Name: Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Naucz się techniki szwajcarskiego zwijania jelit i immunofluorescencyjnego barwienia tkanek zatopionych w parafinie u myszy. Ta metoda umożliwia szczegółową wizualizację wszystkich regionów jelita w jednym bloku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) przyznające DK121869 K01 ACE, a ta publikacja była częściowo wspierana przez T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) oraz granty HCS dla SAD & RS. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe z Uniwersytetu Medycznego Karoliny Południowej (MUSC) dla ACE i była wspierana przez MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) oraz COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). Obrazowanie przeprowadzono przy użyciu rdzenia obrazowania komórkowego i molekularnego w MUSC.

Efficient Swiss Roll Method for High-Quality Immunostaining of Intestinal Tissue

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
<li>Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieger%2C+J+%22Animal+models+of+allergic+disease%3A+Methods+and+protocols%22">Animal models of allergic disease: Methods and protocols</a>. , Springer US. New York, NY. (2021).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bswiss+roll%26%2334%3B%3A+A+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The &#34;swiss roll&#34;: A simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
<li>Lunnemann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecum+axis+%28cecax%29+preservation+reveals+physiological+and+pathological+gradients+in+mouse+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium.</a> Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> J Vis Exp. (139), e58288(2018).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+AT+%22Histopathology%3A+Methods+and+protocols%22">Histopathology: Methods and protocols</a>. , Springer New York. New York, NY. (2014).</li>
<li>Yang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+mechanism+of+mucosal+barrier+erosion+in+the+pathogenesis+of+acquired+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis.</a> iScience. 26 (10), 107883(2023).</li>
<li>Dooley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+5b+is+required+for+proper+localization+of+the+intermicrovillar+adhesion+complex+in+the+intestinal+brush+border%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).</li>
<li>Danan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transit+amplifying+cells+require+mettl3+for+growth+factor+signaling%2C+kras+expression%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).</li>
<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tissue+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse tissue fixation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).</li>
<li>Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+preparation+techniques+for+histological+analysis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse.</a> Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat-induced+antigen+retrieval+following+inconsistent+formalin+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).</li>
<li>Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+three-dimensional+spatial+structure+in+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome.</a> PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).</li>
<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę utrwalania tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki rolkowej w celu zachowania architektury jelit i promowania dokładnego barwienia immunologicznego. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do zbadania szerokiej gamy pytań badawczych związanych z fizjologią jelit i biologią komórki19. Opublikowano kilka zoptymalizowanych szwajcarskich metod walcowania, które są bardzo przydatne20,21. Zaletą tej techniki jest łatwość dokładnego otwarcia jelita na bibule filtracyjnej. Pozwala to na płaskie unieruchomienie tkanki, zapobiegając zwijaniu się tkanki do wewnątrz podczas toczenia, co jest szczególnie pomocne podczas analizy tkanki objętej stanem zapalnym z pogrubionymi mięśniami. Ponadto należy podkreślić kluczową rolę sekcji tkanek w osiąganiu wiarygodnych wyników. Prawidłowe sekcjonowanie zapewnia zachowanie architektury tkanki i ułatwia dokładne barwienie immunologiczne, co ostatecznie przyczynia się do sukcesu dalszych analiz11. Zoptymalizowane podejście jest mniej trudne w porównaniu z innymi protokołami, dając spójne wyniki u różnych osób. Technika przedstawiona w tym artykule zapewnia również dobrze zachowaną architekturę tkankową, wszechstronność i wysoce powtarzalne barwienie immunologiczne przy użyciu różnych przeciwciał.
Krytycznym aspektem tego protokołu jest czas utrwalania i przetwarzania. Niewłaściwe utrwalenie i przetwarzanie tkanek może zakłócić analizę histochemiczną. Tkanka, która jest nadmiernie utrwalona, staje się krucha, podczas gdy tkanka niedostatecznie utrwalona pozostaje zbyt miękka. Zarówno nadmiernie utrwalone, jak i niedostatecznie utrwalone tkanki są trudne do przekroju i pogarszają barwienie immunologiczne. Po wypreparowaniu na bibułę filtracyjną tkankę należy natychmiast umieścić w formalinie, aby zmniejszyć zmiany pośmiertne22. W tym protokole tkanka mysia jest utrwalana w formalinie przez noc. W kilku badaniach wykorzystano ten czas fiksacji 20,23,24. Jednak Boenisch i wsp. wykazali, że barwienie immunologiczne jest spójne w tkance utrwalonej w formalinie przez okres do 4 dni25. W zależności od pożądanych analiz wymagana jest optymalizacja czasu mocowania i utrwalacza. Na przykład utrwalacz Carnoya jest często preferowany do barwienia śluzu26. Wybór utrwalaczy i czas trwania utrwalania powinien być optymalizowany przez każdego badacza w zależności od jego podejścia eksperymentalnego. Zaleca się stosowanie automatycznego procesora tkanek w celu zapewnienia dokładnych i spójnych czasów przetwarzania. Nasze laboratorium używa małych szpilek do utrzymywania tkanki jelitowej na miejscu w postaci rolek. Bez szpilek tkanka może się rozwinąć podczas przetwarzania. Ponieważ te szpilki są dość małe i ostre, należy podjąć środki ostrożności. Zalecamy użycie nożyc do drutu w celu usunięcia ostrego końca szpilki przed obróbką tkanki. Niektóre rdzenie histologiczne nie akceptują tkanek z szpilkami; Dlatego najlepiej sprawdzić przed użyciem. Alternatywnym podejściem jest użycie agaru do zakotwiczenia tkanki przed przetworzeniem27 lub gąbki kasetowe mogą być używane w kasetach, aby pomóc w utrzymaniu rolek.
Barwienie immunologiczne to protokół, który wymaga optymalizacji dla każdego przeciwciała. W miarę możliwości zaleca się stosowanie przeciwciał zwalidowanych przez nokaut. Ta metoda utrwalania i przetwarzania tkanek powoduje wyraźne barwienie, co pozwala na łatwą identyfikację wiązania przeciwciał w porównaniu z sygnałem tła, gdy stosowane są niezwalidowane przeciwciała. Wybór utrwalacza, pobieranie antygenu i rozcieńczanie przeciwciał mogą mieć wpływ na swoistość przeciwciała. Zalecamy, aby badacze dokładnie ocenili i zoptymalizowali protokół, dostosowując fiksację, pobieranie antygenu i czas inkubacji dla każdego przeciwciała. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeciwciała należy testować w różnych rozcieńczeniach w celu określenia optymalnego stężenia i w różnych do pobierania antygenu. Pobieranie epitopów poprawia barwienie immunologiczne poprzez rozbijanie mostków metylenowych powstałych podczas utrwalania. W tym protokole stosuje się odzyskiwanie epitopów indukowane ciepłem, a nie odzyskiwanie epitopów indukowane proteolityzmem, ponieważ trawienie enzymatyczne jest bardziej prawdopodobne, że zakłóci morfologię tkanek28. Najczęstszymi do odzyskiwania epitopów indukowanymi ciepłem są bufor cytrynianowy, tris-HCl i tris-EDTA, przy czym bufor cytrynianowy jest najłagodniejszy pod względem morfologii tkanek29. Wybór buforu jest różny i powinien być określony dla każdego przeciwciała. W handlu dostępnych jest wiele do odzyskiwania antygenów, roztworów blokujących i rozcieńczalników przeciwciał. Jednak rozwiązania te mogą być niezwykle drogie i zbyt kosztowne. Dostarczyliśmy receptury popularnych roztworów do odzyskiwania antygenów oraz roztworów blokujących i rozcieńczalników przeciwciał, aby zapewnić opłacalność. 
Ograniczeniem tej metody jest to, że utrwalanie i przetwarzanie może zmieniać tkanki i maskować epitopy. Alternatywnym podejściem jest barwienie immunologiczne świeżo zamrożonej tkanki. Świeżo zamrożona tkanka jest zamrażana błyskawicznie, co pozwala uniknąć narażenia na toksyczne utrwalacze, zachować strukturę białka i poprawić dostępność niektórych epitopów. Jednak architektura i morfologia tkanek są gorsze niż w przypadku tkanek utrwalonych i zanurzonych w parafinie. Kolejne wyzwania związane ze świeżo mrożoną tkanką obejmują materiały i logistykę wymaganą do cięcia i przechowywania zamrożonych bloków i szkiełek. Analiza szwajcarskich bułek w porównaniu z paskami tkanki jelitowej pokazuje różnice w wysokości i szerokości kosmków oraz różnice w komórkach odpornościowych w blaszce właściwej, jak opisano we wcześniejszym raporcie30. Wyniki te sugerują, że jelitowe bułeczki szwajcarskie zmieniają niektóre cechy jelit, które należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentów. Ponadto wymagana jest ponowna walidacja przeciwciał, ponieważ wiele przeciwciał, które wiążą się specyficznie z tkanką zatopioną w parafinie utrwalonej w formalinie, nie barwi się dobrze w świeżo zamrożonej tkance31.
Barwienie immunologiczne tkanki jelitowej może być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na wiele różnych pytań dotyczących biologii i fizjologii komórek przewodu pokarmowego. Technika ta jest szeroko stosowana do identyfikacji zmian nabłonkowych w przebiegu zapalenia jelit, po infekcji bakteryjnej oraz podczas progresji raka. Przedstawiona tutaj metoda jest idealna do konserwacji tkanki jelitowej, ponieważ jest opłacalna, nie stanowi wyzwania technicznego i jest wysoce powtarzalna. Aby zapewnić najlepsze wyniki, zachęcamy do optymalizacji kroków opisanych w niniejszym protokole w oparciu o projekt eksperymentalny i testowaną hipotezę.

Architektura komórkowa jelita stanowi wyjątkowe wyzwanie w utrzymaniu jego integralności strukturalnej, gdy tkanka jelitowa jest zachowywana do barwienia immunologicznego. Jelito cienkie składa się z wydłużonych, przypominających palce struktur znanych jako kosmki1. Te kosmki często ulegają zniekształceniu podczas procesów osadzania. Zapewnienie, że badacze dysponują technikami prawidłowego osadzania jelit w celu uzyskania przekrojów poprzecznych, co pozwala na wizualizację wszystkich regionów jelita, a także warstw tworzących jelito (tj. muscularis propria, błona śluzowa i błona surowicza), ma kluczowe znaczenie dla solidnej analizy eksperymentalnej2. Nieodpowiednie utrwalenie, nadmierne utrwalenie i niewłaściwe obchodzenie się z tkankami naruszy integralność tkanki, powodując niezamierzone uszkodzenie nabłonka jelitowego3,4. Uszkodzenie nabłonka jelitowego podczas tych etapów może znacznie obniżyć jakość późniejszych analiz, takich jak immunofluorescencja, niezależnie od skuteczności protokołów immunohistochemicznych i zastosowanych przeciwciał.
Barwienie immunologiczne, podobnie jak prawidłowe utrwalanie tkanek, jest ważną częścią badań biomedycznych. Dobrze przeprowadzone barwienie immunologiczne może rzucić światło na nieznane wcześniej aspekty struktury i funkcji komórek. Barwienie immunofluorescencyjne skrawków parafiny może być trudne ze względu na modyfikacje fizykochemiczne wynikające z procesu utrwalania i zatapiania parafiny5. Utrwalanie i osadzanie parafiny powoduje maskowanie antygenu, które może zakłócać immunofluorescencyjne wykrywanie epitopów będących przedmiotem zainteresowania6. Opóźnione utrwalenie może wywołać degradację proteolityczną, co skutkuje osłabieniem lub brakiem barwienia krytycznych epitopów7. Ponadto przeciwciała są często niedokładne przy wysokim poziomie tła. Protokoły barwienia immunologicznego, które promują spójne i swoiste wiązanie przeciwciał oraz wysoki stosunek sygnału do szumu, mogą dostarczyć cennych informacji dla badaczy. 
Tutaj oferujemy kompleksowy protokół przeznaczony do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez utrwalanie tkanki jelitowej, szwajcarskie przygotowanie rolki8, oraz barwienie immunologiczne. Kładąc nacisk na wytyczne dotyczące zachowania integralności jelita, protokół ma na celu zapewnienie naukowcom solidnej metodologii w celu poprawy jakości i wiarygodności badań obrazowania immunofluorescencyjnego. Staraliśmy się również wykorzystać opłacalne zasoby, w tym bibułę filtracyjną i domowe pobieranie antygenu, roztwory blokujące i rozcieńczalniki przeciwciał, aby protokół był bardziej dostępny dla laboratoriów, które mogą mieć ograniczone fundusze. Podobnie jak w przypadku wszystkich protokołów eksperymentalnych, badacze powinni zoptymalizować obecny protokół w oparciu o swoje podejście eksperymentalne i obszary zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Celulozowa bibuła filtracyjna</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Gruby papier Whatman</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane z ładunkiem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki preparacyjne rozmiar 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice do zamrażania</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Podgrzewacz do slajdów</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>64111-04</td><td>Odczynnik czyszczący</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Duże kasety</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minutien</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>precyzyjnej NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący Mysz na myszy</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Blok myszy na myszy</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>PCNA</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Szybkowar</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong złoty antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Medium</td></tr><tr><td>montażowe Kleszcze odwrotnego działania</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na slajdy</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia szkiełek</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Naczynia odporne na rozpuszczalniki i metalowa rama</td></tr><tr><td>Małe kasety</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwodny</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Bufor blokujący</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

Jelito to złożony organ złożony z jelita cienkiego i grubego. Jelito cienkie można dalej podzielić na dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte. Każdy obszar anatomiczny jelita ma unikalną funkcję, która znajduje odzwierciedlenie w różnicach w strukturze komórkowej. Badanie zmian w jelicie wymaga dogłębnej analizy różnych regionów tkanek i zmian komórkowych. Aby zbadać jelito i uwidocznić duże kawałki tkanki, naukowcy powszechnie używają techniki znanej jako jelitowe szwajcarskie bułeczki. W tej technice jelito jest dzielone na każdy obszar anatomiczny i mocowane w płaskiej orientacji. Następnie tkanka jest starannie zwijana i przetwarzana w celu zatopienia w parafinie. Prawidłowe utrwalenie i orientacja tkanek jest często pomijaną techniką laboratoryjną, ale ma kluczowe znaczenie dla dalszej analizy. Ponadto niewłaściwe szwajcarskie zwijanie tkanki jelitowej może uszkodzić delikatny nabłonek jelitowy, prowadząc do złej jakości tkanek do barwienia immunologicznego. Zapewnienie dobrze utrwalonej i prawidłowo zorientowanej tkanki z nienaruszonymi strukturami komórkowymi jest kluczowym krokiem, który zapewnia optymalną wizualizację komórek jelitowych. Przedstawiamy opłacalną i prostą metodę wytwarzania szwajcarskich bułeczek, która obejmuje wszystkie odcinki jelita w jednym bloku zatopionym w parafinie. Opisujemy również zoptymalizowane barwienie immunofluorescencyjne tkanki jelitowej w celu zbadania różnych aspektów nabłonka jelitowego. Poniższy protokół zapewnia naukowcom kompleksowy przewodnik po uzyskiwaniu wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez utrwalanie tkanki jelitowej, technikę Swiss-roll i barwienie immunologiczne. Zastosowanie tych wyrafinowanych podejść pozwala zachować skomplikowaną morfologię nabłonka jelitowego i sprzyja głębszemu zrozumieniu fizjologii i patobiologii jelit.

Przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E), zgodnie z wcześniejszym opisem12. Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanej metody, preparaty typu „Swiss roll” jelita obejmowały wszystkie trzy segmenty jelita cienkiego oraz jelito grube na jednym szkiełku. Umieszczenie całego jelita na jednym szkiełku pozwala badaczom na analizę zmian we wszystkich częściach jelita i redukuje koszty sekcjonowania oraz odczynników do barwienia (Rycina 1). Ponadto jednoczesne narażenie wszystkich segmentów jelit na te same roztwory podczas immunostainingu pomaga zapewnić dokładne wyniki. Mikrografia H&amp;E wykazuje zachowaną architekturę jelit we wszystkich częściach jelita cienkiego i grubego (Rycina 2). Pomiar kosmków dwunastnicy nie wykazał istotnych różnic w wysokości kosmków w nieotwartej tkance jelita w porównaniu z metodą „Swiss roll”, co sugeruje, że otwarcie jelita nie zaburza architektury tkanki (Rycina 2D). Immunostaining preparatów „Swiss roll” jelita ukazuje poszczególne warstwy jelita, a także całą oś kosmek-krypty. Obrazy fluorescencyjne wykazują niski poziom tła z barwienia przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi oraz wyraźnie przedstawiają poszczególne komórki obecne w nabłonku. Rycina 3 przedstawia morfologię różnych segmentów jelita oraz barwienie komórek kubkowych (komórki MUC2 dodatnie)13, błony apikalnej (γ-ACTIN)14, błony bocznej komórek nabłonkowych (E-CADHERIN)15 oraz jąder komórkowych. Niniejszy protokół nadaje się do identyfikacji wielu różnych przedziałów komórkowych, w tym komórek proliferujących (PCNA)16, śródmiąższu (LAMININ; Rycina 4A)17, domeny lizosomalnej (LAMP1)14 oraz nabłonka (β-CATENIN; Rycina 4B)18.
<img alt="Proces przygotowania i zatapiania jelit; zwijanie tkanki pęsetą; metoda zatapiania w parafinie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przygotowania i przetwarzania tzw. szwajcarskich roladek jelitowych (Swiss rolls). (A) Segmenty jelit są przepłukiwane strzykawką zawierającą PBS, a następnie myte w PBS. (B) Wilgotna tkanka jelitowa jest następnie umieszczana na suchej papierze filtracyjnym. (C) Jelito jest rozcinane wzdłużnie na papierze filtracyjnym i (D) delikatnie rozkładane. (E) Na rozcięte jelito nakłada się kawałek papieru filtracyjnego, a następnie jelito jest delikatnie dociskane między arkuszami papieru i spinane zszywkami. Segmenty jelit są utrwalane przez noc, a następnie (F) zwijane za pomocą pęsety. (G) Jelito jest delikatnie uwalniane z pęsety o odwrotnym działaniu i (H) przyjmuje formę rozety. (I, J) Tkanka jelitowa jest przypinana i umieszczana w dużej kasecie. (K) Wszystkie cztery segmenty jelit są umieszczane w tej samej kasecie w celu przetworzenia tkanki i zatopienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia jelita cienkiego, przekroje tkankowe, kosmki jelitowe, analiza histologiczna, porównanie wykresów danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Barwienie hematoksyliną i eozyną wszystkich czterech odcinków jelita. (A) Skanowanie kafelkowe demonstruje możliwość wizualizacji całego jelita na jednym preparacie z poszczególnymi „szwajcarskimi rolkami” (Swiss rolls) dwunastnicy, jelita czczego, jelita krętego i okrężnicy. (B) Mikrografia jelitowej „szwajcarskiej rolki” oraz (C) wstawka w większym powiększeniu ukazująca architekturę kosmków i krypt. (D) Ilościowe oznaczenie długości kosmków jelita cienkiego nie wykazuje istotnej różnicy między tkanką zwiniętą w „szwajcarską rolkę” a tkanką niezwinniętą. Paski skali = 1000 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja tkanki jelitowej; białka E-Cadherin, MUC2, γ-Actin; obrazy złożone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Barwienie immunofluorescencyjne wszystkich czterech odcinków jelita. U dorosłych myszy kontrolnych szczepu C57BL/6J przeprowadzono immunostaining jąder komórkowych (cyjan), markera błony bocznej E-CADHERIN (zielony), komórek kubkowych zidentyfikowanych za pomocą MUC2 (żółty) oraz markera brzeżka szczoteczkowego apikalnego γ-ACTIN (magenta). Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja tkanki jelitowej; obrazy A i B pokazują jądra, PCNA, lamininę, β-kateninę i LAMP1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Barwienie immunofluorescencyjne jelita. (A) Reprezentatywna mikrofotografia barwienia immunofluorescencyjnego jelita myszy uwidacznia jądra (cyjan), komórki proliferujące, PCNA (zielony) oraz blaszka właściwa, LAMININ (magenta). (B) Obraz immunofluorescencyjny identyfikujący jądra (cyjan), marker błony komórkowej β-CATENIN (zielony) oraz marker lizosomów LAMP1 (magenta) w jelicie. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Jelito jest niezbędne do trawienia i wchłaniania. Każdy region - dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, okrężnica - pełni różne funkcje dzięki unikalnym strukturom komórkowym. Studiowanie fizjologii jelit wymaga skrupulatnej analizy tkanek. Protokół ten określa utrwalanie i przetwarzanie tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki walcowania, zapewniając dokładne barwienie immunologiczne poprzez odpowiednie zachowanie i orientację tkanki.

Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu, jak funkcjonuje przewód pokarmowy i jak na te funkcje wpływają różne stany patologiczne. Jesteśmy zainteresowani poznaniem odpowiedzi różnych komórek nabłonka jelitowego na różne stany, takie jak infekcje i stany zapalne, otyłość i mutacje genetyczne. Znaczenie swoistości przeciwciał staje się coraz bardziej oczywiste.Jednak wpływ utrwalania tkanek, konserwacji i standaryzowanych metod barwienia jest niedoceniany w tej dziedzinie. Spójne i solidne barwienie immunofluorescencyjne w dużej mierze zależy od jakości zachowania, przetwarzania i orientacji tkanek, które występują na początkowych etapach gromadzenia danych. Protokół ten zapewnia prostą i skuteczną metodę badania różnych pytań dotyczących biologii i fizjologii komórek jelitowych.Nasze laboratorium korzysta obecnie z tych protokołów, aby lepiej zrozumieć rolę różnych typów komórek jelitowych w utrzymaniu homeostazy i ograniczaniu stanu zapalnego. Protokół ten umożliwia szczegółową wizualizację wszystkich obszarów jelita myszy w jednym bloku zatopionym w parafinie. Pozwala to zaoszczędzić pieniądze na parafinie i usługach zatapiania parafiny, ilości czasu potrzebnego na sekcjonowanie i odczynników.Jest również wysoce odtwarzalny przy użyciu różnych przeciwciał. Aby rozpocząć, przymocuj dużą końcówkę pipety P200 do 10-mililitrowej strzykawki i napełnij ją PBS. Za pomocą kleszczy włóż końcówkę strzykawki do otworu odcinka jelita wyizolowanego od myszy poddanej eutanazji.Przytrzymaj odcinek jelita na strzykawce za pomocą kleszczyków i delikatnie przepłucz z szybkością około 50 mikrolitrów na sekundę, aby usunąć zawartość. Zbierz zawartość jelit do pustej łodzi do ważenia. Następnie połóż mokry segment jelita w linii prostej na pasku suchej etykietowanej celulozowej bibuły filtracyjnej.Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć jelito wzdłuż linii krezki około 5 milimetrów na raz. Użyj dolnej krawędzi nożyczek lub kleszczy, aby położyć pociętą tkankę płasko na bibule filtracyjnej. Teraz umieść kolejny kawałek bibuły filtracyjnej na segmencie jelita, aby zapobiec jego zwijaniu się lub utracie kształtu podczas utrwalania.Aby zabezpieczyć chusteczkę na miejscu, zszyj krawędzie bibuły filtracyjnej, unikając zszywania tkanki. Zanurz tkanki w 10% normalnie buforowanej formalinie. Delikatnie wyjmij górny kawałek bibuły filtracyjnej dotykający luminalnej strony jelita.Użyj kleszczy, aby ostrożnie oderwać jelito od dolnego kawałka bibuły filtracyjnej przed jej wyrzuceniem. Następnie umyj tkankę w PBS trzy razy, aby usunąć formalinę z tkanki. Używając kleszczy o odwrotnym działaniu, podnieś kawałek jelita wzdłuż krótszej krawędzi stroną świetlną skierowaną do góry i obróć kleszcze, aby zwinąć tkankę.Umieść chusteczkę w łodzi do wysadzania suchym ciężarem. Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą kleszczy w jednej ręce. Ostrożnie otwórz kleszcze o odwrotnym działaniu i uwolnij tkankę, używając innych kleszczy do usunięcia tkanki z kleszczy o odwrotnym działaniu.Włóż szpilkę do wycinku w rozmiarze 00 do tkanki. Użyj nożyc do drutu, aby usunąć ostrą końcówkę kołka. Po zrolowaniu wszystkich próbek umieść wszystkie cztery rolki tkanek w tej samej kasecie i włóż kasetę do procesora tkanek.Na stacji zatapiania umieść niewielką ilość parafiny w formie. Wyjmij cztery szwajcarskie rolki z kasety i umieść je w osobnej formie, układając je tak płasko, jak to możliwe. Dodaj więcej parafiny, aby wypełnić formę.Przenieś formę na zimną płytę i upewnij się, że wszystkie szwajcarskie bułki leżą płasko na dnie formy. Umieść oznaczoną małą kasetę na formie. Gdy wosk zastygnie, wyjmij blok z formy.Na początek przygotuj nawilżoną komorę, biorąc duże pudełko na suwak i zdejmując tekturową pokrywę przyklejoną do pokrywy. Umieść wilgotne ręczniki papierowe pionowo u podstawy pudełka na prowadnice, upewniając się, że leżą płasko. Przygotować szkiełko do barwienia przez deparafinowanie, ponowne nawodnienie, pobranie antygenu i mycie.Wyjmij szkiełko z PBS i zetrzyj nadmiar PBS, omijając tkankę. Za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj pudełko wokół tkanki, aby utworzyć barierę. Umieść prowadnicę konturową poziomo na adamp ręczniki papierowe.Dodaj około 100 mikrolitrów buforu blokującego, aby pokryć tkankę. Zamknij wilgotną komorę i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Następnie delikatnie stuknij roztwór blokujący.Natychmiast dodaj przygotowany blok myszy na myszy, aby przykryć tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Pod koniec inkubacji wyjąć szkiełka z nawilżonej komory i umieścić je bezpośrednio w stojaku na szkiełka zanurzonym w PBS. Następnie usuń slajdy z PBS.Delikatnie strzepnij nadmiar PBS i umieść je poziomo z powrotem w nawilżonej komorze. Dodaj odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe, które są przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę. Po wyjęciu szkiełek z wilgotnej komory delikatnie stuknij pierwotne przeciwciała i umieść szkiełka w stojaku na szkiełka zanurzonym w PBS na pięć minut.Po wyjęciu szkiełek z PBS i strząśnięciu nadmiaru PBS, umieść je poziomo z powrotem w nawilżonej komorze. Dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe fluorofory lub sprzężone przeciwciała pierwszorzędowe będące przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę. Następnie dodaj odpowiednio rozcieńczony hoist bezpośrednio na tkankę przed inkubacją w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie umieść szkiełka w nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym PBS na pięć minut w ciemności. Usuwaj jeden slajd na raz, pozostawiając pozostałe slajdy zanurzone w PBS w ciemności. Po usunięciu nadmiaru PBS dodaj jedną lub dwie krople pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu do środka tkanki.Chwyć czyste szkiełko nakrywkowe za krawędzie i powoli opuść je na szkiełko pod kątem 45 stopni. Zaczynając od środka tkanki, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe dwoma palcami. Przymocuj przeciętą, niefiltrowaną pipetę P200 do końcówki pipety serologicznej podłączonej do próżni.Podążając za krawędziami szkiełka nakrywkowego, użyj odkurzacza, aby usunąć nadmiar medium montażowego. W nowym pudełku na szkiełka połóż szkiełko poziomo płasko, a następnie pozostaw do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej. Obrazy mikroskopowe wykazały morfologię różnych segmentów jelita i barwienie komórek kubkowych, błony wierzchołkowej, błony bocznej komórek nabłonkowych i jąder.Barwienie immunofluorescencyjne jelita uwidoczniło wiele różnych przedziałów komórkowych, w tym komórki proliferacyjne, śródmiąższ, domenę lizosomalną i nabłonek.

