjednostkami.

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

Nasze badania koncentrują się na właściwościach i funkcji transportu błonowego, w szczególności transporterów jonów i kanałów, takich jak kanały anionowe i osmolitowe utworzone przez LRRC8. Badamy ich mechanizmy biofizyczne, procesy regulacyjne i funkcje fizjologiczne komórki. Na koniec dążymy również do wyjaśnienia, w jaki sposób ich dysfunkcja może prowadzić do zaburzeń u ludzi.Wiele laboratoriów pogłębiło naszą wiedzę na temat kanałów LRRC, rozwiązując struktury kompleksów LRRC8, wyjaśniając właściwości elektrofizjologiczne i odkrywając różne role fizjologiczne. Pozostaje jednak zasadnicze pytanie: w jaki sposób kanały te są regulowane biochemicznie i fizjologicznie oraz jak skład podjednostek wpływa na ich aktywację i role w komórce? Metoda ta pozwala na obserwację aktywności kanału LRRC8 w przedziałach zwykle niedostępnych dla elektrofizjologii, takich jak przedziały wewnątrzkomórkowe, bez zakłócania składu cytozolowego, jak miałoby to miejsce w przypadku patch-clampu całego komórki.Jego subkomórkowa rozdzielczość umożliwia monitorowanie różnicowo aktywowanych kanałów LRRC8 w pojedynczej komórce i pozwala na ciągłe monitorowanie podczas procesów fizjologicznych. Za pomocą tego czujnika opartego na fret będziemy badać regulację i funkcję kanałów VRAC LRRC8 w różnych warunkach fizjologicznych. Kluczowe pytania to: w jaki sposób podjednostki zmieniają swoje potwierdzenia; które procesy transdukcji sygnału są zaangażowane w różne bodźce i czy istnieją różnice między różnymi paralogami LRRC8; i czy istnieją subkomórkowe różnice w procesach fizjologicznych.Na początek przygotuj izotoniczne, hipotoniczne i hipertoniczne. Za pomocą osmometru zmierz osmolarność bufora. Dzień przed transfekcją wysiewaj jeden razy dziesięć do potęgi pięciu komórek HeLa w dwóch mililitrach pożywki do hodowli komórkowych na 35-milimetrowej szalce.Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia kroplami dodaj do naczynia roztwór do transfekcji ruchem spiralnym. Przesuń naczynie pięć razy w poziomie i pionie po powierzchni ławki, aby wymieszać roztwór.Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia sprawdź transfekcję pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pobrać komórki wykazujące ekspresję zarówno konstruktów dawcy, jak i akceptora i odessać pożywkę do hodowli komórkowej.Umyj komórki trzykrotnie dwoma mililitrami buforu izotonicznego. Po zasysaniu buforu izotonicznego dodaj trzy mililitry buforu izotonicznego do komórek i umieść naczynie na próbkę na stoliku mikroskopu. Załaduj ustawienia FRET mikroskopii lub ustaw niezbędne kanały dla eksperymentu FRET: wzbudzenie dawcy-emisja dawcy, DD;dawca-akceptor, DA; i akceptor-akceptor, AA. Znajdź pole widzenia z co najmniej jedną komórką wyrażającą zarówno konstrukty dawcy, jak i akceptora, a następnie dostosuj ustawienia kanału, jeśli to konieczne.Wyjmij płytkę ze stolika mikroskopu i umieść ją z powrotem w inkubatorze do czasu zakończenia eksperymentu. Pobrać komórki, w których występuje ekspresja tylko konstruktu dawcy i odessać pożywkę hodowlaną. Umyj komórki trzykrotnie dwoma mililitrami buforu izotonicznego.Po ostatnim płukaniu dodaj trzy mililitry buforu izotonicznego do komórek i umieść naczynie na próbkę na stoliku mikroskopu. Znajdź pole widzenia z co najmniej jedną komórką wyrażającą konstrukt dawcy. Zobrazuj wszystkie kanały dawca-dawca, akceptor-akceptor i dawca-akceptor.Narysuj obszar zainteresowania lub ROI wokół komórek i zmierz średnią intensywność kanałów dawca-akceptor i dawca-dawca. W celu odjęcia tła narysuj ROI w kanałach dawca-akceptor i dawca-dawca, w których znajduje się tylko sygnał tła, i zmierz średnią intensywność. Po zobrazowaniu komórek narysuj ROI wokół komórek i zmierz średnią intensywność kanału donor-akceptor i akceptor-akceptor.W przypadku odejmowania tła narysuj ROI w kanałach donor-akceptor i akceptor-akceptor, w których znajduje się tylko sygnał tła, i zmierz średnie intensywności. Na koniec oblicz współczynniki korekcyjne, beta i gamma, używając wartości wyznaczonych dla IDA z korekcją tła, IDD z korekcją tła i IAA z korekcją tła. Na początek należy odessać bufor z wcześniej przygotowanych komórek HeLa wyrażających dawcę i akceptora.Umyj komórki trzema mililitrami buforu izotonicznego i umieść naczynie na próbkę na stoliku mikroskopu. W celu zasysania buforu izotonicznego zamocuj i wyreguluj kaniulę węża tak, aby jej końcówka sięgała dna naczynia. Aby dodać, zamocuj i wyreguluj rurki, aby umożliwić przepływ bufora napędzany grawitacją do naczynia.Znajdź pole widzenia z co najmniej jedną komórką wyrażającą jednocześnie konstrukt dawcy i akceptora i uzyskaj obraz. Aby odjąć tło dla sygnału FRET, narysuj ROI w kanale donor-akceptor, w którym znajduje się tylko sygnał tła i zmierz średnią intensywność. W przypadku kwantyfikacji SE-FRET narysuj ROI wokół komórki i zmierz średnią intensywność w kanałach dawca-dawca, dawca-akceptor i akceptor-akceptor dla wszystkich obrazów w szeregach czasowych.Skonfiguruj eksperyment poklatkowy dla kanałów dawca-dawca, dawca-akceptor i akceptor-akceptor z interwałem 10 sekund i czasem trwania, aby objąć wszystkie warunki sekwencji stymulacji. Rozpocznij akwizycję obrazowania poklatkowego i narysuj ślady SE-FRET. Po pomiarze linii podstawowej zastąp bufor przepływem grawitacyjnym.W eksperymencie na żywo odessać bufor izotoniczny przez kaniulę węża, stosując podciśnienie za pomocą strzykawki. Dodaj trzy mililitry bufora następnego stanu przez przepływ grawitacyjny, kontynuując obrazowanie poklatkowe. Aby zmierzyć inny warunek, umyj próbkę w następnym buforze, jak pokazano wcześniej, kontynuując obrazowanie poklatkowe.Za pomocą metody opartej na FRET monitorowano aktywność regulowanego objętościowo kanału anionowego LRRC8 podczas stymulacji osmotycznej i redukcję SE-FRET skorelowaną z hipotonicznością zewnątrzkomórkową. W innych eksperymentach wykryto również aktywację LRRC8 VRAC przez bodźce izosmotyczne, takie jak sygnalizacja diacyloglicerolu lub aktywacja miocytów. Aktywność LRRC8 VRAC monitorowano po indukcji apoptozy w komórkach HeLa eksprymujących LRRC8A mCerulean3 i LRRC8E mVenus.Czynnik martwicy nowotworu alfa i cykloheksymid spowodowały znaczny spadek SE-FRET, który powrócił do normy w środowisku hipertonicznym. Leczenie DMSO nie zmniejszyło SE-FRET, potwierdzając swoistość dla LRRC8 VRAC.

monitoring-leucine-rich-repeat-containing-8-channel-lrrc8vrac

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy zjawisko FRET pomiędzy sprzężonym polimerem polidiacetylenem (PDA) a fluorophorem przyczepionym do powierzchni liposomów PDA w celu detekcji biomolekuł. Liposomy PDA zawierały na swojej powierzchni cząsteczki receptorowe dla biomolekuł, które służyły jako sondy. Oddziaływania ligand-receptor prowadzą do zmian w efektywności FRET pomiędzy fluorophorem a PDA, co stanowi podstawę mechanizmu detekcji.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej fluorescencji

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Intherentnie nieuporządkowane regiony (IDR) to elastyczne domeny białkowe, które modyfikują swoją konformację w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Zespołowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) może oszacować wymiary białka w różnych warunkach. Przedstawiamy podejście FRET do oceny wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w warunkach stresu hiperosmotycznego.

Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET

Ten protokół opisuje test oparty na bret do pomiaru interakcji kinazy CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach. Protokół określa etapy przygotowania ogniw, odczytu emisji BRET i analizy danych. Przedstawiono również przykładowy wynik wraz z identyfikacją odpowiednich elementów sterujących i rozwiązywaniem problemów w celu optymalizacji testu.

Test oparty na rezonansie bioluminescencyjnym (BRET) do pomiaru oddziaływań CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach

Opisujemy protokół mapowania przestrzennego rozkładu aktywności enzymatycznej dla enzymów, które generują fosforan dinukleotydu nikotynoatmidadeninowego (NAD(P)H) + H+ bezpośrednio w próbkach tkanek.

Mapowanie metabolizmu: monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w tkance

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Poznaj metodę SE-FRET do monitorowania aktywności kanałów LRRC8/VRAC w komórkach HeLa podczas zmian osmotycznych. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie regulacji kanałów anionowych w żywych komórkach.

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET) (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

Przeglądaj więcej filmów