Name: Implantacja urządzeń optoelektronicznych w rdzeniu kręgowym gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Poznaj metodę implantacji sond neuronalnych w rdzeń kręgowy gryzoni. Technika umożliwia badaczom bez doświadczenia chirurgicznego eksplorację obwodów rdzenia kręgowego przy zachowaniu funkcji motorycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.S. jest częściowo finansowany przez czteroletnie stypendium doktoranckie z University of British Columbia. A.M. jest częściowo wspierany przez Canada Graduate Scholarship - Master's z Canadian Institute of Health Research (CIHR). D.S. potwierdza finansowanie z Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Award. Praca ta została częściowo sfinansowana przez rząd Kanady New Frontiers in Research Fund - Transformation (NFRFT-2020-00238). Schemat na rysunku 1 został wygenerowany przy użyciu Biorender.com, a model 3D został uzyskany za zgodą sketchfab.com.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i nadzorowane przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Samice szczurów Long-Evans, o wadze 350-450 g i w wieku 6-8 miesięcy, były trzymane w grupach (21 °C; 12 godzin : 12 godzin cyklu świetlnego) i otrzymywały ad libitum dostęp do standardowej diety gryzoni przed i po operacji. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę izofluranem (5% do indukcji i 2% do podtrzymania) podawanym w tlenie o natężeniu przepływu 1 l/min.</li>
	<li>Przenieś zwierzę z komory indukcyjnej na poduszkę grzewczą i niezwłocznie podłącz stożek nosowy izofluranu. Sprawdź, czy zwierzę znajduje się w znieczuleniu chirurgicznym, zapewniając całkowitą utratę odruchu szczypania palców u nóg na obu nogach.</li>
	<li>Ogol grzbiet szczura, zaczynając od podstawy uszu, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.</li>
	<li>Nałóż dużą ilość sterylnej maści na oczy i wstrzyknij podskórnie buprenorfinę (rozcieńczoną do 0,03 mg/kg) i 10 ml dzwonków z mleczanami (ogrzanymi do temperatury ciała).</li>
	<li>Przetrzyj ogolony obszar antyseptycznym peelingiem chirurgicznym (chlorheksydyna), a następnie alkoholem izopropylowym okrężnymi ruchami, zaczynając od środka ogolonego obszaru i poszerzając średnicę koła. Powtórz proces z mydłem/alkoholem jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zabezpiecz zwierzę w ramie stereotaktycznej, ustawiając głowę za pomocą nasmarowanych nauszników w celu zapewnienia stabilności (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Przez cały czas trwania zabiegu konsekwentnie zapewniaj wsparcie termiczne, sprawdzaj głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u nóg i monitoruj parametry życiowe</li>.
	<li>Umieść sterylną serwetę chirurgiczną na wierzchu zwierzęcia.</li>
</ol>
2. Odsłonięcie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym
<ol>
	<li>Używając sterylnych kleszczy, zacznij od badania palpacyjnego podstawy czaszki. Poczuj wyraźny wyrostek kolczysty, który rozciąga się rostrocaudycznie w pobliżu podstawy czaszki; to jest C214 (Rysunki 1B i Rysunek 2B).</li>
	<li>Kontynuuj badanie palpacyjne ogonowe do C2, aby znaleźć szczególnie ostry i spiczasty wyrostek kolczysty, identyfikowany jako T215 (<silna klasa="xfig">Rysunki 1B i <silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w skórze, zaczynając od C2 i rozciągając się doogonowo na około 1,5 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Rozmiar nacięcia może się różnić w zależności od zwierzęcia o różnych rozmiarach. Upewnij się z wyprzedzeniem, że anatomiczne punkty orientacyjne są zidentyfikowane i postępuj zgodnie z nimi.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć podskórną warstwę tłuszczową skalpelem, aby odsłonić nienaruszoną mięśnie grzbietowe.</li>
	<li>Gdy mięśnie grzbietowe zostaną odsłonięte, wykonaj rozwarstwienie, odciągając je od linii środkowej za pomocą dwóch kleszczy Adson (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
	UWAGA: Ważne jest, aby wykonać rozwarstwienie (rozsunięcie włókien mięśniowych), a nie przecinanie mięśni, aby zminimalizować krwawienie. Odpowiednie odsłonięcie mięśnia grzbietowego powinno ujawnić mięsień w kształcie kuli (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G). Mięsień ten całkowicie pokrywa C2 i częściowo zakrywa C3.</li>
	<li>Za pomocą rongeurów i sterylnych kleszczy podnieś płat skóry bezpośrednio doogonowo do naciętego obszaru. Użyj rongeurs, aby utworzyć małą kieszeń podskórną - będzie to lokalizacja urządzenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F). 
	UWAGA: Kieszeń podskórna powinna być większa niż samo urządzenie. Zaleca się, aby chirurg (chirurdzy) zmienił pozycję tak, aby był zwrócony przodem do zwierzęcia, aby poprawić kontrolę i widoczność podczas otwierania kieszonki podskórnej.</li>
	<li>Umieść zwijacz, aby odsłonić kręgosłup (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Za pomocą rongeurs usuń wszelkie pozostałe mięśnie lub tkanki pokrywające kręgi i zacznij identyfikować segmenty rdzenia kręgowego. Bezpośrednio doogonowo do mięśnia w kształcie kuli znajduje się C4, a następnie C5 i C6 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G-I). Po zakończeniu spłucz obszar operacyjny sterylną solą fizjologiczną i osusz sterylną gazą. 
	UWAGA: Mięsień w kształcie kuli całkowicie otacza C2 i częściowo rozciąga się nad C3. Odcinek rdzenia kręgowego bezpośrednio do niego ogonowy, z minimalnym kontaktem, jest oznaczony jako C4.</li>
	<li>Wykonaj laminektomię w zależności od przeznaczenia sondy.
	<ol>
		<li>W przypadku sondy pod blaszką należy wykonać laminektomię boczną w C5 i C6, tworząc boczny otwór w blaszce do przyszłego umieszczenia sondy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2H, Rysunek uzupełniający 1A).</li>
		<li>W przypadku sondy nad blaszką należy wykonać laminektomię przyśrodkową C5, upewniając się, że nie usuwasz bocznych aspektów wyrostka kolczystego - odsłaniając jedynie przyśrodkową ścieżkę do umieszczenia sondy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2I, Rysunek uzupełniający 1B).</li>
		<li>Po laminektomii spłucz obszar sterylną solą fizjologiczną i osusz sterylną gazą, aby usunąć wszelkie resztki kości. 
