Opracowanie nieskomplikowanego modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu zmodyfikowanego metodą Weight-Drop i potwierdzonego rezonansem magnetycznym
11 kwietnia 2025
W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie modelu zwierzęcego z zamkniętym urazem głowy, replikującego wynik neuroobrazu niepowikłanego, łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z zachowaną strukturą mózgu w ostrej fazie i długotrwałym zanikiem mózgu. Podłużne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego jest podstawową metodą stosowaną do celów dowodowych.
Nasze badania koncentrują się na opracowaniu modelu zwierzęcego z zamkniętym urazem głowy, który naśladuje wyniki neuroobrazowania niepowikłanego, łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu. Kończymy na ustaleniu, czy różne parametry wpływu w RmTBI prowadzą do różnych zmian obrazowych, behawioralnych i patologicznych. Opracowaliśmy model zwierzęcy, który odtwarza zmiany radiologiczne nieskomplikowanego mTBI, wykazując znaczne deficyty behawioralne i długotrwałą atrofię mózgu.
Praca ta łączy przekrojowe badania na ludziach z badaniami patologii zwierząt, zapewniając translację i podłużną ocenę neuroobrazowania w celu lepszego zrozumienia progresji mTBI. Nasze wyniki otwierają nowe możliwości badania progresji choroby i zmian wyników po nieskomplikowanym mTBI. Podkreślają również kluczową rolę parametrów urazu w kształtowaniu wyników po urazie.
Nasze laboratorium koncentruje się na mTBI u dzieci i młodzieży, największej kohorcie pacjentów. Zastosujemy nasz wygodny model CHI do badania rozwojowego uszkodzenia mózgu i śledzenia długoterminowych zmian za pomocą rezonansu magnetycznego, ocen behawioralnych i neuropatologicznych. Na początek umieść znieczulonego szczura na poduszce grzewczej i zabezpiecz go w ramce stereotaktycznej za pomocą listwy do zębów.
Ustaw nauszniki, aby ustabilizować głowę. Upewnij się, że szczur jest wyśrodkowany i symetryczny w ramce stereotaktycznej. Teraz przymocuj czujnik pulsoksymetru do tylnej łapy, aby monitorować częstość oddechów, tętno, poziom tlenu we krwi i temperaturę ciała.
Nałóż krem do depilacji na głowę Po trzech minutach zetrzyj krem za pomocą wacików nasączonych 70% alkoholem izopropylowym. Kilkakrotnie wyczyść ogolony obszar za pomocą sterylnego wacika nasączonego jodem. Następnie usuń pozostałości jodu za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem.
Za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości około dwóch do 2,5 centymetra, aby uzyskać dostęp do powierzchni czaszki. Następnie usuń tkankę miękką z czaszki za pomocą wacika. Oczyść powierzchnię czaszki bawełnianym wacikiem nasączonym 0,9% solą fizjologiczną, a następnie suchym wacikiem.
Teraz zidentyfikuj bregmę jako punkt odniesienia do określenia obszaru wpływu. Po określeniu żądanych współrzędnych przymocuj okrągły kask ze stali nierdzewnej nad wyznaczonym obszarem za pomocą cementu dentystycznego. Następnie wyjmij poduszkę grzewczą i pulsoksymetr.
Przenieś urządzenie stereotaktyczne i szczura na stół podnośnika pod zamkniętym impaktorem urazu głowy. Podnieś ciało szczura za pomocą piankowej gąbki. Wyjmij szczura z nauszników, trzymając go zabezpieczonego na listwie zębatej połączonej ze stożkiem nosowym dostarczającym 2% izofluoru.
Upewnij się, że głowa i ciało szczura są wypoziomowane w kierunku rostrocaudalnym. Wyreguluj stół podnośny, aby upewnić się, że nie ma szczeliny między impaktorem CHI a kaskiem. Następnie należy wyłączyć izofluran bezpośrednio przed uderzeniem.
Teraz upuść 600-gramowy mosiężny ciężarek z wysokości jednego metra przez rurkę ze stali nierdzewnej na zabezpieczony impaktor z okrągłą końcówką, celując w metalowy hełm. Po uderzeniu opuść stół podnośnika. Wyjmij szczura z ramy stereotaktycznej i umieść go w pozycji leżącej na poduszce grzewczej.
