Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Angiogeneza jest charakterystycznym procesem związanym z embriologią i rozwojem choroby, w tym wzrostem guza i chorobą naczyń krwionośnych. W tym projekcie naszym celem jest przedstawienie kompleksowych ram technik in vitro, które można wykorzystać do badania angiogenezy na poziomie molekularnym w bardzo kontrolowanych warunkach oraz do badań przesiewowych pod kątem potencjalnie mniejszej liczby opcji produktu. Przełożenie wyników z in vitro na in vivo, a ostatecznie na warunki kliniczne, jest trudne ze względu na ryzyko wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych.

Wybór odpowiedniego testu angiogenezy jest zatem kluczowy i znajomość jego ograniczeń. Badanie to ma na celu przedstawienie wytycznych oraz sposobu interpretacji i ustalenia dwóch powszechnych testów angiogenezy. Niedawno porównaliśmy test migracji ran drapanych 2D z testem kiełkowania sferoidów 3D.

Tam, gdzie test 2D jest łatwo skalowalny, test 3D rejestruje angiogenezę bardziej szczegółowo, w tym tworzenie komórek łodygi wierzchołkowej, interakcję macierzy i przełącznik glikolityczny. Dane te dostarczają naukowcom wskazówek, który test wybrać w następnej kolejności w swoich projektach. Nasze laboratorium będzie nadal charakteryzować kluczowe aspekty prezentowanych testów in vitro poprzez bezpośrednie porównanie ich z warunkami in vivo, aby ułatwić przełożenie wyników in vitro na zastosowania kliniczne.

Na początek wysiew 100 mikrolitrów komórek HUVEC w dołkach 96-dołkowej płytki. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla na sześć godzin, aby ułatwić osadzanie się komórek. Następnie zastąp pożywkę w każdej studzience 100 mikrolitrami podstawowego podłoża do wzrostu komórek śródbłonka zawierającego 2% FBS i ponownie inkubuj.

Następnego dnia umieść płytkę w 96-dołkowym narzędziu do tworzenia ran. Naciśnij dźwignię urządzenia, aby wygenerować zadrapanie. Ostrożnie zdejmij pokrywę narzędzia Woundmaker Tool przed zwolnieniem dźwigni, aby zapobiec podwójnemu zadrapaniu.

Umyj studzienki dwa razy 200 mikrolitrami podłoża podstawowego wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionego FBS. Po potwierdzeniu całkowitego usunięcia zanieczyszczeń, pipetować 100 mikrolitrów przygotowanych roztworów stymulacyjnych lub kontrolnych do każdej studzienki. Użyj mikroskopu do obrazowania żywych komórek, aby rejestrować obrazy co godzinę przez 24 godziny.

Kontrola pozytywna wykazała udaną migrację w pierwotnym zarysowanym obszarze. Problemy techniczne były postrzegane jako niejednolity wzrost komórek, podwójne drapanie lub fale na granicach zadrapań. Za optymalne uznano 25-procentowe zwiększenie względnej odległości od rany.

Nieprawidłowe rozdzielenie kontrolek dodatnich i ujemnych wskazywało na niski zakres dynamiki. Na początek dodaj 30 mililitrów 5% wodorotlenku potasu w metanolu do 50-mililitrowej probówki. Inkubować 100 szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 milimetrów w probówce przez 30 minut pod ciągłym mieszaniem.

Następnie umyj szkiełka nakrywkowe w wodzie demineralizowanej przez 30 minut. Po zakończeniu mycia przenieś szkiełka pokrowca do 70% roztworu izopropylu w celu przechowywania. Aby pokryć szkiełka nakrywkowe, najpierw oprzyj je pojedynczo o ścianę kwadratowej szalki Petriego.

Gdy alkohol izopropylowy odparuje, przenieś je do 24-dołkowej płytki. Odpipetować jeden mililitr kolagenu z PBS do każdej studzienki i inkubować. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe około cztery do pięciu razy przez pięć minut każdy jednym mililitrem PBS.

Pipetować wyhodowane HUVEC do studzienek za pomocą powlekanych szkiełek nakrywkowych. Po hodowli komórek przez pożądany okres czasu, myj komórki w jednym mililitrze PBS przez pięć minut. Utrwal komórki w jednym mililitrze 2% paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Teraz przepłucz komórki w jednym mililitrze PBS przez trzy do czterech cykli prania po pięć minut każdy. Na koniec odpipetuj jeden mililitr buforu blokującego do płytki studzienki przed barwieniem. Na początek dodaj HUVEC do 10-mililitrowej probówki Falcon zawierającej osiem mililitrów śródbłonkowej pożywki wzrostowej.

Dodaj dwa mililitry roztworu podstawowego metylokomórkowego do probówki i dobrze wstrząśnij. Następnie przenieś 25 mikrolitrów mieszaniny na odwróconą wewnętrzną powierzchnię dużej, kwadratowej szalki Petriego. Delikatnie obróć pokrywkę o 180 stopni i umieść ją na dnie naczynia do hodowli komórkowej i inkubuj przez noc.

Następnego dnia dodaj 2,3 mililitra kolagenu typu 1 ze szczurzego ogona do fiolki zawierającej 0,28 mililitra 10 x pożywki 199. Trzymaj tę mieszaninę na lodzie i mieszaj, aż będzie równomiernie żółta. Miareczkować mieszaninę względem wodorotlenku sodu, aż zmieni kolor na pomarańczowy.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu HEPES do produktu końcowego. Zbierz wiszące hodowane komórki do 50-mililitrowej probówki sokoła z 20 mililitrami PBS, a następnie odwiruj. Po odrzuceniu supernatantu dodać 0,1 mililitra FBS i 0,4 mililitra śródbłonkowej pożywki podstawowej do sferoidalnego osadu.

Delikatnie postukaj w rurkę, aby ponownie zawiesić granulkę. Teraz odpipetuj dwa mililitry roztworu podstawowego metylokomórki i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj dwa mililitry przygotowanej mieszaniny kolagenu do zawieszonych sferoid.

Dozować 0,5 mililitra powstałej mieszaniny do dołków 24-dołkowej płytki i inkubować. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonego rekombinowanego czynnika wzrostu ludzkiego śródbłonka naczyniowego do dołków płytki. Inkubuj kulturę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla przez 12 godzin.

Następnego dnia za pomocą odwróconego mikroskopu uchwyć obrazy sferoid, które nie stykają się ze sobą z krawędzią studni lub wykazują oznaki uszkodzenia. Sferoidy stymulowane tylko podłożem podstawowym lub rekombinowanym czynnikiem wzrostu ludzkiego śródbłonka naczyniowego były wyraźnie rozróżnialne. Sferoidy w żelach niskiej jakości wydawały się opadać na ziemię i rozpraszać się.

Kontrola ujemna wykazała umiarkowaną wyjściową szybkość kiełkowania, podczas gdy czynnik wzrostu ludzkiego śródbłonka naczyniowego podwoił lub potroił względną długość kiełkowania. Liczba kiełków wykazywała podobny zakres dynamiczny. Na początek utrwal kiełkujące sferoidalne żele HUVEC w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu na godzinę.

Delikatnie umyj żele w jednym mililitrze PBS około trzy do czterech razy. Całkowicie oderwij żele od powierzchni każdego dołka płytki. Następnie przenieś je do nowych płytek 24-dołkowych.

Dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do płytki studzienki, a następnie inkubuj na wytrząsarce orbitalnej przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przed inkubacją należy pipetować 500 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego do studzienek. Następnego dnia delikatnie umyj żele PBS przez pięć cykli prania po pięć minut każdy.

Dodać 500 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego płynem i FTSE w buforze blokującym. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej. Po umyciu żeli w PBS przenieś je na szkiełka mikroskopowe.

Dodaj dwie krople DAPI zawierające podłoże montażowe na szkiełko nakrywkowe i umieść je na każdym żelu. Zaschnięte żele uszczelnij lakierem do paznokci. Umieść je w ciemności przed przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy.