Name: Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj metody badania interakcji RBPR2 z RBP4 oraz wiązania 11-cis-retinalu z rodopsyną w kontekście homeostazy witaminy A. Techniki ilościowe ujawniają mechanizmy transportu między wątrobą a okiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Beacie Jastrzębskiej, Ph.D. (Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, OH) za jej porady dotyczące protokołu absorpcji rodopsyny. Praca ta była wspierana przez grant NIH-NEI (EY030889 i 3R01EY030889-03S1) oraz, częściowo, przez fundusze startowe University of Minnesota dla G.P.L.

1. Metodologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)
<ol>
	<li>Przygotowanie i oczyszczanie mysiego białka RBP4
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery do generowania cDNA myszy RBP4 (msRBP4) o pełnej długości (sekwencja referencyjna NCBI: NM_001159487.1). Sklonuj cDNA msRBP4 do wektora ekspresyjnego opornego na kanamycynę pET28a His-tag i ulegnij ekspresji w komórkach BL-21 DE3 (tabela materiałów).</li>
		<li>Przekształć kompetentne komórki BL-21 DE3 (zgodnie z protokołem producenta) za pomocą ligowanego wektora msRBP4-pET28a, a następnie płytkę na płytkach agarowych bulionu Luria-Bertani (LB) zawierających Kanamycynę 50 μg/ml30,37. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze, a następnego dnia przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu dodatnich kolonii.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w 5 ml bulionu LB zawierającego kanamycynę 50 μg/ml.</li>
		<li>Dla hodowli wtórnej w 500 ml bulionu LB zawierającego Kanamycynę 50 μg/ml należy użyć 1% objętości kultury podstawowej (od kroku 1.1.3) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny; sprawdzić gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru. Najlepiej postępować, jeśli wartość OD wynosi od 0,6 do 1, aby indukować ekspresję białka za pomocą 0,5 mM IPTG w temperaturze 24 °C przez noc.</li>
		<li>Stosować wiele stężeń IPTG w zakresie 0,1-1 mM i 16-30 °C, aby zoptymalizować ekspresję i stabilność msRBP4.</li>
		<li>Odwirować kulturę (od etapu 1.1.5) w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut, odrzucić supernatant i pozostawić osad na lodzie.</li>
		<li>Homogenizować osad z buforem do lizy (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% glicerol, 0,5 mM PMSF i inhibitory proteazy [pH 8,0]). Sonikuj lizat przez 15 s cyklu ON i 30 s OFF za pomocą homogenizatora o mocy wyjściowej 250 W i częstotliwości wyjściowej 40-50% 20 kHz. Powtórz 5 razy.</li>
		<li>Usunąć resztki komórek i niezlizowane komórki przez odwirowanie w stężeniu 16 000 × g przez 20 minut. Przepuścić supernatant lizatu przez kolumnę NTA z buforem zrównoważonym.</li>
		<li>Przemyć kolumnę buforem do lizy (z etapu 1.1.8) zawierającym 30 mM imidazolu.</li>
		<li>We frakcjach eluować związane białko msRBP4 za pomocą buforu zawierającego 250 mM imidazolu. Uruchom eluowane frakcje i wizualnie monitoruj ilość białka za pomocą 12% żelu poliakrylamidowego SDS, wybarwionego Coomassie Brilliant Blue R-250 w roztworze metanolu: woda: kwas octowy (45:45:10) i odbarwiaj roztworem bez barwnika Coomassie metanol: woda: kwas octowy (45:45:10).</li>
		<li>Połącz niewykorzystane frakcje i dializa połączonych frakcji za pomocą kasety dializacyjnej 10K o mocy 10 kDa MWCO.</li>
		<li>Oceń jakość dializowanej frakcji na 12% żelu SDS-PAGE i określ ilościowo stężenie białka. 
		UWAGA: W analizie SPR wykorzystano białko Apo-RBP4. Aby uzyskać informacje na temat generowania holo-RBP4 (RBP4-retinol), zapoznaj się ze szczegółowymi protokołami opublikowanymi w innym miejscu36,37.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna walidacja peptydów RBPR2 i STRA6 z RBP4 pod kątem struktury i interakcji za pomocą testu fluorescencji tryptofanu i spektroskopii dichroizmu kołowego (CD)
	<ol>
		<li>Test fluorescencji tryptofanu
		<ol>
			<li>Skorzystaj z internetowego narzędzia do analizy składu białek (https://web.expasy.org/protparam/) i wklej sekwencję aminokwasów w jednoliterowym kodzie, aby ocenić skład strukturalny rekombinowanego białka RBP4 oraz poszczególnych peptydów RBPR2 i STRA6 w celu określenia reszt aminokwasowych tryptofanu w poszczególnych peptydach i białku (tabela materiałów).</li>
			<li>Kliknij przycisk parametrów obliczeniowych i oceń skład aminokwasowy dla reszt tryptofanu (Trp). 
			UWAGA: Reszty tryptofanu muszą być obecne w poszczególnych analizowanych peptydach lub białkach.</li>
			<li>Rozcieńczyć poszczególne peptydy RBPR2 i STRA6 w różnych stężeniach mikromolowych i inkubować pojedynczo z 3 μg msRBP4 na 96-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wzbudzić mieszaninę przy 290 nm i zeskanować emisję od 300 nm do 400 nm długości fali.</li>
			<li>Znormalizuj dane za pomocą ślepej próby (tylko bufor, bez peptydu i bez białka) i warunku kontroli peptydu (bez białka) i wykreśl. 
			UWAGA: Przyrost fluorescencji tryptofanu po ekspozycji na niskie lub wysokie stężenie peptydu sugeruje pozytywną interakcję między dwoma pojedynczymi peptydami a białkiem RBP4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD)
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć poszczególne peptydy i rekombinowane białko RBP4 w 1x buforze PBS, pH 7,0. Do kontroli jakości należy użyć różnych stężeń peptydów RBPR2 i STRA6 oraz białka RBP4 od 0,1 do 10 μg/ml, jak opisano poniżej.</li>
			<li>Dodać pojedyncze rozcieńczone peptydy i białko do kuwety o długości ścieżki 0,1 cm i zmierzyć absorbancję/eliptyczność CD za pomocą spektrofotometru CD (195-250 nm). Skorzystaj z poniższego wzoru, aby obliczyć średnią eliptyczność pozostałości (θ). 
			[v] = (S × mRw)/(10cl) 
			S oznacza sygnał CD w mθ; mRw oznacza średnią masę pozostałości; c oznacza stężenie białka w mg/ml; a l oznacza długość ścieżki w cm.</li>
			<li>Oblicz procentową zmianę struktury cząsteczki za pomocą analizy struktury drugorzędowej BeStSel do przewidywania fałdowania białek za pomocą spektroskopii CD (https://bestsel.elte.hu). 
			UWAGA: Struktura drugorzędowa wskazuje na prawidłowe fałdowanie i konserwatywne potwierdzenia kluczowe dla badania interakcji i wyniku interakcji. Sprawdź przewidywaną strukturę domeny i kontynuuj badanie interakcji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza SPR w celu określenia powinowactwa wiązania i parametrów kinetycznych receptorów błonowych witaminy A (RBPR2 i STRA6) z ich fizjologicznym ligandem RBP4
<ol>
	<li>Do unieruchomienia RBP4 na powierzchni chipa CM5 używamy chipa czujnika SPR, który przenosi łącznik karboksymetylodekstranowy wydłużony do rozmiaru ~100 nm kowalencyjnie przymocowany do złotej powierzchni. W obecności chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC), N-hydroksysukcynimid (NHS) przekształca grupy karboksylowe na powierzchni chipa w estry N-hydroksysukcynimidowe, które spontanicznie reagują z grupami aminowymi aminokwasów i białek, zmuszając ligand do kowalencyjnego wiązania się z powierzchnią chipa (tabela materiałów). 
	<ol>
		<li>Unieruchomić oczyszczone białko msRBP4 na chipie czujnika (Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2). W menu Uruchom oprogramowanie wybierz Kreatora i przejdź do opcji unieruchomienia. Rozcieńczyć ligand (msbiałka RBP4 otrzymanego z kroku 1.1) w buforze immobilizacyjnym (10 mM bufor octanu sodu, pH 5,0) do 10 μg/ml (4 μl liganda + 396 μl buforu) i poddzielić odczynniki sprzęgające w fiolkach. Otwórz okno kreatora konfiguracji unieruchomienia z kontrolki oprogramowania, wybierz chip CM5 i opcję Unieruchomić komórkę przepływową 2 i docelowy poziom 1,200 jednostki odpowiedzi (RU) w celu osiągnięcia Rmax 30 RU w badaniu kinetycznym i roztworze do mycia: etanoloamina. Wprowadź nazwę RBP4 i kliknij przycisk Dalej. 
		UWAGA: Opcjonalnie: Okno dialogowe Przygotowanie systemu dla opcji Przygotowanie systemu przed uruchomieniem nie jest wymagane, jeśli wcześniej przeprowadzono zalewanie buforem PBST (buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej z 0,05% roztworem detergentu Tween 20).</li>
		<li>W oknie dialogowym Pozycja szafy kliknij przycisk Wysuń stelaż. Weź stojak i umieść fiolki z przypisanymi objętościami dla każdego odczynnika: 156 μl msRBP4, 177 μl etanoloaminy, 89 μl EDC, 89 μl NHS i pustą fiolkę. Włóż stojak z fiolkami na próbki i kliknij OK i Dalej.</li>
		<li>W oknie dialogowym Prepare Run Protocol (Przygotowywanie protokołu uruchamiania) kliknij przycisk Start and Save (Zapisz).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zestaw testów kinetycznych peptydów RBPR2 i STRA6
	<ol>
		<li>Seryjnie rozcieńczyć mysie peptydy RBPR2, zmutowane RBPR2 i STRA6 (chemicznie zsyntetyzowane wcześniej31 i wymienione w Tabeli Materiałów) w buforze do pracy w zakresie 0,8-26,6 μM.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie sterujące i wybierz Kreatora Kinetyki/Powinowactwa. Kliknij pozycję Plik | Otwórz szablon i wybierz Kinetyka/Powinowactwo. Wprowadź ścieżkę przepływu 2-1 w oknie dialogowym sekwencji wtrysku (komórka przepływu 2 jako aktywna i komórka przepływu 1 jako odniesienie), sprawdź typ układu CM5 i kliknij przycisk Dalej. W oknie dialogowym konfiguracji zaznacz opcję Uruchom cykle uruchamiania, wprowadź Rozwiązanie: bufor i cykle: i kliknij przycisk Dalej.</li>
		<li>W oknie dialogowym parametrów wtrysku wprowadź wartości parametrów próbki: czas kontaktu: 120 s, natężenie przepływu 30 μL/min, czas dysocjacji 300 s; dla parametrów regeneracji: wprowadź nazwę roztworu do regeneracji: Glycine-HCl (pH 2,5), czas kontaktu: 30 s, natężenie przepływu: 30 μL/min i kliknij Dalej.</li>
		<li>W oknie dialogowym próbek wprowadź nazwę peptydów, masę cząsteczkową i stężenia, a następnie kliknij przycisk Dalej. W oknie dialogowym Pozycja stojaka przypisz rozcieńczone peptydy jako pojedyncze próbki ~120 μL o różnych stężeniach od 1 do 100 μM i ~230 μL buforu, ~120 μL buforu i ~1,000 μL glicyny, pH 2,5, do pozycji na stojaku. Kliknij przycisk Eject Rack (Wysuń stojak) i włóż wszystkie fiolki. Kliknij przycisk Dalej, a następnie w oknie dialogowym Prepare Run Protocol kliknij przycisk Start, wprowadź nazwę pliku i Zapisz (Rysunek 2).</li>
		<li>W oprogramowaniu kliknij menu Start i wybierz opcję Ocena. Wybierz otwórz plik w oprogramowaniu, a następnie z rozwijanego menu wyboru wybierz Fc2-1, aby przeanalizować komórkę referencyjną Blank-subtracted Active sensorgram dla faz asocjacji i dysocjacji peptydów msRBP4 i zmutowanych msRBPR2 i msSTRA6.</li>
		<li>Kliknij przycisk listy rozwijanej Kinetyka/Powinowactwo i wybierz opcję Graniczna powierzchnia; aby otworzyć okno dialogowe Wybierz krzywe, zaznacz opcję Uwzględnij kolumnę w tabeli i kliknij przycisk Dalej. Wybierz okno dialogowe Dane, aby wyświetlić sensorgramy odjęte od pustego miejsca; kliknij Kinetyka i Powinowactwo, zachowaj parametry domyślne, a następnie kliknij opcję Dopasuj dla dopasowania krzywej. Sprawdź kartę Raport pod kątem stałej dysocjacji równowagi Kd i Ka lub Kna współczynniku asocjacji i Kd lub Kpoza współczynnikiem dysocjacji. Zapisz sensorgram danych Kinetics w formacie rozdzielanym tabulatorami .txt i użyj wartości do wykreślenia wykresów (Rysunek 3).</li>
		<li>Aby określić stałą kinetyki powinowactwa Kd (stężenie liganda, które wiąże się z połową receptorów w stanie równowagi), skopiuj i wklej kolumny danych w pliku w formacie .txt wygenerowanym na podstawie wykresu oceny do XY używanego w oprogramowaniu. Kliknij opcję Analiza i regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej), sprawdź kolumnę danych i kliknij przycisk OK. W oknie dialogowym parametrów kliknij opcję Nasycenie powiązania i Model dopasowania powiązania specyficzny dla jednego miejsca ze wzorem: 
		Y= (Bmax*X)/(Kd + X) 
		Gdzie Bmax to maksymalna liczba miejsc wiązania (jednostka odpowiedzi), X to stężenie peptydów, a Y to wiązanie (jednostka odpowiedzi) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metodologia spektrofotometrii do ilościowego oznaczania kompleksu białkowego siatkówki GPCR-11- cis (białko retinylidenu rodopsyny) w lizatach siatkówki
<ol>
	<li>Przenieś z góry określoną grupę myszy składającą się z dorosłych myszy WT-C57BL/6J do ciemnego pokoju.</li>
	<li>Ciemne myszy przystosowują się przez noc przez 12-16 godzin, a przy czerwonym świetle umieszczają mysz w komorze eutanazyjnej i otwierają zawór gazowy CO2 na regulatorze do 5 l/min na ~5 min. Upewnij się, że umrą, wywierając nacisk na szyję i ogon ciągnięty do tyłu (zwichnięcie szyjki macicy).</li>
	<li>Wyłuszczyć gałki oczne i homogenizować oczy w lodowatym buforze zawierającym 20 mM bis-tris propan (1,3-bis (tris(hydroksymetylo)metyloamino)propan; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA oraz z inhibitorem proteazy (tabela materiałów).</li>
	<li>Odwirować homogenat przez 15 minut w temperaturze 16000 x g w temperaturze 4 °C, odrzucić sklarowany sklarant zawierający rozpuszczalne w wodzie białka cytozolowe. Ponownie zawiesić i rozpuścić granulowane białka błonowe i błonowe w buforze zawierającym 20 mM n-dodecylo-β-d-maltozydu (DDM), 20 mM bis-trispropanu (BTP) o pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA i inhibitorem proteazy przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej.</li>
	<li>Odwirować rozpuszczoną frakcję membranową przez 1 godzinę w temperaturze 16000 x g, 4 °C. Wymieszać supernatant z 30 μl kulek przeciwciała Rho 1D4 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej.</li>
	<li>Za pomocą stojaka magnetycznego oddziel ściąganie za pomocą kulek, wyrzuć supernatant i umyj kulki buforem 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7,4, 500 mM NaCl i 2 mM DDM.</li>
	<li>Eluować białko rodopsyny przez inkubację przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej z buforem 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM zawierającym 0,2 mg/ml peptydu 1D4 (-TETSQVAPA) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4 i <silna klasa = "xfig"> Rysunek 5).</li>
	<li>Analizuj elucję pod kątem absorbancji od 200 nm do 800 nm za pomocą prostokątnej, submikro, kwarcowej, apertury 2 mm, długości ścieżki 10 mm, 50 μl kuwety w szybkim skanowaniu za pomocą spektrofotometru. 
	UWAGA: Używaj tylko wysokiej jakości kuwet kwarcowych (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Aby zweryfikować i określić jakość, sprawdź i wystaw elucję na działanie jasnego światła przez 1 minutę, a następnie powtórz krok 3.8.</li>
	Odejmij absorbancję ślepej próby i oblicz stosunek analizowanych widm absorbancji z absorbancją przy 500 nm dla opsyny związanej z siatkówką 11-cis, 380 nm dla wystawionej na światło opsyny związanej z siatkówką all-trans i 280 nm dla białka Apo-opsyny bez ligandu (<klasa silna = "xfig">Rysunek 6).<li> Wolna opsyna bez liganda siatkówki daje wyjściową absorbancję przy 500 nm.</li>
	<li>Aby określić ilościowo stężenie rodopsyny, użyj prawa Beera-Lamberta: 
	A=ε·C·l lub C=A/ε·l 
	Gdzie A to absorbancja, ε molowy współczynnik ekstynkcji (rodopsyna ε500 = 40 600 M−1 cm−1 dla wolnej Apo Opsyny ε280 = 81 200 M−1 cm−1), C to stężenie, a l długość drogi.</li>
	<li>Do ilościowego określenia ligandowej opsyny w procentach należy użyć stosunku A280/A500.</li>
	<li>Wykreślić widma absorbancji odjęte od ślepej próby i obliczyć wartość wolnej opsyny32.</li>
	<li>Oblicz stężenie rodopsyny, korzystając ze współczynnika ekstynkcji ε500 = 40600 M−1 cm−1. Stężenie opsyny wolnej od ligandów oblicza się za pomocą prawa Beera-Lamberta przy użyciu współczynnika ekstynkcji ε280 = 81 200 M−1 cm−1.</li>
</ol>

Investigating Vitamin A Receptor Kinetics and Function for Retinoid Homeostasis

<ol><li>Dowling, J. E., Wald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+deficiency+and+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vitamin A deficiency and night blindness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).</li>
<li>Dowling, J. E., Wald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+vitamin+A+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The biological function of vitamin A acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).</li>
<li>Kiser, P. D., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+and+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoids and retinal diseases.</a> Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).</li>
<li>Harrison, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+the+intestinal+absorption+of+dietary+vitamin+A+and+provitamin+A+carotenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids.</a> Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).</li>
<li>Harrison, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotenoids%2C+%CE%B2-apocarotenoids%2C+and+retinoids%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it.</a> Nutrients. 14 (7), 1411(2022).</li>
<li>Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+nature+of+retinoid+transport+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+Surg+Nutr%22%5BJournal%5D)">The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism.</a> Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).</li>
<li>O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinol+and+retinyl+esters%3A+biochemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology.</a> J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).</li>
<li>Blomhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+and+metabolism+of+vitamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">Transport and metabolism of vitamin A.</a> Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).</li>
<li>Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+vitamin+A+uptake+and+Storage+in+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates.</a> Nutrients. 8 (11), 676(2016).</li>
<li>Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+transporters+in+visual+function%3A+A+mini+review+on+membrane+receptors+for+dietary+vitamin+A+uptake%2C+storage%2C+and+transport+to+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye.</a> Nutrients. 13 (11), 3987(2021).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+transthyretin+%28TTR%29+and+retinol-binding+protein+%28RBP%29+in+the+uptake+of+retinol+by+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes.</a> Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).</li>
<li>Chen, C. C., Heller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+retinol+and+retinoic+acid+from+serum+retinol-binding+protein+by+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells.</a> J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).</li>
<li>Gjøen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+takes+up+retinol-binding+protein+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver takes up retinol-binding protein from plasma.</a> J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).</li>
<li>Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+uptake+of+%5B3H%5Dretinol+bound+to+the+serum+retinol+binding+protein+involves+both+parenchymal+and+perisinusoidal+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells.</a> J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).</li>
<li>Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinol-binding+protein%3A+The+transport+protein+for+vitamin+A+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma.</a> J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).</li>
<li>Quadro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extrahepatic+retinol+binding+protein+in+the+mobilization+of+retinoid+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores.</a> J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).</li>
<li>Blaner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRA6%2C+a+cell-surface+receptor+for+retinol-binding+protein%3A+The+plot+thickens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens.</a> Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+receptor+for+retinol+binding+protein+mediates+cellular+uptake+of+vitamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A.</a> Science. 315 (5813), 820-825 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRA6-catalyzed+vitamin+A+influx%2C+Efflux%2C+and+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange.</a> J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).</li>
<li>Pasutto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+STRA6+cause+a+broad+spectrum+of+malformations+including+anophthalmia%2C+congenital+heart+defects%2C+diaphragmatic+hernia%2C+alveolar+capillary+dysplasia%2C+lung+hypoplasia%2C+and+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation.</a> Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).</li>
<li>Golzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matthew-Wood+Syndrome+is+caused+by+truncating+mutations+in+the+retinol-binding+protein+receptor+gene+STRA6%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6.</a> Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).</li>
<li>Isken, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBP4+disrupts+vitamin+A+uptake+homeostasis+in+a+STRA6-deficient+animal+model+for+Matthew-Wood+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome.</a> Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).</li>
<li>Ruiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+content%2C+visual+responses%2C+and+ocular+morphology+are+compromised+in+the+retinas+of+mice+lacking+the+retinol-binding+protein+receptor%2C+STRA6%5BTitle%5D)+AND+%22Investig+Opthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6.</a> Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).</li>
<li>Kelly, M., von Lintig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRA6%3A+Role+in+cellular+retinol+uptake+and+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+Surg+Nutr%22%5BJournal%5D)">STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux.</a> Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).</li>
<li>Berry, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRA6+receptor+is+essential+for+retinol-binding+protein-induced+insulin+resistance+but+not+for+maintaining+vitamin+A+homeostasis+in+tissues+other+than+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye.</a> J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).</li>
<li>Amengual, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRA6+is+critical+for+cellular+vitamin+A+uptake+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis.</a> Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).</li>
<li>Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+homeostasis+and+beyond%3A+How+retinol+binding+protein+4+contributes+to+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease.</a> Nutrients. 14 (6), 1236(2022).</li>
<li>Alapatt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+retinol+transporter+and+receptor+for+serum+retinol-binding+protein+%28RBP4%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4).</a> J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).</li>
<li>Radhakrishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+the+systemic+vitamin+A+receptor+RBPR2+show+decreased+ocular+retinoids+and+loss+of+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function.</a> Nutrients. 14 (12), 2371(2022).</li>
<li>Solanki, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+binding+domain+in+the+Rbpr2+receptor+is+required+for+vitamin+A+transport%2C+ocular+retinoid+homeostasis%2C+and+photoreceptor+cell+survival+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish.</a> Cells. 9 (5), 1099(2020).</li>
<li>Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+extracellular+RBP4+ligand+binding+domain+on+the+RBPR2+receptor+for+vitamin+A+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport.</a> Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).</li>
<li>Ramkumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vitamin+A+transporter+STRA6+adjusts+the+stoichiometry+of+chromophore+and+opsins+in+visual+pigment+synthesis+and+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling.</a> Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).</li>
<li>Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+chromophore+binding+in+the+visual+photoreceptor+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin.</a> Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).</li>
<li>Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpe65-%2F-+and+Lrat-%2F-+mice%3A+comparable+models+of+leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).</li>
<li>Breen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+human+vitamin+A+transporter%2FRBP+receptor+%28STRA6%29+for+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination.</a> PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).</li>
<li>Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analyses+of+retinol+transport+by+the+membrane+receptor+of+plasma+retinol+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein.</a> J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).</li>
<li>Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinol+binding+protein+receptor+2+%28Rbpr2%29+is+required+for+photoreceptor+outer+segment+morphogenesis+and+visual+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish.</a> Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu manuskryptu lub w decyzji o publikacji wyników.

Krytyczne kroki w protokole 
Metodologia SPR 
Modelowanie in silico i analiza dokowania:Do badania dokowania należy wykorzystać przewidywaną strukturę RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) i STRA6 oraz znaną strukturę bazy danych msRBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa). Dodatkowo należy zastosować metody in vitro (hodowla komórkowa) w celu potwierdzenia interakcji przypuszczalnych miejsc wią...

Witamina A/all-trans retinol/ROL jest ważnym składnikiem odgrywającym rolę w funkcjonowaniu wzrokowym1,2. Chromofor 11-cis retinal, metabolit witaminy A w diecie, wiąże się z opsyną receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w celu wytworzenia białka retinylidenu, rodopsyny, w fotoreceptorach. Kiedy światło pada na oko, konfiguracja rodopsyny ulega fundamentalnej zmianie poprzez konwersję jej 11-cis-retinalnego komponentu do all-trans-retinalu. Ta zmiana konfiguracji uruchamia kaskadę fototransdukcji w fotoreceptorach pręcików, przekształcając światło w sygnał elektryczny, który jest przesyłany do kory wzrokowej w mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego3,4,5,6,7,8,9,10. Zmniejszone stężenie surowicy i ROL w oku może wpływać na tworzenie białka retinylidenu, co z kolei powoduje błędną lokalizację opsyny, akumulację opsyny apoproteinowej, ślepotę nocną i zwyrodnienie OS fotoreceptorów, prowadząc do barwnikowego zwyrodnienia siatkówki lub wrodzonej ślepoty Lebera, co może powodować ślepotę3,10.
Retinol all-trans jest podstawową formą transportu witaminy A w diecie i jest źródłem, z którego pochodzą wszystkie funkcjonalne retinoidy i metabolity witaminy A w diecie. Wątroba służy jako główny organ do magazynowania witaminy A w diecie. Retinol wątrobowy jest transportowany przez surowicę jako jego kompleks z białkiem wiążącym retinol 4 (RBP4). RBP4, ulegający głównie ekspresji w wątrobie, tworzy holokompleks z substratem retinolu i transtyretyną (TTR), który dostaje się do krążenia11,12,13,14,15,16,17. Doniesienie o receptorze powierzchniowym komórki dla RBP4 w latach siedemdziesiątych XX wieku doprowadziło do hipotezy, że białka transportowe błony wspomagają transport retinoidów do i z komórek. Receptor powierzchniowy komórki dla retinolu związanego z RBP4 (RBP4-ROL) został zidentyfikowany jako STimulowany przez kwas retinowy 6 Retinol (STRA6) w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE) oka. STRA6 wiąże się z krążącym kompleksem holo-RBP4 i przenosi retinol związany z RBP4 przez RPE, który jest wykorzystywany przez fotoreceptory18,19. Mutacje w STRA6 mogą prowadzić do niezliczonych chorób i fenotypów związanych ze zmniejszonym stężeniem ROL w oku. Mutacje STRA6 podczas rozwoju mogą prowadzić do anoftalmii, mikroftalmii i innych objawów niezwiązanych z oczami, które pokrywają się z fenotypami związanymi z zespołem Matthew-Wooda20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 ulega ekspresji w różnych narządach i tkankach, takich jak RPE w oku, ale nie we wszystkich tkankach26,27. Chociaż głównym miejscem magazynowania retinoidów jest wątroba, STRA6 nie ulega ekspresji w wątrobie.
Alapatt i współpracownicy odkryli, że Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) wiąże RBP4 z wysokim powinowactwem i jest odpowiedzialny za wychwyt retinolu związanego z RBP4 w wątrobie, podobnie jak STRA6 w klasie RPE<sup="xref">28. Doniesiono, że RBPR2 dzieli homologię strukturalną z STRA629,30,31. Proponuje się, aby RBP4 wiązał się z resztami S294, Y295 i L296 na RBPR2, domenie wiążącej aminokwasy częściowo konserwatywnej również między RBPR2 i STRA629,30,31. Na podstawie tych badań sugeruje się, że receptory błonowe witaminy A, takie jak STRA6 i RBPR2, które zawierają jedną lub więcej reszt/domen wiążących zewnątrzkomórki, wchodzą w interakcje z krążącym RBP4-ROL. Receptory błonowe odgrywają zatem ważną rolę w wiązaniu receptorów z krążącymi RBP4 w celu internalizacji ROL do tkanek docelowych, takich jak wątroba i oko.
W pierwszej części tego badania wykorzystaliśmy Powierzchniowy Rezonans Plazmonowy (SPR) do zbadania interakcji dwóch receptorów błonowych witaminy A (RBPR2 i STRA6) z ich fizjologicznym ligandem RBP431. Powinowactwo wiązania i kinetyka asocjacji/dysocjacji białka z kompleksami ligandów można mierzyć w czasie rzeczywistym za pomocą SPR. Metodologia ta miała na celu dostarczenie krytycznych informacji kinetycznych, strukturalnych i biochemicznych na temat motywów wiążących RBP4 w RBPR2 i STRA6, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologicznych stanów niedoboru witaminy A31,32. Jak wspomniano powyżej, krążący ROL jest internalizowany do RPE przez STRA6 w celu wytworzenia chromoforu 11-cis retinal, który wiąże się z opsyną w celu wytworzenia białka retinylidenu, rodopsyny, w fotoreceptorach33. Użyliśmy metodologii spektrofotometrii do ilościowego określenia GPCR-opsyny i jej kompleksu ligandowego 11-cis siatkówki w mysich lizatach siatkówki, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów zmniejszonego białka retinylidenu, rodopsyny, w barwnikowym zwyrodnieniu siatkówki lub wrodzonej ślepo-guzowatej chorobie Lebera34. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te można zastosować do badania in vitro fizjologicznych konsekwencji zmutowanego RBP4, STRA6 lub RBPR2 we wpływie na homeostazę witaminy A w układzie ogólnym i ocznej lub wpływu zmutowanej rodopsyny lub białek cyklu retinoidowego na funkcje wzrokowe35,36.

