Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy
4 października 2024
Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.
Nasz zakres badawczy polega na wykorzystaniu myszy jako modelu zwierzęcego do badań nad jaskrą w celu precyzyjnej oceny stanu jaskry w siatkówce myszy. Musimy określić, ile komórek zwojowych siatkówki znajduje się w siatkówce. W całej siatkówce myszy znajduje się około 50 000 komórek zwojowych siatkówki.
Jeśli policzymy je ręcznie, może to potrwać od ośmiu do 10 godzin. Automatyczne metody liczenia mogą zrobić to w ciągu kilku minut i zaoszczędzić ludziom dużo czasu i wysiłku. W przyszłości w naszym laboratorium koncentrujemy się na badaniach nad leczeniem jaskry.
Zamierzamy użyć różnych modeli myszy w przypadku jaskry, aby przetestować różne metody leczenia. Metoda opisana w tym protokole jest szczególnie przydatna do oceny leczenia. Po eutanazji myszy za pomocą zwichnięcia szyjki macicy w celu wyłuszczenia i przetwarzania gałki ocznej, zaznacz krawędź rogówki po grzbietowej stronie gałki ocznej za pomocą niebieskiego markera, aby zapewnić orientację podczas sekcji.
Za pomocą nożyczek usuń resztki tkanek mięśniowych przyczepionych do gałki ocznej. Następnie przenieś wyłuszczoną gałkę oczną do dwumililitrowej probówki mikrowirówki z okrągłym dnem wypełnionej PBS. Teraz umieść gałkę oczną w kolejnej dwumililitrowej tubce zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd do utrwalenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.
Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby wykonać małe nacięcie na rogówce. Umieść gałkę oczną z powrotem w utrwalaczu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby zachować morfologię tkanki. Aby usunąć rogówkę i soczewkę, za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wykonaj małe nacięcie o długości około jednego milimetra wokół rąbka rogówki, granicy między rogówką a twardówką.
Ostrożnie przeciąć na obwodzie rogówki, wycinając ją całkowicie, aby odsłonić leżące pod nią struktury. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie chwyć i ostrożnie unieś soczewkę z otaczających tkanek, aby uniknąć uszkodzenia siatkówki. W przypadku nacięcia twardówki należy wyciąć precyzyjną szczelinę w twardówce cienkimi nożyczkami okulistycznymi, aby ułatwić późniejsze rozwarstwienie.
Następnie, w celu oddzielenia siatkówki, włóż kleszcze zębate w nacięcie między twardówką a siatkówką. Delikatnie chwyć krawędź twardówki, unikając nadmiernej siły, aby zapobiec rozerwaniu tkanki. Stopniowo powiększaj nacięcie, przesuwając kleszcze wzdłuż granicy między twardówką a siatkówką.
Użyj ząbkowanej części kleszczy, aby ostrożnie oddzielić twardówkę od siatkówki, nie uszkadzając jej. Teraz za pomocą ostrych nożyczek podziel siatkówkę na cztery mniej więcej równej wielkości płaty. Delikatnie rozłóż wypreparowaną siatkówkę za pomocą szczoteczki o miękkim włosiu i skrupulatnie usuń zanieczyszczenia z jej powierzchni.
Po odizolowaniu całej siatkówki od myszy, przemyj siatkówkę w PBS, delikatnie mieszając przez pięć minut. Zanurz przepłukaną siatkówkę w buforze blokującym na 30 minut. Po inkubacji zastąpić bufor blokujący pierwszorzędowym przeciwciałem BRN3A.
Inkubuj siatkówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić specyficzne wiązanie antygen-przeciwciało. Następnego dnia przemyj siatkówkę trzy razy PBS przez pięć minut każdy, a następnie inkubuj z sprzężonym przeciwciałem anty-króliczym Alexa 594 lub Alexa 488 przez dwie godziny, aby uwidocznić docelowe antygeny. Po umyciu wybarwionej immunologicznie siatkówki PBS delikatnie przenieś ją na szklane szkiełko mikroskopowe.
Spłaszcz siatkówkę, aby zminimalizować fałdowanie lub zniekształcenia. Umieść szkiełko nakrywkowe na zamontowanej siatkówce, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Pobierz kod z linku GitHub, a następnie pobierz niezbędne pliki z dysku w chmurze i rozpakuj je.
Zlokalizuj plik config. ini i zmodyfikuj jego zawartość tak, aby wskazywała ścieżkę procesora Yolo V5. Następnie kliknij interfejs użytkownika.
exe, aby otworzyć interfejs graficzny. Sprawdź, czy pmse_plus. pt model file znajduje się w katalogu głównym dysku C. Jeśli nie, skopiuj go z folderu waits w folderze Yolo V5.
Otwórz oprogramowanie do zliczania komórek. Kliknij Otwórz obraz, aby zaimportować obraz. Następnie kliknij Uruchom, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne zliczenie komórek.
Oprogramowanie do automatycznego zliczania komórek dokładnie zidentyfikowało 15 231 komórek zwojowych siatkówki w mysim modelu jaskry wywołanej N-metylo-D-asparaginianem, wykazując znaczną utratę komórek w porównaniu z około 45 000 do 50 000 RGC w normalnej siatkówce.
Przegląd
Niniejsze opracowanie przedstawia protokół izolacji całej siatkówki myszy oraz przeprowadzania immunobarwienia w celu znakowania komórek zwojowych siatkówki (RGCs). Wykorzystanie oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji do automatycznego liczenia pozwala na szybką i dokładną kwantyfikację RGCs, co ułatwia badanie schorzeń takich jak jaskra.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Anatomia siatkówki
- Badania nad jaskrą
Wstęp
- Komórki zwojowe siatkówki są kluczowe dla przetwarzania wzroku.
- Ręczne liczenie komórek RGC może być czasochłonne i pracochłonne.
- Automatyzacja liczenia z wykorzystaniem AI stanowi obiecującą alternatywę.
- Zrozumienie utraty komórek RGC jest niezbędne do badania jaskry.
Cel badania
- Opracowanie metody szybkiego ilościowego oznaczenia komórek zwojowych siatkówki.
- Ułatwienie badań nad jaskrą poprzez efektywną ocenę utraty komórek RGC.
- Wykorzystanie narzędzi zautomatyzowanych w celu zwiększenia dokładności liczenia komórek.
Zastosowane Metody
- Główna platforma obejmuje izolację całej siatkówki oraz barwienie immunocytochemiczne.
- Wykorzystanym modelem biologicznym jest siatkówka myszy, w szczególności w kontekście jaskry.
- Kluczowe etapy obejmują fiksację, inkubację przeciwciał oraz przetwarzanie obrazów przy użyciu oprogramowania AI.
- Protokół kładzie nacisk na staranną dyssekcję i obchodzenie się z siatkówką w celu zachowania integralności tkanki.
Główne wyniki
- Automatyczne liczenie pozwoliło na dokładną identyfikację ponad 15 000 RGC w mysim modelu jaskry.
- Zaobserwowano znaczną utratę komórek w porównaniu do zdrowych siatkówek, które zawierają około 50 000 RGC.
- Metoda ta zwiększa wydajność i redukuje błędy manualne podczas liczenia komórek.
Wnioski
- Badanie przedstawia usprawnione podejście do ilościowego oznaczania RGC z wykorzystaniem AI.
- Metoda ta daje nadzieję na postępy w badaniach nad leczeniem jaskry i zdrowiem siatkówki.
- Wnioski obejmują zrozumienie utraty RGC oraz potencjalne terapie chorób siatkówki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena utraty komórek zwojowych siatkówki (RGC) ma kluczowe znaczenie dla przedklinicznych badań nad jaskrą oraz oceny terapeutycznej. Zautomatyzowane barwienie immunocytochemiczne całych preparatów oraz liczenie komórek oparte na sztucznej inteligencji (AI) umożliwiają szybki, powtarzalny i skalowalny pomiar degeneracji RGC w modelach mysich. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel terapeutyczny oraz skuteczności leczenia w punktach zwrotnych odkryć i badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną kwantyfikację utraty RGC w celu zbadania mechanizmów neurodegeneracyjnych w modelach jaskry.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów neuroprotekcyjnych poprzez pomiar przeżywalności komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie obiektywnych danych z całej siatkówki do weryfikacji hipotez.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zstandaryzowane i powtarzalne zliczanie RGC dla procesów opracowywania testów oraz przesiewania związków.
- Umożliwia wysokoprzepustową ocenę potencjalnych terapeutyków poprzez skrócenie czasu ręcznego zliczania z godzin do minut.
- Dostarcza wyników ilościowych odpowiednich do porównań między różnymi badaniami i modelami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia przedkliniczną kwantyfikację RGC, dostosowując ją do punktów końcowych istotnych dla badań nad jaskrą.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając spójny pomiar neurodegeneracji.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka dzięki dostarczeniu rzetelnych i obiektywnych danych dotyczących skuteczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i późne oceny skuteczności w mysich modelach jaskry.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków neurodegeneracyjnych oraz walidację celów terapeutycznych in vivo.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, ilościowe zliczenia RGC do oceny związków i badań zależności dawka-odpowiedź.
- Analityka: Generuje powtarzalne, zautomatyzowane zliczenia komórek w celu wsparcia statystycznego porównania grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną poprzez zestawienie pomiaru utraty RGC z progresją choroby i punktami końcowymi terapii.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalny, zestandaryzowany schemat pracy, który można dostosować do różnych modeli neurodegeneracji i programów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuroprotekcyjnych oraz skuteczności leczenia.
- Wartość operacyjna: Redukuje nakład pracy ręcznej, zwiększa przepustowość i standaryzuje ilościowe oznaczanie RGC w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie solidnych decyzji go/no-go oraz selekcję projektów w portfelu w oparciu o obiektywne dane ilościowe.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację kandydatów neuroprotekcyjnych i programów translacyjnych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w zakresie dyssekcji siatkówki, immunostainingu oraz analizy obrazów.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej oraz oprogramowania do liczenia komórek opartego na AI.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów przygotowania tkanek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania w innych modelach neurodegeneracji przy odpowiednim doborze przeciwciał.
- Staranne obchodzenie się z tkankami jest kluczowe, aby uniknąć artefaktów, które mogłyby wpłynąć na automatyczną kwantyfikację.
