Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Nasze badania koncentrują się na rozwoju terapii przeciwnowotworowych z wykorzystaniem naszej platformy dostarczania nanocząstek tlenku żelaza. Zaletą naszej nanoplatformy jest jej zdolność do przekraczania bariery krew-mózg i kumulowania się w guzie, dostarczając środki terapeutyczne. Celem jest dodanie do małego arsenału dostępnych terapii glejaka.

Bariera krew-mózg stanowi wyzwanie w dostarczaniu leków do glejaka. Wiele związków nie jest w stanie przekroczyć bariery, co sprawia, że ogólnoustrojowe podawanie leków do leczenia glejaka jest prawie niemożliwe. Obecnie dostępne ogólnoustrojowe metody leczenia tej choroby mają wiele toksyczności poza celem.

Nasza nanoplatforma pokonuje to ograniczenie, pomagając terapeutycznym cząsteczkom przenikać przez barierę krew-mózg. Dostarczanie terapeutycznego oligonukleotydu do miejsca guza może być monitorowane za pomocą różnych metod obrazowania, co czyni go narzędziem o znaczeniu klinicznym. Modułowy charakter nanoplatformy pozwala na opracowywanie terapii dostosowanych do indywidualnych potrzeb, oferując elastyczność w rozwiązywaniu problemów związanych z ogromną heterogenicznością molekularną podtypów glejaka.

To podejście medycyny precyzyjnej, z doskonałą penetracją bariery krew-mózg, pozwala nam rozszerzyć ograniczone opcje terapeutyczne. Na początek zważ mysz i oblicz objętość nanocząstki magnetycznej, anty-mikroRNA-10b, którą należy podać w dawce 20 miligramów żelaza na kilogram w glejaku wielopostaciowym. Bez wprowadzania pęcherzyków należy przygotować strzykawkę o rozmiarze 28 z dawką nanocząstek magnetycznych anty-microRNA-10b.

Wysterylizuj ogon myszy chusteczką z 70% izopropanolem. Po wysuszeniu obróć ogon, aby ustawić boczne żyły ogonowe na szczycie ogona. Następnie włóż igłę do ogonka i odciągnij tłok, aby wytworzyć podciśnienie, kontynuuj wprowadzanie igły, aż krew dostanie się do strzykawki.

Powoli wstrzyknąć roztwór nanocząstek magnetycznych i wycofać igłę po całkowitym podaniu. Uciskać miejsce wstrzyknięcia gazą, aż do ustania krwawienia. 24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstki magnetycznej anty-microRNA-10b zważ mysz i oblicz objętość D-Lucyferyny do podania w dawce 150 miligramów na kilogram.

Przygotować strzykawkę o rozmiarze 28 rozmiarów, której objętość chroni roztwór przed bezpośrednim światłem. Po znieczuleniu delikatnie potrząśnij myszą, aby uniknąć dalszego uszkodzenia pola operacyjnego i wstrzyknij dawkę D-Lucyferyny dootrzewnowo. Poczekaj, aż mysz się zregeneruje i odczekaj 10 minut przed obrazowaniem.

Po przygotowaniu systemu obrazowania in vivo lub skanera IVIS należy położyć czarną matę o niskiej fluorescencji na stoliku do obrazowania i skonfigurować matrycę stożka nosowego do obrazowania. W oprogramowaniu kliknij kreatora obrazowania, a następnie wybierz obrazowanie bioluminescencyjne, a następnie otwórz filtr. Na następnym ekranie wybierz temat obrazowania i pole widzenia.

Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na skanerze IVIS. Kliknij przycisk Uzyskaj sekwencję i korzystając z ustawień automatycznej ekspozycji z minimalnym progiem sygnału wynoszącym 3 000 zliczeń, uchwyć obraz w celu lokalizacji komórek glejaka U251 znakowanych lucyferazy. Następnie w kreatorze obrazowania wybierz Fluorescencja, a następnie Filtrowana para z epi-iluminacją.

Na następnym ekranie wybierz sondę CY5.5. Wybierz obiekt obrazowania i pole widzenia. Korzystając z ustawień automatycznej ekspozycji z minimalnym progiem sygnału wynoszącym 6 000 zliczeń, uchwyć obraz w celu lokalizacji nanocząstek magnetycznych anty-microRNA-10b.

Umieść znieczuloną mysz na brzuchu na łóżku do rezonansu magnetycznego. Unieruchom i ustaw głowę do skanowania za pomocą paska do gryzienia i nauszników. Zainstaluj nasmarowaną sondę temperatury doodbytniczej i upewnij się, że działa monitorowanie oddychania i temperatury.

Umieść cewkę mózgu myszy nad głową, dopasowując kołki na łożu myszy do otworów w cewce, a następnie przyklej cewkę na miejscu, aby zmniejszyć ruch podczas skanowania. Umieść małą podkładkę cyrkulacyjną ciepłej wody na górze myszy, aby utrzymać temperaturę ciała. Przesuń mysz i stół obrazowania w odpowiednie miejsce do skanowania.

W oprogramowaniu do akwizycji rozpocznij krok konfiguracji chybotania, aby dostroić i dopasować cewki MRI. Upewnij się, że ścieżka jest wyśrodkowana i tak głęboko, jak to możliwe. Uzyskaj trójpłaszczyznowy skan lokalizacyjny mózgu.

Korzystając z następujących parametrów, uzyskaj dwuwymiarowe skany ważone T2 w celu wykrycia guza. Uzyskaj mapę B0 całego mózgu, aby obliczyć zlokalizowaną podkładkę za pomocą narzędzia Map Shim. Użyj trójwymiarowych obrazów ważonych T2*, aby zobrazować nanocząstki.

Przy następujących parametrach należy uzyskać mapę T2*, aby uzyskać dalsze obrazowanie nanocząstek, wykorzystując dwuwymiarowy obraz ważony T2 jako odniesienie do umieszczenia skanu nad guzem. Uzyskuj 10 obrazów pozytywnego echa z pięciomilisekundowym odstępem czasu echa. W eksperymentalnym punkcie końcowym zważyć mysz i obliczyć objętość D-Lucyferyny do podania w dawce 150 miligramów na kilogram.

Obrazowanie bioluminescencyjne na żywo należy przeprowadzić 10 minut po wstrzyknięciu, zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieść szalkę Petriego z wyciętym mózgiem myszy poddanej eutanazji w skanerze IVIS. Zobrazuj mózg zarówno za pomocą modalności bioluminescencji, jak i fluorescencji, używając tych samych ustawień akwizycji, co obrazowanie in vivo.

Sygnały fluorescencji i bioluminescencji CY5.5 w nanocząstkach magnetycznych, którym wstrzyknięto anty-mikroRNA-10b, wykazały wyraźną kolokalizację, wskazując na dostarczenie nanocząstek do guza, podczas gdy myszy kontrolne nie wykazały sygnału fluorescencji. Obrazowanie fluorescencyjne ex vivo wykazało lokalizację nanocząstek w głównych narządach klirensowych, takich jak wątroba i nerki. Charakterystyczny spadek sygnału MRI zależnego od T2 pokazuje potencjał nanocząstek magnetycznych anty-mikroRNA-10b jako środka kontrastowego MRI do przekraczania bariery krew-mózg i jej akumulacji w obszarze guza.

Na początek wyjmij szybko zamrożony mózg przechowywany w związku o optymalnej temperaturze cięcia z magazynu o temperaturze 80 stopni Celsjusza i umieść go w komorze kriostatu. Pozwól próbkom ogrzać się do temperatury w komorze. Za pomocą obosiecznej maszynki do golenia przeciąć mózg w miejscu wstrzyknięcia.

Zamontuj próbkę na tarczy próbki, używając niewielkiej ilości optymalnej temperatury cięcia. Zastosuj wystarczający nacisk za pomocą schłodzonego ciężarka wewnątrz komory, aby stabilnie zamocować próbkę. Przesuń zamontowaną próbkę i krążek próbki na głowicę próbki.

Przytnij tkankę na żądaną głębokość, wykonując odcinki o długości 20 mikrometrów. Po osiągnięciu żądanej głębokości wyreguluj kriostat tak, aby pobierał próbki o długości od pięciu do siedmiu mikrometrów. Następnie zamontuj sekcje na wstępnie oznaczonym szkiełku.

Zamocuj skrawki w 4% paraformaldehydzie na 15 minut. Po utrwaleniu przepłukać szkiełko trzykrotnie DPBS. Na szkiełko nanieść 40-mikrolitrową kroplę podłoża montażowego zawierającego DAPI.

Ostrożnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu podłoża. Pod mikroskopią fluorescencyjną uwidocznij tkankę za pomocą DAPI i CY5.5 W mikroskopii fluorescencyjnej ex vivo tkanek nowotworowych obserwowany sygnał fluorescencyjny CY5.5 potwierdził dostarczenie nanocząstek magnetycznych.