Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego zakażenia Leishmania infantum u chomików złocistych przez iniekcję dziąseł. Technika ta umożliwia śledzenie infekcji w czasie rzeczywistym i stanowi alternatywę dla promastigotów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul- FUNDECT. PPSUS/ Decit-MS/CNPq/SES zapewniło wsparcie finansowe dla tych badań. Podziękowania dla Monique Ribeiro de za jej rady dotyczące dróg szczepienia. Projekt ten został opracowany w ramach Umowy o współpracy nr 258/2017 pomiędzy FIOCRUZ, a Universidade Federal do Rio de Janeiro- UFRJ. Zespół jest szczerze wdzięczny producentom wideo Ricardo Baptista Schmidtowi i Geniltonowi José Vieirze z Centrum Popularyzacji Nauki (IOC) za ich nieocenione wsparcie i pomoc w filmowaniu protokołów i przeprowadzaniu wywiadów.

<ol><li>Ruiz-Postigo, J. A., et al. Global leishmaniasis surveillance, 2022: assessing trends over the past 10 years. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuiz-Postigo%2C+JA+%22WHO%2C+Weekly+epidemiological+record+n%C2%B0+40%22">WHO, Weekly epidemiological record n° 40</a>. , (2023).</li>
<li>Faraut-Gambarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+resistance+of+Leishmania+infantum+to+meglumine+antimoniate%3A+a+study+of+37+strains+collected+from+patients+with+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo resistance of Leishmania infantum to meglumine antimoniate: a study of 37 strains collected from patients with visceral leishmaniasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (4), 827-830 (1997).</li>
<li>Ribeiro-Romão, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+lesion+development%2C+tissue+damage%2C+and+cytokine+expression+in+golden+hamsters+%28Mesocricetus+auratus%29+infected+by+inocula+with+different+Leishmania+%28Viannia%29+braziliensis+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of lesion development, tissue damage, and cytokine expression in golden hamsters (Mesocricetus auratus) infected by inocula with different Leishmania (Viannia) braziliensis concentrations.</a> Infect Immun. 82 (12), 5203-5213 (2014).</li>
<li>Gomes-Silva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamster+%28Mesocricetus+auratus%29+as+an+experimental+model+for+Leishmania+%28Viannia%29+braziliensis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">hamster (Mesocricetus auratus) as an experimental model for Leishmania (Viannia) braziliensis infection.</a> Parasitology. 140 (6), 771-779 (2013).</li>
<li>Moreira, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hematological+and+biochemical+alterations+in+hamster+%28Mesocricetus+auratus%29+experimentally+infected+with+Leishmania+infantum+through+different+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">hematological and biochemical alterations in hamster (Mesocricetus auratus) experimentally infected with Leishmania infantum through different routes of inoculation.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 181-194 (2016).</li>
<li>Carnielli, J. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Leishmania+infantum+genetic+marker+associated+with+miltefosine+treatment+failure+for+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">A Leishmania infantum genetic marker associated with miltefosine treatment failure for visceral leishmaniasis.</a> EBioMedicine. 36, 83-91 (2018).</li>
<li>Carnielli, J. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+resistance+of+Leishmania+infantum+to+miltefosine+contributes+to+the+low+efficacy+in+the+treatment+of+visceral+leishmaniasis+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Natural resistance of Leishmania infantum to miltefosine contributes to the low efficacy in the treatment of visceral leishmaniasis in Brazil.</a> Am J Trop Med Hyg. 101 (4), 789-794 (2019).</li>
<li>Moreira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+continuous+axenic+cultivation+in+Leishmania+infantum+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).</li>
<li>Fortin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+oleylphosphocholine+%28OlPC%29+in+a+laboratory+model+of+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of oleylphosphocholine (OlPC) in a laboratory model of visceral leishmaniasis.</a> J Antimicrob Chemother. 67 (11), 2707-2712 (2012).</li>
<li>Rodrigues, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gingival+vein+is+a+minimally+traumatic+site+for+multiple+blood+sampling+in+guinea+pigs+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The gingival vein is a minimally traumatic site for multiple blood sampling in guinea pigs and hamsters.</a> PLoS ONE. 12 (5), e0177967(2017).</li>
<li>Oliveira, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+report%3A+Gingival+vein+punction%3A+A+new+simple+technique+for+drug+administration+or+blood+sampling+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Technical report: Gingival vein punction: A new simple technique for drug administration or blood sampling in rats and mice.</a> Scand J Lab Anim Sci. 36 (2), 109-113 (2009).</li>
<li>Saeij, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+Toxoplasma+gondii+infection+in+living+mice+reveals+dramatic+differences+between+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of Toxoplasma gondii infection in living mice reveals dramatic differences between strains.</a> Infect Immun. 73 (2), 695-702 (2005).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 41, e1980(2010).</li>
<li>Andriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+in+vivo+of+anti-Trypanosoma+cruzi+compounds+selected+from+a+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Activity in vivo of anti-Trypanosoma cruzi compounds selected from a high throughput screening.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (8), e1298(2011).</li>
<li>Henriques, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mice+infected+with+bioluminescent+Trypanosoma+cruzi+unveils+novel+sites+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mice infected with bioluminescent Trypanosoma cruzi unveils novel sites of infection.</a> Parasit Vectors. 7, 89(2014).</li>
<li>Henriques, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+of+Trypanosoma+cruzi+infection+in+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging of Trypanosoma cruzi infection in Rhodnius prolixus.</a> Parasit Vectors. 26 (5), 214(2012).</li>
<li>Sereno, D., Lemesre, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenically+cultured+amastigote+forms+as+an+in+vitro+model+for+investigation+of+antileishmanial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Axenically cultured amastigote forms as an in vitro model for investigation of antileishmanial agents.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 972-976 (1997).</li>
<li>Lachaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+two+PCR+methods+for+the+diagnosis+of+canine+visceral+leishmaniasis+and+the+detection+of+asymptomatic+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Value of two PCR methods for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis and the detection of asymptomatic carriers.</a> Parasitology. , 197-207 (2002).</li>
<li>Blood sampling Microsite. , National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of animals in research (NC3RS). 
 <a target="_blank" href=" https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-hamster"> https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-hamster</a> (2021).</li>
<li>Bolhassani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Leishmania+species%3A+development+of+stable+GFP+expression+and+its+application+for+in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies.</a> Exp Parasitol. 127 (3), 637-645 (2011).</li>
<li>Mendes Costa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+infection+with+bioluminescent+Leishmania+infantum+axenic+amastigotes+applied+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Murine infection with bioluminescent Leishmania infantum axenic amastigotes applied to drug discovery.</a> Sci Rep. 9 (1), 18989(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Pobieranie krwi lub dożylne wstrzykiwanie substancji chomikom jest niezbędne do różnych badań naukowych. Opracowano kilka metod umożliwiających dostęp do różnych dróg pobierania lub inokulacji bezpośrednio związanych z celami badawczymi19. Ze względu na anatomię chomika - krótki ogon i kończyny - droga wewnątrzsercowa jest zwykle wyborem do dożylnego wstrzyknięcia Leishmania. W zależności od zastosowanego szczepu, droga dosercowa okazała się korzystna jako szczep referencyjny L. infantum MHOM/BR/1974/PP75, którego zakażenie występuje przez długi czas, 6-9 miesięcy5. Jest to jednak inokulum, które może prowadzić do krwawienia i śmierci zwierzęcia. W związku z tym ustandaryzowaliśmy alternatywną drogę inokulacji dożylnej w przypadku infekcji w splocie dziąsłowym, żyle wargowej żuchwy, która powoduje mniejsze szkody dla zwierzęcia. Zwierzęta zostały zakażone genetycznie zmodyfikowanym szczepem referencyjnym L. infantum MHOM / BR / 1974 / PP75, który stabilnie wyrażał lucyferazy świetlika nawet po kilku pasażach w kulturze i myszach (Figura 1), jak to miało miejsce w przypadku innych gatunków Leishmania transfekowanych tym samym plazmidem integracyjnym20.
Żyła żuchwowa wargowa lub żyła dziąsłowa jest lepszą drogą do pobierania krwi i wielokrotnego pobierania krwi10,11. Jest to jednak pierwszy dowód na to, że żyła dziąsłowa jest możliwym miejscem dożylnego zakażenia Leishmania u chomików. W przeciwieństwie do pobierania krwi, w którym zwykle używa się igły o dużej grubości 26 G, aby uniknąć hemolizy krwi10, ten miernik igły nie był odpowiedni do inokulacji Leishmania ze względu na perforację żyły, krwawienie i wyciek inokulum. W przypadku zakażenia Leishmania przez żyłę żuchwy szczęki niezbędna była igła 30G o mniejszej średnicy. Innym aspektem, który odróżnia nakłucie żyły od infekcji przez żyłę dziąsłową, jest szybkość podawania, wynosząca około 1 μl/s; oraz zapewnić, że jest wstrzykiwany do naczynia - żyły wargowej żuchwy i nie jest osadzony w błonie śluzowej, podskórnie lub śródskórnie. Ze względu na niski obrót krwi w splocie dziąsłowym, 50 μl inokulum o dużej gęstości aksenicznych amastigotów lub promastigotów L. infantum-Luc, 2 x 109 pasożytów/ml, musiało być inokulowane powoli (~ 1 min), a igłę należy usunąć, przytrzymując wacik dociśnięty przez 1 minutę, aby umożliwić dyspersję inokulum w krwiobiegu (ryc. 2).
W celu podłużnej oceny infekcji chomiki były zakażone dootrzewnowo (IP) lub drogą dodziąsłową (IG) L. infantum-Luc i były obserwowane przez 50 dpi przez system obrazowania bioluminescencyjnego aż do eutanazji. Biorąc pod uwagę, że szczep referencyjny PP75 może być mniej zjadliwy per se i że nadekspresja lucyferazy może również wpływać na skuteczność infekcji i utrzymywać infekcję przez długi czas, do infekcji użyto wysokiego inokulum 10-8 pasożytów. Po inokulacji dziąsłowej zarówno amastigotów, jak i promastigotów L. infantum-Luc i ocenie za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego, bioluminescencję ograniczono do okolicy szczęki chomików 24 godziny po zakażeniu. Rzeczywiście, chomiki zakażone dootrzewnowo amastigotami i promastigotami L. infantum-Luc wykazywały bioluminescencję rozproszoną w całym brzuchu (ryc. 3, 1 dpi). Ciągły spadek emisji bioluminescencji w czasie, od pierwszego dnia zakażenia do8 dnia i do 22 dpi u chomików zakażonych L. infantum-Luc, był niezależny od drogi inokulacji (Tabela 1 i Ryc. 4).
Jednakże, gdy obciążenie pasożytami w tkankach zwierzęcych jest niskie, może być poniżej granicy wykrywalności systemu obrazowania bioluminescencyjnego, ale może być wykryte i określone ilościowo za pomocą PCR lub qPCR. Jak już informowaliśmy, zakażenie wywołane przez szczep PP75 jest rzeczywiście niższe niż w przypadku innych szczepów5 i tylko u kilku wystąpiły kliniczne objawy choroby ze względu na zmienność genetyczną zwierząt. W tym badaniu, pomimo niewielkiej liczby zwierząt i niskiej zjadliwości tego szczepu, akseniczne amastigoty wykazały przewagę przy 50 dpi, wykazując lepszą infekcję niż promastigoty, jak wykazano za pomocą PCR (Figura 5). Osiem miesięcy po zakażeniu amastigotami drogą dziąseł, pasożyty można było wykryć za pomocą PCR w wątrobie (ryc. 5), a także wykazywały umiarkowaną piloerekcję, ucisk oczodołu i wygiętą w łuk postawę.
Aksostigoty mogą być lepszym wyborem w przypadku infekcji i obserwacji niż promastigotes21 i mają tę zaletę, że są łatwe do produkcji na dużą skalę. Inokulum dziąsłowe jest wykonalne i stanowi lepszą drogę do dożylnego inokulacji związków oraz do zakażenia Leishmania i innych patogenów, bez uszkodzeń lub obrzęków w miejscu aplikacji w żuchwie lub dla zdrowia zwierząt.

