Name: Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę długoterminowego pomiaru zużycia tlenu w kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki przy użyciu urządzenia Resipher. Ta technika umożliwia szczegółową analizę bioenergetyczną komórek RPE przez wiele tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Danielowi Hassowi i Jimowi Hurleyowi za pomysł przetestowania rozpuszczalności O2 w nowych pożywkach w porównaniu z kondycjonowanymi jako kontrolą. Dziękujemy dr Magali Saint-Geniez za wkład redakcyjny w powstanie manuskryptu. Dziękujemy Scottowi Szalayowi z Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, za doposażenie komory hipoksyjnej w USB Resipher. Na badania nad HFT nie wykorzystano żadnych funduszy federalnych. Rdzeń usług elektronicznych jest wspierany przez P30 EY007003 z National Eye Institute. Praca ta jest wspierana przez nieograniczony grant wydziałowy z Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. jest wspierany przez James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, Fundację E. Matildy Ziegler dla Niewidomych, grant Eversight-eye-bank, grant na K08EY033420 z National Eye Institute oraz wsparcie od Dee i Dickson Brown, a także David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. jest wspierany przez UNSW Scientia Program. L.A.K. jest wspierany przez Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, grant R01EY027739 z National Eye Institute oraz Departament Obrony Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Novel OCR Monitoring System for Differentiated RPE Cultures

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

Richard A. Bryan i Kin Lo są pracownikami firmy Lucid Scientific, która produkuje system Resipher.

Mitochondrialny metabolizm RPE odgrywa kluczową rolę w patogenezie powszechnych chorób siatkówki powodujących ślepotę, w tym AMD i PVR. Modelowanie metabolizmu mitochondrialnego RPE in vitro pozwala na odizolowanie jego stanu metabolicznego od stanu metabolicznego otaczających tkanek, a także poddanie tkanki różnym obrażeniom symulującym chorobę w kontrolowany sposób. Takie modelowanie in vitro metabolizmu mitochondrialnego RPE zostało ułatwione dzięki pojawieniu się kultur pierwotnych i iPSC-RPE o wysokiej wierności, które osiągają właściwy stan różnicowania i polarność niezbędne do ścisłego zbliżenia RPE in vivo. Podczas gdy monitorowanie wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w takich kulturach jest idealną metodą monitorowania metabolizmu mitochondrialnego, konfiguracja monitorowania OCR często wyklucza hodowlę kultur w warunkach niezbędnych do uzyskania wysoce spolaryzowany i w pełni zróżnicowany RPE. W tym miejscu opisujemy Resipher jako nowatorski system do monitorowania metabolizmu mitochondriów RPE poprzez długoterminową ocenę OCR w czasie rzeczywistym w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach RPE.
Do monitorowania OCR w RPE zastosowano inne metody. Analizator Seahorse XF jest przeznaczony do monitorowania OCR w krótkich okresach czasu z ostrymi manipulacjami funkcji mitochondriów. Jednak testy konika morskiego wymagają, aby komórki były hodowane na niestandardowych płytkach, co nie sprzyja wspieraniu wysokiej polaryzacji i różnicowania RPE21. Calton, Vollrath i współpracownicy dostosowali Seahorse do oceny wysoce zróżnicowanych kultur RPE hodowanych na mikroporowatych podłożach poprzez cięcie mikroporowatej membrany na kawałki i umieszczanie ich na płytce Seahorse, ale ta metoda nadal działa tylko w przypadku krótkoterminowego monitorowania kultur w punkcie końcowym, ponieważ komórki nie mają dostępu do CO2 Podczas testu test można wykonać tylko w warunkach niesterylnych, a przecięcie mikroporowatego nośnika spowoduje śmierć i dysfunkcję krawędziowej części mikroporowatego nośnikaw czasie 22. Barofuse to bezpompowy system perfuzyjny, w którym paski RPE wyhodowane na mikroporowatych podłożach mogą być ładowane do systemu perfuzyjnego, co pozwala na monitorowanie OCR w czasie rzeczywistym23. Podobnie jak w przypadku zmodyfikowanej konfiguracji dla Seahorse przez Caltona, Vollratha i współpracowników, głównymi ograniczeniami oceny RPE za pomocą Barofuse są konieczność cięcia mikroporowatych podpór i krótkoterminowy, końcowy charakter testu. Oxygraph jest również przeznaczony do szybkich zmian kinetycznych w OCR w odpowiedzi na manipulacje metaboliczne24. Nie był on stosowany w przypadku kultur RPE i miałby takie same ograniczenia w ocenie wysoce spolaryzowanych i zróżnicowanych kultur RPE, jak konik morski i Barofuse.
W przeciwieństwie do tych innych metod, opisany tutaj system OCR pozwala na monitorowanie OCR, podczas gdy RPE jest hodowany na standardowych płytkach/podłożach do hodowli komórkowych w standardowych warunkach przy użyciu standardowych pożywek RPE w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowychCO 2 , zapewniając łatwe i wygodne sondowanie wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kultur RPE. Oprócz generowania przez system danych o zmianach OCR w czasie rzeczywistym, te same komórki mogą być wykorzystywane do dodatkowych testów pod koniec okresu monitorowania OCR. Pozwala to na bardzo elastyczne eksperymenty, w których wpływ interwencji na OCR jest wielokrotnie testowany przez okres tygodni (np. - indukcja RPE EMT na rysunku 5) lub w których można przetestować długoterminową regenerację po interwencji (np. - powrót do zdrowia po rozprzęgnięciu mitochondriów na rysunku 3) lub gdzie można monitorować kaskadowe zmiany metaboliczne w odpowiedzi na początkową interwencję (np. - wpływ surowicy na OCR po wyczerpaniu składników odżywczych pożywki na rysunku 2). System OCR opisany w tym artykule jest szczególnie wygodny do pomiaru OCR w wysoce spolaryzowanych i zróżnicowanych kulturach RPE. Takie kultury są funkcjonalnie postmitottyczne, ze szczelnym upakowaniem i ciężką pigmentacją. Oznacza to, że każda studzienka zawiera prawie identyczne komórki o numerze9, eliminując w ten sposób potrzebę normalizacji OCR do liczby komórek w większości eksperymentów. Nawet gdy wymagana jest normalizacja do liczby komórek, silna pigmentacja RPE i dobrze odgraniczone granice komórek pozwalają na normalizację przy nieinwazyjnej prostej liczbie komórek opartej na obrazowaniu w jasnym polu. W przypadku eksperymentów obejmujących niezróżnicowane RPE i proliferację RPE, takich jak eksperymenty EMT na rysunku 5, normalizacja OCR na studnię do liczby komórek staje się konieczna, aby wiedzieć, czym jest OCR "na komórkę".
Poza polem siatkówkowym system został wykorzystany do badania oddychania komórkowego i aktywności metabolicznej w różnych typach komórek, w tym w komórkach wysp trzustkowych25, mięśniach szkieletowych26, raku jajnika27, kardiomiocytach28, a nawet całych organizmach, takich jak C. elegans29. Długoterminowe monitorowanie OCR w czasie rzeczywistym za pomocą opisanego tutaj systemu OCR ujawniło kluczowe informacje na temat zmian bioenergetycznych i dysfunkcji mitochondriów w tych różnych modelach chorób.
System Resipher ma jednak pewne ograniczenia. Metoda określania OCR zasadniczo różni się od metody Seahorse Analyzer, BaroFuse lub Oxygraph. Wymaga ustanowienia gradientu O2 w celu obliczenia OCR, a ustalenie gradientu może zająć wiele godzin. Tak więc szybkie eksperymenty kinetyczne, możliwe w innych systemach, nie są możliwe w tym systemie. Ponadto, w przeciwieństwie do innych systemów, Resipher nie posiada żadnych portów iniekcyjnych do szybkiego dostarczania małych cząsteczek lub zbierania metabolitów. Zamiast tego należy zdjąć pokrywę czujnika z okapu do hodowli komórkowej, a następnie dodać do niego leki lub wymienić pożywkę, a także ręcznie pobrać metabolity do analizy.
Aby ustanowić eksperyment i rozwiązać związane z nim problemy przy użyciu systemu OCR opisanego w tym dokumencie, zaleca się wykonanie następujących czynności. Po pierwsze, zminimalizuj parowanie. Przypomnijmy, że gradientO2 w kolumnie nośnika powyżej monowarstwy RPE jest w dużym stopniu zależny od wysokości kolumny9, a system oblicza OCR na podstawie gradientuO2 . Tak więc, jeśli podczas eksperymentu nastąpi wyraźne obniżenie kolumny pożywki z powodu parowania, gradientO2 zmieni się, wpływając na odczyty OCR. Utrzymanie pełnej tacki na wodę w inkubatorze ma kluczowe znaczenie, ale sugeruje się również, aby woda była umieszczana we wszystkich nieużywanych studzienkach na 96-dołkowej płycie. Co więcej, studzienki na krawędzi płyty mają wyższe szybkości parowania, więc studzienki te pozostają puste z komórek w typowych eksperymentach przedstawionych powyżej. Czujnik wilgotności w systemie OCR może pomóc w monitorowaniu wilgotności w inkubatorze. Na rysunku 8A spadek wilgotności podczas eksperymentu sugeruje, że taca na wodę w inkubatorze jest pusta. W miarę przyspieszania parowania w studni, odczyty stężenia O2 dla odwiertu będą rosły wyżej i ostatecznie "spłaszczą się" przy stężeniu atmosferycznym O2 (~ 200 μM) (rysunek 8A).
Po drugie, upewnij się, że "kanapka" systemu OCR jest odpowiednio zmontowana. Metalowe miejsca styku na spodzie urządzenia i górnej części pokrywy czujnika powinny być czyste, bez zanieczyszczeń utrudniających pełny kontakt. Urządzenie i pokrywa czujnika powinny być przymocowane całkowicie równo i równomiernie wyrównane na 96-dołkowej płytce bez przechylania. Kabel USB łączący Urządzenie z Hubem nie powinien być napięty, co może skutkować momentem obrotowym "kanapki" i ograniczeniem prawidłowego ruchu Urządzenia.
Po trzecie, upewnij się, że urządzenie i czujniki pokrywy są skalibrowane. Rysunek 2B szczegółowo opisuje, jak szybko sprawdzić prawidłowe działanie czujnika na początku każdego eksperymentu. Po czwarte, upewnij się, że dany odwiert nie wykazuje odstającego OCR przed manipulacją eksperymentalną. Po upewnieniu się, że czujniki działają, określenie podstawowych wartości OCR dla wszystkich studzienek z komórkami może pomóc w ustaleniu, czy niektóre studzienki zawierają komórki w złym stanie. Rysunek 8B przedstawia kilka studzienek poddawanych podstawowej ocenie OCR, w których studzienka w kolorze niebieskim wyraźnie wykazuje niższy OCR (a zatem wysokie stężenieO2 ). Ten odwiert jest wartością odstającą i powinien być wyłączony z manipulacji eksperymentalnej.
Po piąte, zminimalizuj manipulacje środowiskowe podczas aktywnych odczytów OCR. GradientO2 jest bardzo wrażliwy na zmiany temperatury, wilgotności, poziomu CO2 w inkubatorze i ciśnienia atmosferycznego. Otwarcie drzwi inkubatora znacząco wpływa na te czynniki, powodując tymczasowe zakłócenia w odczytach OCR, dopóki gradient O2 kolumny pożywki nie powróci do równowagi (rysunek 8C). Parametry wpływające na OCR można monitorować w interfejsie online systemu w zakładce "Środowisko" (Rysunek 8A).
Po szóste, określ optymalną objętość nośnika dla eksperymentu. Podczas gdy niewystarczająca objętość podłoża może powodować artefakty spowodowane nadmiernym parowaniem (patrz pierwszy środek rozwiązywania problemów powyżej) lub przedwczesnym wyczerpaniem składników odżywczych w pożywce, nadmierna objętość pożywki ogranicza dostępność O2 dla monowarstwy RPE, wywołując niedotlenienie9. Rysunek 7 jest zrzutem ekranu kalkulatora online dostępnego do określania wpływu objętości pożywki na stężenieO2 w monowarstwie RPE. Maksymalny OCR możliwy do rozpoznania dla danego woluminu nośnika jest wyświetlany na rysunku 9A. Jeśli szybkość OCR dla danego eksperymentu przy użyciu danej objętości jest zbliżona do szybkości przedstawionej na rysunku 9A, wówczas stężenieO2 w monowarstwie RPE zbliża się do anoksyjności (0%) i potrzebna jest mniejsza objętość pożywki. Ogólnie rzecz biorąc, eksperymenty obejmujące intensywne procesy mitochondrialne w hodowli RPE powinny mieć objętość pożywki nie większą niż 75 μl na 96 dołków.
Po siódme, wykonaj odpowiednią normalizację, aby wyizolować wpływ eksperymentalnej interwencji na OCR. Ponieważ różne studzienki mogą mieć różne wyjściowe OCR, kluczowe znaczenie ma uzyskanie podstawowych odczytów OCR dla każdego dołka przed interwencją eksperymentalną. Odejmij podstawowy OCR od OCR po interwencji eksperymentalnej, aby uzyskać "Delta OCR", który pokazuje wpływ interwencji eksperymentalnej na OCR. Metodę otrzymywania "Delta OCR" przedstawiono na rys. 3 i rys. 9B. Jeśli ktoś jest zainteresowany wpływem jednej interwencji eksperymentalnej na zdolność innej interwencji eksperymentalnej do indukowania OCR, potrzebny jest dodatkowy etap normalizacji, "OCR Delta-Delta". Taki przykład zilustrowano na rysunku 9B, gdzie zdolność palmitynianu (jedna interwencja eksperymentalna) do indukowania zwiększonego OCR (poprzez indukcję β-utleniania) zależy od rodzaju pożywki do hodowli RPE (druga interwencja eksperymentalna).
Wreszcie, zminimalizuj ryzyko zanieczyszczenia. System monitoruje OCR poprzez wprowadzenie czujnika tlenu do mediów nad komórkami. Zwiększa to ryzyko infekcji. Nieoczekiwane spadki OCR podczas eksperymentu lub nieoczekiwanie niski OCR na początku eksperymentu mogą być oznakami infekcji. Płytki muszą być aktywnie monitorowane pod kątem infekcji pod mikroskopem hodowli komórkowych. Zanieczyszczenie krzyżowe między płytkami 96-dołkowymi może wystąpić, jeśli pokrywka czujnikowa zostanie ponownie użyta. Aby zminimalizować takie zanieczyszczenie krzyżowe, należy zanurzyć całą pokrywę w 70% etanolu na 20 minut w celu odkażenia po zakończeniu eksperymentu, przed ponownym użyciem pokrywy czujnika w nowym eksperymencie (patrz sekcja protokołu 1.2.15).
Podsumowując, przedstawiono protokół długoterminowego monitorowania metabolizmu mitochondriów w czasie rzeczywistym w kulturach RPE o wysokiej wierności poprzez ocenę OCR przy użyciu nowatorskiego systemu o nazwie Resipher. Może być stosowany do wielu zastosowań w wysoce spolaryzowanych i zróżnicowanych kulturach RPE, w szczególności do badania fizjologicznych właściwości metabolicznych izolowanego RPE, a także zmienionego metabolizmu RPE w modelach in vitro chorób siatkówki, w tym AMD i PVR.