Zapisz czas odruchu prostowania, czyli czas, w którym szczur próbuje przejść z pozycji leżącej na plecach do pozycji leżącej. Teraz ponownie zmobilizuj szczura w stereotaktycznej ramce. Zdejmij kask i oczyść całą tkankę łączną przed zacementowaniem z powierzchni czaszki.
Teraz przykryj czaszkę cementem dentystycznym i pozwól jej wyschnąć. Za pomocą tylnej części pęsety sprawdź, czy cement jest sztywny i twardy. Następnie zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów chirurgicznych 4o z czterema do pięciu niezależnych węzłów i nałóż miejscowe antybiotyki na miejsce operowane, aby zapobiec infekcjom.
Wstrzyknąć jeden mililitr na kilogram masy ciała karprofenu podskórnie w szyję jako środek przeciwbólowy po operacji. Umieść szczura w czystej klatce na poduszce grzewczej, aż odzyska przytomność. Gdy szczur usiądzie prosto, odłóż go z powrotem do klatki domowej.
Podawaj doustnie pięć mililitrów paracetamolu zmieszanego z 200 mililitrami wody dziennie przez trzy kolejne dni jako środek przeciwbólowy. Umieść znieczulonego szczura w uchwycie głowy i podłącz do stożka nosowego w celu utrzymania znieczulenia. Przymocuj głowę małym kawałkiem taśmy, aby zapobiec ruchowi podczas skanowania.
Następnie umieść podkładkę uciskową pod klatką piersiową, aby monitorować oddychanie. Włóż elektrody i przyklej klipsy pulsoksymetru do kończyny tylnej, aby sprawdzić tętno. Włóż sondę doodbytniczą, aby zmierzyć temperaturę w odbycie.
Przykryj szczura kocem grzewczym z krążącą ciepłą wodą i okładem z tkanek, aby utrzymać temperaturę ciała podczas eksperymentu. Użyj laserowego systemu pozycjonowania skanera PET MR, aby oznaczyć środek głowy w celu precyzyjnego wyrównania. Przenieś szczura do otworu MRI za pomocą zmotoryzowanego systemu transportu zwierząt, aż środek głowy zrówna się z izocentrum skanera.
Na koniec uzyskaj obrazy MRI i przeanalizuj je. Nie zaobserwowano istotnych pęknięć czaszki, stłuczenia mózgu, obrzęku istoty białej ani deformacji w obrazach ważonych T2 i mapach anizotropii frakcyjnej po jednym i 50 dniach od CHI, potwierdzając minimalne uszkodzenia strukturalne w modelu CHI. Znaczne zmniejszenie objętości kory mózgowej zaobserwowano po 50 dniach od CHI, a powtarzające się CHI powodowało większą utratę kory mózgowej w porównaniu z pojedynczym CHI.
Najbardziej znaczące zmniejszenie objętości kory mózgowej zaobserwowano w warstwach w bregma minus cztery do plus zero i bregma minus pięć do plus jeden po powtarzających się CHI o różnych parametrach uderzenia. Istotnie mniejszą objętość kory zaobserwowano przy bregma zero po centralnym CHI mózgu w porównaniu z SMCx CHI. Barwienie immunologiczne w 50 dniu po urazie wykazało akumulację astrocytów w ipsilesional SMCx, niezależnie od ciężkości CHI i miejsca wpływu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół tworzenia zwierzęcego modelu urazu zamkniętego głowy, który precyzyjnie odwzorowuje wyniki neuroobrazowania w przypadku niepowikłanego łagodnego urazu czaszkowo-mózgowego (mTBI). Model ten zachowuje strukturę mózgu w fazie ostrej, wykazując jednocześnie długotrwały zanik mózgu, i wykorzystuje podłużne obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) jako główne narzędzie oceny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Urazowe uszkodzenie mózgu
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Zrozumienie przebiegu niepowikłanego łagodnego urazu czaszkowo-mózgowego (mTBI) jest kluczowe, szczególnie w populacjach dzieci i młodzieży.
- Celem badania jest powiązanie przekrojowych badań na ludziach z patologią zwierzęcą, aby dostarczyć informacji na temat progresji mTBI.
- Badania koncentrują się na ocenie różnych parametrów uderzenia w celu analizy ich wpływu na mierniki wyników.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu zwierzęcego, który dokładnie odzwierciedla wyniki neuroobrazowania związane z mTBI.
- Zbadanie wpływu różnych parametrów uderzenia na wyniki behawioralne, obrazowe i patologiczne po urazie.
- Umożliwienie podłużnych ocen neuroobrazowych w celu zrozumienia długofalowych skutków mTBI.