Leiszmanioza jest uważana za zaniedbaną i powracającą chorobę wywoływaną przez ponad 20 gatunków Leishmania, endemicznej w kilku krajach w czterech centralnych regionach ekoepidemiologicznych: Ameryka Łacińska, Afryka Północna i Wschodnia oraz Azja Zachodnia i Południowo-Wschodnia1. Można je podzielić na leiszmaniozę nakrywkową (TL) i leiszmaniozę trzewną (VL), która jest śmiertelna, jeśli nie jest leczona. Czynnikiem etiologicznym VL w Brazylii jest Leishmania infantum, a leczenie przeprowadza się za pomocą pięciowartościowych leków przeciwmoniowych lub amfoterycyny B. Leki te są podawane dożylnie, mają wysoką toksyczność, wykazują działania niepożądane i występują przypadki oporności2.
Dlatego konieczne jest zainwestowanie w poszukiwanie nowej chemioterapii. Testy przedkliniczne są w rzeczywistości wąskim gardłem w odkrywaniu nowych leków do leczenia VL, w zależności od modelu zwierzęcego, użytego szczepu, drogi inokulum i innych czynników logistycznych, technicznych i operacyjnych. Chomik złoty wyróżnia się wysoką podatnością na gatunki z podrodzajów Viannia i Leishmania, wykazując wiele procesów klinicznych i immunopatologicznych obserwowanych w chorobie człowieka, jak zaobserwowano w poprzednich badaniach nad Leishmania braziliensis3,4. Chomik zakażony L. infantum rozwija również większość procesów immunopatologicznych charakterystycznych dla VL u ludzi i psów5, takich jak niedokrwistość, leukopenia, małopłytkowość i powiększenie wątroby i śledziony. Ponadto chomik złoty jest zwierzęciem niekrewniaczym i nie wykazuje jednolitej reakcji, odtwarzając niejednorodność objawów klinicznych obserwowanych u ludzi3.
Innym aspektem do rozważenia przy ocenie wyniku infekcji jest szczep L. infantum i droga szczepienia. Kilka szczepów L. infantum różni się podłożem genetycznym i podatnością na leczenie2,6,7. Niektóre szczepy mają niskie obciążenie pasożytnicze w wątrobie i śledzionie po zakażeniu promastigotami8, a akskoniczne amastigotes mogą być alternatywą dla poprawy infekcji, która nie jest zbyt dobrze zbadana. Rzeczywiście, droga dożylna sprzyja infekcji i zwiększa częstotliwość występowania zwierząt z objawami klinicznymi; Ale najczęściej stosuje się inokulację dootrzewnową. Droga dożylna jest wyborem w przypadku dożylnego zakażenia L. infantum5,8,9. Jednak u chomików inokulacja dodziąsłowa jest alternatywną drogą wstrzyknięcia dożylnego, która nie jest opisana jako miejsce infekcji. Pomimo doniesień, nakłucie żyły dziąsłowej jest minimalnie inwazyjne, umożliwia łatwy dostęp żylny i powoduje niewiele urazów miejscowych i ogólnoustrojowych10. Nakłucie żyły dziąsłowej najbardziej zgadza się z zaleceniami mającymi na celu maksymalizację jakości i możliwości zastosowania wyników przy jednoczesnym zachowaniu dobrostanu zwierząt11.
Przedkliniczna ocena związków VL przy użyciu tradycyjnych metod wymaga większej liczby zwierząt, które muszą zostać poddane eutanazji w celu analizy histopatologicznej i oceny obciążenia pasożytami w tkankach. Z kolei system obrazowania bioluminescencyjnego może przyspieszyć badania przedkliniczne i zmniejszyć liczbę zwierząt. Miejsca bioluminescencyjne w zakażonych tkankach mogą być obserwowane w czasie rzeczywistym u tego samego zwierzęcia przez kilka tygodni. Kilka badań nad standaryzacją tego kluczowego narzędzia technologicznego wykazało jego zastosowanie w badaniach na myszach zakażonych Trypanosoma cruzi, Leishmania spp. i Toxoplasma gondii12,13,14,15. Jednak w zależności od obciążenia pasożytami w tkance, bioluminescencja może być niedostatecznie wykryta przez system obrazowania in vivo, co wymaga oceny za pomocą ilościowego PCR dotkniętych narządów. Dlatego proponujemy opracowanie metodologii opartej na dożylnym wstrzyknięciu L. infantum eksprymującego lucyferazy w żyle dziąsłowej chomików złocistych w celu obserwacji za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego i PCR.