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa funkcjonalnie postmitotycznych, wysoce spolaryzowanych komórek nabłonkowych, które tworzą barierę między światłoczułymi fotoreceptorami w siatkówce a ich krążeniem krwi, łożyskiem włosowatym zwanym naczyniówką włosowatą. Podobnie jak neurony wspierające glej, RPE pełni niezliczone funkcje wspierające fotoreceptory, w tym fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, transport składników odżywczych i wsparcie metaboliczne dla fotoreceptorów oraz wydzielanie niezbędnych czynników wzrostu, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji wzrokowych.
Zwyrodnienie RPE leży u podstaw kilku powszechnych zaburzeń zwyrodnieniowych wzroku. W zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), jednej z najczęstszych przyczyn nieuleczalnej utraty wzroku na świecie, RPE umiera, a zatem leżące nad nim fotoreceptory cierpią na wtórne zwyrodnienie. W proliferacyjnej witreoretinopatii (PVR) RPE zamiast tego wychodzi ze swojego normalnie spokojnego stanu postmitotycznego, proliferując i odróżnicowując się w stan mezenchymalny (tak zwane przejście nabłonkowe do mezenchymalnego [EMT]) ze zmianami w jego metabolizmie. Dedyferencjacja RPE powoduje utratę wsparcia RPE dla fotoreceptorów, jednocześnie wywołując stan bardziej zwłóknienia. Powoduje to zarówno zwyrodnienie fotoreceptorów, jak i bliznowacenie wywołane przez RPE, które powodują utratę wzroku1,2.
Główna część wsparcia RPE dla fotoreceptorów ma charakter metaboliczny, a dysregulacja metaboliczna jest krytycznym czynnikiem w wielu chorobach siatkówki, w tym AMD i PVR. RPE służy jako bariera regulacyjna między fotoreceptorami a ich źródłem tlenu i składników odżywczych, naczyniówką włosowatą. Tak więc to, co RPE wybiera do metabolizowania, w porównaniu z tym, co RPE decyduje się przejść z naczynia włosowatego do fotoreceptorów, silnie reguluje metabolizm i przeżycie fotoreceptorów. Liczne badania wykazały, że RPE jest silnie zależny od metabolizmu mitochondrialnego dla swojego normalnego zdrowia, a fotoreceptory zamiast tego w dużym stopniu polegają na glikolizie3. W ten sposób wprowadzono koncepcję komplementarnych, splecionych stanów metabolicznych między fotoreceptorami a RPE. W szczególności RPE zmniejsza metabolizm preferowanych substratów metabolicznych fotoreceptorów i zamiast tego wykorzystuje produkty uboczne metabolizmu fotoreceptorów w połączeniu z metabolitami, których fotoreceptory nie zużywają. W chorobach takich jak PVR i AMD dowody silnie sugerują, że RPE staje się bardziej glikolityczny i mniej zależny od metabolizmu mitochondrialnego; to przesunięcie w kierunku glikolizy RPE może pozbawić fotoreceptory potrzebnych im metabolitów, wywołując degenerację4,5,6. Biorąc pod uwagę, jak współzależny jest metabolizm RPE i fotoreceptorów oraz jak bardzo zmieniony metabolizm leży u podstaw choroby siatkówki, istnieje duże zainteresowanie modelowaniem i manipulowaniem metabolizmem RPE w celach terapeutycznych.
Podczas gdy badanie metabolizmu mitochondriów RPE in vivo jest idealne, wiele aspektów metabolizmu mitochondriów RPE można praktycznie zbadać tylko w systemie hodowli in vitro. W ciągu ostatnich kilku dekad poczyniono znaczący postęp w kierunku kultur RPE o wysokiej wierności, do tego stopnia, że najbardziej starannie przygotowane kultury RPE są obecnie wykorzystywane do terapii zastępczej komórek w badaniach klinicznych na ludziach7. Aby utrzymać tak wierne hodowle, RPE musi być uprawiany na określonych podłożach w określonych podłożach przez wiele miesięcy przed eksperymentami. W tych warunkach kultury RPE są maksymalnie zróżnicowane i spolaryzowane, zbliżając się do RPE in vivo. Niestety, obecnie nie ma dostępnego sprzętu, który mógłby mierzyć metabolizm mitochondrialny konkretnie z RPE in vivo. Chociaż monitorowanie tlenu w sieci kapilarnej siatkówki zostało osiągnięte in vivo za pomocą oksymetrii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) 8, nie jest to możliwe w przypadku analizy RPE. Różnice między metabolizmem RPE in vivo i in vitro nie są dobrze opisane, ale wykazano, że hodowle RPE mają wysoką aktywność mitochondrialną, podobną do RPE in vivo3,9, co sugeruje, że istotny wgląd w metabolizm mitochondriów RPE można uzyskać przy użyciu kultur RPE o wysokiej wierności.
Ponieważ cały metabolizm mitochondriów prowadzi do zużycia tlenu, pomiar wskaźników zużycia tlenu RPE (OCR) jest wiernym wskaźnikiem metabolizmu mitochondriów. Pomiar OCR w kulturach RPE był trudny, ponieważ warunki, które sprzyjają maksymalnej polaryzacji i różnicowaniu RPE, często uniemożliwiają długoterminowe dokładne pomiary OCR przy użyciu obecnie dostępnych technik, takich jak Seahorse Analyzer. W tym artykule przedstawiono nowatorskie urządzenie, nazwane Resipher (zwane dalej "systemem"), które umożliwia ciągły pomiar OCR przez tygodnie w RPE hodowanym w warunkach, które maksymalnie promują polaryzację i różnicowanie. Łatwość, z jaką OCR może być mierzony przez ten system w warunkach hodowli RPE, które maksymalnie promują różnicowanie i polaryzację RPE, jest wyjątkowa wśród istniejących urządzeń do pomiaru OCR.
Ten artykuł zawiera porady i wskazówki dotyczące korzystania z systemu z kulturami RPE, a następnie demonstrację dwóch konkretnych zastosowań. Po pierwsze, RPE EMT, naśladując PVR, jest wyzwalany przez ekspozycję na transformujący czynnik wzrostu-beta (TGFβ)1,10,11,12. System służy do monitorowania ewolucji metabolizmu RPE podczas procesu EMT. Po drugie, za pomocą tego systemu bada się rolę hipoksji w metabolizmie RPE. Niedotlenienie jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do patogenezy AMD, ponieważ naczyniówka włosowata rozrzedza się z wiekiem13,14. Połączenie tego systemu z komorami hipoksyjnymi pozwala na modelowanie zmienionego metabolizmu mitochondrialnego RPE z subtelnym niedotlenieniem, które towarzyszy starzeniu się. Na koniec wprowadzono kalkulator online wykorzystujący dane Resipher, który pozwala określić, czy hodowle RPE znajdują się w warunkach hipoksyjnych, normoksycznych czy hiperoksycznych. Takie informacje mają kluczowe znaczenie dla wyciągnięcia jakichkolwiek wniosków na temat metabolizmu RPE na podstawie badań in vitro hodowli RPE.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-trijodo-L-tyronina sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32-kanałowa pokrywka Resipher</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A dla Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A ze streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Inhibitor kompleksu III łańcucha transportu elektronów</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Środek rozprzęgający zwiększający oddychanie mitochondrialne</td></tr><tr><td>DMSO, klasa hodowli komórkowej</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Nośnik do odtwarzania leków mitochondrialnych</td></tr><tr><td>Podłoża powlekające macierz zewnątrzkomórkową: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa dla hfRPE</td></tr><tr><td>Substraty powlekające macierz zewnątrzkomórkową: Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa do iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>Środek rozprzęgający zwiększający oddychanie mitochondrialne</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon-cyklodekstryna</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Komora do hipoksyji</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Suplement mediów</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik O2</td><td>Technologia Sensit lub detektory kryminalistyczne</td><td>P100 lub FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF i beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Transformujący czynnik wzrostu beta-2 w celu indukowania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Inhibitor kompleksu I łańcucha transportu elektronów</td></tr><tr><td>Płytka kompatybilna z systemem</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (Modyfikacja Alfa Pożywki Orła)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