<table><tbody><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>Cytiva</td><td>80648356</td><td></td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td><td>Cytiva</td><td>BR100050</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ewaluacyjne Biacore Biacore</td><td>S200</td><td>wersja 1.1</td><td></td></tr><tr><td>Biacore Układ czujnika CM5</td><td>Cytiva</td><td>BR100530</td><td></td></tr><tr><td>Bis tris propan</td><td>Sigma</td><td>B6755-25G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>BL21 DE3 kompetentne ogniwa</td><td>Thermo Naukowy</td> spektrofotometr <td>CD EC0114</td><td></td></tr><tr><td>Spektropolarymetr</td><td></td><td>Jasco</td><td>J-815</td></tr><tr><td>Glicyna HCL</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dopasowanie modelu, analiza danych</td></tr><tr><td>Bulion LB</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-d-maltozyd (DDM)</td><td>EMD Milipor</td><td>324355-1GM</td><td>2-20 mM</td></tr><tr><td>pET28a His-tag Wektor ekspresji odporny na kanamycynę&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>69864-3</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Rho1D4 MagBeads</td><td>CubeBiotech</td><td>33299</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta dializacyjna Slide-A_Lyzer 10K</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td>0,05%</td></tr> <tr><td>UV vis Spektrofotometr</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Cary 60 UV-Vis</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa peptydu</td><td>Sekwencja peptydowa</td><td>HPLC-czystość</td><td>Mass Spec</td></tr><tr><td>Mouse Rbpr2 (42)</td><td>HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG</td><td>92.14%</td><td>Pasuje do</td></tr><tr><td>myszy Stra6 (40)</td><td>SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK</td><td>90.84%</td><td>Zgadza się</td></tr><tr><td>z mutantem myszy Rbpr2 S294A (42)</td><td>HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG</td><td>0.92%</td><td>Zgadza się</td></tr></tbody></table>

metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy a i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu

Methodology for Studying Interactions of Vitamin A Membrane Receptors and Opsin Protein with their Ligands in Generating the Retinylidene Protein

Dystrybucja witaminy A/all-trans retinolu (ROL) w organizmie jest kluczowa dla utrzymania funkcji retinoidów w tkankach obwodowych i generowania białka retinylidenu dla funkcji wzrokowych. RBP4-ROL to kompleks ROL z białkiem wiążącym retinol 4 (RBP4), który jest obecny we krwi. Dwa receptory błonowe, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) w wątrobie i STimulowane przez kwas retinowy 6 Retinol (STRA6) w oku, wiążą krążący RBP4 i ten mechanizm ma kluczowe znaczenie dla internalizacji ROL w komórkach. Ustalenie metod badania kinetyki receptor-ligand jest niezbędne do zrozumienia fizjologicznej funkcji receptorów witaminy A dla homeostazy retinoidów. Za pomocą testów powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) możemy analizować powinowactwo wiązania i parametry kinetyczne receptorów błonowych witaminy A z jej fizjologicznym ligandem RBP4. 
Te metodologie mogą ujawnić nowe strukturalne i biochemiczne informacje o motywach wiążących RBP4 w RBPR2 i STRA6, które są kluczowe dla zrozumienia patologicznych stanów niedoboru witaminy A. W oku zinternalizowany ROL jest metabolizowany do 11-cis retinal, wizualnego chromoforu, który wiąże się z opsyną w fotoreceptorach, tworząc białko retinylidenu, rodopsynę. Absorbancja światła powoduje izomeryzację cis-to-trans siatkówki 11-cis, indukując zmiany konformacyjne w rodopsyny, a następnie aktywację kaskady fototransdukcji. Zmniejszone stężenie ROL w surowicy i oku może wpływać na tworzenie białka retinylidenu, co z kolei może powodować nieprawidłową lokalizację rodopsyny, akumulację opsyny apoproteinowej, ślepotę nocną i zwyrodnienie zewnętrznego segmentu fotoreceptora, prowadząc do barwnikowego zwyrodnienia siatkówki lub wrodzonej ślepoty Lebera. 
Dlatego metodologie spektrofotometryczne do ilościowego oznaczania kompleksu siatkówkowego opsyn-11-cis sprzężonego z białkiem G w siatkówce są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów degeneracji komórek siatkówki w wyżej wymienionych stanach patologicznych. Dzięki tym kompleksowym metodologiom badacze będą w stanie lepiej ocenić podaż witaminy A w diecie w utrzymaniu homeostazy retinoidów ogólnoustrojowych i ocznych, co ma kluczowe znaczenie dla generowania i utrzymywania stężeń białka retinylidenu w fotoreceptorach, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji wzrokowych u ludzi.

Opisano metody ilościowe służące do badania oddziaływań białko-ligand receptorów błonowych witaminy A oraz opsyny fotoreceptorów z ich odpowiednimi ligandami fizjologicznymi. Rekombinowane białko RBP4 mysie powinno zostać wyekspresowane w E. coli, a oczyszczone białko powinno być wykorzystane jako ligand sprzężony na chipie SPR. Chemicznie syntetyzowane białka RBPR2, STRA6 oraz mutant S294A RBPR2 „SYL motif RBP4 interacting extracellular site” w postaci peptydów o długości ok. 40 aminokwasów są wykorzystywane ja...

Tutaj opisujemy dwie ilościowe metody badania oddziaływań białko-ligand receptorów błonowych witaminy A i opsyny fotoreceptorów z ich odpowiednimi fizjologicznymi ligandami.

Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu

Distribution of dietary vitamin A/all-trans retinol (ROL) throughout the body is critical for maintaining retinoid function in peripheral tissues and ...

Nasze badania badają, w jaki sposób regulowana jest homeostaza witaminy A, koncentrując się na fizjologicznej interakcji między receptorem białka wiążącego siatkówkę 2, RBPR2, a jego ligandem, RBP4, do transportu witaminy A w całym organizmie. Badamy również, w jaki sposób 11-cis-retinal wiąże się z rodopsyną, co ma kluczowe znaczenie dla fototransdukcji i widzenia. Używamy dwóch znanych technik, aby ustalić związek między magazynowaniem i dystrybucją witaminy A przez receptory wątrobowe a wpływem przerwania tego mechanizmu na dobre samopoczucie wzroku poprzez gromadzenie chorobotwórczych lipofuscyn.Nasz protokół wykorzystuje dwie techniki, koncentrując się na zdalnej komunikacji między wątrobą a okiem w celu transportu witaminy A. Nasz protokół sprawia, że jest to bardziej oczywiste i łatwiejsze do skorelowania stanów chorobowych spowodowanych problemami dietetycznymi lub dziedzicznymi. Białko i czynniki w surowicy krwi stabilizują komunikację między receptorem białka wiążącego retinol a jego ligandem, RBP4.Znalezienie wszystkich istotnych mechanizmów jest skomplikowane, ale niezbędne w następnej części, aby odpowiedzieć na niektóre niezbadane obszary. W przyszłości skupimy się na

methodology-for-studying-interactions-vitamin-membrane-receptors

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną technikę produkcji wysokiej jakości kompleksu witaminy A/RBP oraz dwie techniki monitorowania w czasie rzeczywistym do badania transportu witaminy A przez STRA6, receptor RBP.

Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

Tutaj opisana jest metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej fazy normalnej, mająca na celu wykrywanie i ilościowe określanie krytycznych retinoidów zaangażowanych w ułatwianie funkcji wzrokowych zarówno w tkance ocznej, jak i ogólnoustrojowej, w kontekście ogólnoustrojowego dostarczania witaminy A do wytwarzania niezbędnego światłoczułego chromoforu rodopsyny 11-cis-retinal.

Analiza ilościowa metabolitów witaminy A w diecie metabolitów witaminy A w mysich tkankach ocznych i nieocznych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj opisujemy protokół dla ogólnej metody pościgu za impulsami, która pozwala na analizę kinetyczną fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach.

Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Interakcje czynników transkrypcyjnych (TF) z polimerazą RNA są zwykle badane za pomocą testów pulldown. Stosujemy technologię interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu scharakteryzowania oddziaływania GrgA z polimerazą chlamydiowego RNA. W porównaniu z testami pulldown, BLI wykrywa asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym, oferuje wyższą czułość i jest wysoce ilościowy.

Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Dostępny jest tutaj protokół do badania interakcji między natywnymi formami, prefibrylarnymi i dojrzałymi fibrylami amyloidowymi różnych peptydów i białek z mitochondriami izolowanymi z różnych tkanek i różnych obszarów mózgu.

Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Poznaj metody badania interakcji RBPR2 z RBP4 oraz wiązania 11-cis-retinalu z rodopsyną w kontekście homeostazy witaminy A. Techniki ilościowe ujawniają mechanizmy transportu między wątrobą a okiem.

Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu (Wideo) | JoVE Journal

Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu

Przeglądaj więcej filmów