Zastosowane metody
- Protokół wykorzystuje model zamkniętego urazu czaszkowo-mózgowego u szczurów.
- Procedura obejmuje precyzyjny zabieg stereotaktyczny w celu zadania kontrolowanego urazu, a następnie badanie MRI w celu analizy obrazowej.
- Kluczowe etapy obejmują znieczulenie, przygotowanie czaszki, zadanie urazu oraz późniejszą diagnostykę obrazową w określonych punktach czasowych.
- Po urazie przeprowadza się oceny behawioralne w celu ewaluacji powrotu do sprawności oraz występujących deficytów.
Główne wyniki
- Podłużne badanie MRI nie wykazało natychmiastowych uszkodzeń strukturalnych mózgu, jednak w późniejszych punktach czasowych zaobserwowano znaczną redukcję objętości kory.
- Powtarzające się urazy zamknięte głowy doprowadziły do większej utraty kory w porównaniu z pojedynczym zdarzeniem.
- Odnotowano akumulację astrocytów niezależnie od stopnia nasilenia urazu i miejsca uderzenia.
Wnioski
- Badanie pomyślnie ustanawia model do badania skutków łagodnych urazów czaszkowo-mózgowych, pogłębiając nasze zrozumienie progresji mTBI.
- Model ten umożliwia prowadzenie przyszłych badań nad złożonością parametrów urazu oraz ich wpływem na leczenie i rehabilitację.
- Ogólnie wyniki te podkreślają krytyczne znaczenie dynamiki urazu w kształtowaniu wyników neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niepowikłany łagodny uraz czaszkowo-mózgowy (mTBI) stanowi wyzwanie translacyjne ze względu na brak obrazowych znalezisk w fazie ostrej oraz zmienne wyniki długoterminowe. Niniejszy model przedkliniczny, integrujący kontrolowany uraz zamknięty głowy z podłużnymi badaniami MRI oraz ocenami behawioralnymi, umożliwia systematyczną ewaluację parametrów urazu i ich wpływu na progresję choroby. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz odkrywaniu biomarkerów dla portfeli badań nad neurotraumą.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów urazu oraz szlaków neurobiologicznych istotnych dla mTBI.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez korelację parametrów uderzenia z wynikami obrazowania i behawioralnymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie ostrych i przewlekłych sygnatur urazu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny system in vivo do oceny potencjalnych interwencji neuroprotekcyjnych.
- Standaryzuje ilościowe punkty końcowe obrazowania MRI oraz analizy behawioralnej dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Umożliwia opracowanie testów w celu identyfikacji biomarkerów obrazowych czułych na subtelne uszkodzenia mózgu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie przedklinicznych wyników obrazowania i analiz behawioralnych z klinicznymi cechami mTBI w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Wspiera podłużne monitorowanie biomarkerów istotnych dla choroby oraz procesów neurodegeneracyjnych.
- Uzasadnia dostosowanie ryzyka w rozwoju terapii neurotraumy na podstawie predykcyjnych wyników obrazowania.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model ten łączy wczesną fazę odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną, umożliwiając testowanie parametrów urazu i interwencji terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących związku między dynamiką uderzenia a neurodegeneracją.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych z MRI oraz danych behawioralnych do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia podłużne obrazowanie i wskaźniki behawioralne do analizy porównawczej między kohortami.
- Badania translacyjne: Dostosowuje przedkliniczne punkty końcowe do klinicznego obrazowania i wyników funkcjonalnych w mTBI.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną platformę do ciągłych badań nad neurotraumą i walidacji biomarkerów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów terapeutycznych i biomarkerów dla łagodnych urazów czaszkowo-mózgowych (mTBI).
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły indukcji urazu i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie parametrów urazu z wynikami translacyjnymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów w obszarze neurotraumatologii z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane mechanistyczne i obrazowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii stereotaktycznej, akwizycji obrazów MRI oraz fenotypowania behawioralnego.
- Wymaga dostępu do przedklinicznego MRI oraz infrastruktury analitycznej do badań podłużnych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołu pomiędzy zespołami, aby zapewnić powtarzalność urazu oraz punktów końcowych obrazowania.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych modeli gryzoni i parametrów urazu w celu szerszego zastosowania.
- Ograniczenia obejmują zmienność międzyosobniczą oraz potrzebę precyzyjnej kontroli warunków uderzenia.