Metabolizm mitochondriów jest krytyczny dla prawidłowego funkcjonowania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), monowarstwy komórek w siatkówce, ważnej dla przetrwania fotoreceptorów. Dysfunkcja mitochondriów RPE jest cechą charakterystyczną zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), głównej przyczyny nieodwracalnej ślepoty w krajach rozwiniętych, oraz proliferacyjnej witreoretinopatii (PVR), oślepiającego powikłania odwarstwienia siatkówki. Stany zwyrodnieniowe RPE zostały dobrze wymodelowane przez systemy hodowli RPE, które są wysoce zróżnicowane i spolaryzowane, aby naśladować RPE in vivo. Jednak monitorowanie wskaźników zużycia tlenu (OCR), wskaźnika funkcji mitochondriów, było trudne w takich systemach hodowli, ponieważ warunki sprzyjające idealnej polaryzacji i różnicowaniu RPE nie pozwalają na łatwe pomiary OCR. 
Tutaj wprowadzamy nowatorski system, Resipher, do monitorowania OCR przez wiele tygodni w dobrze zróżnicowanych kulturach RPE, jednocześnie utrzymując RPE na optymalnych podłożach wzrostowych i fizjologicznych podłożach hodowlanych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych. System ten oblicza OCR, mierząc gradient stężenia tlenu obecnego w pożywkach nad komórkami. Omawiamy zalety tego systemu w porównaniu z innymi metodami wykrywania OCR oraz sposób konfiguracji systemu pomiaru OCR w hodowlach RPE. Omówiono najważniejsze porady i wskazówki dotyczące korzystania z systemu, ostrzeżenia dotyczące interpretowania danych oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z nieoczekiwanymi wynikami. 
Udostępniamy również kalkulator online do ekstrapolacji poziomu doświadczenia z hodowlami RPE w hipoksji, normoksji lub hiperoksji na podstawie gradientu tlenu w pożywkach nad komórkami wykrytymi przez system. Na koniec dokonujemy przeglądu dwóch zastosowań systemu, mierząc stan metaboliczny komórek RPE w modelu PVR i rozumiejąc, w jaki sposób RPE metabolicznie dostosowuje się do niedotlenienia. Przewidujemy, że zastosowanie tego systemu w wysoce spolaryzowanych i zróżnicowanych kulturach RPE poprawi naszą wiedzę na temat metabolizmu mitochondrialnego RPE zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych.