<table><tbody><tr><td>1 kb drabinka</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td></td></tr><tr><td>Acetylokoenzym A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, LE, klasa analityczna</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>aprt reverse primer A1715 aprt reverse primer A1715</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-111</td><td></td></tr><tr><td>BamHI 10 U/ ml</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td></td></tr><tr><td>BglII 10 U/ml</td><td>Promega</td><td>R6071</td><td></td></tr><tr><td>napar z mózgu i serca (BHI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>Cetamin (chlorowodorek ketaminy 10%)</td><td>Syntec-Weterynaryjny</td><td></td> <td>zastosowanie. Znieczulenia. Roztwór do wstrzykiwań zawierający 10 ml fiolkę z 10% chlorowodorkiem ketaminy.</td></tr><tr><td>Dekstroza Glukoza, BD Diagnostyka</td><td>Difco</td><td>215530</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>DMEM niska glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>eletroporador Gene Pulser Xcell&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt płodowych (FCS)</td><td>vitrocell/embriolife</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-plaqueTM PLUS&nbsp;</td><td>Kuwety do elektroporacji Cytiva</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser, odstęp 0,2 cm 1652082</td> Kuwety do elektroporacji <td>Bio-Rad</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser, odstęp 0,4 cm 1652081&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Polimeraza platynowa</td><td>Fischer Scientific</td><td>10-966-034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA Polimeraza Promega</td><td></td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Hemin w proszku</td><td>inlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>hyg podkład do przodu A3804</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-109</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>ISOFORINE</td><td>Cristalia</td><td></td><td>Roztwór do inhalacji w opakowaniach zawierających 1 butelkę po 100 i 240 ml izofluranu</td></tr><tr><td>IVIS Lumina</td><td>Perkin Elmer</td><td>ISO838N4625</td><td></td></tr><tr><td>JM109 Competent Cells</td><td>Promega</td><td>&nbsp; L2005</td><td></td></tr><tr><td>L- Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA/HindIII Marker</td><td>Thermo Fischer</td><td>Scientific SM0101</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich 168149<</td><td>br/> Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Living Image oprogramowanie</td><td>Perkin Elmer-NotI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6431</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, 25:24:1 (v/v), klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pLEXSY-hyg2&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>EGE-232</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K Promega</td><td></td><td>V3021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAGEN Plasmid Midi&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR & Żelowy zestaw do czyszczenia</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763 Czytnik mikropłytek Sigma-Al</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax2</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssu podkład do przodu F3001 podkład F3001</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-105</td><td></td></tr><tr><td>ssu odwrotny starter F3002 ssu reverse primer F3002</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-104</td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>SwaI 10 U/ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1241</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA 1 U/ml</td> System szybkiej ligacji <td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>T4</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veritiy 96-dołkowa płytka</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Bulion (podłoże sojowo-kazeinowe do trawienia)</td><td>Difco-BD</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Regały wentylowane&nbsp;</td><td>Alesco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z Earle&prime; s sole i L-glutamina, bez wodorowęglanu sodu, proszek,&nbsp;</td><td>Merck</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Żel i PCR Clean-Up</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (chlorowodorek ksylazyny 2%)</td><td>Syntec-Veterinary</td><td></td> <td>zastosowanie. Działa uspokajająco, przeciwbólowo i miorelaksacyjnie. Roztwór do wstrzykiwań zawierający 10 ml fiolkę z 2% chlorowodorkiem ksylazyny.</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania Zero Blunt TOPO PCR&nbsp;</td><td>Termo Fischer&nbsp;</td><td></td><td></td>451245</tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie chomików zakażonych leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

In Vivo Imaging of Leishmania infantum-infected Hamsters by Gingival Inoculation of Axenic Amastigotes Expressing Luciferase

Amerykańska leiszmanioza nakrywkowa (ATL) i leiszmanioza trzewna (VL) są uważane za zaniedbane przez Światową Organizację Zdrowia. VL może być śmiertelna, jeśli nie jest leczona; Leki stosowane w leczeniu są toksyczne i zdarzają się przypadki oporności. Testy przedkliniczne mogą stanowić wąskie gardło w odkrywaniu nowych leków do leczenia, w zależności od modelu zwierzęcego, zastosowanego szczepu i drogi inokulum. Chomik złoty wyróżnia się wysoką podatnością na podrodzaje gatunków Viannia i Leishmania, wykazując wiele procesów klinicznych i immunopatologicznych obserwowanych w chorobach człowieka.
Ze względu na anatomię chomika, który ma krótki ogon i kończyny, droga wewnątrzsercowa jest zwykle wybierana do dożylnego wstrzyknięcia Leishmania. Jest to jednak inokulum, które może prowadzić do krwawienia, a ostatecznie do śmierci zwierzęcia. W związku z tym ustandaryzowaliśmy alternatywną drogę inokulacji dożylnej w przypadku infekcji w żyle dziąsłowej, która jest minimalnie inwazyjna, umożliwia łatwy dostęp żylny i powoduje niewiele miejscowych i ogólnoustrojowych urazów zwierzęcia. W związku z tym chomiki zakażone drogą dootrzewnową (IP) lub dodziąsłową (IG) z Leishmania Infantum wykazującą ekspresję lucyferazy (Luc) były obserwowane przez 22 dni przez system obrazowania bioluminescencyjnego oraz 50 dni i 8 miesięcy po zakażeniu metodą PCR.
Po zaszczepieniu dziąsłowym zarówno aksonowych amastigotów, jak i promastigoty L. infantum-Luc, bioluminescencja była ograniczona przez co najmniej 2 tygodnie w miejscu wstrzyknięcia, co jest wskaźnikiem infekcji w tkankach wokół splotu dziąsłowego. Chomiki zakażone dootrzewnowo L. infantum-Luc wykazywały bioluminescencję rozproszoną w całym jamie brzusznej, zgodnie z oczekiwaniami. Jednak dzięki systemowi obrazowania bioluminescencyjnego infekcja zmniejszyła się do 50. dpi i była wykrywalna tylko za pomocą PCR. Amastigoty akseniczne wykazały lepszą infekcję niż promastigoty, co oceniono za pomocą PCR. Rzeczywiście, 8 miesięcy po zakażeniu pasożyty wykryto metodą PCR w wątrobie zwierząt zaszczepionych aksenicznymi amastigotami drogą dożylną, co może być charakterystyczne dla szczepu referencyjnego L. infantum MHOM/BR/1974/PP75, którego zakażenie postępuje powoli i wykazuje niskie obciążenie pasożytami, poniżej rozdzielczości obrazowania bioluminescencyjnego. Tak więc akstyniczne amastigoty mogą być lepszym wyborem do infekcji i obserwacji niż promastigoty, a inokulum dziąsłowe jest wykonalną drogą dożylnego wstrzyknięcia Leishmania i innych patogenów.

Stabilna ekspresja lucyferazy w L. infantum 
Genetycznie zmodyfikowane L. infantum uzyskano przy użyciu plazmidu z linii pLEXSY, który integruje się z genomem Leishmania w locus rybosomalnym 18S rRNA (ssu), którego transkrypcja jest sterowana przez polimerazę RNA I. W związku z tym klony L. infantum-Luc oceniono pod kątem integracji plazmidu w genomie Leishmania oraz stabilnej ekspresji poprzez emisję bioluminescencji in vitro. Do oceny integracji genomowej metodą PCR wybrano klon o wysokim poziomie ekspresji, wykazujący bioluminescencję &gt;120-krotnie wyższą od tła. Elektroforezę produktów PCR w żelu agarozowym w celu oceny integracji plazmidu w genomie oraz emisję bioluminescencji (RLU) promastigot klonu L. infantum-Luc przedstawiono na Rysunku 1. W każdej reakcji PCR uzyskano fragmenty o oczekiwanej wielkości; z genomu L. infantum- Luc namnożono jeden produkt o wielkości około 1,1 kb (5'ssu - utr1) oraz drugi o wielkości 1,8 kb (hyg- 3'ssu) (Rysunek 1A), co potwierdziło integrację kasety plazmidowej i genu lucyferazy w locus ssu genomu L. infantum .
Ekspresję lucyferazy świetliki oceniono również w promastygotach L. infantum-Luc poprzez pomiar emisji bioluminescencji (RLU) w czytniku mikropłytek, zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołów. Poziom bioluminescencji został utrzymany nawet po kilku pasażach w hodowli oraz w myszach BALB/c przez 5 dni; wyniósł on 569,3 ± 19,5 dla szczepu dzikiego i 59361,9 ± 2673,3 (n = 2) dla klona L. infantum- Luc (Rysunek 1B). W związku z tym klon L. infantum-Luc stabilnie eksponujący lucyferazę świetliki został wykorzystany do zakażania chomątek drogą poddziąsłową lub dosytroniczną.
Podanie inokulum dożylnie do żyły dziąsłowej 
Aby zaszczepić Leishmania do krwiobiegu chomiątek, należy zachować ostrożność, aby zminimalizować ryzyko perforacji żyły, krwawienia oraz wycieku inokulum. W związku z tym należy delikatnie odciągnąć dolną wargę, aby odsłonić żyłę dziąsłową (Rycina 2A); oraz należy użyć igły o mniejszej średnicy (30 G), aby uniknąć nadmiernej perforacji żyły. Igłę należy ustawić otworem skierowanym do góry, aby wprowadzić ją do żyły pod odpowiednim kątem (Rycina 2B). Rzeczywiście, aby upewnić się, że igła została wprowadzona do naczynia – żylnej sieci wargowej żuchwy – należy odciągnąć tłok strzykawki, aż krew zostanie zassana do wnętrza igły (Rysunek 2C). Przed wyjęciem igły należy przyłożyć lekki ucisk za pomocą watowego tamponu w celu wspomagania hemostazy (Rycina 2D).
Ocena podłużna za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego 
Hamstery zainfekowane drogą doprzewnowłasną (IP) lub poddziąsłową (IG) za pomocą L. infantum-Monitorowano poziom Luc aż do 50.th dni po infekcji i oceniano je za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego do 22 dni po infekcji (Rycina 3). Obrazy pozyskano 2 h po zakażeniu drogą dosytrawniczą 108 pasożyty w jamie otrzewnowej; obrazy pozyskano przy czasie ekspozycji 30 s lub 1 min i średnim binningu. Sygnał bioluminescencji był &gt;65-krotnie silniejsza w jamie brzusznej u zwierząt zakażonych amastygotami (4,6 × 105 ± 3.7 × 105) niż w przypadku zainfekowanych promastigotami (6,8 × 103 ± 3.8 × 103) (Tabela 1), co wykazuje, że amastygoty zróżnicowały się in vitro wykazują silniejszą bioluminescencję niż promastigoty metacykliczne w fazie stacjonarnej oraz te oczyszczone w poduszce z Ficollu.
Jeden dzień po infekcji (1 dpi) wykonano obrazy bioluminescencyjne przy czasie ekspozycji 3 min (Rycina 3). Odnotowano 45% spadek sygnału bioluminescencyjnego w obrębie jamy brzusznej u chomików zainfekowanych promastygotami oraz 70% spadek u zwierząt zainfekowanych amastygotami (Rycina 3), co sugeruje, że amastygoty uległy w większym stopniu degradacji niż promastygoty metacykliczne (Tabela 1 i Rycina 4). Tydzień po infekcji (8 dpi) u zwierząt zainfekowanych promastygotami sygnał bioluminescencyjny utrzymał się na stałym poziomie (3,3 × 103 ± 5 × 103). Natomiast emisja bioluminescencji u chomików zainfekowanych amastygotami spadła o 95%, z 1,3 × 105 ± 1,1 × 105 do 6,7 × 103 ± 7,5 × 103 (Tabela 1), osiągając poziom zbliżony do chomików zainfekowanych promastygotami. Trzy tygodnie po infekcji (22 dpi) wykonano obrazowanie bioluminescencyjne przy czasie ekspozycji 5 min i dużym binningu (Rycina 3); sygnał był znacznie niższy u zwierząt zainfekowanych promastygotami oraz amastygotami (Tabela 1 i Rycina 4).
Kolejna grupa chomików została zainfekowana drogą poddziąślową amastigotami i promastigotami L. infantum-Luc (108); emisję bioluminescencji zaobserwowano w obszarze szczękowym (Rysunek 3). Obserwacje rozpoczęto 1 dzień po infekcji; chomiki zainfekowane amastigotami wykazały silniejszy sygnał bioluminescencji i wyższą radiancję (7,3 × 103 ± 4,1 × 103) niż zwierzęta zainfekowane promastigotami (1 × 103 ± 5,7 × 102). Tydzień po infekcji (8. dzień po infekcji, dpi), zaobserwowano spadek sygnału bioluminescencji o 36% u zwierząt zainfekowanych promastigotami oraz o 90% u chomików zainfekowanych amastigotami; radiancja wahała się od 7,3 × 103 ± 4,1 × 103 do 7,8 × 102 ± 5,6 × 102 (Tabela 1). Trzy tygodnie po infekcji (22 dpi), sygnał bioluminescencji zarejestrowano również przy 5-minutowym czasie ekspozycji i dużym binningu (Rysunek 3). Sygnał bioluminescencji był podobny i niski dla zwierząt zainfekowanych promastigotami oraz amastigotami (Tabela 1 i Rysunek 4) w obrębie głowy zwierząt zainfekowanych w dziąśle; za pomocą sygnału bioluminescencji nie zaobserwowano rozprzestrzeniania się infekcji do obszaru brzusznego.
Ocena zakażenia tkanek i narządów metodą PCR 
Przeprowadziliśmy konwencjonalną reakcję PCR w celu zbadania zakażenia w konkretnych narządach, takich jak wątroba, śledziona i węzły chłonne, które mogły znajdować się poniżej granicy wykrywalności obrazowania in vivo. Region docelowy kDNA był bardziej specyficzny dla amplifikacji DNA L. infantum w zakażonych tkankach i narządach, a PCR dla enzymu GAPDH chomika służył jako kontrola integralności DNA i przebiegu reakcji PCR. W analizie uwzględniono jedynie próbki, w których uzyskano amplifikację GAPDH. W ten sposób, metodą PCR, u dwóch z trzech chomików zakażonych drogątrawienną amastigotami aksenicznymi stwierdzono zakażenie w tkankach i narządach; u zwierzęcia dwa (A2) w śledzionie i u zwierzęcia trzy (A3) w wątrobie, w 50 dpi (Rysunek 5A). Jeden chomik został zakażony drogątrawienną promastigotami aksenicznymi; u zwierzęcia trzy (A3) (Rysunek 5B) stwierdzono amplifikację w węźle chłonnym. U chomików inokulowanych wewnątrzdziąsłowo promastigotami lub amastigotami aksenicznymi w 50 dpi nie stwierdzono wyraźnej amplifikacji – pojawił się jedynie prążek w wątrobie zwierzęcia jeden (A1) zakażonego promastigotami (Rysunek 5C). Warto zauważyć, że mieliśmy trzy zwierzęta utrzymywane przez 8 miesięcy, u których inokulum podane drogą wewnątrzdziąsłową z amastigotami lekko wyciekło podczas wstrzykiwania. U dwóch z trzech zwierząt stwierdzono wyraźne zakażenie wątroby, u zwierzęcia jeden i dwa (Rysunek 5D).
<img alt="Wykres elektroforezy żelowej i bioluminescencji; prążki DNA i ekspresja lucyferazy L. infantum." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ocena klonu Leishmania infantum-Luc za pomocą PCR i emisji bioluminescencji. (A) Elektroforeza produktów PCR w żelu agarozowym w celu oceny integracji plazmidu w genomie: ścieżka 1 – drabinka DNA 1 kb; PCR genomowego DNA L. infantum-Luc, ścieżka 2 – 5'ssu - utr1 (1,1 kb) oraz ścieżka 3 – hyg- 3'ssu (1,8 kb); PCR genomowego DNA L. infantum-wt, ścieżki 4 i 5.(B) Emisja bioluminescencji (RLU) promastigotów klonu L. infantum-Luc (106) w czytniku mikropłytek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura stomatologiczna u gryzonia przedstawiająca cztery etapy; aplikacja strzykawki do czyszczenia i badania zębów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Dożylne wstrzyknięcie Leishmania infantum-Luc do żyły dziąsłowej. (A) Chomika ułożono w pozycji na plecach i odciągnięto dolną wargę. (B) Cieńszą igłę (8 x 0,30 mm) połączoną ze strzykawką 1 mL umieszczono pod dolnymi siekaczami wzdłuż linii środkowej między parą zębów pod kątem 25º i wprowadzono na 2-4 mm do żyły wargowej żuchwy. (C) Inokulacja 50 µL (108) amastygotów lub promastygotów w PBS. (D) Hemostaza przy użyciu patyczka bawełnianego i wywieraniu lekkiego nacisku w miejscu inokulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Postęp infekcji Leishmania u myszy, obrazowanie fluorescencyjne, metody dostępu dootrzewnowego i wewnątrzdziąsłowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Monitorowanie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Reprezentatywne obrazy jednego zwierzęcia z grupy: zakażone drogą dootrzewnową (panele górne) lub wewnątrzdziąsłową (panele dolne) amastygotami lub promastygotami L. infantum-Luc, w dniach 1, 8 i 22 dpi. Czerwone ROI reprezentujące badane obszary brzucha i głowy, odpowiednio dla infekcji dootrzewnowej lub wewnątrzdziąsłowej. Dane pokazują, że w 1 dpi wszystkie zwierzęta wykazywały sygnał bioluminescencyjny w obrębie brzucha lub żuchwy. Sygnał spadał po 8 dpi i był niemal niewykrywalny w żadnej grupie w 22 dpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres promieniowania infekcji promastigotami i amastigotami; analiza danych z dni po infekcji (dpi)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza porównawcza promieniowania z obrazów bioluminescencyjnych. Ilościowe oznaczenie promieniowania w jednostkach fotonów.sec-1.cm-2.sr-1 przeprowadzono w obrębie brzucha lub głowy chomików przy użyciu narzędzi do ręcznego pomiaru ROI. Średnie ROI tła odjęto od mierzonego ROI, aby usunąć wszelkie sygnały zakłócające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy, prążki DNA przy 564 bp i 125 bp, analiza żelu dla porównania ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Amplifikacja PCR kDNA. (A>) IP-AMA, chomiki zakażone drogą dosytniewiczową amastigotami, 50 dni po zakażeniu (dpi) (n = 3); (B>) IP-PRO, zakażone drogą dosytniewiczową promastigotami, 50 dpi (n = 3); (C>) IG-AMA, zakażone drogą dziąsłową amastigotami (n = 2), IG-PRO, zakażone drogą dziąsłową promastigotami (n = 2); (D>) IG-AMA, zakażone drogą dziąsłową amastigotami, 8 miesięcy po zakażeniu (n = 3). NI, chomiki niezakazżone jako kontrola negatywna (n = 2); C- genomowe DNA L. infantum-Luc, kontrola pozytywna PCR. Tkanki i organy: 1- śledziona, 2- wątroba, 3- węzły chłonne. mw- marker masy cząsteczkowej, strzałki wskazują prążki o niższej masie cząsteczkowej. A1- zwierzę pierwsze, A2- zwierzę drugie i A3- zwierzę trzecie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">dpi (liczba punktów na cal)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Immunoprecypitacja amastigotów</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">IP promastigotów</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Amastigoty IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Promastigoty IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">Średnia</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Średnia</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Średnia</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Średnia</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">0</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,6 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,7 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">1</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,3 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,1 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,1 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,7 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">8</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,7 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,8 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,4 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,2 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">22</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,3 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">9,9 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,6 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,0 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,5 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Surowe dane z porównawczej analizy promieniowania obrazów bioluminescencyjnych. Średnia kwantyfikacja promieniowania w jednostkach fotonów.sec-1.cm-2.sr-1 w podziale na grupę i drogę podania. Skróty: dpi = dni po infekcji; SD = odchylenie standardowe; N = liczebność próby.

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

American tegumentary leishmaniasis (ATL) and visceral leishmaniasis (VL) are considered neglected by the World Health Organization. VL can be lethal if ...

Naszym celem było ujednolicenie metodologii dożylnego wstrzykiwania Leishmania infantum do żyły dziąsłowej chomików, aby ocenić jej potencjał jako alternatywnej drogi zakażenia. Ponadto zbadaliśmy, czy aksendikony byłyby lepszą opcją w przypadku infekcji niż promastigoty, wykorzystując system obrazowania bioluminescencyjnego do obserwacji.System obrazowania in vivo stanowi udoskonalenie oceny zakażenia. Miejsca bioluminescencyjne mogą być obserwowane w czasie rzeczywistym u tego samego zwierzęcia, podczas gdy innymi najczęściej stosowanymi ocenami byłyby obciążenie pasożytami we krwi i tkankach, analiza histopatologiczna i PCR, co może wymagać eutanazji.Żyła dziąsłowa jest mało inwazyjna. Umożliwia dostęp dożylny bez miejscowych urazów w porównaniu z innymi drogami infekcji dożylnej. Inną ważną kwestią jest to, że amastigoty akseniczne można uzyskać in vitro, w przeciwieństwie do amastigotów otrzymywanych z tkanek.W przypadku zakażenia Leishmania przez żyłę dziąsłową usankcjonowano mniejszy wskaźnik z powodu perforacji żyły, krwawienia i nieszczelności inokulusów. System obrazowania bioluminescencyjnego ujawnił, że infekcja zmniejsza się przez długi czas i można ją wykryć tylko za pomocą PCR, co jest cechą szczepu referencyjnego, którego infekcja postępuje powoli i wykazuje niskie obciążenie pasożytami.Ustandaryzowaliśmy kolejną drogę zakażenia L. infantum u chomików złotych. Wykonując zakażenia dożylne do żyły dziąsłowej, dążymy do osiągnięcia stabilnego i powtarzalnego wskaźnika infekcji dla badań przedklinicznych.[Przesłuchujący] Na początek unieruchomij znieczulonego chomika w pozycji leżącej na plecach, używając obu rąk. Delikatnie pociągnij kciukami dolną wargę w dół, aby odsłonić dziąsło i żyłę dziąsełową. Używając jednomililitrowej strzykawki połączonej z cieńszą igłą, umieść igłę poniżej dolnych siekaczy, wzdłuż linii środkowej między parą zębów, pod kątem 25 stopni. Wbij igłę od dwóch do czterech milimetrów do żyły wargowej żuchwy. Odessać krew do strzykawki, aby upewnić się, że igła znajduje się w żyle wargowej żuchwy. Upewnij się, że krew dociera do cylindra igły. Powoli wstrzyknąć 50 mikrolitrów inokulum zawierającego 100 milionów lucyferazy świetlików wyrażających Leishmania u fantomowych amastigotów lub promastigoty w PBS. Przed wyjęciem igły należy lekko docisnąć bawełnianym wacikiem. Jednocześnie wyjmij igłę z naczynia, utrzymując nacisk bawełnianym wacikiem, aby promować hemostazę. Powstrzymaj chomika zarażonego Leishmanią i fantomem w ręku. Wstrzyknąć 150 miligramów na kilogram delucyferanu dootrzewnowo do chomika. Pięć minut po znieczuleniu umieść zwierzę w pozycji brzusznej w celu obrazowania bioluminescencyjnego. pod kamerą CCD. Uzyskaj obrazy chomika dwie godziny i 24 godziny po zakażeniu, a także osiem i 22 dni po zakażeniu. Na podstawie poziomów emisji bioluminescencji ustaw czas ekspozycji w zakresie od 30 sekund do pięciu minut. Wybierz opcję Binning jako średni lub duży, ustaw wartość F/Stop na 1 i wybierz pole widzenia na D. Użyj ręcznego narzędzia pomiarowego, aby zidentyfikować obszary zainteresowania lub ROI w głowie i ciele zwierzęcia. Określ ilościowo bioluminescencję w wybranym ROI z kamery CCD. Aby zmierzyć sygnał tła, oblicz średni zwrot z inwestycji i odejmij go od emisji bioluminescencyjnej uzyskanej z ręcznego zwrotu z inwestycji. Wyraź emisję bioluminescencji w promieniowaniu jako fotony na sekundę na centymetr kwadratowy na steradian. W okolicy szczęki chomików zakażonych dodziąsłowy Leishmania i fantom, zwierzęta zakażone amastigotami wykazywały wyższą bioluminescencję niż zwierzęta zakażone promastygotem dwie godziny i jeden dzień po zakażeniu. W ciągu ośmiu dni po zakażeniu zaobserwowano 36% spadek bioluminescencji u zwierząt zakażonych promastygotem i 90% u zwierząt zakażonych amastigotą w okolicy szczęki. Po 22 dniach od zakażenia zarówno zwierzęta zakażone promastygotą, jak i amastigotą wykazywały podobnie niski poziom bioluminescencji w okolicy szczęki. Osiem miesięcy po zakażeniu amastigotami drogą dziąseł, pasożyty można było wykryć za pomocą PCR w wątrobie, a także wykazywać umiarkowaną piloerekcję, ucisk oczodołu i wygiętą w łuk postawę.

in-vivo-imaging-leishmania-infantum-infected-hamsters-gingival

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Optymalizacja eksperymentalnego modelu chomika w leiszmaniozie skórnej poprzez wstrzyknięcie promastigot Leishmania do skóry grzbietu. Podejście to jest przydatne podczas inokulacji, obserwacji, charakteryzacji zmian, stosowania leczenia oraz pobierania próbek klinicznych. Zachowane zostają zdolność poruszania się, poszukiwanie pokarmu i wody, zabawa oraz aktywności społeczne.

Leiszmanioza skóry na grzbietowej skórze chomików: użyteczny model do przesiewowych badań leków przeciwleiszmanialnych

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

Tutaj prezentujemy skompilowany protokół do oceny infekcji skórnej myszy Leishmania amazonensis. Jest to wiarygodna metoda badania zjadliwości pasożytów, pozwalająca na systemowy wgląd w reakcję kręgowców gospodarza na infekcję.

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego zakażenia Leishmania infantum u chomików złocistych przez iniekcję dziąseł. Technika ta umożliwia śledzenie infekcji w czasie rzeczywistym i stanowi alternatywę dla promastigotów.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów