Name: Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę barwienia immunologicznego całościowej siatkówki myszy i automatycznego zliczania komórek zwojowych przy użyciu oprogramowania AI. Technika ta przyspiesza badania nad jaskrą i ocenę utraty komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt badawczy był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82371059 (H.Z.)), Departament Nauki i Technologii Prowincji Sychuan, Chiny (2023JDZH0002 (H.Z.)), Biuro Nauki i Technologii Chengdu (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)) oraz Szpital Ludowy Prowincji Sichuan (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).

Procedura była zgodna z wytycznymi Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystywania zwierząt w badaniach i została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szpitala Ludowego Prowincji Syczuan. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57Bl/6J (w wieku 2 miesięcy). Rysunek 1 ilustruje całą procedurę opisaną tutaj. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja całych siatek siatkówki
<ol>
	<li>Składanie ofiar ze zwierząt
	<ol>
		<li>Złóż w ofierze myszy za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Przed zwichnięciem szyjki macicy, 
		Znieczulenie myszy należy poprzez wdychanie izofluranu (3% -5% tlenu) lub dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyłuszczenie i przetwarzanie gałek ocznych
	<ol>
		<li>Zaznacz krawędź rogówki po grzbietowej stronie gałki ocznej niebieskim markerem, aby zapamiętać orientację podczas późniejszej sekcji.</li>
		<li>Usuń resztki tkanek mięśniowych przyczepionych do gałki ocznej za pomocą nożyczek. Przenieś wyłuszczoną gałkę oczną do okrągłej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 1x PBS w celu krótkiego płukania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Przenieś gałkę oczną do innej probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml z okrągłym dnem, zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd (PFA) w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 10 minut (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie (około 1-2 mm) na rogówce za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Umieść gałkę oczną z powrotem w utrwalaczu w celu dalszego utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 3 godziny, aby zachować morfologię tkanki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunięcie rogówki i soczewki1,9
	<ol>
		<li>Wykonaj małe nacięcie o długości około 1 mm wokół rąbka rogówki, granicy między rogówką a twardówką, za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych.</li>
		<li>Ostrożnie przeciąć na obwodzie rogówki, wycinając ją całkowicie, aby odsłonić leżące pod nią struktury.</li>
		<li>Użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie chwycić i ostrożnie podnieść soczewkę z otaczających tkanek, aby zapobiec uszkodzeniu siatkówki. Utrzymuj integralność strukturalną siatkówki przy delikatnej operacji.</li>
		<li>Przenieś muszlę oczną do probówki mikrowirówkowej w celu dalszej obróbki. 
		UWAGA: Wytnij rogówkę i wyprowadź soczewkę bardziej efektywnie, stosując technikę "szczeliny krzyżowej"10. Wykonaj dwie prostopadłe szczeliny w poprzek rogówki i użyj kleszczy, aby wyjąć soczewkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nacięcie twardówki
	<ol>
		<li>Wytnij precyzyjną szczelinę w twardówce za pomocą cienkich nożyczek okulistycznych, aby ułatwić kolejne etapy sekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja siatkówki
	<ol>
		<li>Włóż kleszcze z zębami do nacięcia między twardówką a siatkówką. Delikatnie chwyć krawędź twardówki, unikając nadmiernej siły, aby zapobiec rozerwaniu tkanki.</li>
		<li>Stopniowo powiększaj nacięcie, przesuwając kleszcze wzdłuż granicy między twardówką a siatkówką powolnymi, pewnymi ruchami ręki. Użyj ząbkowanej części kleszczy, aby ostrożnie oddzielić twardówkę od siatkówki, upewniając się, że siatkówka nie jest uszkodzona (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przecięcie siatkówki
	<ol>
		<li>Podziel siatkówkę na cztery mniej więcej równej wielkości płaty za pomocą ostrych nożyczek. Upewnij się, że nacięcia znajdują się mniej więcej w połowie drogi w kierunku nerwu wzrokowego i są zorientowane pod kątem 90° od siebie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie siatkówki
	<ol>
		<li>Delikatnie rozłóż wypreparowaną siatkówkę za pomocą szczotki o miękkim włosiu i skrupulatnie usuń zanieczyszczenia z jej powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2K).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostateczne utrwalenie
	<ol>
		<li>Przenieś izolowaną siatkówkę do probówki mikrowirówkowej zawierającej świeże 4% PFA za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Pozostaw do utrwalenia na lodzie przez dodatkowe 5 godzin do nocy w celu zachowania tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Przemyć izolowaną siatkówkę w całości w 1x PBS z delikatnym mieszaniem przez 5 minut. Wyrzuć roztwór PBS. Powtórz ten proces dwukrotnie, aby usunąć resztki utrwalacza i zanieczyszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Zanurz przemytą siatkówkę w blokującym roztworze buforowym (1x PBS z 4% normalną surowicą osła (NDS) i 0,2% Triton X-100) na 30 minut, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał i zwiększyć przepuszczalność (<silna klasa = "xfig" >Figura 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Zastąp bufor blokujący przeciwciałem pierwszorzędowym BRN3A (rozcieńczonym w stosunku 1:200 w buforze blokującym). Inkubować siatkówkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić specyficzne wiązanie antygen-przeciwciało (<silna klasa = "xfig">Figura 3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Przemyj siatkówkę trzy razy 1x PBS przez 5 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe i zmniejszyć barwienie tła (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Inkubuj siatkówkę z drugorzędowym przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z Alexa594 lub Alexa488 (rozcieńczonym 1:300) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby uwidocznić docelowe antygeny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Wykonaj trzy kolejne płukania 1x PBS przez 5 minut każde, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych i zminimalizować niespecyficzne wiązanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Delikatnie przenieś immunologicznie wybarwioną siatkówkę na szklane szkiełko mikroskopowe, ostrożnie je spłaszczając, aby zminimalizować fałdowanie lub zniekształcenie.</li>
		<li>Nałóż niewielką kroplę środka mocującego zapobiegającego blaknięciu na środek siatkówki, zapewniając równomierne rozprowadzenie w tkance.</li>
		<li>Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na zamontowanej siatkówce, unikając pęcherzyków powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E,F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie obrazu
UWAGA: Zaimportuj obraz do oprogramowania do automatycznego liczenia RGC i rozpocznij liczenie. Liczbę komórek BRN3A-dodatnich dla całej siatkówki można uzyskać w ciągu kilku minut. Pobierz oprogramowanie AutoCount z GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Postępuj zgodnie z poniższymi szczegółowymi krokami instalacji oprogramowania:
<ol>
	<li>Pobierz kod z linku GitHub. Otrzymasz plik o nazwie "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Rozpakuj ten plik.</li>
	<li>Pobierz niezbędne pliki z dysku w chmurze (patrz Spis materiałów) i rozpakuj je. Pobrany plik nosi nazwę "yolov5_cpu". Rozpakuj ten pakiet do bieżącego folderu, aby uniknąć nieoczekiwanych problemów.</li>
	<li>Znajdź plik konfiguracyjny z kroku 1 i zmodyfikuj jego zawartość tak, aby wskazywała ścieżkę "yolov5_cpu". 
	UWAGA: Na przykład, jeśli pobrany plik "yolov5_cpu" zostanie umieszczony w folderze "D:\1me\yolov5_cpu_", zmień plik "config.ini" w kroku 1 na "D:/1me/yolov5_cpu" (użyj / zamiast \). (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Otwórz interfejs graficzny, klikając userinterface.exe. Początkowe ładowanie może być powolne (uruchom jako administrator) (Rysunek 4B).</li>
	<li>Po otwarciu oprogramowania sprawdź, czy plik modelu "pmse_plus.pt" znajduje się w katalogu głównym dysku C. Jeśli go nie ma, skopiuj go do tego katalogu. 
	UWAGA: Plik modelu "pmse_plus.pt" znajduje się w folderze weights folderu "yolov5", który znajduje się w wyodrębnionym folderze Intelligent-quantifying RGCs (Rysunek 4C).</li>
	<li>Przygotuj obrazy do wykrycia. 
	UWAGA: Oprogramowanie pozwala na odczytanie tylko jednego lub pięciu zdjęć na raz. Przeczytanie więcej spowoduje błąd.</li>
</ol>
4. Automatyczne zliczanie komórek
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do liczenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Kliknij OTWÓRZ OBRAZ, aby zaimportować obraz (Rysunek 5B).</li>
	<li>Kliknij URUCHOM, aby oprogramowanie automatycznie zliczyło komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). 
	UWAGA: Oprogramowanie oznaczy zliczone komórki czerwonym kwadratowym polem i wyświetli liczbę komórek w prawym górnym rogu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D).</li>
</ol>

Immunostaining and AI-Based Counting of RGCs in Mouse Whole-Mount Retina

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia metodę określania wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC) w siatkówce myszy, która może być wykorzystana do monitorowania postępu zwyrodnienia RGC w modelach mysich do badań jaskry. Siatkówka myszy jest delikatną tkanką nerwową5, a izolowanie całych siatkówek od oczu myszy wymaga wielokrotnej praktyki. Podczas eksperymentów stwierdzono, że czas fiksacji znacząco wpływa na morfologię siatkówki. W przypadku myszy w wieku około 2 tygodni czas utrwalenia wynoszący 20 minut jest wystarczający, aby uzyskać dobre wyniki ze względu na cienką i słabą twardówkę. Jednak w przypadku dorosłych myszy w wieku powyżej 2 miesięcy 20 minut fiksacji jest niewystarczające. Czas fiksacji wynoszący 3 godziny jest optymalny dla uzyskania nienaruszonych całych siatek siatkówki.
W procesie izolacji siatkówki najtrudniejszym krokiem jest oddzielenie twardówki od siatkówki10. Twardówkę można stosunkowo łatwo oderwać od siatkówki za pomocą dwóch zestawów kleszczy z ząbkowanymi końcówkami. Używając dwóch zestawów kleszczy do chwytania twardówki i rozsuwania, twardówka jest rozrywana na małe kawałki i oddzielana od siatkówki.
Wysokiej jakości obraz komórek zwojowych siatkówki (RGC) ma kluczowe znaczenie dla dokładnego liczenia. Ponieważ siatkówka jest trójwymiarowa, nie wszystkie RGC znajdują się na tym samym poziomie w płasko zamontowanej siatkówce8. Gdy siatkówka jest zamontowana na szklanym szkiełku, powinna być rozłożona tak płasko, jak to możliwe, aby ułatwić późniejsze obrazowanie. Podczas obrazowania obrazy są rejestrowane na wielu poziomach ostrości, aby uchwycić wszystkie RGC w różnych obszarach całej siatkówki.
Podsumowując, protokół ten zapewnia ustandaryzowaną procedurę automatycznego zliczania wszystkich RGC w płasko zamontowanej siatkówce myszy. Metoda ta umożliwia naukowcom dokładną ocenę degeneracji RGC w modelach mysich, zwiększając wydajność i dokładność kwantyfikacji RGC. Taka precyzja jest kluczowa dla zrozumienia i leczenia jaskry i chorób pokrewnych.

Jaskra charakteryzuje się postępującą śmiercią komórek zwojowych, co stanowi poważne wyzwanie dla przywrócenia wzroku1,2. Choroba ta jest głównym przedmiotem badań okulistycznych ze względu na jej rozpowszechnienie i wpływ na wzrok3. Modele mysie są niezbędne w jaskrze 
Badania ze względu na ich jednorodne pochodzenie genetyczne, wysoką zdolność reprodukcyjną i podobieństwo właściwości ich komórek zwojowych do ludzi4. Głównym celem tej metody jest dokładne ilościowe określenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) w modelach mysich, co jest niezbędne do zrozumienia patogenezy jaskry i opracowania odpowiednich metod leczenia.
Uzasadnienie dla rozwoju tej techniki wynika z potrzeby niezawodnej i efektywnej metody oceny degeneracji RGC w modelach mysich. Tradycyjne metody, takie jak znakowanie RGC w przekrojach siatkówki, często dają niewiarygodne wyniki ze względu na nierównomierny rozkład RGC w siatkówce5. Ilościowe określenie RGC w całej siatkówce lepiej odzwierciedla zmiany w ich liczbie i ma kluczowe znaczenie dla oceny postępu choroby i interwencji terapeutycznych.
