Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki
16 sierpnia 2024
Wprowadzamy nowatorskie urządzenie do pomiaru wskaźników zużycia tlenu (OCR) w hodowlach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Urządzenie może mierzyć OCR przez wiele tygodni na RPE hodowanym na standardowych płytkach do hodowli komórkowych ze standardowymi pożywkami, podczas gdy płytki znajdują się w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
Zwyrodnienie RPE, czyli nabłonka barwnikowego siatkówki, leży u podstaw wielu przyczyn utraty wzroku. Dysfunkcja mitochondriów leży u podstaw tej degeneracji RPE w wielu przypadkach. Możemy zmierzyć funkcję mitochondriów, patrząc na wskaźniki zużycia tlenu lub OCR.
W tym miejscu przedstawiamy nową metodę pomiaru OCR w RPE. Dzięki pracom z wielu laboratoriów jest już dobrze ugruntowane, że RPE wymaga aktywności mitochondriów, aby utrzymać swoje zdrowie i funkcję. Badania koncentrują się teraz bardziej na tym, jakie składniki odżywcze preferencyjnie wykorzystuje RPE i czy zmienia się to pod wpływem stresu.
Wcześniejsze metody oceny OCR w RPE mają ograniczenia. Albo RPE rósł w nieidealnych warunkach, albo nie można go było ocenić przez długi czas. Tak więc pomiar OCR w kulturach o wysokiej wierności, które zachowują cechy in vivo, jest jednym z głównych wyzwań.
Metoda monitorowania OCR przedstawiona w tym manuskrypcie umożliwia nam mierzenie OCR przez tygodnie, jednocześnie manipulując RPE w obliczu wielu wyzwań eksperymentalnych. Wszystko to odbywa się, gdy RPE znajduje się w idealnych warunkach hodowli, które pozwalają mu naśladować idealny RPE in vivo. Resipher to nowatorskie urządzenie do długoterminowego monitorowania zużycia tlenu w hodowlach komórkowych, takich jak nabłonek barwnikowy siatkówki.
W przeciwieństwie do metod krótkoterminowych, takich jak Seahorse Analyzer, Resipher obsługuje rozszerzone monitorowanie w standardowych warunkach, umożliwiając szczegółowe profilowanie bioenergetyczne przez wiele tygodni przy jednoczesnym zachowaniu zdrowia komórek. Aby rozpocząć, umieść pokrywę czujnika na pustej 96-dołkowej płytce odbiorczej i umieść ją w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wyrównaj i zamontuj urządzenie na pokrywie czujnika i podłącz je do koncentratora za pomocą dostarczonego USB, tworząc kanapkę Resipher.
Teraz przejdź do strony Lucid Lab i kliknij przycisk Nowy eksperyment w prawym górnym rogu, aby utworzyć nowy eksperyment. Nazwij tytuł eksperymentu i wprowadź wszelkie istotne notatki eksperymentalne dotyczące badania. Następnie stwórz dobre warunki i grupy zabiegowe.
Na przykład, jeśli testuje się wpływ różnych stężeń surowicy w pożywce na szybkość zużycia tlenu, wybierz Surowicę w nazwie grupy. Wprowadź stężenia pożywki w surowicy, które mają być używane, i dodaj więcej wartości procentowych surowicy, klikając przycisk plusa. Następnie przypisz, które studzienki otrzymają określony procent surowicy i wybierz wzór kolorystyczny dla tych studzienek.
Kliknij przycisk Dodaj grupę, aby w razie potrzeby dodać więcej grup. Następnie zdefiniuj ustawienia blachy i wybierz odpowiedni styl urządzenia i blachy. W tym celu należy kliknąć przycisk Dodaj blachę, wybrać urządzenie i wybrać typ blachy.
Wybierz Leczenie i kliknij odpowiednią studnię. Teraz kliknij przycisk Rozpocznij teraz, aby rozpocząć eksperyment. Sprawdź, czy wskaźnik na stronie internetowej i dioda elektroluminescencyjna na hubie świecą na zielono.
Pozwól systemowi działać przez 15 do 60 minut, aby umożliwić sprawdzenie, czy każdy czujnik jest dobrze skalibrowany i wykrywa tlen atmosferyczny. Następnie zdejmij urządzenie z pokrywy czujnika i umieść je do góry nogami w inkubatorze, aby umożliwić zresetowanie silnika urządzenia. Teraz umieść płytkę z pokrywką czujnikową z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych wraz z 96-dołkową płytką zawierającą kultury RPE.
Zmień pożywkę na płytce z kulturami RPE na tę samą pożywkę i objętość dla wszystkich studzienek, aby uzyskać podstawowe wartości zużycia tlenu dla każdej studzienki. Następnie przenieść pokrywkę czujnikową na płytkę zawierającą kultury komórkowe i umieścić standardową pokrywkę na płytce zawierającej kultury komórkowe na pustą 96-dołkową płytkę odbiorczą, aby zachować sterylność standardowej pokrywy. Umieścić płytkę z kulturami komórkowymi i pokrywką czujnikową z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Wyrównaj i zamontuj urządzenie na pokrywie czujnika i podłącz je do koncentratora za pomocą dostarczonego USB. Sprawdź, czy wskaźniki na interfejsie witryny internetowej i hubie świecą na zielono. Pozwól urządzeniu mierzyć wskaźniki zużycia tlenu lub OCR w każdej studzience przez co najmniej 12 do 24 godzin, aby uchwycić podstawowy OCR.
Po eksperymencie zanurz pokrywkę czujnika w 70% etanolu na 10 minut w kapturze do hodowli komórkowych, aby ją wysterylizować. Gdy etanol i woda całkowicie odparują, umieść pokrywę czujnika na nowej 96-dołkowej płytce odbiorczej. Aby rozpocząć, zmontuj pokrywę czujnika z płytką do hodowli komórkowej w kapturze i przenieś je do komory hipoksji.
Ustaw kanapkę w komorze do hipoksji. Następnie umieść szalkę Petriego ze sterylną wodą w komorze hipoksji, aby pomóc utrzymać wilgotność. Na koniec umieść przenośny czujnik tlenu w komorze hipoksji.
Następnie uszczelnij komorę hipoksji. Upewnij się, że USB wychodzi z komory hipoksji, a otwór, w którym wyjście jest uszczelniony kitem lub smarem silikonowym. Podłącz komorę hipoksji do butli gazowej o hipoksyjnym stężeniu tlenu i standardowym stężeniu dwutlenku węgla w hodowli komórkowej.
Powoli wymieniaj powietrze w komorze hipoksji na 1% tlenu i 5% dwutlenku węgla powietrze z butli, aż czujnik tlenu pokaże pożądane stężenie tlenu, zwykle od 1% do 10% Teraz zamknij zawory wlotowe i wylotowe komory hipoksji i przenieś całą komorę do inkubatora. Następnie skonfiguruj i rozpocznij eksperyment. Pożywki zrównoważone tlenem atmosferycznym potrzebowały więcej czasu, aby osiągnąć równowagę przy większych objętościach.
Komora hipoksyjna wykazywała powolny wyciek, co spowodowało, że poziom tlenu zbliżył się do stężenia atmosferycznego o 30 godzin. Rozpuszczalność tlenu była identyczna między pożywkami świeżymi i kondycjonowanymi, co wskazuje, że zmiany składu pożywek w czasie nie wpływały na rozpuszczalność tlenu. Na początek należy monitorować wskaźniki zużycia tlenu (OCR) w dobrze zróżnicowanych kulturach RPE w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych przy użyciu systemu Resipher.
Po eksperymencie otwórz kalkulator, aby oszacować poziom tlenu w monowarstwie ogniwa i wprowadź objętość pożywki w mikrolitrach. Wprowadź stężenie nasyconego tlenu na granicy faz powietrze-ciecz. Na wejściu Flux wprowadź strumień lub OCR, zgłaszany przez system.
Na podstawie tych wartości oblicza się stężenie tlenu w stanie ustalonym na każdej wysokości w kolumnie pożywki i przedstawia je na wykresie. Oś x wykresu reprezentuje wysokość w milimetrach nad dnem studni. Oś y reprezentuje obliczone stężenie tlenu na tej wysokości.
Stężenie tlenu na dnie studni podaje się w wierszu poniżej wykresu.
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy degeneracji nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE), która jest kluczowym czynnikiem utraty wzroku, poprzez wprowadzenie nowego urządzenia do pomiaru tempa zużycia tlenu (OCR) w kulturach RPE. Urządzenie Resipher umożliwia długoterminowe monitorowanie OCR w optymalnych warunkach hodowli, co pozwala na rozległe profilowanie bioenergetyczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Zdrowie i funkcja nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE)
- Ocena funkcji mitochondriów
- Wskaźniki zużycia tlenu (OCR)
Wstęp
- Degeneracja RPE przyczynia się do utraty wzroku.
- Dysfunkcja mitochondriów jest powiązana z degeneracją RPE.
- Poprzednie metody pomiaru OCR były ograniczone przez nieoptymalne warunki hodowli oraz krótki czas monitorowania.
Zastosowane metody
- Wprowadzenie urządzenia Resipher do długotrwałego pomiaru OCR w kulturach RPE
- Dobrze zróżnicowane kultury komórek nabłonka barwnego siatkówki
- Ciągły monitoring w standardowych warunkach hodowli komórkowej
Główne wyniki
- Resipher umożliwia pomiar OCR w ciągu wielu tygodni.
- Zachowuje żywotność komórek, umożliwiając jednocześnie szczegółowe profilowanie bioenergetyczne.
- Ułatwia manipulacje eksperymentalne w optymalnych warunkach.
Wnioski
- Badanie przedstawia zaawansowaną metodę oceny funkcji mitochondriów in vitro.
- Ta innowacyjna technika ma istotne znaczenie dla badań nad RPE oraz potencjalnych interwencji terapeutycznych w przypadku utraty wzroku.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Długoterminowe, ilościowe monitorowanie szybkości zużycia tlenu (OCR) w wysoko zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) wypełnia istotną lukę w ocenie funkcji mitochondriów w systemach istotnych dla badania chorób. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego dla modeli chorób oczu, wspierając decyzje dotyczące portfela projektów skorygowane o ryzyko. Podejście to umożliwia rzetelną ocenę adaptacji metabolicznej i odpowiedzi stresowej w RPE, co bezpośrednio dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celów terapeutycznych i procesów badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnych modelach RPE.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez ilościowe określanie odpowiedzi metabolicznych na wyzwania eksperymentalne.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w systemach nabłonkowych istotnych dla przebiegu chorób.
- Zwiększa pewność prognostyczną w przypadku wczesnych etapów identyfikacji celów terapeutycznych w chorobach oczu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, spolaryzowanych kultur RPE do dalszych etapów przepływów pracy w zakresie screeningu metabolicznego.
- Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne pomiary OCR dla ilościowych wyników analizy.
- Umożliwia podłużną ocenę wpływu związków na funkcję mitochondriów.
- Wspiera skalowalne formaty analiz wielodołkowych, kompatybilne z analizą wysokotreściową (high-content analysis).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie in vitro profilowania metabolicznego z fenotypami RPE istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów mitochondrialnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o funkcjonalne punkty końcowe metabolizmu.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów dysfunkcji mitochondrialnych w modelach chorób oczu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten system monitorowania OCR integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając ciągłą ocenę metaboliczną w kulturach RPE w warunkach fizjologicznych i stresowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolizmu mitochondrialnego w nabłonku barwnej warstwy siatkówki (RPE).
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki OCR do oceny związków w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Analityka: Dostarcza ciągłe dane OCR z wielu studzienek do analizy porównawczej między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy in vitro znaleziska metaboliczne z przedklinicznymi modelami chorób siatkówki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny metabolicznej w modelach RPE i potencjalnie w innych modelach nabłonkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów mitochondrialnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje długoterminowy pomiar OCR w kulturach istotnych fizjologicznie przy skalowalnej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne kapitałowo ustalanie priorytetów dla celów mitochondrialnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp i porównywalność międzyprogramową dla punktów końcowych metabolizmu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli RPE oraz bioenergetyki mitochondrialnej.
- Wymagany jest dostęp do urządzenia Resipher oraz kompatybilnej infrastruktury wielodotykowych płytek hodowlanych.
- Konieczna jest standaryzacja mediów, warunków hodowli i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych nabłonkowych lub metabolicznych systemów modelowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Interpretacja danych OCR musi uwzględniać skład mediów, gradienty tlenu oraz kontrole eksperymentalne.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:49
Setup of Resipher System "Sandwich" to Monitor Oxygen Consumption Rate in Well‐Differentiated RPE Cultures
5:11
Measuring Changes in Mitochondrial Metabolism in Hypoxic RPE Using Resipher System
7:03
Calculating the O2 Concentration at the RPE Monolayer to Determine if Cells are in Hypoxic, Normoxic, or Hyperoxic Conditions