		UWAGA: Podczas wykonywania laminektomii bardzo ważne jest, aby docisnąć rungeurs do kości i unikać ruchów w dół, aby zapobiec uszkodzeniu rdzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znieczulenie zewnątrzoponowe urządzenia
<ol>
	<li>Przytrzymaj sterylne urządzenie sterylnymi kleszczami z plastikową końcówką (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3A) i wbij je do otworu podskórnego wykonanego wcześniej w kroku 2.9. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać dotykania urządzenia niesterylnymi rękawicami/narzędziami, aby zachować sterylność urządzenia. Używaj wyznaczonych sterylnych kleszczy do umieszczania i umieszczania urządzenia pod skórą.</li>
	<li>Zszyj lub przyklej urządzenie do sąsiedniej warstwy mięśniowej, aby było bezpieczne, zapewniając, że wszystkie szwy i procedury pozostaną sterylne. Użyj niewchłanialnych szwów 6-0 lub 7-0 dla optymalnego zabezpieczenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
	UWAGA: Używaj szwów niewchłanialnych w przypadku zszywania urządzenia do mięśni. W przeciwnym razie urządzenie jest podatne na ruchy po wchłonięciu szwów w ciele. Jeśli używasz kleju, upewnij się, że używasz komercyjnego sterylnego kleju chirurgicznego, który zapewnia jego długotrwałą stabilność i biokompatybilność. Unikaj mocowania urządzenia do podskórnej warstwy tłuszczu/tłuszczu, aby zapewnić niezawodne punkty kotwiczenia.
	<ol>
		<li>Zaplanuj pozycję korpusu urządzenia przed przystąpieniem do tego kroku. Ponieważ urządzenie będzie przymocowane na stałe, mogą wystąpić problemy z umieszczeniem sondy (krok 3.4), jeśli urządzenie znajduje się zbyt blisko lub zbyt daleko od pożądanego poziomu w rdzeniu kręgowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zwijacz wokół rdzenia kręgowego i otwórz odpowiednie okienko, aby umieścić sondę na rdzeniu kręgowym.</li>
	<li>Rozmieszczenie sond:
	<ol>
		<li>Umieszczenie sondy pod blaszką: Ostrożnie włóż sondę za pomocą kleszczyków z plastikową końcówką pod blaszki (C5 i C6), przesuwając ją przez boczne kanały wykonane w kroku 2.9.1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
		<li>Umieszczenie sondy nad rdzeniem kręgowym:
		<ol>
			<li>Wyreguluj sondę za pomocą kleszczyków z plastikową końcówką, aby wyrównać i umieścić końcówkę sondy na górze okna przyśrodkowego utworzonego w C5 w kroku 2.9.2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sterylnym, małym, a najlepiej ceramicznym pojemniku przygotuj cement, mieszając jedną miarkę proszku cementu dentystycznego, 3 krople zaawansowanego technologicznie smaru i jedną kroplę katalizatora. Mieszać sterylnymi wykałaczkami, aż do uzyskania lepkiej konsystencji. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby jedna osoba, która nie wykonuje zabiegu, przygotowała cement tak, aby chirurg mógł przytrzymać sondę na miejscu i wysuszyć żądany obszar bezpośrednio przed nałożeniem cementu. Ten krok jest wrażliwy na czas. Upewnij się, że chirurg ustawił sondę przed przygotowaniem cementu. Po nałożeniu katalizatora cement zgęstnieje zbyt mocno, aby skutecznie związać się z kością, jeśli nastąpi opóźnienie. Poćwicz z cementem przed operacją, aby upewnić się, że uzyskasz odpowiednią konsystencję przed umieszczeniem go na sondzie/kości.</li>
	<li>Całkowicie osusz zamierzony obszar cementowania na kręgach, aby uzyskać niezawodny punkt kotwiczenia. Nałóż 1-2 krople cementu dentystycznego na końcówkę sondy, którą należy umieścić na zamierzonym poziomie kręgów, w tym przypadku C4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C,D). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby kręgi były jak najbardziej suche przed cementowaniem. W przeciwnym razie cement nie będzie przylegał, a sonda nie zostanie zabezpieczona.</li>
	<li>Zatrzymaj się na 30 sekund i delikatnie dotknij cementu, aby sprawdzić, czy jest utwardzony.</li>
	<li>Jeśli cement nie jest całkowicie utwardzony, odczekaj dodatkowe 20 s i ponownie nałóż świeżo wytworzony cement, aż sonda zostanie solidnie przymocowana do kości. 
	UWAGA: Cement związał się prawidłowo, gdy staje się twardy i sztywny w dotyku. 
	UWAGA: Nakładanie cementu, gdy jest zbyt płynny, może spowodować jego przesiąkanie do tkanki rdzenia kręgowego między kręgami. W takim przypadku odczekaj około 10 sekund, aż cement zgęstnieje do konsystencji przypominającej dziąsło, a następnie delikatnie użyjesz kleszczyków do usunięcia cementu, który miał kontakt z rdzeniem kręgowym.</li>
</ol>
4. Zabiegi pooperacyjne
<ol>
	<li>Po zakończeniu operacji zszyj miejsce nacięcia za pomocą szwów vicryl 5-0. Delikatnie wyjmij zwierzę z aparatu stereotaktycznego i przenieś je do podgrzewanej komory rekonwalescencyjnej. Przez pierwsze 3-5 dni po operacji podawaj zwierzęciu miękką, nawilżoną karmę, smakołyki i wodę hydrożelową.</li>
	<li>Dokładnie monitoruj zwierzę dwa razy dziennie w pierwszym tygodniu po operacji. Podawać buprenorfinę i podgrzane laktowane zastrzyki Ringera dwa razy dziennie przez kolejne 2 dni lub dłużej, jeśli objawy bólu utrzymują się. Waż zwierzę codziennie przez tydzień po implantacji, a następnie co tydzień. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli zaobserwujesz utratę wagi. Kontynuuj codzienne kontrole, dopóki zwierzę nie wykaże żadnych klinicznych problemów zdrowotnych. Następnie sprawdzaj stan zwierzęcia co najmniej raz w tygodniu. 
	UWAGA: Monitoruj zwierzęta pod kątem utraty masy ciała o ponad 20%, silnego bólu niereagującego na leczenie, odsłoniętych implantów lub dużych surowiczów (3 razy większy rozmiar implantu), autofagii, odwodnienia lub połączonych objawów podnoszących kliniczną ocenę zdrowotną do konieczności eutanazji. W razie potrzeby skonsultuj się z weterynarzem, aby uzyskać informacje o opcjach leczenia.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Obrysuj obwód urządzenia na skórze po operacji i zamknięciu nacięcia, aby wizualnie wskazać położenie urządzenia w ciele (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Ten krok jest szczególnie przydatny, gdy urządzenie wymaga dostępu z zewnątrz, na przykład urządzenia muszą być zasilane bezprzewodowo przez zewnętrzny nadajnik, gdzie sprzężenie antenowe ma kluczowe znaczenie, lub pompy dostarczające leki, które muszą być uzupełniane przez skin16,17,18.</li>
</ol>

Spinal Cord Surgery and Optical Shank Implantation in Rodents

<ol><li>Osseward, P. J., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+circuit+modules+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cell type and circuit modules in the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 56, 175-184 (2019).</li>
<li>Alilain, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rescue+of+breathing+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 28 (46), 11862-11870 (2008).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+optogenetics+applications+for+central+nervous+system+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Advances in optogenetics applications for central nervous system injuries.</a> J Neurotrauma. 40 (13-14), 1297-1316 (2023).</li>
<li>Montgomery, K. L., Iyer, S. M., Christensen, A. J., Deisseroth, K., Delp, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+brain%3A+Optogenetic+control+in+the+spinal+cord+and+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Beyond the brain: Optogenetic control in the spinal cord and peripheral nervous system.</a> Sci Transl Med. 8 (337), 5(2016).</li>
<li>Tan, T., Watts, S. W., Davis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery%3A+Enabling+technology+for+drug+discovery+and+development.+iPRECIO+Micro+infusion+pump%3A+Programmable%2C+refillable%2C+and+implantable%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Drug delivery: Enabling technology for drug discovery and development. iPRECIO Micro infusion pump: Programmable, refillable, and implantable.</a> Front Pharmacol. 2, 44(2011).</li>
<li>Suehiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecto-domain+phosphorylation+promotes+functional+recovery+from+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ecto-domain phosphorylation promotes functional recovery from spinal cord injury.</a> Sci Rep. 4 (1), 4972(2014).</li>
<li>Harland, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subdural+bioelectronic+implant+to+record+electrical+activity+from+the+spinal+cord+in+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (20), 2105913(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+and+fully+implantable+upconversion+device+for+wireless+optogenetic+stimulation+of+the+spinal+cord+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Flexible and fully implantable upconversion device for wireless optogenetic stimulation of the spinal cord in behaving animals.</a> Nanoscale. 12 (4), 2406-2414 (2020).</li>
<li>Grajales-Reyes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+wireless%2C+battery-free+optoelectronic+epidural+implants+for+optogenetic+manipulation+of+spinal+cord+circuits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of wireless, battery-free optoelectronic epidural implants for optogenetic manipulation of spinal cord circuits in mice.</a> Nat Protoc. 16 (6), 3072-3088 (2021).</li>
<li>Kathe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+closed-loop+optogenetics+across+the+entire+dorsoventral+spinal+cord+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Wireless closed-loop optogenetics across the entire dorsoventral spinal cord in mice.</a> Nat Biotechnol. 40 (2), 198-208 (2022).</li>
<li>Hogan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+spinal+stimulation+system+for+ventral+activation+of+the+rat+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A wireless spinal stimulation system for ventral activation of the rat cervical spinal cord.</a> Sci Rep. 11 (1), 14900(2021).</li>
<li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+and+stretchable+nanowire-coated+fibers+for+optoelectronic+probing+of+spinal+cord+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Flexible and stretchable nanowire-coated fibers for optoelectronic probing of spinal cord circuits.</a> Sci Adv. 3 (3), e1600955(2017).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+flexible+electronics+advancing+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">How is flexible electronics advancing neuroscience research.</a> Biomaterials. 268, 120559(2021).</li>
<li>Keomani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+cervical+spinal+cord+injury+to+study+post-lesional+respiratory+neuroplasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A murine model of cervical spinal cord injury to study post-lesional respiratory neuroplasticity.</a> J Vis Exp. (87), e51235(2014).</li>
<li>Chaterji, S., Barik, A., Sathyamurthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+injection+of+adeno-associated+viruses+into+the+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intraspinal injection of adeno-associated viruses into the adult mouse spinal cord.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100786(2021).</li>
<li>Agrawal, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformal+phased+surfaces+for+wireless+powering+of+bioelectronic+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Conformal phased surfaces for wireless powering of bioelectronic microdevices.</a> Nat Biomed Eng. 1 (3), 0043(2017).</li>
<li>Park, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretchable+multichannel+antennas+in+soft+wireless+optoelectronic+implants+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (50), E8169-E8177 (2016).</li>
<li>Manoufali, M., Bialkowski, K., Mohammed, B., Abbosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+power+link+based+on+inductive+coupling+for+brain+implantable+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Antennas+and+Wirel+Propaga+Lett%22%5BJournal%5D)">Wireless power link based on inductive coupling for brain implantable medical devices.</a> IEEE Antennas and Wirel Propaga Lett. 17 (1), 160-163 (2018).</li>
<li>Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rating+scale+for+open-field+evaluation+of+behavioral+recovery+after+cervical+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats.</a> J Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+wireless+reprogrammable+multilateral+optogenetic+devices+for+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of wireless reprogrammable multilateral optogenetic devices for behavioral neuroscience.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1073-1096 (2022).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multilateral+devices+for+optogenetic+studies+of+individual+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors.</a> Nat Neurosci. 24 (7), 1035-1045 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Neuromodulacja i interwencje terapeutyczne rdzenia kręgowego często wymagają umieszczenia sond w precyzyjnych, docelowych segmentach 3,4,7,13. Biorąc pod uwagę nieodłączną ruchomość rdzenia kręgowego, sonda musi być niezawodnie zabezpieczona, aby umożliwić przewlekłe badania. W zależności od konkretnego zastosowania może być ważne kontrolowanie, czy sonda ma fizyczny kontakt z rdzeniem kręgowym, czy też kontakt można zmniejszyć, aby zmniejszyć reakcję zapalną tkanki, jeśli to możliwe. W związku z tym opisano kroki chirurgiczne dla każdej z dwóch metod. Protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób umieścić sondę w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego w C5. Niemniej jednak, korzystając z opisanego punktu orientacyjnego dla T2 lub T10 rdzenia kręgowego, sondę można podobnie umieścić w precyzyjnym miejscu nad odcinkiem piersiowym lub lędźwiowym, odliczając kręgi odpowiednio od T2 lub T10, gdy są one odsłonięte. Ponadto, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki rdzenia kręgowego, zabezpieczyliśmy korpus urządzenia, który jest często większy i sztywniejszy w porównaniu z podłączoną sondą, w przestrzeni podskórnej z dala od rdzenia kręgowego.
Istnieje kilka krytycznych punktów wszczepienia urządzenia, które jest sprzężone z sondą. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby zdecydować o lokalizacji korpusu urządzenia przed zacementowaniem sondy. Zapewnia to optymalizację odległości między końcówką sondy a korpusem urządzenia w celu zmniejszenia naprężenia sondy, a także uniknięcia dodatkowej długości sondy, która może na przykład spowodować skręcenie lub przemieszczenie sondy. Zasadniczo celem jest upewnienie się, że długość sondy jest podobna do odległości od przestrzeni podskórnej, w której umieszcza się korpus urządzenia, do docelowego obszaru rdzenia kręgowego, w którym sonda jest zacementowana. Przeprowadzając końcowe zabiegi chirurgiczne, w których testowane są różne długości sondy, można określić optymalny rozmiar dla docelowego segmentu.
Aby zachować sterylność, z urządzeniem należy obchodzić się ostrożnie, aby zapobiec kontaktowi z zewnętrzną warstwą skóry podczas wprowadzania do kieszonki podskórnej. Taki kontakt może zagrozić sterylności urządzenia, potencjalnie prowadząc do infekcji pooperacyjnej. Ponadto ważne jest, aby zminimalizować siłę wywieraną na urządzenie podczas trzymania go kleszczami, aby zapobiec uszkodzeniu jego powłoki, która jest zazwyczaj cienką warstwą ochronną, izolacyjną i sterylną20,21. Usunięcie powłoki może drastycznie skrócić żywotność urządzenia, na przykład poprzez skrócenie obwodu, spowodowanie porażenia prądem zwierzęcia i/lub wywołanie reakcji zapalnej w organizmie. Obchodzenie się z urządzeniem za pomocą kleszczyków z plastikową końcówką może pomóc w zmniejszeniu takich komplikacji.
Podczas przyszywania urządzenia do tkanek miękkich ważne jest, aby unikać szycia do podskórnej tkanki tłuszczowej. Jak zaobserwowano we wstępnych badaniach, warstwy tłuszczu nie są niezawodnym punktem zakotwiczenia szwów, ponieważ są podatne na pękanie. Zamiast tego korpus urządzenia został zszyty do sąsiedniej warstwy mięśniowej w przestrzeni podskórnej za pomocą niewchłanialnych szwów w celu trwałego umieszczenia urządzenia w ciele. Z drugiej strony, podczas mocowania sondy do wyrostków kolczystych, ważne jest, aby przed nałożeniem cementu upewnić się, że miejsce, do którego sonda jest mocowana, jest suche. Mokry kość/sonda wydłuża czas utwardzania i może spowodować całkowite niepowodzenie procesu.
Istnieje kilka krytycznych kwestii związanych z urządzeniem wszczepialnym, które należy dokładnie rozważyć przed zabiegiem implantacji. (1) Elektrycznie czynne części urządzenia muszą być otoczone izolacyjną warstwą pasywacyjną. Jakakolwiek deprywacja w warstwie pasywacyjnej może spowodować awarię funkcjonalności urządzenia. (2) Zwierzę do implantacji musi być dokładnie wysterylizowane zgodnie z protokołem zakładu dla zwierząt. (3) Połączenie między urządzeniem a sondami neuronowymi lub trzonkami stymulującymi musi być bezpiecznie uformowane. Połączenie będzie poddawane powtarzalnym naprężeniom mechanicznym z powodu ciągłych ruchów zwierząt. (4) Sondy neuronowe lub trzonki stymulujące przymocowane do urządzenia muszą być wystarczająco elastyczne i rozciągliwe, aby uniknąć zatrzaskiwania się w różnych punktach.
Opisany protokół może zostać rozszerzony na urządzenia implantacyjne w modelach zwierzęcych o różnych rozmiarach. Po zidentyfikowaniu anatomicznych punktów orientacyjnych, opisane metody chirurgiczne można metodycznie dostosować, aby zabezpieczyć wszelkie sondy neuronowe lub trzonki stymulujące w docelowych segmentach rdzenia kręgowego i wszczepić powiązane z nimi moduły sterujące. Jednak w zależności od zastosowania, różne urządzenia mogą mieć różne rozmiary, materiały i grubości od tego wszczepionego w ten papier; Na przykład urządzenia podłączone do zewnętrznego modułu sterującego wymagają dodatkowych względów. Ponadto należy zauważyć, że chociaż protokół ten jest dostosowany do stymulacji optogenetycznej, inne zastosowania neuromodulacyjne, takie jak dostarczanie leków lub stymulacja/rejestracja elektryczna, wymagają nieco innych procedur chirurgicznych. W szczególności aplikacje te wymagają implantacji podtwardówkowej, aby zapewnić bezpośredni kontakt z rdzeniem kręgowym pod oponą twardą7. Jednak w przypadku optogenetyki bliski kontakt z tkanką jest zazwyczaj zbędny, ponieważ opona twarda gryzonia nie utrudnia znacząco przenikania światła, co umożliwia umieszczenie źródeł światła w pozycji zewnątrzoponowej10.

Rdzeń kręgowy ułatwia szereg podstawowych funkcji ośrodkowego układu nerwowego, od koordynowania zachowań motorycznych po regulację procesów homeostatycznych, takich jak oddychanie1,2. Wyjaśnienie roli wyrafinowanej sieci obwodów w rdzeniu kręgowym wymaga interfejsów, czy to do stymulacji elektrycznej, nagrywania, dostarczania leków, czy stymulacji optycznej do docelowych obszarów3,4,5,6. Chociaż urządzenia zostały opracowane w celu umożliwienia takich przesłuchań7,8,9,10,11, do ich przewlekłego wszczepienia do rdzenia kręgowego wymagane są specjalistyczne techniki chirurgiczne4. W szczególności rdzeń kręgowy i związane z nim kręgi mają zwiększoną podatność na deformacje mechaniczne spowodowane naturalnymi ruchami, takimi jak rozciąganie i zginanie8,12,13. Te unikalne cechy rdzenia kręgowego sprawiają, że z natury rzeczy trudno jest zapewnić, aby wszczepione sondy pozostały stabilne, funkcjonalne i zabezpieczone w określonym segmencie przez dłuższy czas.
Tutaj opisany jest protokół chirurgiczny dotyczący wkładania i zabezpieczania trzonu optycznego w docelowym segmencie rdzenia kręgowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Ponieważ wykazano, że w szczególności łączenie się z obszarem szyjki macicy stwarza unikalne wyzwania9, etapy implantacji są specjalnie pokazane w obszarze szyjki macicy C5. Przypuszcza się, że złożoność kręgosłupa szyjnego wynika z jego głębszego położenia i obfitości mięśni, co nie jest tak widoczne wzdłuż reszty rdzenia kręgowego. Niezależnie od tego, procedury opisane w tym protokole zostały zaprojektowane tak, aby można je było dostosować do operacji w różnych obszarach rdzenia kręgowego. Podano instrukcje krok po kroku, aby zlokalizować i zidentyfikować segmenty rdzenia kręgowego za pomocą wyraźnych anatomicznych "punktów orientacyjnych" rozpoznawalnych zza skóry (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Protokół wyjaśnia następnie dwie techniki implantacji chirurgicznej: jedną dostosowaną do sond wymagających bezpośredniego kontaktu z rdzeniem kręgowym, a drugą dla sond, które mogą nie wymagać bezpośredniego kontaktu. Opisane kroki są zaprojektowane tak, aby mogły być odtworzone przez każdego badacza przeszkolonego w zakresie chirurgii przetrwania gryzoni.
Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące implantacji urządzenia optoelektronicznego (18 mm x 13 mm) z dołączonym elastycznym trzonkiem optycznym na poziomie szyjki macicy C5. Wszczepialne urządzenie jest przymocowane podskórnie doogonowo do C5 i składa się ze wskaźnika diody elektroluminescencyjnej (μLED) w mikroskali, który zapala się, gdy następuje stymulacja optyczna rdzenia kręgowego, zapewniając na żywo informację zwrotną o działaniu urządzenia. Wpływ wszczepionego trzonka optycznego na naturalne funkcje motoryczne oceniano u gryzoni, które otrzymały implanty, i porównano z gryzoniami po pozorowanych operacjach. Wyniki wskazują, że sondy nie wpływają negatywnie na naturalną funkcję kończyn tylnych i przednich zwierzęcia siedem dni po implantacji.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze Adson&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Alm 3-punktowy retraktor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17010-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina / Vetergesic&nbsp;</td><td>CDMV</td><td>124918</td><td>Producent podaje w dawce 0,3 mg/ml, ale musi być rozcieńczony do 0,03 mg/kg do stosowania u szczurów</td></tr><tr><td>Roztwór chlorheksydyny 2%</td><td>Partnar</td><td>PCH-020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione długie kleszcze do hemostatu</td><td>Narzędzia KaamKaaj</td><td>14,5</td><td>Zakrzywione długie kleszcze do hemostatów z pęsetą blokującą grzechotkę ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>CVD Parylene Maszyna: SCS Labcoter 2</td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>PDS 2010</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny - Katalizator&nbsp;</td><td>Parkell, Inc</td><td>S371</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny - Metabond</td><td>Parkell, Inc</td><td>S398</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny - Proszek&nbsp;</td><td>Parkell, Inc</td><td>Kleszcze S396</td><td></td></tr><tr><td>z wymiennymi plastikowymi końcówkami</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11980-13</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran USP</td><td>Fresenius Kabi&nbsp;</td><td>CP0406V2</td><td>Dostarczane na poziomie 5% do indukcji i 2% do konserwacji przez waporyzator precyzyjny&nbsp;</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy 70%</td> <td>McKesson</td><td>350600</td><td></td></tr><tr><td>Lacri-Lube Sterylna maść do oczu&nbsp;</td><td>Odśwież&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Evans Rats</td><td>Charles River Laboratories</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Niskotemperaturowa pasta lutownicza</td><td>Chip Quik Inc.</td><td>11.38</td><td></td></tr><tr><td>Magnesy</td><td>Radial Magnets, Inc.</td><td>0,53</td><td>Magnes Neodymowo-żelazowo-borowy (NdFeB) N35 (3,00 mm x 1,00 mm)</td></tr><tr><td>Uchwyty igieł Olsen-Hegar z obcinakami do szwów&nbsp;</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PDMS: SYLGARD&nbsp; 184</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Chip topnika lutowniczego</td><td>Quik Inc.</td><td>14.25</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna&nbsp;</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny klej Kwik-Sil World</td><td>Precision Instruments</td> Latarka <td>UV KWIK-SIL-S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vansky</td><td>19.99</td><td></td></tr><tr><td>Bezprzewodowa ładowarka</td><td>Nilkin</td><td>NKT06</td><td></td></tr><tr><td>Bezprzewodowa cewka ładująca</td><td>TDK Corporation</td><td>WT202012-15F2-ID</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja urządzeń optoelektronicznych w rdzeniu kręgowym gryzoni

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulacja może dostarczyć zastosowań diagnostycznych, modulacyjnych i terapeutycznych. Chociaż przeprowadzono szeroko zakrojone prace w mózgu, modulacja rdzenia kręgowego pozostaje stosunkowo niezbadana. Z natury delikatna i ruchoma tkanka rdzenia kręgowego narzuca ograniczenia, które sprawiają, że precyzyjne wszczepienie sond neuronowych jest wyzwaniem. Pomimo ostatnich postępów w dziedzinie urządzeń do neuromodulacji, w szczególności elastycznej bioelektroniki, możliwości rozszerzenia ich zastosowania w rdzeniu kręgowym są ograniczone przez złożoność chirurgiczną implantacji urządzeń. W tym miejscu zapewniamy szereg protokołów chirurgicznych dostosowanych specjalnie do wszczepienia specjalnie wykonanego urządzenia optoelektronicznego, które łączy się z rdzeniem kręgowym u gryzoni. Kroki, które należy wykonać, aby umieścić i zakotwiczyć trzpień optyczny w określonym segmencie rdzenia kręgowego za pomocą dwóch różnych metod implantacji chirurgicznej, są szczegółowo opisane tutaj. Metody te są zoptymalizowane pod kątem różnorodnych urządzeń i zastosowań, które mogą, ale nie muszą, wymagać bezpośredniego kontaktu z rdzeniem kręgowym w celu stymulacji optycznej. Aby wyjaśnić metodologię, najpierw odwołuje się do anatomii kręgów, aby zidentyfikować widoczne punkty orientacyjne przed wykonaniem nacięcia skóry. Przedstawiono kroki chirurgiczne mające na celu zabezpieczenie trzonu optycznego nad kręgosłupem szyjnym u gryzoni. Następnie przedstawiono procedury mocowania urządzenia optoelektronicznego podłączonego do trzpienia optycznego w przestrzeni podskórnej z dala od rdzenia kręgowego, minimalizując niepotrzebny kontakt bezpośredni. Badania behawioralne porównujące zwierzęta otrzymujące implanty z tymi, które przechodzą pozorowane operacje, wskazują, że trzonki optyczne nie wpłynęły negatywnie na funkcję kończyn tylnych lub przednich siedem dni po implantacji. Niniejsza praca poszerza zestaw narzędzi do neuromodulacji do wykorzystania w przyszłych badaniach mających na celu zbadanie różnych interwencji rdzenia kręgowego.