Ta metoda oferuje kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi technikami. Na przykład ręczne liczenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) w normalnej siatkówce dorosłej myszy, która zawiera od 40 000 do 60 000 RGC, może być czasochłonne i podatne na błędy6,7,8. Opracowane przez nas oprogramowanie do automatycznego liczenia RGC pozwala na dokładne liczenie w czasie krótszym niż 3 minuty, potencjalnie oszczędzając naukowcom znaczną ilość czasu. Ponadto oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji wykorzystywane do automatycznego liczenia minimalizuje odchylenia i zwiększa odtwarzalność.
Ponadto, ta technika zapewnia ustandaryzowane podejście do oceny degeneracji RGC w różnych modelach myszy i warunkach eksperymentalnych, dostarczając cennych danych do badań nad jaskrą. Metoda jest zgodna z innymi badaniami, które podkreślają znaczenie analizy całej siatkówki dla zrozumienia zmian siatkówki w chorobach9.
Aby pomóc czytelnikom określić, czy ta metoda jest odpowiednia dla ich zastosowania, ważne jest, aby zauważyć, że ta technika jest szczególnie korzystna dla badaczy badających zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) w mysich modelach jaskry lub innych chorób siatkówki. Metodę można dostosować do różnych konfiguracji eksperymentalnych i oferuje wysoki stopień dokładności i wydajności w zliczaniu RGC, dzięki czemu idealnie nadaje się zarówno do badań na małą, jak i dużą skalę. Ponadto prosta konstrukcja protokołu i dostępność przyjaznego dla użytkownika oprogramowania sprawiają, że jest on dostępny dla badaczy o różnym poziomie wiedzy specjalistycznej w zakresie analizy siatkówki.

<table><tbody><tr><td>1 i razy; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594-sprzężony kozioł anty-królik IgG&nbsp; (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-BRN3A [EPR23257-285]</td> <td>Oprogramowanie</td><td></td> Abcam ab245230 <td></td></tr><tr><td>AutoCount</td><td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td>Dysk w chmurze Link do dysku Google https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dysk w chmurze</td><td>Baidu</td><td>link Kod ekstrakcji: g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>Marker</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Biosharp, Labgic 25030081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td></td><td>Macklin P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Jaskra jest główną przyczyną ślepoty na całym świecie, charakteryzującą się złożonym mechanizmem patogennym, który sprawia, że przywrócenie wzroku jest trudne. Myszy służą jako cenne modele zwierzęce do badania patogenezy i leczenia jaskry ze względu na ich stosunkowo jednorodne tło genetyczne i komórki zwojowe siatkówki (RGC), które strukturalnie przypominają te u ludzi. Dokładna ocena uszkodzeń RGC i wyników leczenia w modelach jaskry myszy wymaga określenia liczby RGC w całej siatkówce. Protokół ten przedstawia kompleksową metodę obejmującą izolację całej siatkówki, znakowanie RGC specyficznymi przeciwciałami oraz szybkie, dokładne automatyczne zliczanie RGC przy użyciu programu opartego na sztucznej inteligencji. Uproszczone podejście pozwala na skuteczne i precyzyjne określenie liczby RGC w siatkówkach myszy, ułatwiając ocenę zwyrodnienia RGC i potencjalnych interwencji terapeutycznych. Umożliwiając naukowcom ocenę zakresu uszkodzeń RGC, protokół ten przyczynia się do głębszego zrozumienia patogenezy jaskry i pomaga w opracowaniu skutecznych strategii leczenia w celu radzenia sobie z utratą wzroku i zapobiegania jej.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodologię całego preparatu immunobarwienia siatkówek myszy, zapewniając staranne przygotowanie tkanki, precyzyjną inkubację przeciwciał oraz wiarygodne zautomatyzowane liczenie komórek. Procedura ta umożliwia skuteczne znakowanie i kwantyfikację komórek zwojowych siatkówki (RGCs), co pozwala na dokładną ocenę populacji komórkowych w różnych kontekstach eksperymentalnych. Metodę tę zastosowano do zliczenia RGCs u myszy typu dzikiego oraz myszy z modelem jaskry, uzyskując spójne wyniki. Reprezentatywny wynik pokazuje, że liczba RGCs u normalnej dorosłej myszy w wieku 2 miesięcy wynosi około 45 000 (Rysunek 6).