optimized-protocol-for-intestinal-swiss-rolls-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film ilustruje opartą na immunofluorescencji metodę wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jelita czczego myszy. W obrębie kosmków jelitowych kolokalizacja zielonej fluorescencji na końcu światła z wydłużoną masą czerwonych korzonków wskazuje na obecność komórek kępkowych.

Oparta na immunofluorescencji metoda wizualizacji komórek kępek w kriosekcjach jelita drogowego

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Prezentujemy protokoły izolacji struktur 3D jelit z organoidów in vivo i in vitro w macierzy podstawnej, a także szczegółowo opisujemy różne protokoły utrwalania i barwienia zoptymalizowane pod kątem znakowania immunologicznego białek mikrotubulowych, centrosomalnych i łączących, a także markerów komórkowych, w tym białka komórek macierzystych Lgr5.

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Kuga i in. odkryli, że przeciwciała specyficzne dla statusu fosforylacji przeciwko białku wiążącemu aktynę, które fosforyluje się w tyrozynie 1798 (pY1798), mogą być używane do znakowania komórek kępek (TC). Protokół ten umożliwia solidną wizualizację TC przy użyciu barwienia immunofluorescencyjnego swobodnie pływających kriosekcji jelita czczego z przeciwciałami pY1798.

Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Protokół ten określa metodę immunobarwienia całego żołądka, zmodyfikowaną na podstawie techniki "Swiss roll" pierwotnie opracowanej dla jelita myszy.

Ulepszone mapowanie przestrzenne warstw mięśni żołądka myszy z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Swiss Roll

Naucz się techniki szwajcarskiego zwijania jelit i immunofluorescencyjnego barwienia tkanek zatopionych w parafinie u myszy. Ta metoda umożliwia szczegółową wizualizację wszystkich regionów jelita w jednym bloku.

Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie

Przeglądaj więcej filmów