Urządzenie optoelektroniczne, którego szczegółowy schemat funkcjonalny przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 2, wszczepiono czterem szczurom linii Long Evans. Rysunek uzupełniający 3 przedstawia gotowe do implantacji urządzenie optoelektroniczne. Trzy pozostałe zwierzęta poddano operacjom pozorowanym, które obejmowały przyśrodkową laminektomię na poziomie C5 bez implantacji urządzenia. Urządzenie optoelektroniczne składało się z elastycznej sondy z wbudowaną diodą µLED na końcówce, aktywowaną przez zintegrowany sterownik LED. Sterownik LED jest kontrolowany przez mikrokontroler z programowalnym oprogramowaniem układowym. Urządzenie obejmowało również korpus, który przyszyto do warstwy mięśniowej bezpośrednio pod skórą. Na całe urządzenie naniesiono warstwę Parylenu-C (~10 µm) metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej (CVD). Druga warstwa polidimetylosiloksanu (PDMS) (~800 µm) pokrywała korpus urządzenia optoelektronicznego (Rysunek uzupełniający 3), tworząc miękki interfejs z tkanką. Końcówka sondy została zabezpieczona na poziomie C4, tak aby dioda µLED znajdowała się nad poziomem C5. W urządzeniu zastosowano wskaźnik µLED (którego światło było widoczne spod skóry), który włączał się jednocześnie z diodą µLED trzpienia optycznego w celu weryfikacji funkcjonalności urządzenia w czasie rzeczywistym. Zwierzęta monitorowano przez okres 7 dni po operacji, aby potwierdzić trwałą niezawodność ich działania w czasie (Rysunek 4B).
Funkcje motoryczne zwierząt oceniono za pomocą skali oceny lokomocji w otwartym polu według Martinez19. W celu oceny zachowania w otwartym polu dwóch przeszkolonych obserwatorów, nieznających przydziału zwierząt do grup badawczych, przeprowadziło testy przed operacjami oraz w trzecim, piątym i siódmym dniu po zabiegu. Po zebraniu danych przeprowadzono test U Manna-Whitneya, aby określić różnice w punktacji kończyn przednich i tylnych w każdym punkcie czasowym pomiędzy grupą z implantem a grupą kontrolną (sham). Nasza analiza wskazuje na podobną punktację funkcji kończyn przednich w grupach z implantem i kontrolnej do siódmego dnia (Rycina 5A). Podobnie, nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między grupami w punktacji kończyn tylnych we wszystkich punktach czasowych (Rycina 5B).
Weryfikację pośmiertną przeprowadzono 7 dni po implantacji, aby potwierdzić, czy sonda i korpus urządzenia pozostały na miejscu. Nie stwierdzono widocznego oderwania szwu ani urządzenia. Ponadto pociągnięcie za korpus urządzenia nie spowodowało jego oddzielenia od tkanki (Rysunek uzupełniający 4A). Następnie odsłonięto wcześniej rozcięte i zaszyte mięśnie nad rdzeniem kręgowym i potwierdzono, że sondy pozostały bezpiecznie przymocowane do rdzenia kręgowego (Rysunek uzupełniający 4B). Podobnie jak w przypadku korpusu urządzenia, głowicę sondy sukcesywnie odciągano w kierunku przeciwnym do punktu mocowania, aby ocenić jej połączenie z mechanicznym złączem sonda-blaszka łukowa.
<img alt="Anatomia gryzonia z implantem i strukturą kręgosłupa; schemat badawczy dotyczący interfejsu neuronalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd implantacji urządzenia i punktów orientacyjnych anatomii. (A) Przedstawienie rozmieszczenia sondy nad rdzeniem kręgowym oraz podskórnego umieszczenia urządzenia. (B) Model 3D wskazujący punkty orientacyjne wykorzystywane do wyznaczania poziomów rdzenia kręgowego. Dla odniesienia pokazano wyrostki kolczyste C2, T2 i T10. Ciemniejsze kolory wskazują odpowiadający im poziom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces operacji kręgosłupa szczura, schemat laminektomii C5-C6, technika chirurgiczna, badania weterynaryjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Odsłanianie rdzenia kręgowego i przygotowanie kieszonki podskórnej. (A) Aparat stereotaktyczny umieszczony na zwierzęciu. (B) Wyznaczono wyrostek kolczasty C2 i (C) wyrostek kolczasty T2 poprzez palpację. (D) Wykonano nacięcie skóry i tkanki tłuszczowej podskórnej w celu odsłonięcia mięśni grzbietowych w interesującym obszarze na poziomie szyjnym. (E) Poprzez tępe rozczepianie mięśni grzbietowych odsłonięto kręgi szyjne. (F) Utworzono kieszonkę podskórną do zabezpieczenia implantu w miejscu gudał od miejsca nacięcia. (G) Po odpowiednim rozczepieniu umieszczono rozsetnik, aby odsłonić kręgi szyjne i mięsień kulisty, który całkowicie zakrywa C2 i częściowo przesłania C3. Linia przerywana wskazuje mięsień kulisty. Po odsłonięciu szyjnego odcinka rdzenia kręgowego wykonano albo (H) dwie laminektomie boczne na poziomie C5 i C6 w celu umieszczenia sondy pod kręgami, albo (I) laminektomię przyśrodkową na poziomie C5 w celu umieszczenia sondy nad kręgami. Gwiazdki wskazują miejsce laminektomii bocznej. Paski skali = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej pokazujący umieszczenie sondy nad i pod blaszką łukową z widocznymi szwami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Implantacja urządzenia i rozmieszczenie sondy. (A) Urządzenie umieszczone w kieszeni podskórnej. (B) Urządzenie przyszyte do mięśni. (C) Sonda zabezpieczona na szczycie blaszki łukowej C5, poddanej przyśrodkowej laminektomii. (D) Urządzenie umieszczone pod blaszkami łukowymi C5 i C6, które obie zostały poddane laminektomii bocznej. W obu przypadkach (C) i (D) końcówka sondy została unieruchomiona cementem na poziomie nienaruszonego kręgu C4. Paski skali = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Regeneracja tkanki szczura z markerem bioluminescencyjnym; ustawienie eksperymentalne i porównanie wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Urządzenie do znakowania i weryfikacja funkcjonalności po operacji. (A) Lokalizacja urządzenia może zostać opcjonalnie zaznaczona na skórze po zszyciu, aby ułatwić jego identyfikację po operacji. (B) Rysunek przedstawia zwierzę po implantacji. Funkcjonalność urządzenia została zwalidowana poprzez obserwację wskaźnika µLED widocznego pod skórą, co potwierdza prawidłowe działanie urządzenia (zgrubienie po prawej stronie zwierzęcia to miejsce implantacji korpusu urządzenia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wyników oceny kończyn przednich i tylnych, implant vs grupa kontrolna (sham), pokazujący trendy powrotu do sprawności po implantacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Rycina 5: Wyniki testów behawioralnych w otwartym polu według skali Martinez w grupach kontrolnej (sham) i z implantem dla sprawności kończyn przednich i tylnych w czasie.Wykresy przedstawiają średnie wyniki behawioralne dla oceny w otwartym polu kończyn (A) przednich oraz (B) tylnych w czterech punktach czasowych: 0 (poziom wyjściowy), 3. dniu, 5. dniu i 7. dniu po implantacji (DPI). Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (SEM). Istotne różnice (p &lt; 0,05) między grupą kontrolną a grupą z implantem zaznaczono gwiazdkami (*) w konkretnych punktach czasowych. Legenda rysunku wskazuje, że grupa kontrolna (sham) jest przedstawiona linią przerywaną, natomiast grupa z implantem linią ciągłą. Wielkość próby dla grupy kontrolnej wynosiła n = 3, a dla grupy z implantem n = 4. Do oceny istotności różnic między grupami w każdym punkcie czasowym wykorzystano nieparametryczny test U Manna-Whitneya. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Ilustracja laminektomii. Linie przerywane wskazują obszary do resekcji dla (A) dwóch laminektomii bocznych w celu umieszczenia sondy pod kręgami oraz (B) laminektomii przyśrodkowej w celu umieszczenia sondy nad kręgami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Schemat urządzenia optoelektronicznego. Przedstawiono szczegółowy schemat blokowy urządzenia. Blok w lewym górnym rogu obrazuje rezonansowy obwód LC anteny odbiorczej zasilania bezprzewodowego. Odebrana energia jest prostowana i przekazywana do stabilizatora napięcia o niskim spadku napięcia (LDO). Jednostka mikrokontrolera automatycznie aktywuje urządzenie na podstawie zaprogramowanych parametrów, a sterownik LED zasila wszystkie mikrodiody LED (µLEDs) wbudowane w sondę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3: Urządzenie optoelektroniczne. Końcowe urządzenie optoelektroniczne z biokompatybilną enkapsulacją połączone z trzpieniem optycznym zawierającym 1 µLED na końcówce. Przerywany prostokąt przedstawia lokalizację µLED. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 4: Post-mortem weryfikacja stabilności urządzenia. Siedem dni po implantacji (A) korpus urządzenia pozostał przyszyty do muskulatury w tej samej pozycji, w której został wszczepiony, a (B) cementowana sonda pozostała przymocowana do górnej części blaszki łukowej C4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę chirurgiczną przeprowadzania operacji rdzenia kręgowego oraz wszczepiania i zabezpieczania trzonu optycznego nad rdzeniem kręgowym u gryzoni.

Implantacja urządzeń optoelektronicznych w rdzeniu kręgowym gryzoni

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

Wprowadzamy innowacyjną i łatwą do wykonania metodykę implantacji i zabezpieczania sond neuronowych w rdzeniu kręgowym gryzoni. Protokół implantacji jest przeznaczony dla sond neuronowych, które wymagają bezpośredniego kontaktu z rdzeniem kręgowym i może być dostosowany do sond, które nie wymagają bezpośredniego kontaktu. Ostatnie postępy w dziedzinie elastycznej bioelektroniki znacznie udoskonaliły wszczepialne urządzenia neuromodulacyjne.Chociaż urządzenia te są szeroko stosowane w badaniach nad mózgiem, istnieją ograniczone doniesienia na temat ich zastosowania w delikatnej i ruchomej tkance rdzenia kręgowego. Ponadto kręgosłup szyjny jest szczególnie głęboki w stosunku do reszty kręgosłupa, co dodatkowo komplikuje bezpieczeństwo sondy. Protokoły przedstawione w tym artykule umożliwiają naukowcom bez doświadczenia w chirurgii zbadanie skomplikowanych obwodów rdzenia kręgowego.W szczególności wdrożenie w pełni wszczepialnych urządzeń optoelektronicznych może odpowiedzieć na pytania związane z obwodami i funkcją rdzenia kręgowego. Na początek zabezpiecz ogolonego, znieczulonego szczura na stereotaktycznej ramie. Za pomocą sterylnych kleszczy zbadaj palpacyjnie podstawę czaszki, wyczuj wyraźny wyrostek kolczysty rozciągający się doogonowo w pobliżu podstawy czaszki, zidentyfikowany jako C2. Kontynuuj badanie palpacyjne ogonowe do C2, aby znaleźć szczególnie ostry i spiczasty wyrostek kolczysty identyfikowany jako T2. Wykonaj nacięcie w skórze za pomocą skalpela, zaczynając od C2 i rozciągając się doogonowo na około 1,5 centymetra.Ostrożnie przetnij podskórną warstwę tłuszczową, aby odsłonić nienaruszoną mięśnię grzbietową. Następnie wykonaj rozwarstwienie mięśni grzbietowych, odciągając je od linii środkowej za pomocą dwóch kleszczy Adson. Za pomocą rongeur i sterylnych kleszczy podnieś płat skóry bezpośrednio doogonowo do naciętego obszaru.Następnie za pomocą rongeurs utwórz małą kieszeń podskórną dla urządzenia optoelektronicznego. Umieść retraktor, aby odsłonić kręgosłup. Za pomocą rongeurs usuń wszelkie pozostałe mięśnie lub tkanki pokrywające kręgi i zacznij identyfikować segmenty rdzenia kręgowego.Bezpośrednio ogonowy do mięśnia w kształcie kuli jest C4, a następnie C5 i C6. Po zakończeniu spłucz obszar operacyjny sterylną solą fizjologiczną i osusz sterylną gazą. Aby umieścić sondę pod blaszką, należy wykonać laminektomię boczną w C5 i C6, tworząc boczny otwór w blaszce. Aby umieścić sondę nad blaszką, należy wykonać laminektomię przyśrodkową C5, odsłaniając jedynie ścieżkę przyśrodkową.Po laminektomii spłucz obszar sterylną solą fizjologiczną i osusz sterylną gazą, aby usunąć wszelkie resztki kości. Trzymaj sterylne urządzenie optoelektroniczne z plastikowymi końcówkami, sterylnymi kleszczami i wbij je do otworu podskórnego. Zszyj lub przyklej urządzenie do sąsiedniej warstwy mięśniowej.Umieść zwijacz wokół rdzenia kręgowego i otwórz odpowiednie okienko, aby umieścić sondę na rdzeniu kręgowym. Następnie ostrożnie włóż sondę za pomocą plastikowych kleszczyków pod blaszki C5 i C6, przesuwając ją przez boczne kanały. Aby umieścić sondę nad rdzeniem kręgowym, wyreguluj sondę za pomocą plastikowych kleszczyków do wyrównywania i umieść końcówkę sondy na górze okna przyśrodkowego utworzonego w C5. Całkowicie osusz zamierzony obszar cementowania przed nałożeniem jednej lub dwóch kropli cementu dentystycznego na końcówkę sondy.Na koniec potwierdzono, że zastosowany cement jest bezpieczny. Analiza funkcji motorycznych wykazała podobne wyniki funkcji kończyn przednich w grupach implantów urządzeń i grup pozorowanych do 7 dnia. Podobnie, nie było statystycznie istotnych różnic między grupami pod względem wyników kończyn tylnych we wszystkich punktach czasowych.

implantation-of-optoelectronic-devices-in-the-rodent-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje wszczepienie okienka rdzenia kręgowego znieczulonej myszy do obrazowania in vivo. Protokół stabilizuje odsłonięty rdzeń kręgowy za pomocą borokrzemianowego szkła osłonowego i wydrukowanej w 3D płyty tylnej. Metoda ta umożliwia mikroskopię dwufotonową o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania dynamiki bariery krew-mózg i interakcji nerwowo-naczyniowych.

Implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy do obrazowania in vivo

Rozwój optogenetyki dostarcza teraz środków do precyzyjnej stymulacji genetycznie zdefiniowanych neuronów i obwodów, zarówno in vitro, jak i in vivo.  Tutaj opisujemy montaż i wszczepienie światłowodu do przewlekłej fotostymulacji tkanki mózgowej.

Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej

Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

Pokazujemy chirurgiczne implanty i procedury rejestrujące do pomiaru wizualnych sygnałów elektrofizjologicznych z oka (elektroretinogram) i mózgu (wizualny potencjał wywołany) u przytomnych szczurów, co jest bardziej analogiczne do stanu ludzkiego, gdzie nagrania są prowadzone bez zakłóceń znieczulenia.

Implantacja i rejestracja bezprzewodowego elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u świadomych szczurów

Ten protokół opisuje wszczepienie szklanego okienka do rdzenia kręgowego myszy w celu ułatwienia wizualizacji za pomocą mikroskopii przyżyciowej.

Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Ten protokół chirurgiczny to krok po kroku przewodnik po wprowadzeniu cewnika wewnątrz kręgosłupa podtwardówkowego gryzonia, aby zapewnić ukierunkowane leczenie.

Dostęp do przestrzeni podtwardówkowej rdzenia kręgowego gryzoni w celu przeprowadzenia leczenia

W tym filmie zaprezentowano metodę preparowania i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Dysocjowane neurony komisuralne są użyteczne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów.

Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Poznaj metodę implantacji sond neuronalnych w rdzeń kręgowy gryzoni. Technika umożliwia badaczom bez doświadczenia chirurgicznego eksplorację obwodów rdzenia kręgowego przy zachowaniu funkcji motorycznych.

Implantacja urządzeń optoelektronicznych w rdzeniu kręgowym gryzoni

Przeglądaj więcej filmów