Aby ocenić, czy oprogramowanie AI potrafi dokładnie ilościowo określić liczbę RGC oznakowanych BRN3a w modelach prawidłowych i chorobowych, stworzono mysi model jaskry indukowany N-metylo-D-asparaginianem (NMDA)7. Całą siatkówkę z tego modelu poddano immunobarwieniu z przeciwciałami anty-BRN3A, a liczbę RGC określono przy użyciu oprogramowania do automatycznego zliczania. Wynik wskazał na stosunkowo wysokie tło barwienia (Rysunek 7). Niemniej jednak oprogramowanie było w stanie dokładnie zidentyfikować niemal wszystkie RGC. W tej siatkówce zidentyfikowano łącznie 15 231 RGC, w porównaniu do około 45 000–50 000 RGC w prawidłowej siatkówce myszy, co wskazuje na ciężką degenerację. Zatem oprogramowanie AI może być również skutecznie wykorzystywane do zliczania RGC w siatkówkach o mniej optymalnej jakości barwienia.
<img alt="Schemat procesu sekcji oka; ekstrakcja soczewki, immunoznakowanie siatkówki, liczenie RGC za pomocą mikroskopii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przygotowania RGC. (A) Gałka oczna zostaje usunięta i umieszczona w 1x PBS. (B) Gałka oczna jest utrwalana w 4% PFA na lodzie przez 3 h. (C) Usunięcie rogówki. (D) Ekstrakcja soczewki. (E) Muszla oka zostaje podzielona na 4 płaty za pomocą nożyczek. (F) Twardówka zostaje odwarstwiona, a zanieczyszczenia są delikatnie usuwane z powierzchni siatkówki miękkim pędzlem. (G) Siatkówka zostaje poddana immunoznakowaniu przeciwciałem anty-BRN3A. (H) Sygnały fluorescencyjne są obrazowane przy użyciu mikroskopu konfokalnego. (I) Automatyczne liczenie RGC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Disekcja i przygotowanie oka myszy do analizy eksperymentalnej, seria obrazów przedstawiająca kolejne kroki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Izolacja całej siatkówki oka myszy. (A) Myszy dokonuje się eutanazji poprzez zwichnięcie szyi. (B) Myszy kładzie się na płaskiej powierzchni. (C) Gałkę oczną ostrożnie usuwa się za pomocą nożyczek. (D) Gałkę oczną delikatnie umieszcza się w 1x PBS. (E) Gałkę oczną unieruchamia się pęsetą na brzegu rogówki. (F) Za pomocą igły wykonuje się małe nacięcie na brzegu rogówki. (G) Po usunięciu rogówki usuwa się strukturę w kształcie miseczki. (H) Soczewkę ostrożnie usuwa się pęsetą. (I) Na twardówce wykonuje się małe nacięcie wzdłuż brzegu rogówki w kierunku nerwu wzrokowego, unikając uszkodzenia siatkówki. (J) Twardówkę rozdziera się pęsetą wzdłuż nacięcia. (K) Siatkówkę spłaszcza się i oczyszcza za pomocą pędzelka. (L) Siatkówkę spłaszcza się i szybko utrwala w lodowatym metanolu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces przygotowania próbki do mikroskopii; pipetowanie, montaż preparatu na szkiełku, konfiguracja stolika mikroskopu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Immunobarwienie całej siatkówki myszy. (A) Po przemyciu w 1x PBS siatkówkę blokuje się przy użyciu buforu blokującego. (BSiatkówkę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym w 4 °C przez noc. (CSiatkówkę przemywa się trzykrotnie 1x PBS.DSiatkówkę inkubuje się z przeciwciałem wtórnym przez 2 h w temperaturze pokojowej.ESiatkówkę mocuje się na szkiełku przedmiotowym tak, aby komórki zwojowe siatkówki (RGC) były skierowane ku górze.FObrazy są pozyskiwane przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja YOLOv5 ze strukturą katalogów i lokalizacją pliku modelu, z podkreśleniem plików konfiguracyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Instalacja oprogramowania do automatycznego liczenia. (A) Krok 1 obejmuje aktualizację ścieżki do pliku w katalogu „yolov5_cpu”. (B) Uruchomienie interfejsu graficznego. (C) Weryfikacja obecności pliku modelu w katalogu głównym dysku C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzorców liści kukurydzy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów; obejmuje segmentację i identyfikację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Działanie zautomatyzowanego oprogramowania do liczenia RGC. (A) Otwarcie oprogramowania do liczenia. (B) Kliknięcie przycisku OPEN IMAGE w celu zaimportowania obrazu. (C) Kliknięcie przycisku RUN w celu uruchomienia automatycznego liczenia. (D) Policzone komórki są zaznaczone czerwonym kwadratem, a liczba komórek jest wyświetlana w prawym górnym rogu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza neuronów siatkówki; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, zaznaczone jądra w celu porównania liczby komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zautomatyzowane liczenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) myszy. Panel górny (lewo) przedstawia reprezentatywne wyniki preparatu siatkówki typu flat-mount poddanego immunobarwieniu przeciwciałem anty-BRN3A; panel górny (prawo) przedstawia zautomatyzowane liczenie RGC przy użyciu wcześniej opracowanego oprogramowania. Pasek skali: 100 µm. Powiększenia wybranych fragmentów z paneli górnych przedstawiono odpowiednio w panelu dolnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki roślinnej z czerwonym chlorofilem i zielonymi markerami białka fluorescencyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Liczenie RGC w mysim modelu jaskry indukowanym NMDA. Panel lewy: Przegląd całej siatkówki, pokazujący RGC rozpoznane przez oprogramowanie AI. Panel prawy: Powiększony widok fragmentu obszaru siatkówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

Nasz zakres badawczy polega na wykorzystaniu myszy jako modelu zwierzęcego do badań nad jaskrą w celu precyzyjnej oceny stanu jaskry w siatkówce myszy. Musimy określić, ile komórek zwojowych siatkówki znajduje się w siatkówce. W całej siatkówce myszy znajduje się około 50 000 komórek zwojowych siatkówki.Jeśli policzymy je ręcznie, może to potrwać od ośmiu do 10 godzin. Automatyczne metody liczenia mogą zrobić to w ciągu kilku minut i zaoszczędzić ludziom dużo czasu i wysiłku. W przyszłości w naszym laboratorium koncentrujemy się na badaniach nad leczeniem jaskry.Zamierzamy użyć różnych modeli myszy w przypadku jaskry, aby przetestować różne metody leczenia. Metoda opisana w tym protokole jest szczególnie przydatna do oceny leczenia. Po eutanazji myszy za pomocą zwichnięcia szyjki macicy w celu wyłuszczenia i przetwarzania gałki ocznej, zaznacz krawędź rogówki po grzbietowej stronie gałki ocznej za pomocą niebieskiego markera, aby zapewnić orientację podczas sekcji.Za pomocą nożyczek usuń resztki tkanek mięśniowych przyczepionych do gałki ocznej. Następnie przenieś wyłuszczoną gałkę oczną do dwumililitrowej probówki mikrowirówki z okrągłym dnem wypełnionej PBS. Teraz umieść gałkę oczną w kolejnej dwumililitrowej tubce zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd do utrwalenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby wykonać małe nacięcie na rogówce. Umieść gałkę oczną z powrotem w utrwalaczu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby zachować morfologię tkanki. Aby usunąć rogówkę i soczewkę, za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wykonaj małe nacięcie o długości około jednego milimetra wokół rąbka rogówki, granicy między rogówką a twardówką.Ostrożnie przeciąć na obwodzie rogówki, wycinając ją całkowicie, aby odsłonić leżące pod nią struktury. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie chwyć i ostrożnie unieś soczewkę z otaczających tkanek, aby uniknąć uszkodzenia siatkówki. W przypadku nacięcia twardówki należy wyciąć precyzyjną szczelinę w twardówce cienkimi nożyczkami okulistycznymi, aby ułatwić późniejsze rozwarstwienie.Następnie, w celu oddzielenia siatkówki, włóż kleszcze zębate w nacięcie między twardówką a siatkówką. Delikatnie chwyć krawędź twardówki, unikając nadmiernej siły, aby zapobiec rozerwaniu tkanki. Stopniowo powiększaj nacięcie, przesuwając kleszcze wzdłuż granicy między twardówką a siatkówką.Użyj ząbkowanej części kleszczy, aby ostrożnie oddzielić twardówkę od siatkówki, nie uszkadzając jej. Teraz za pomocą ostrych nożyczek podziel siatkówkę na cztery mniej więcej równej wielkości płaty. Delikatnie rozłóż wypreparowaną siatkówkę za pomocą szczoteczki o miękkim włosiu i skrupulatnie usuń zanieczyszczenia z jej powierzchni.Po odizolowaniu całej siatkówki od myszy, przemyj siatkówkę w PBS, delikatnie mieszając przez pięć minut. Zanurz przepłukaną siatkówkę w buforze blokującym na 30 minut. Po inkubacji zastąpić bufor blokujący pierwszorzędowym przeciwciałem BRN3A.Inkubuj siatkówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić specyficzne wiązanie antygen-przeciwciało. Następnego dnia przemyj siatkówkę trzy razy PBS przez pięć minut każdy, a następnie inkubuj z sprzężonym przeciwciałem anty-króliczym Alexa 594 lub Alexa 488 przez dwie godziny, aby uwidocznić docelowe antygeny. Po umyciu wybarwionej immunologicznie siatkówki PBS delikatnie przenieś ją na szklane szkiełko mikroskopowe.Spłaszcz siatkówkę, aby zminimalizować fałdowanie lub zniekształcenia. Umieść szkiełko nakrywkowe na zamontowanej siatkówce, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Pobierz kod z linku GitHub, a następnie pobierz niezbędne pliki z dysku w chmurze i rozpakuj je.Zlokalizuj plik config. ini i zmodyfikuj jego zawartość tak, aby wskazywała ścieżkę procesora Yolo V5. Następnie kliknij interfejs użytkownika.exe, aby otworzyć interfejs graficzny. Sprawdź, czy pmse_plus. pt model file znajduje się w katalogu głównym dysku C. Jeśli nie, skopiuj go z folderu waits w folderze Yolo V5.Otwórz oprogramowanie do zliczania komórek. Kliknij Otwórz obraz, aby zaimportować obraz. Następnie kliknij Uruchom, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne zliczenie komórek.Oprogramowanie do automatycznego zliczania komórek dokładnie zidentyfikowało 15 231 komórek zwojowych siatkówki w mysim modelu jaskry wywołanej N-metylo-D-asparaginianem, wykazując znaczną utratę komórek w porównaniu z około 45 000 do 50 000 RGC w normalnej siatkówce.

whole-mount-immunostaining-automatic-counting-mouse-retinal-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę izolowania mysich pierwotnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na przyszłe badania RGC, w celu lepszego zrozumienia poważnego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolowanie mysich komórek zwojowych siatkówki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Źródło: Lani-Louzada, R.,  i inni. Kauteryzacja pełnego koła rąbkowego splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni. J. Vis. Exp. (2022). Ten film pokazuje ilościowe oznaczanie komórek zwojowych siatkówki z chemicznie utrwalonych siatkówk szczurów poddanych pełnej kauteryzacji splotu naczyniowego rąbka. Proces obejmuje przenikanie, barwienie przeciwciał i barwienie przeciwjądrowe, a następnie wizualizację pod mikroskopem epifluorescencyjnym w celu oceny wpływu...

Kwantyfikacja somy komórek zwojowych siatkówki po nadciśnieniu ocznym wywołanym kauteryzacją 

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Ten rękopis przedstawia protokół histologicznego przygotowania preparatów z gałek ocznych gryzoni. Dzięki proponowanej metodzie wewnętrzną siatkówkę można łatwo zobrazować i ocenić pod mikroskopem świetlnym. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów.

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę barwienia immunologicznego całościowej siatkówki myszy i automatycznego zliczania komórek zwojowych przy użyciu oprogramowania AI. Technika ta przyspiesza badania nad jaskrą i ocenę utraty komórek nerwowych.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów