Name: Badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Poznaj metodę badania interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów. Protokół umożliwia wzbogacanie par bakteryjno-grzybowych z różnych podłoży środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Science Focus Area Grant z Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE), Biological and Environmental Research (BER), Biological System Science Division (BSSD) w ramach grantu numer LANLF59T.

<ol><li>Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+constraints+affecting+bacterial+habitats+and+activity+in+unsaturated+porous+media+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Water+Resour%22%5BJournal%5D)">Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media - A review.</a> Adv Water Resour. 30 (6), 1505-1527 (2007).</li>
<li>Kohlmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+fungal+highway%3A+Mobilization+of+pollutant-degrading+bacteria+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Taking the fungal highway: Mobilization of pollutant-degrading bacteria by fungi.</a> Environ Sci Technol. 39 (12), 4640-4646 (2005).</li>
<li>Simon, A., Hervé, V., Al-Dourobi, A., Verrecchia, E., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+situ+inventory+of+fungi+and+their+associated+migrating+bacteria+in+forest+soils+using+fungal+highway+columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">An in situ inventory of fungi and their associated migrating bacteria in forest soils using fungal highway columns.</a> FEMS Microbiol Ecol. 93 (1), 217(2017).</li>
<li>Wick, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fungal+hyphae+on+the+access+of+bacteria+to+phenanthrene+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Effect of fungal hyphae on the access of bacteria to phenanthrene in soil.</a> Environ Sci Technol. 41 (2), 500-505 (2007).</li>
<li>Bravo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+oxalotrophic+bacteria+able+to+disperse+on+fungal+mycelium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of oxalotrophic bacteria able to disperse on fungal mycelium.</a> FEMS Microbiol Lett. 348 (2), 157-166 (2013).</li>
<li>Furuno, S., Remer, R., Chatzinotas, A., Harms, H., Wick, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mycelia+as+paths+for+the+isolation+of+contaminant-degrading+bacteria+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of mycelia as paths for the isolation of contaminant-degrading bacteria from soil.</a> Microb Biotechnol. 5 (1), 142-148 (2012).</li>
<li>Buffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+drops%3A+A+novel+approach+for+macro-+and+microscopic+analyses+of+fungal+mycelial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microlife%22%5BJournal%5D)">Fungal drops: A novel approach for macro- and microscopic analyses of fungal mycelial growth.</a> Microlife. 4, 042(2023).</li>
<li>Kuhn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+3D+printed+devices+to+investigate+active+and+passive+bacterial+dispersal+on+hydrated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and construction of 3D printed devices to investigate active and passive bacterial dispersal on hydrated surfaces.</a> BMC Biol. 20 (1), 203(2022).</li>
<li>Junier, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Democratization+of+fungal+highway+columns+as+a+tool+to+investigate+bacteria+associated+with+soil+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Democratization of fungal highway columns as a tool to investigate bacteria associated with soil fungi.</a> FEMS Microbiol Ecol. 97 (2), 003(2021).</li>
<li>Reasoner, D. J., Geldreich, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+enumeration+and+subculture+of+bacteria+from+potable+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (1), 1-7 (1985).</li>
<li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+interactive%2C+scalable%2C+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Vázquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMPeror%3A+A+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">EMPeror: A tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> Gigascience. 2 (1), 16(2013).</li>
<li>Li, P. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+the+democratization+of+the+genomics+revolution+with+a+fully+integrated+web-based+bioinformatics+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Enabling the democratization of the genomics revolution with a fully integrated web-based bioinformatics platform.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 67-80 (2017).</li>
<li>Eloe-Fadrosh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Microbiome+Data+Collaborative+Data+Portal%3A+An+integrated+multi-omics+microbiome+data+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The National Microbiome Data Collaborative Data Portal: An integrated multi-omics microbiome data resource.</a> Nucleic Acids Res. 50 (1), D828-D836 (2022).</li>
<li>Kans, J. Entrez Direct: E-utilities on the Unix Command Line. Entrez Programming Utilities Help. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK179288/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK179288/</a> (2024).</li>
<li>Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+3D+printing%3A+Approaches+and+bioapplications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functional 3D printing: Approaches and bioapplications.</a> Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).</li>
<li>Guttridge, C., Shannon, A., O'Sullivan, A., O'Sullivan, K. J., O'Sullivan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+3D+printing+resins+for+medical+applications%3A+A+review+of+marketed+intended+use%2C+biocompatibility+certification%2C+and+post-processing+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+3D+Print+Med%22%5BJournal%5D)">Biocompatible 3D printing resins for medical applications: A review of marketed intended use, biocompatibility certification, and post-processing guidance.</a> Ann 3D Print Med. 5, 100044(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+accuracy+and+precision+of+various+types+of+photo-curing+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Conf+Ser%22%5BJournal%5D)">Comparison of accuracy and precision of various types of photo-curing printing technology.</a> J Phys Conf Ser. 1549 (3), 032151(2020).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bacterial+and+fungal+growth+media%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Evolution of bacterial and fungal growth media.</a> Bioinformation. 11 (4), 182-184 (2015).</li>
<li>Liu, Y. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+amplicon+and+metagenomic+analysis+of+microbiome+data%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data.</a> Protein Cell. 12 (5), 315-330 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podczas generowania komponentów kolumny wybór drukarki 3D i materiału do druku może być modyfikowany w oparciu o dostępność i pożądane właściwości materiału17,18. Biokompatybilność, tekstura powierzchni, możliwość sterylizacji w autoklawie, zdolność do drukowania drobnych detali i względna przezroczystość zostały wzięte pod uwagę przy wyborze materiałów przez naszą grupę. Należy również wziąć pod uwagę inne cechy, takie jak porowatość, hydrofobowość, parametry druku itp. Różne żywice zostały przetestowane (patrz Tabela materiałów) przed ostatecznym wyborem, a wiele biokompatybilnych materiałów będzie działać do drukowania tych kolumn. Materiał wybrany do budowy elementów kolumny określi, jakie podejścia do czyszczenia, utwardzania i sterylizacji należy zastosować. Nie wszystkie materiały będą nadawały się do sterylizacji w autoklawie i może być wymagane światło ultrafioletowe, wybielacz lub inne techniki sterylizacji, w zależności od instrukcji producenta materiału. Niektóre techniki sterylizacji lub czyszczenia mogą również uszkodzić lub nie być kompatybilne z wybranym materiałem, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na te informacje od producenta materiału. W przypadku drukarek 3D niektóre kwestie obejmują czas drukowania, kompatybilność materiałów, rozmiar platformy roboczej, technologię drukowania i koszt19. Wydrukowane w 3D elementy kolumn mogą być delikatne i mogą pęknąć, jeśli będą obsługiwane zbyt mocno. Gwinty pierścienia i nasadek mogą nie zawsze być dokładnie wyrównane, dlatego zalecamy wydrukowanie i wysterylizowanie dodatkowych elementów przed etapem montażu lub wykonanie wstępnego drukowania w celu przetestowania, jak wybrane parametry i materiał wpływają na gwintowanie. Specyfikacje projektowe dotyczące gwintowania w nasadkach i pierścieniu mogą wymagać dostosowania w zależności od wybranego materiału do druku 3D. Wymiary, złożoność sieci i inne cechy fizyczne można modyfikować w oprogramowaniu do projektowania CAD przed drukowaniem. Zgodnie z projektem, sama kolumna ma 4 cm wysokości, a konstrukcja kratowa w środku kolumny ma komórkę elementarną o wielkości 2 mm, średnicę rozpórki 0,5 mm, a cała wysokość kraty wynosi 22 mm9. Parametry te można dostosować, jeśli badacz chce na przykład uzyskać większą lub bardziej złożoną strukturę kratową. Ogólnie rzecz biorąc, drukowana w 3D produkcja tych urządzeń umożliwia elastyczność projektowania, zapewniając jednocześnie, że pojedynczy projekt może być używany w ustandaryzowany sposób w różnych organizacjach i grupach, a nawet używanyjako narzędzia do nauczania w klasie.
Kilka kroków w protokole może wymagać rozwiązywania problemów w zależności od środowiska lub konfiguracji eksperymentalnej. Kolumny autostradowe grzybów nie są zbyt skuteczne w warunkach niskiej wilgotności, ponieważ korki pożywki szybko wysychają, zanim ułatwią rozwój grzybów, co może ograniczyć czas trwania eksperymentów w tych środowiskach (ryc. 5A). Techniki, które poprawiły skuteczność kolumn w środowiskach o niskiej wilgotności, obejmują sztuczne zwiększanie wilgotności poprzez dodawanie wilgoci do podłoża i/lub uszczelnianie kolumny i podłoża w wtórnym pojemniku ze źródłem wody (np. małym pojemnikiem z czystą wodą). Kształt klepsydry i struktura siatki zostały włączone, aby zapobiec samemu ruchowi bakterii (bez tworzenia autostrady grzybów), jeśli w środowiskach o wysokiej wilgotności miałaby powstać kondensacja. Szybko rosnące grzyby mogą przerastać powierzchnię celu i podłoża przynęty oraz wystawać poza górną lub dolną część kolumny (ryc. 5C). Skrócenie czasu inkubacji grzyba przynęty lub czasu trwania eksperymentu może zminimalizować lub wyeliminować ten przerost. Ponadto ograniczeniem tych urządzeń jest to, że szybko rosnące grzyby w podłożu będącym przedmiotem zainteresowania mogą ograniczać kolonizację przynęty i pożywki docelowej przez wolno rosnące grzyby, potencjalnie wpływając na to, które interakcje autostradowe są obserwowane. Niektóre grzyby, zwłaszcza wolniej rosnące grzyby, mogą nie kolonizować podłoża przynętowego w sposób, który pozwala im przerosnąć przez korek agarowy i do struktury sieciowej. Jeśli w otoczeniu jest wystarczająca wilgotność, można użyć cieńszych zatyczek agarowych, aby pobudzić wzrost w sieci po kolonizacji zatyczki agarowej na przynętę. Pożywki można wybrać w zależności od tego, czy badacz chce dokonać selekcji pod kątem wzrostu grzybów czy bakterii, ale może to również ograniczyć hodowlę do organizmów, które preferują ten typpożywki 20. Jeśli nie obserwuje się wzrostu w pożywce docelowej, może być konieczne zaszczepienie podłoża przynętowego lub substratu grzybem, o którym wiadomo, że tworzy autostrady grzybowe. 
W ramach tych eksperymentów można przeprowadzić sekwencjonowanie metagenomiczne lub amplikonowe, a obie te strategie mają swoje własne ograniczenia i mocnestrony 21. Sekwencjonowanie metagenomiczne jest idealne do uzyskania dodatkowych informacji genomowych o drobnoustrojach. Jednak odzyskiwalna ilość kwasów nukleinowych bezpośrednio z pożywki docelowej może być bardzo niska, co może wymagać zastosowania sekwencjonowania amplikonów lub innych metod amplifikacji przed sekwencjonowaniem. Biblioteki sekwencjonowania amplikonów muszą być przygotowywane oddzielnie (16S i ITS), a metoda ta nie ma rozdzielczości taksonomicznej i ogranicza wszelkie oceny cech genomu lub potencjału funkcjonalnego, które można osiągnąć za pomocą sekwencjonowania metagenomicznego. Metody sekwencjonowania bezpośredniego z wtyczek mogą być preferowane w przypadkach, gdy drobnoustroje nie są w stanie być hodowane. Zaleca się, aby wtyczki były podzielone na wiele sekcji, aby umożliwić zarówno podejście do hodowli, jak i sekwencjonowania.
Zaletą tych urządzeń jest to, że mogą być używane zarówno w laboratorium, jak i w terenie. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby kolumny na polu mogły pozostać w pozycji pionowej i były chronione przed zwierzętami i zakłóceniami środowiskowymi, które mogłyby zakłócić ich ustawienie. Kolumny nie zostały jeszcze przetestowane w pozycji poziomej, w pozycji, w której są całkowicie pokryte podłożem, i nie były testowane w środowiskach, które są narażone na znaczne opady deszczu lub śniegu. Jak wspomniano powyżej, struktura kratowa została zaprojektowana tak, aby zminimalizować prawdopodobieństwo przemieszczenia się bakterii na podłoże docelowe w środowiskach o wysokiej wilgotności. Możliwe jest jednak, że gdyby kolumna była wystawiona na działanie większych objętości wody i ta woda całkowicie nasyciła kolumnę, ruch bakterii byłby ułatwiony w całej kolumnie niezależnie od obecnych autostrad grzybów. W przypadku eksperymentów laboratoryjnych kolumny mogą być używane w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, małych mikrokosmosach substratów, w glebie otaczającej rośliny doniczkowe, w pudełkach lub w innych kontrolowanych systemach eksperymentalnych. Kolumny są z powodzeniem stosowane w glebie, ryzosferach i oborniku, a ich użyteczność można rozszerzyć na inne podłoża, w tym ściółkę z liści, szlam, piasek, śnieg, kompost itp. 
Kolumny autostrad grzybów umożliwiają szereg porównań w celu zrozumienia tego fenotypu BFI w różnych typach próbek. Porównanie składu społeczności między przynętą a pożywką docelową może wskazać, które bakterie mogą wykorzystywać autostrady grzybów, a które grzyby mogą służyć jako potencjalne autostrady9. Jeśli stosuje się sekwencjonowanie metagenomu, można również zbadać cechy genomu, które odróżniają organizmy od przynęty od pożywki docelowej. Możliwe jest również porównanie pożywek docelowych z kolumn umieszczonych na różnych podłożach (np. gleba kontra obornik) lub umieszczonych na tym samym podłożu w różnych warunkach (np. temperatura lub wilgotność). Ogólnie rzecz biorąc, kolumny autostrad grzybów rozszerzają możliwości poprzednich metod badania tej formy BFI i umożliwiają szeroko zakrojone badania tych interakcji, które kształtują dynamikę przestrzenną złożonych mikrobiomów środowiskowych.

Interakcje bakteryjno-grzybowe (BFI) są niezwykle ważne w kształtowaniu strukturalnych, przestrzennych i funkcjonalnych właściwości mikrobiomów środowiskowych. Na przykład wzrost i ekspansja grzybów strzępkowych lub innych mikroorganizmów strzępkowych podobnych do grzybów generuje sieć biologiczną, która może funkcjonować jako "autostrada" ułatwiająca przemieszczanie się innych mikroorganizmów, takich jak bakterie. Niejednorodność i niespójne nasycenie w podłożach środowiskowych mogą utrudniać ruchliwość bakterii; Bakterie mogą jednak korzystać z tych autostrad, aby ułatwić dostęp do dodatkowych obszarów środowiska 1,2. Interakcje te mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki przestrzennej społeczności drobnoustrojów. Do badania autostrad grzybowych zastosowano kilka technik i metod, jednak są one w dużej mierze ograniczone do badań laboratoryjnych 3,4.
W jednej metodzie opartej na płytkach duża część agaru jest usuwana ze środka szalki Petriego, tworząc szczelinę między dwiema wyspami agarowymi. Strzępki grzybów mogą pokonywać tę lukę, zapewniając kompatybilnym bakteriom możliwość przejścia z jednej wyspy agarowej na drugą5. Inne zmodyfikowane metody szalki Petriego obejmują odwrócone płytki, na których gleba jest umieszczana w pokrywie, dzięki czemu strzępki grzybów mogą rosnąć pionowo i kolonizować pożywkę bez bezpośredniego kontaktu, zapewniając środki do transportu bakterii 5,6. Niedawno opracowana metoda oparta na kropelkach pożywki wzrostowej może być stosowana do oceny selektywnego transportu strzępek bakterii w kierunku określonych profili składników odżywczych7. Mosty bakteryjne i urządzenia do szlaków zostały również wykorzystane do zbadania wpływu czynników abiotycznych na przemieszczanie się bakterii8. Chociaż do badania autostrad grzybowych wykorzystano kilka metod i technik, nadal istnieje zapotrzebowanie na znormalizowane urządzenia, które utrzymują sterylne mikrośrodowisko, jednocześnie promując tworzenie autostrad grzybowych ze złożonych substratów środowiskowych, takich jak obornik, gleba i ryzosfery.
Nasza grupa zaprojektowała wydrukowaną w 3D wersję kolumn drogowych z grzybami, w których grzyby mogą transportować bakterie z jednego końca na drugi9. Urządzenia te składają się z czterech drukowanych elementów: samej kolumny w kształcie klepsydry i złożonej wewnętrznej struktury kratowej, gwintowanego pierścienia i dwóch nasadek (dużej nasadki i małej nasadki), a także kawałka wysterylizowanej siatki nylonowej (rysunek 1). Zmontowana kolumna jest dodawana bezpośrednio do żądanego podłoża środowiskowego. Kolumna następnie umożliwia mikroorganizmom kolonizację pożywki agarowej, znanej jako korek pożywki "przynęta", która znajduje się na dnie kolumny i styka się z podłożem środowiskowym przez siatkę. Ten rozmiar siatki nylonowej wyklucza innych mieszkańców gleby, którzy mogą przenosić bakterie, ograniczając w ten sposób ruch bakterii w kolumnach do autostrad grzybów. Gdy ta zatyczka przynęty zostanie skolonizowana, grzyby strzępkowe mogą rozciągać się i rosnąć przez wewnętrzną siatkę w środku kolumny, która została zaprojektowana w celu stworzenia nienasyconego systemu przypominającego glebę (lub inne nienasycone media) i zminimalizowania potencjalnego zanieczyszczenia z pożywki przynętowej. Grzyby następnie rosną w kierunku i kolonizują docelową pożywkę na szczycie kolumny. Kolumny mogą być albo zaszczepione określonymi izolatami grzybów w celu przetestowania ich zdolności do transportu bakterii, albo mogą pozostać niezaszczepione, aby zidentyfikować, które grzyby z podłoża są zdolne do transportu bakterii. Organizmy, które dotrą do pożywki docelowej, mogą być dalej hodowane, izolowane i poddawane analizom sekwencjonowania (zarówno z czystych kultur, jak i ze społeczności mieszanych przy użyciu metod sekwencjonowania amplikonowego lub metagenomicznego). Ogólnie rzecz biorąc, kolumny zapewniają ustandaryzowaną, powtarzalną, wielokrotnego użytku i intuicyjną metodę badania autostrad grzybowych na różnych podłożach. Urządzenia te mogą być wykorzystywane do badań i jako narzędzie dydaktyczne w klasie, a w niniejszym dokumencie przedstawiamy instrukcje dotyczące korzystania z nich w oparciu o eksperymenty, które zostały przeprowadzone w przeszłości. Chociaż metoda ta ułatwia standaryzację protokołów, konstrukcja i konstrukcja urządzeń może być modyfikowana pod kątem innych zastosowań i dodatkowych podłoży.

<table><tbody><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>5622-7261</td><td>Probówki 50 ml do wykonywania eksperymentów kolumnowych w laboratorium</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 90 mm</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>08-757-099</td><td>Szalki Petriego do przygotowania agaru i do rozwoju mikroorganizmów</td></tr><tr><td>Drukarka 3D Asiga Freeform Pico Plus 39 z cyfrowym przetwarzaniem światła (DLP)</td><td>Asiga Niemcy</td><td>Dowolny kształt Pico Plus 39</td><td>Drukarka 3D służąca do generowania wsadów kolumn; możliwość użycia innych drukarek 3D</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Fisher Naukowy</td><td>LS40F20</td><td>Autoklaw stołowy do sterylizacji elementów kolumny</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>Fisher Naukowy</td><td>FB100600</td><td>Zlewka 600 ml do różnych zastosowań w całym protokole</td></tr><tr><td>Żywica bezbarwna Dental LT V2</td><td>Laboratoria formowe</td><td>RS-F2-DLCL-02</td><td>Alternatywna żywica do druku 3D, która została przetestowana</td></tr><tr><td>Żywica dentystycznego przewodnika chirurgicznego</td><td>Laboratoria formowe</td><td>RS-F2-SGAM-01</td><td>Służył do generowania kolumn omówionych w rękopisie; Zamiast tego materiału można zastosować inne żywice światłoczułe</td></tr><tr><td>Probówki DNA Low Bind 1,5 ml</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>13-698-791</td><td>Probówki używane do różnych preparatów, w tym ekstrakcji kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Środek konserwujący tarczę DNA/RNA</td><td>Badania Zymo</td><td>Czynnik chłodniczy R1100-50</td><td>Środek konserwujący stosowany przed ekstrakcją kwasami nukleinowymi</td></tr><tr><td>EDGE Bioinformatyka</td><td>Otwarte oprogramowanie; Opracowany przez Los Alamos National Laboratory (LANL)</td><td>N/a</td><td>Platforma bioinformatyczna do przetwarzania danych amplikonowych</td></tr><tr><td>Zestaw wirowy FastDNA do gleby</td><td>MP Biomedicals Sp. z o.o.</td><td>116560200-CF</td><td>Opcjonalny zestaw do ekstrakcji DNA do gleby</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Naukowy</td><td>10-300</td><td>Kleszcze, które można sterylizować</td></tr><tr><td>Żywica bezbarwna Formlabs BioMed</td><td>Laboratoria formowe</td><td>Przekaźnik RS-F2-BMCL-01</td><td>Alternatywna żywica do druku 3D, która została przetestowana</td></tr><tr><td>Drukarka 3D stereolitografia (SLA) Formlabs Form 3B+</td><td>Laboratoria formowe</td><td>Formularz 3B+</td><td>Alternatywna drukarka 3D</td></tr><tr><td>Żywica IBT Formlabs</td><td>Laboratoria formowe</td><td>RS-F2-IBCL-01</td><td>Alternatywna żywica do druku 3D, która została przetestowana</td></tr><tr><td>Pętle inokulacyjne</td><td>Fisher Naukowy</td><td>22-363-598</td><td>Służy do izolacji/przenoszenia drobnoustrojów</td></tr><tr><td>Agar z ekstraktem słodowym (MEA)</td><td>Kryterium</td><td>89405-654</td><td>Typ nośnika używany w kolumnach</td></tr><tr><td>Sekwencer MiSeq + zestaw do sekwencjonowania MiSeq</td><td>Oświetlenie</td><td>SY-410-1003</td><td>Może korzystać z innych sekwencerów</td></tr><tr><td>Zaprawa murarska & Tłuczek</td><td>Fisher Naukowy</td><td>FB961K; FB961A</td><td>Można użyć dowolnej zwykłej zaprawy i tłuczek, który można sterylizować między użyciami</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla Illumina</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>E7805S</td><td>Zestaw do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania metagenomicznego</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (24 próbki)</td><td>Oświetlenie</td><td>FC-131-1024</td><td>Zestaw do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania amplikonów</td></tr><tr><td>KRAWĘDŹ NMDC</td><td>Otwarte źródło: Opracowane przez National Microbiome Data Collaborative (NMDC)</td><td>N/a</td><td>Platforma bioinformatyczna do przetwarzania danych metagenomicznych</td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Sefar powiedział:</td><td>03-25/19</td><td>Siatka zastosowana jako część konstrukcji słupa</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td>Może używać wielu różnych sterylizowanych końcówek pipet do etapów protokołu</td></tr><tr><td>Agar ziemniaczany dekstroza</td><td>Cole'a Parmera</td><td>EW-14200-28</td><td>Typ nośnika używany w kolumnach</td></tr><tr><td>QIIME2 powiedział:</td><td>Otwarty kod źródłowy</td><td>N/a</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych amplikonowych</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Pytanie Q32851 powiedział:</td><td>Służy do ilościowego oznaczania DNA po ekstrakcjach</td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Pytanie Q33238 powiedział:</td><td>Służy do ilościowego oznaczania DNA po ekstrakcjach</td></tr><tr><td>Quick-DNA Zestaw do miniprzygotowania grzybów/bakterii</td><td>Badania Zymo</td><td>Zobacz materiał D6005</td><td>Opcjonalny zestaw do ekstrakcji DNA, który działa zarówno z bakteriami, jak i grzybami</td></tr><tr><td>Agar R2A</td><td>BD Difco</td><td>218263</td><td>Typ podłoża stosowanego w kolumnach (pożywka bakteryjna)</td></tr><tr><td>Stojak na probówki 50 ml</td><td>Fisher Naukowy</td><td>03-448-11</td><td>Stojak do przechowywania probówek 50 ml w pozycji pionowej</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12-000-155</td><td>Precyzyjne nożyczki, które można sterylizować</td></tr><tr><td>Pożywka sodowa karboksymetylocelulozy</td><td>Aldrich</td><td>Numer katalogowy: 419273-100G</td><td>Typ nośnika używany w kolumnach</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CAD SolidWorks</td><td>SolidWorks (SolidWorks)</td><td>N/a</td><td>Oprogramowanie wykorzystywane do projektowania kolumn</td></tr><tr><td>Szufelka do kielni</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Numer katalogowy S41701 powiedział:</td><td>Aby wykonać wgłębienie w podłożu przed dodaniem kolumny</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNaz</td><td>Invitrogen: ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td>Woda do kąpieli wodnej ultradźwięków</td></tr><tr><td>Ultradźwięki</td><td>Fisher Naukowy</td><td>FB-11201 (Zobacz materiał FB-11201)</td><td>Ultradźwiękowiec do czyszczenia kolumn</td></tr></tbody></table>

badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach

Investigating Bacterial-Fungal Interactions using Fungal Highway Columns in Diverse Environments and Substrates

Interakcje bakteryjno-grzybowe (BFI) odgrywają integralną rolę w kształtowaniu składu społeczności drobnoustrojów, funkcji biogeochemicznych, dynamiki przestrzennej i rozprzestrzeniania się drobnoustrojów. Sieci grzybni utworzone przez grzyby strzępkowe lub inne mikroorganizmy nitkowate (np. Lęgniowce) działają jak "autostrady grzybów", które mogą być wykorzystywane przez bakterie do transportu w heterogenicznych środowiskach, znacznie ułatwiając ich mobilność i zapewniając im dostęp do regionów, które mogą być trudne lub niemożliwe do samodzielnego dotarcia (np. z powodu kieszeni powietrznych w glebie). Stworzono kilka urządzeń i protokołów eksperymentalnych do badania tych grzybowych autostrad, w tym kolumn grzybowych autostrad. Kolumna autostradowa grzybów zaprojektowana przez naszą grupę może być używana do różnych zastosowań in situ lub in vitro , a także do różnych typów próbek środowiskowych i związanych z gospodarzem. W niniejszym artykule opisujemy metody przeprowadzania eksperymentów z tymi kolumnami, w tym projektowania, drukowania, sterylizacji i przygotowania urządzeń. Omówiono tu również możliwości analizy danych uzyskanych przy użyciu tych urządzeń, a także zaoferowano porady dotyczące rozwiązywania problemów dotyczących potencjalnych pułapek związanych z eksperymentami z użyciem kolumn drogowych grzybów. Urządzenia te mogą być wykorzystane do uzyskania bardziej wszechstronnego zrozumienia różnorodności, mechanizmów i dynamiki BFI na autostradach grzybów, aby dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej w złożonych środowiskach (np. glebach) oraz w różnych siedliskach, w których współistnieją bakterie i grzyby.

W pełni zmontowana kolumna autostrady grzybowej ma około 5 cm długości (Rysunek 1). Kolumna nie powinna być pęknięta w żadnym miejscu, a nakrętki i pierścień z gwintem powinny łatwo i szczelnie do siebie pasować, aby stworzyć mikrośrodowiska wewnątrz kolumny. Siatka filtracyjna może wystawać poza pierścień z gwintem (jak pokazano na Rysunku 1 i Rysunku 2) lub może zostać przycięta wysterylizowanymi nożyczkami. Czopy agarowe powinny ściśle przylegać do każdego końca kolumny. Po umieszczeniu w podłożu siatka filtracyjna powinna stykać się z podłożem, a kolumna nie powinna zostać całkowicie zakopana.
Kolumny były wcześniej testowane w odchodach końskich9Kolumny umieszczono również w glebie objętościowej oraz ryzosferycznej na polowym obszarze badawczym, a także w niewielkich objętościach gleby w probówkach o pojemności 50 ml w laboratorium (Rycina 3). Po usunięciu kolumn grzybowych autostrad z podłoża i ich rozmontowaniu, wzrost mikroorganizmów był widoczny zarówno na czopach pożywki z przynętą, jak i na czopach pożywki docelowej (przykłady przedstawiono w Rycina 4A). Bakterie i grzyby wyizolowano z podłoży docelowych i przynętowych poprzez techniki pasażowania (Rysunek 4B), a mikroby obecne na korkach mediów zidentyfikowano taksonomicznie za pomocą sekwencjonowania amplikonów (Rycina 4C,D). Rycina 4C,D przedstawić połączone wyniki sekwencjonowania amplikonów z wielu eksperymentów, wskazując, które mikroby były w stanie dotrzeć do docelowej wkładki z pożywką z kolumn uzupełnionych nawozem końskim9Wizualizacje tych danych bakteryjnych i grzybowych zostały wygenerowane zgodnie z opisem w kroku 17. Wyniki można również przedstawić w formie względnej liczebności taksonów.
Nieoptymalne wyniki uzyskano w przypadkach, gdy kolumny umieszczono w środowiskach o ekstremalnie niskiej wilgotności, co doprowadziło do całkowitego wysuszenia czopów z pożywką w ciągu kilku dni i w konsekwencji do braku odzyskania skolonizowanych drobnoustrojów (Rycina 5A). Odnotowaliśmy również przypadki, w których drobnoustroje po prostu nie rosły z docelowego czopa z pożywką (Rycina 5B), a także sytuacje, w których z docelowego czopa nie udało się odzyskać wystarczającej ilości danych sekwencyjnych do przeprowadzenia wiarygodnych analiz. Inne przypadki, w których grzyby przerastały poza kolumny, również skutkowały koniecznością powtórzenia eksperymentów (Rycina 5C).
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Przykłady kolumn umieszczonych w próbkach środowiskowych w warunkach laboratoryjnych i terenowych. (A) Kolumna umieszczona w probówce 50 mL z wilgotną glebą w warunkach laboratoryjnych. Na zdjęciu widoczna jest również linijka dla zachowania skali. (B) Kolumna umieszczona w glebie w terenie. (C) Kolumna umieszczona w systemie korzeniowym rośliny w terenie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki pomyślnych eksperymentów kolumnowych. (A) Przykłady skolonizowanych krążków pożywki wyjętych z kolumn. (B) Przykłady izolatów grzybów przesianych z pożywek docelowych. Podłożem była gleba. Najwyższa tożsamość sekwencji ITS w NCBI BLAST od lewej do prawej: Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii oraz Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Kołowe kladogramy przedstawiające różnorodność filogenetyczną (C) grzybowych sekwencji ITS oraz (D) bakteryjnych sekwencji 16S odzyskanych z pożywek docelowych po wielokrotnych eksperymentach z autostradami grzybowymi z wykorzystaniem obornika końskiego. Sekcje są pokolorowane i oznaczone według typów, a węzły końcowe reprezentują unikalne rodzaje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig05.jpg" /> 
Rycina 5. Nieoptymalne wyniki eksperymentów kolumnowych. (A) Przykład wysuszonej wkładki z pożywką&#160;spowodowany niską wilgotnością otoczenia. (B) Przykład braku wzrostu drobnoustrojów we wkładce z pożywką w kolumnie. (C) Przykład przerostu grzyba przez górną część (pożywkę docelową) kolumny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące konstruowania, sterylizacji, montażu, utylizacji i ponownego wykorzystania kolumn autostradowych grzybów w celu wzbogacenia par bakteryjno-grzybowych oddziałujących przez autostrady grzybowe z różnych podłoży środowiskowych.

Badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach

Bacterial-fungal interactions (BFIs) play an integral role in shaping microbial community composition, biogeochemical functions, spatial dynamics, and ...

[Narrator] Badanie to koncentruje się na interakcjach bakteryjnych grzybów, aby zrozumieć, w jaki sposób te drobnoustroje mogą wpływać na swoje zachowania. W niniejszej pracy badane są bakterie, które wykorzystują hyphy grzybów do transportu. Uzyskanie wglądu w te interakcje umożliwia badanie złożonych mikrobiomów w środowiskach takich jak gleba. Badania transportu bakterii wzdłuż strzępek tradycyjnie przeprowadzano na zmodyfikowanych szalkach Petriego, ale ostatnie postępy w technologii druku 3D pozwoliły na zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzeń, które mogą lepiej naśladować natywne warunki interakcji tych drobnoustrojów. Te grzybowe kolumny autostradowe były z powodzeniem stosowane w glebie, ryzosferach i roślinożercach w różnych środowiskach na dwóch kontynentach. Urządzenia te mogą również służyć jako skuteczne narzędzia dydaktyczne lub być stosowane przez inne grupy badawcze w celu poszerzenia zbiorowej wiedzy na temat interakcji bakteryjnych z grzybami. Na początek wlej wysterylizowane pożywki na bazie ślimaka do 90-milimetrowych szalek Petriego, aż ślimak znajdzie się blisko górnej części boków szalek Petriego. Następnie umieść jeden koniec kolumny autostradowej grzybów na jednej z zestalonych płytek podłoża. Podnieś kolumnę z nośnika ruchem skręconym, tak aby ślimak pozostał w końcu kolumny i utworzył zatyczkę nośnika. Dodaj małą nasadkę na końcu z zatyczką pożywki, aby utrzymać sterylne mikrośrodowisko dla pożywki docelowej. Odwróć kolumnę i utwórz wtyczkę nośnika na drugim końcu. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek wytnij okrągły kawałek nylonowej siatki w autoklawie o średnicy dwóch centymetrów. Połóż siatkę na odsłoniętym końcu kolumny. Przekręć gwintowany pierścień na koniec kolumny z przynętą, jednocześnie zabezpieczając siatkę w nitkach. Teraz umieść dużą nasadkę na spodzie kolumny nad siatką i drugim końcem gwintowanego pierścienia. Stwórz laboratoryjny mikrokosmos glebowy. Zdejmij dużą nasadkę z dolnej części kolumny, aby odsłonić gwintowany pierścień i siatkę. Dodaj kolumnę do mikrokosmosu gleby tak, aby cała dolna część znajdowała się w glebie. Usuń kolumnę po kontakcie z podłożem przez żądany czas. Ostrożnie strząśnij nadmiar podłoża i załóż dużą nasadkę z powrotem na spód kolumny poniżej siatki. Umieść kolumnę w 50-mililitrowej tubie do transportu. Przenieś kolumnę do sterylnego środowiska, takiego jak komora bezpieczeństwa biologicznego. Zdejmij dużą nasadkę z przynętą, gwintowany pierścień i siatkę. Następnie usuń małą nasadkę z końca kolumny zawierającej podłoże docelowe. Użyj wysterylizowanych kleszczyków, aby wyjąć zatyczkę. Przenieś zatyczkę pożywki docelowej bezpośrednio na środek 90-milimetrowej szalki Petriego zawierającej medium ślimakowe. Aby wyekstrahować DNA, najpierw zamroź całe korki ślimakowe lub wybrane kawałki z kolumn w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Alternatywnie, zanurz kawałki korka w środku konserwującym zawartym w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej przed ekstrakcją. Wytnij jednocentymetrowy kawałek świdra zawierający rozwój drobnoustrojów z hodowanego celu lub pożywki przynętowej. Do ekstrakcji izolowanych kolonii bakteryjnych użyj sterylnej pętli do inokulacji, aby usunąć kolonię z płytki. Zakręć pętlę bezpośrednio w dostępnym w handlu buforze do ekstrakcji DNA. Do ekstrakcji izolowanych grzybów użyj moździerza i tłuczka, aby oddzielnie zmielić kawałki ślimaka w ciekłym azocie. Zmielone próbki przenieść do probówek ekstrakcyjnych. Korzystając z komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA zoptymalizowanego pod kątem bakterii i grzybów, wyekstrahuj DNA. Następnie użyj fluorymetru, aby określić ilościowo powstałe DNA. Rozwój mikrobiologiczny był widoczny zarówno na zatyczkach przynęty, jak i pożywki docelowej po usunięciu kolumn grzybów z autostrady z podłoża i zdemontowaniu. Bakterie i grzyby wyizolowano z pożywki docelowej i przynęty za pomocą technik subhodowli. Mikroorganizmy obecne na zatyczkach pożywki zostały zidentyfikowane taksonomicznie. Nie stwierdzono odzysku skolonizowanych mikrobów, gdy kolumny zostały dodane do środowisk o bardzo niskiej wilgotności. W niektórych przypadkach drobnoustroje po prostu nie wyrosły z docelowej zatyczki pożywki lub przez górną część kolumny zaobserwowano przerost grzyba.

investigating-bacterial-fungal-interactions-using-fungal-highway

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Schlafer, S, i Frost Kristensen, M. Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzykrólestwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje hodowlę biofilmów Streptococcus mutans i Candida albicans w międzykrólestwowych warunkach w warunkach podobnych do jamy ustnej, aby modelować interakcje bakteria-grzyb, umożliwiając badanie synergii mikroorganizmów, adhezji pośredniczonej glukanem oraz kwasowej zjadliwości w patogenezie jamy ustnej.

Ustanowienie biofilmów międzykrólestwowych bakterii i grzybów do badania patogenezy jamy ustnej

Źródło: Miquel Guennoc, C. i inni. Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów włóknistych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje przygotowanie hodowli grzybów na poddanych leczeniu błon celofanowych, aby wspierać tworzenie kolonii i wzrost promieniowy. Następnie pokazuje uprawę i przygotowanie komórek bakteryjnych glebowych do testów interakcji. Na koniec ilustruje, jak komórki bakteryjne...

Ustanowienie współkultury grzybowo-bakteryjnej do tworzenia biofilmu

Ten film opisuje metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii. Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchniach grzybów i obejmują liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybiczych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo.

Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Większość roślin w społecznościach prawdopodobnie jest połączona przez arbuskularne grzyby mikoryzowe (AM), ale mediacja interakcji między roślinami przez nie była badana głównie przez uprawę roślin z mikoryzą i bez niej. Przedstawiamy metodę manipulowania powszechnymi sieciami mikoryzowymi wśród roślin mikoryzowych w celu zbadania ich konsekwencji dla interakcji roślin.

Badanie interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Poznaj metodę badania interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów. Protokół umożliwia wzbogacanie par bakteryjno-grzybowych z różnych podłoży środowiskowych.

Badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach

Przeglądaj więcej filmów