Wprowadzamy nowatorskie urządzenie do pomiaru wskaźników zużycia tlenu (OCR) w hodowlach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Urządzenie może mierzyć OCR przez wiele tygodni na RPE hodowanym na standardowych płytkach do hodowli komórkowych ze standardowymi pożywkami, podczas gdy płytki znajdują się w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

Zwyrodnienie RPE, czyli nabłonka barwnikowego siatkówki, leży u podstaw wielu przyczyn utraty wzroku. Dysfunkcja mitochondriów leży u podstaw tej degeneracji RPE w wielu przypadkach. Możemy zmierzyć funkcję mitochondriów, patrząc na wskaźniki zużycia tlenu lub OCR.W tym miejscu przedstawiamy nową metodę pomiaru OCR w RPE. Dzięki pracom z wielu laboratoriów jest już dobrze ugruntowane, że RPE wymaga aktywności mitochondriów, aby utrzymać swoje zdrowie i funkcję. Badania koncentrują się teraz bardziej na tym, jakie składniki odżywcze preferencyjnie wykorzystuje RPE i czy zmienia się to pod wpływem stresu.Wcześniejsze metody oceny OCR w RPE mają ograniczenia. Albo RPE rósł w nieidealnych warunkach, albo nie można go było ocenić przez długi czas. Tak więc pomiar OCR w kulturach o wysokiej wierności, które zachowują cechy in vivo, jest jednym z głównych wyzwań.Metoda monitorowania OCR przedstawiona w tym manuskrypcie umożliwia nam mierzenie OCR przez tygodnie, jednocześnie manipulując RPE w obliczu wielu wyzwań eksperymentalnych. Wszystko to odbywa się, gdy RPE znajduje się w idealnych warunkach hodowli, które pozwalają mu naśladować idealny RPE in vivo. Resipher to nowatorskie urządzenie do długoterminowego monitorowania zużycia tlenu w hodowlach komórkowych, takich jak nabłonek barwnikowy siatkówki.W przeciwieństwie do metod krótkoterminowych, takich jak Seahorse Analyzer, Resipher obsługuje rozszerzone monitorowanie w standardowych warunkach, umożliwiając szczegółowe profilowanie bioenergetyczne przez wiele tygodni przy jednoczesnym zachowaniu zdrowia komórek. Aby rozpocząć, umieść pokrywę czujnika na pustej 96-dołkowej płytce odbiorczej i umieść ją w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wyrównaj i zamontuj urządzenie na pokrywie czujnika i podłącz je do koncentratora za pomocą dostarczonego USB, tworząc kanapkę Resipher.Teraz przejdź do strony Lucid Lab i kliknij przycisk Nowy eksperyment w prawym górnym rogu, aby utworzyć nowy eksperyment. Nazwij tytuł eksperymentu i wprowadź wszelkie istotne notatki eksperymentalne dotyczące badania. Następnie stwórz dobre warunki i grupy zabiegowe.Na przykład, jeśli testuje się wpływ różnych stężeń surowicy w pożywce na szybkość zużycia tlenu, wybierz Surowicę w nazwie grupy. Wprowadź stężenia pożywki w surowicy, które mają być używane, i dodaj więcej wartości procentowych surowicy, klikając przycisk plusa. Następnie przypisz, które studzienki otrzymają określony procent surowicy i wybierz wzór kolorystyczny dla tych studzienek.Kliknij przycisk Dodaj grupę, aby w razie potrzeby dodać więcej grup. Następnie zdefiniuj ustawienia blachy i wybierz odpowiedni styl urządzenia i blachy. W tym celu należy kliknąć przycisk Dodaj blachę, wybrać urządzenie i wybrać typ blachy.Wybierz Leczenie i kliknij odpowiednią studnię. Teraz kliknij przycisk Rozpocznij teraz, aby rozpocząć eksperyment. Sprawdź, czy wskaźnik na stronie internetowej i dioda elektroluminescencyjna na hubie świecą na zielono.Pozwól systemowi działać przez 15 do 60 minut, aby umożliwić sprawdzenie, czy każdy czujnik jest dobrze skalibrowany i wykrywa tlen atmosferyczny. Następnie zdejmij urządzenie z pokrywy czujnika i umieść je do góry nogami w inkubatorze, aby umożliwić zresetowanie silnika urządzenia. Teraz umieść płytkę z pokrywką czujnikową z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych wraz z 96-dołkową płytką zawierającą kultury RPE.Zmień pożywkę na płytce z kulturami RPE na tę samą pożywkę i objętość dla wszystkich studzienek, aby uzyskać podstawowe wartości zużycia tlenu dla każdej studzienki. Następnie przenieść pokrywkę czujnikową na płytkę zawierającą kultury komórkowe i umieścić standardową pokrywkę na płytce zawierającej kultury komórkowe na pustą 96-dołkową płytkę odbiorczą, aby zachować sterylność standardowej pokrywy. Umieścić płytkę z kulturami komórkowymi i pokrywką czujnikową z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.Wyrównaj i zamontuj urządzenie na pokrywie czujnika i podłącz je do koncentratora za pomocą dostarczonego USB. Sprawdź, czy wskaźniki na interfejsie witryny internetowej i hubie świecą na zielono. Pozwól urządzeniu mierzyć wskaźniki zużycia tlenu lub OCR w każdej studzience przez co najmniej 12 do 24 godzin, aby uchwycić podstawowy OCR.Po eksperymencie zanurz pokrywkę czujnika w 70% etanolu na 10 minut w kapturze do hodowli komórkowych, aby ją wysterylizować. Gdy etanol i woda całkowicie odparują, umieść pokrywę czujnika na nowej 96-dołkowej płytce odbiorczej. Aby rozpocząć, zmontuj pokrywę czujnika z płytką do hodowli komórkowej w kapturze i przenieś je do komory hipoksji.Ustaw kanapkę w komorze do hipoksji. Następnie umieść szalkę Petriego ze sterylną wodą w komorze hipoksji, aby pomóc utrzymać wilgotność. Na koniec umieść przenośny czujnik tlenu w komorze hipoksji.Następnie uszczelnij komorę hipoksji. Upewnij się, że USB wychodzi z komory hipoksji, a otwór, w którym wyjście jest uszczelniony kitem lub smarem silikonowym. Podłącz komorę hipoksji do butli gazowej o hipoksyjnym stężeniu tlenu i standardowym stężeniu dwutlenku węgla w hodowli komórkowej.Powoli wymieniaj powietrze w komorze hipoksji na 1% tlenu i 5% dwutlenku węgla powietrze z butli, aż czujnik tlenu pokaże pożądane stężenie tlenu, zwykle od 1% do 10% Teraz zamknij zawory wlotowe i wylotowe komory hipoksji i przenieś całą komorę do inkubatora. Następnie skonfiguruj i rozpocznij eksperyment. Pożywki zrównoważone tlenem atmosferycznym potrzebowały więcej czasu, aby osiągnąć równowagę przy większych objętościach.Komora hipoksyjna wykazywała powolny wyciek, co spowodowało, że poziom tlenu zbliżył się do stężenia atmosferycznego o 30 godzin. Rozpuszczalność tlenu była identyczna między pożywkami świeżymi i kondycjonowanymi, co wskazuje, że zmiany składu pożywek w czasie nie wpływały na rozpuszczalność tlenu. Na początek należy monitorować wskaźniki zużycia tlenu (OCR) w dobrze zróżnicowanych kulturach RPE w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych przy użyciu systemu Resipher.Po eksperymencie otwórz kalkulator, aby oszacować poziom tlenu w monowarstwie ogniwa i wprowadź objętość pożywki w mikrolitrach. Wprowadź stężenie nasyconego tlenu na granicy faz powietrze-ciecz. Na wejściu Flux wprowadź strumień lub OCR, zgłaszany przez system.Na podstawie tych wartości oblicza się stężenie tlenu w stanie ustalonym na każdej wysokości w kolumnie pożywki i przedstawia je na wykresie. Oś x wykresu reprezentuje wysokość w milimetrach nad dnem studni. Oś y reprezentuje obliczone stężenie tlenu na tej wysokości.Stężenie tlenu na dnie studni podaje się w wierszu poniżej wykresu.

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Analiza żywej tkanki w czasie rzeczywistym dostarcza ważnych danych funkcjonalnych i mechanistycznych. W tym artykule opisano protokoły i zmienne krytyczne w celu zapewnienia dokładnego i powtarzalnego generowania danych przez nowatorski i niewymagający pompowania wielokanałowy system fluidyki, który utrzymuje i ocenia szeroką gamę modeli tkanek i komórek.

Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy

Niniejsza praca dotyczy opracowania i standaryzacji wartościowego protokołu metodycznego służącego do określania długoterminowej (14-dniowej) toksyczności letalnej substancji chemicznych, ścieków przemysłowych lub komunalnych oraz ciekłych próbek środowiskowych wobec słonawodnego skorupiaka Artemia franciscana.

Długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka Artemia franciscana

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Poznaj metodę długoterminowego pomiaru zużycia tlenu w kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki przy użyciu urządzenia Resipher. Ta technika umożliwia szczegółową analizę bioenergetyczną komórek RPE przez wiele tygodni.

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki (Wideo) | JoVE Journal

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

Przeglądaj więcej filmów