Name: Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę testu ligandów zbliżeniowych do badania interakcji białek w miejscach uszkodzenia DNA w liniach komórkowych U2OS. Ta technika umożliwia wizualizację interakcji białkowych in vivo z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, poprzez Grant Temático 2022/15126-9 dla JK i fellowship 21/09439-1 dla LARM) oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) za sfinansowanie tych badań.

1. Poszycie komórek
UWAGA: Komórki mogą być umieszczane w mikroskopijnych szkiełkach fluorescencyjnych, komorach lub płytkach. Stosowanie małych szkiełek nakrywkowych lub płytek 96/384-dołkowych jest zalecane do testowania w wielu warunkach i zapasowych odczynników. Stosowanie szkiełek nakrywkowych jest wskazane w przypadku linii komórkowych, które łatwo się odłączają, takich jak komórki HEK293. Szkiełka nakrywkowe można wcześniej pokryć roztworem poli-L-lizyny, aby poprawić mocowanie.
<ol>
	<li>Komórki tabliczkowe z uwzględnieniem pojazdu, kontroli technicznej i kontroli biologicznej. Stosować powtórzenia techniczne w dwóch lub trzech dołkach na warunek. 
	UWAGA: Korzystanie z kontroli technicznej (zarówno wtórnej, jak i tylko jednej podstawowej) jest obowiązkowe. Jeśli to możliwe, należy również uwzględnić kontrolę biologiczną (np. nadekspresję lub knockdown jednego z docelowych białek lub stan, o którym wiadomo, że zmienia interakcję).
	<ol>
		<li>Hodowla komórek U2OS w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 4,5 g / l glukozy i 4 mM L-glutaminy na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotnej atmosferze zawierającej 90% powietrza. W zależności od liczby warunków, które mają być badane oraz w przypadku stosowania szkiełek podstawowych 384 lub szkiełek nakrywkowych na płytce 60 mm, należy zacząć odpowiednio od płytki 60 lub 100 mm.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną konfluencję 60%-70%, podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA 14. Policz komórki za pomocą komory Neubauera lub automatycznego counter14. Płytka 4 x 105 komórek w 60 mm płytka zawierająca wiele okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 13 mm lub 4 x 105 komórek na basenie na 384-dołkowej płytce (płytkach) 384-dołkowej i inkubować przez 12-24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Stężenie i czas leczenia zostały wybrane na podstawie wyników literatury, które wskazują na aktywację szlaków naprawy uszkodzeń DNA15,16.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy etopozydu o stężeniu 50 mM w DMSO. Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Rozcieńczyć roztwór etopozydu do użycia w kompletnej pożywce o końcowym stężeniu 25 μM. Użyć DMSO w 0,05% rozcieńczonym w kompletnej pożywce hodowlanej jako kontroli nośnika.</li>
	<li>Przygotować 20x sól fizjologiczną cytrynianu sodu (SSC; 3,0 M NaCl, 0,30 M cytrynian trisodowy pH 7,0). Roztwór ten można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Leczenie i utrwalanie komórek
UWAGA: Nie pozwól, aby komórki wyschły w żadnym momencie; staraj się jak najbardziej korzystać z poprzednich rozwiązań. Należy wcześniej określić odpowiednią metodę utrwalania komórek (lodowaty metanol lub 4% paraformaldehyd (PFA)) oraz rozcieńczenie przeciwciał przy użyciu konwencjonalnego doświadczenia immunofluorescencyjnego.
UWAGA: Metanol musi być odpowiednio zutylizowany.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną ze studzienek i dodać pożywkę zawierającą etopozyd lub DMSO odpowiednio w stężeniu 25 μM lub 0,05%. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotnej atmosferze zawierającej 90% powietrza z etopozydem lub DMSO przez 3 różne okresy czasu: 20 min, 1 godzinę i 3 godziny. W przypadku korzystania z płyt 384 wszystkie warunki muszą być ustalone jednocześnie.
	<ol>
		<li>W tym celu zacznij od leczenia schorzenia, w którym leczenie trwa najdłużej, np. 3 godziny. Po 2 godzinach potraktuj stan 1 godziny zabiegu, a gdy pozostało 20 minut na utrwalenie, potraktuj stan 20 minut. Następnie wszystkie warunki można ustalić w tym samym czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń pożywkę z dołków i umyj komórki PBS 3x.</li>
	<li>Napraw komórki, dodając lodowaty metanol o objętości wystarczającej do pokrycia powierzchni studzienki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze -20 °C. Przemyć studzienki PBS 3x. 
	UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.</li>
</ol>
4. Przepuszczalność i blokowanie
UWAGA: Jeśli używasz metody utrwalania PFA, przed przepuszczalnością musi zostać wykonany etap blokowania glicyną. Komorę wilgotnościową można przygotować, umieszczając miskę na wodę w inkubatorze, co daje wilgotność około 95%. Płytkę lub szkiełka 384 można inkubować w zamkniętym plastikowym pojemniku nad bibułą filtracyjną lub zwilżoną gąbką i przezroczystą folią.
<ol>
	<li>Odczep PBS od próbek.</li>
	<li>Dodać 30-40 μl buforu permeabilacyjnego (0,2% Triton X-100 w PBS) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Mycie 3x z PBS</li>
	<li>Stuknąć PBS z próbek i dodać 30-40 μl 1x roztworu blokującego dostarczonego w zestawie PLA (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X-100 0,1% w roztworze PBS) do każdej studzienki/szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Inkubować płytkę w komorze wilgotnościowej podgrzanej do temperatury 37 °C przez 1 godzinę.</li>
</ol>
5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych (PLA)
UWAGA: Jeśli używasz szkiełek nakrywkowych, ważne jest, aby upewnić się, że roztwór przeciwciała pokrywa wszystkie powierzchnie szkiełek nakrywkowych. Szczególną uwagę należy zwrócić na dobór przeciwciał. Przeciwciała muszą pochodzić od różnych gatunków zwierząt, a przeciwciało drugorzędowe stosowane do γ-H2AX nie może być skierowane przeciwko gatunkowi gospodarza produkcji sond PLA. Na przykład pierwotne przeciwciała stosowane do PLA hodowano u myszy i kóz. Sondy PLA, anty-mysie i anty-kozie zostały wyprodukowane w osle. Przeciwciało przeciwko γ-H2AX zostało wytworzone u królików, a wtórne wykorzystane przeciwciało to przeciwciało anty-królicze wytwarzane u osłów. W ten sposób wtórny nie rozpozna sond PLA.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (mysie anty-Ku70 1:100 i kozie anty-Nek4 1:50; królicze anty-Nek5 1:25 i mysie anty-TOPIIβ 1:25) w rozcieńczalniku przeciwciał dostarczonym w zestawie (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X-100 0,1% w roztworze PBS). Przygotować 30 μl roztworu przeciwciał na warunek w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych lub 20 μl na dołek w przypadku stosowania płytki 384-dołkowej.</li>
	<li>Stuknij rozwiązanie blokujące. Dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w komorze wilgotnościowej.</li>
</ol>
6. Inkubacja sondy PLA
UWAGA: Wybierz sondy, biorąc pod uwagę nie tylko podstawowe przeciwciała, ale także te przeznaczone do użycia w etapach immunofluorescencji. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych do długiej inkubacji w temperaturze 37 °C, można zastosować powolną rotację w celu poprawy dystrybucji roztworu przeciwciała.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć sondy minus i plus w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku przeciwciał. Przygotować 10 μl na studzienkę w przypadku stosowania płytek 384-dołkowych lub 20 μl na próbkę w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych. Wykorzystaj następujące kombinacje: Osioł anty-mysz minus z osiołkiem anty-kozioł plus; Osioł anty-mysz minus z osioł anty-królik plus.</li>
	<li>Stuknąć roztwór przeciwciała pierwotnego. Przemyć 1x TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20). Prać 3x po 5 min z TBS-T w temperaturze pokojowej. Wykonaj dodatkowe pranie za pomocą TBS-T.</li>
	<li>Odkręć i dodaj roztwór sondy PLA o objętości 10 μl na płytki i 20 μl na szkiełka nakrywkowe. Inkubować w podgrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
</ol>
7. Podwiązanie
UWAGA: Poczekaj z dodaniem Ligase do momentu bezpośrednio przed dodaniem jej do próbek. Ligaza musi być przechowywana w zamrażarce (-20 °C). Całkowicie usuń cały roztwór myjący przed dodaniem roztworu ligazy. Unikaj pozostawiania komórek bez roztworu przez dłuższy czas. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych do inkubacji w temperaturze 37 °C, można zastosować powolną rotację w celu poprawy dystrybucji roztworu przeciwciała.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 5-krotny bufor do podwiązywania w wodzie o wysokiej czystości. Przygotować 10 μl na basenik w przypadku stosowania płytek 384-dołkowych lub 20 μl w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Odczep roztwór sondy PLA. Umyć 1x za pomocą TBS-T. Następnie wykonaj trzy dodatkowe prania, z których każde trwa 5 minut, przy użyciu TBS-T. Umyj po raz ostatni i stuknij TBS-T przed następnym krokiem.</li>
	<li>Dodaj ligazę do roztworu 1x ligacji w stosunku 1:40, bezpośrednio przed nałożeniem go na próbki. Inkubować w komorze wilgotnościowej podgrzanej do 37 °C przez 30 minut do 1 godziny.</li>
</ol>
8. Amplifikacja i mycie
UWAGA: Poczekaj z dodaniem polimerazy do momentu bezpośrednio przed dodaniem do próbki. Bufor wzmacniający jest wrażliwy na światło; Chronić wszystkie roztwory zawierające bufor przed światłem. Polimeraza musi być przechowywana w zamrażarce (-20 °C). Unikaj pozostawiania komórek bez roztworu przez dłuższy czas. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych do inkubacji w temperaturze 37 °C, powolna rotacja może poprawić dystrybucję roztworu przeciwciała.
<ol>
	<li>Całkowicie usuń cały roztwór myjący przed dodaniem roztworu polimerazy. Unikaj pozostawiania komórek bez roztworu przez dłuższy czas. Rozcieńczyć 5-krotny bufor wzmacniający w wodzie o wysokiej czystości. Przygotować 10 μl na basenik w przypadku stosowania płytek 384-dołkowych lub 20 μl w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Stuknąć roztwór do podwiązywania. Umyć 1x za pomocą TBS-T. Następnie wykonaj trzy dodatkowe prania, z których każde trwa 5 minut, przy użyciu TBS-T. Umyj po raz ostatni i stuknij TBS-T przed następnym krokiem.</li>
	<li>Dodaj polimerazę do roztworu do amplifikacji 1x w rozcieńczeniu 1:80, bezpośrednio przed nałożeniem jej na próbki. Inkubować w podgrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 100 min. 
	UWAGA: Od tego kroku unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło</li>
	<li>Wyłącz bufor amplifikacji. Myć 2x z 1x buforem SSC przez 10 min każdy. Myć 2x buforem SSC 0,01x przez 2 min każdy.</li>
</ol>
9. Barwienie γ-H2AX (immunofluorescencja - IF)
UWAGA: Etykietowanie γ-H2AX odbywa się po zakończeniu PLA.
<ol>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych (IF)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (króliczy anty yH2AX w stosunku 1:100) w roztworze blokującym (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X-100 0,1% w roztworze PBS). Przygotować 30 μl roztworu przeciwciała na basenik w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych lub 20 μl w przypadku stosowania płytki 384-dołkowej.</li>
		<li>Skorzystaj z rozwiązania SSC 0,01x. Umyj 2x PBS.</li>
		<li>Dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugorzędowa inkubacja przeciwciał (IF) 
	UWAGA: Upewnij się, że wybrane przeciwciała drugorzędowe nie rozpoznają przeciwciał lub sond PLA. Dodatkowo długość fali przeciwciała drugorzędowego musi być inna niż długość fali odczynnika wykrywającego PLA. Na przykład: nasz odczynnik do wykrywania PLA zawiera fluorofor 647, a wtórny, którego użyliśmy do wykrywania γ-H2AX, to 488.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) w roztworze blokującym (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X - 100 0,1% w roztworze PBS) w rozcieńczeniu 1:300. Przygotować 30 μl roztworu przeciwciał na warunek w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych lub 20 μl na dołek w przypadku stosowania płytki 384-dołkowej. Dodać barwnik Hoechst 33342 o stężeniu końcowym 0,6 μg/ml.</li>
		<li>Stuknąć roztwór przeciwciała pierwotnego. Umyj 3x za pomocą TBS-T.</li>
		<li>Dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Umyj 5x z TBS-T. Mycie 2x z 1x buforem SSC. Mycie 2x z buforem SSC 0,01x. 
		UWAGA: W tym momencie płytki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C (w SSC 0,01X) w sposób chroniony przed światłem. W przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych można zamontować szkiełka, a po 1 dniu można je przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Użyj konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego i obiektywu 63x. Określ czas ekspozycji, porównując kontrole ujemne i pozytywne, aby uniknąć nasycenia i zapadania się kropek. 
	UWAGA: Zastosowanie mikroskopów konfokalnych poprawia wykrywanie kropek PLA. Obiektyw 20x może być również używany do zwiększania liczby wykrywanych jąder.</li>
	<li>Po dostosowaniu czasu ekspozycji należy wykonać wszystkie akwizycje kropek PLA o tych samych parametrach. Staraj się pozyskiwać obrazy z różnych dołków lub regionów szkiełek nakrywkowych, aby uniknąć artefaktów spowodowanych niejednorodną inkubacją.</li>
	<li>Zapisz wszystkie kanały o tym samym wzorcu nazwy. Jeśli mikroskop wykonuje zdjęcia w kanałach oddzielnie, zapisz odpowiadające im obrazy o tej samej nazwie, dodając tylko PLA lub Nucleus na początku nazwy pliku, aby rozróżnić kanał.</li>
</ol>
11. Analiza obrazu
UWAGA: Makro zostało stworzone do analizy punktów na jądro w obrazie J/FIJI17 i do użytku z mikroskopami, w których informacje o skali muszą być dodawane ręcznie. Rozmiar piksela zastosowanej soczewki obiektywu musi być znany. Umieść obrazy dla każdego kanału w różnych folderach (Dodatkowy plik kodowania 1, Rysunek uzupełniający 1). 
UWAGA: Makro uwzględnia kanały fluorescencji uzyskane oddzielnie. W takim przypadku ważne jest, aby zapisać wszystkie obrazy o tej samej nazwie.
<ol>
	<li>Makro pozwala na wybór konkretnego regionu w terenie. Użyj opcji Wybierz ROI, gdy region na obrazie pokazuje artefakty, które mogą być szkodliwe dla analizy. Wybierz ROI na początku analizy i użyj go dla wszystkich obrazów. 
	UWAGA: Jest to funkcja opcjonalna. Jeśli ta opcja nie zostanie wybrana, w analizie zostanie uwzględniony cały obraz (rysunek uzupełniający 2).</li>
	<li>Plik ROI powinien zostać utworzony przed użyciem makra, jak opisano poniżej. Aby wybrać ROI, użyj narzędzia prostokąta, wybierz region do analizy i dodaj go do menedżera ROI, klikając Edytuj > Zaznaczenie> Dodaj do menedżera. Zapisz zwrot z inwestycji, klikając przycisk Więcej> Zapisz.</li>
	<li>W ImageJ 17 otwórz obrazy z różnych warunków, aby dostosować parametry do analizy. Parametry te muszą być określone przez użytkownika i określone, wraz z danymi, w programie makra (Uzupełniający plik kodowania 1)
	<ol>
		<li>Korekcja tła: Aby usunąć tło, kliknij przycisk Proces> Odejmij tło. Przetestuj różne promienie toczącej się kulki za pomocą funkcji podglądu). Użyliśmy walcowania 10 dla kropek PLA i walcowania 100 dla jądra.</li>
		<li>Usuń szum, klikając Przetwarzaj > Szum > Usuń plamki. W przypadku jądra użyj funkcji smooth, aby poprawić wypełnienie jądra, klikając przycisk Process>Smooth.</li>
		<li>Regulacja progu: Przekonwertuj na obraz 8-bitowy i dostosuj próg, klikając Obraz > Wpisz > 8 bitów i Obraz > Dostosuj >Próg. Dostosuj odpowiednio próg, aby zobrazować wszystkie jądra lub kropki obecne na obrazie, unikając nadmiernego nasycenia i zapadania się struktur. Zanotuj wartości i przetestuj na różnych obrazach, aby sprawdzić, czy próg działa dla różnych obrazów.</li>
		<li>Konwertuj na maskę, klikając Przetwarzaj > Binarny > Konwertuj na maskę. W przypadku jądra kliknij Process > Binary > Fill holes, a następnie Process > Binary > Watershed. W przypadku kropek PLA kliknij pozycję Process > Binary > Watershed.</li>
		<li>Aby policzyć jądra, zmierz powierzchnię lub długość różnych jąder, aby oszacować średni rozmiar. Użyj przybliżonej wartości do analizy cząstek. Kliknij Analizuj > Analizuj cząstki, a następnie wybierz Ustaw rozmiar: 15-nieskończoność (wartości te zależą od wielkości jąder). Sprawdź następujące opcje: Pokaż: Maska; Wyświetlanie wyników; Przejrzyste wyniki; Podsumować; Dodaj do menedżera; Wyklucz na krawędziach.</li>
		<li>Aby policzyć kropki PLA, zmierz obszar lub promień kropek, aby oszacować średni rozmiar. Wybierz Zastosuj maskę jądra (zastosuj maskę to funkcja we wtyczce GDSC, sprawdź, czy jest zainstalowana), a następnie Analizuj > Analizuj cząstki i ustaw. 0,02-3 (wartości te zależą od wielkości jąder). Sprawdź następujące opcje: Pokaż: Maska; Wyświetlanie wyników; Przejrzyste wyniki; Podsumować; Dodaj do menedżera; Wyklucz na krawędziach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyniki pokazują liczbę kropek na jądro w każdym jądrze obecnym na obrazie. Zapisz te dane.</li>
</ol>
12. Wizualizacja scalonych obrazów
<ol>
	<li>Otwórz kanały odpowiadające PLA, jądrze i γ-H2AX. Odejmij tło i usuń szum, jak wspomniano w krokach 11.4.1 i 11.4.2 dla wszystkich obrazów.</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast automatycznie lub ręcznie, używając tej samej wartości dla wszystkich warunków z tego samego kanału. Wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/kontrast.</li>
	<li>Łączenie obrazów (scalanie), wybierając opcje Obraz > Kolor > Scal kanały. Dodaj podziałkę liniową, wybierając pozycję Analizuj > Narzędzia > Pasek skali. Zapisz jako. Plik TIFF.</li>
</ol>

Assessing Protein Interaction and Localization in DNA Damage

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dane pokazują, że stosowanie PLA w połączeniu z markerem uszkodzonym przez DNA może dostarczyć najwięcej informacji w profilowaniu odpowiedzi na uszkodzenie DNA, pokazując przestrzenne i czasowe zachowanie interakcji po zniewadze. PLA jest wszechstronną metodą, która została wykorzystana do identyfikacji dimeryzacji, oznaczania kontaktu organelli, interakcji białko-kwas nukleinowy, a głównie interakcji białko-białko 10,11,19,20. Krytycznymi etapami wykonywania PLA są określenie i walidacja przeciwciał pierwotnych, gęstości wysiewu komórek, płukania i inkubacji w temperaturze. Uważamy, że stosowanie tego narzędzia w połączeniu z konwencjonalną immunofluorescencją pozwala na określenie regionu, czasu i rozkładu interakcji.
Konieczne jest stosowanie odpowiednich środków kontroli technicznej i zdecydowanie zaleca się stosowanie kontroli biologicznej. Co więcej, wykonanie analizy z tymi samymi parametrami dla wszystkich warunków pozwala na porównanie między próbkami.
Chociaż PLA jest prostym testem, który nie wymaga specjalnego sprzętu, komercyjne odczynniki są nadal trochę drogie iz tego powodu technika ta jest wskazana do testów potwierdzających lub gdy w literaturze znajdują się istotne informacje dotyczące interakcji i roli w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Kolejną pułapką tej techniki jest niekompatybilność odczynników, która występuje również w konwencjonalnej analizie mikroskopii fluorescencyjnej. Jeśli interakcja jest rzadka lub bardzo przejściowa, PLA jest dobrym wyborem ze względu na wysoką czułość. Jednak gdy liczba interakcji jest niewielka, zaobserwowanie zmian w różnych warunkach może być trudne, co wymaga zwiększenia liczby powtórzeń. Ponadto, jeśli wiele cząsteczek uczestniczy w oddziaływaniu w tym samym miejscu, wykrywanie sygnałów PLA może być ograniczone przez rozdzielczość soczewki obiektywu, a liczba oddziaływań może być niedoszacowana. Cząstki, które znajdują się bliżej niż granica rozdzielczości soczewki obiektywu, będą się łączyć, nie pozwalając na rozróżnienie poszczególnych oddziaływań białko-białko. Jeżeli kropki są gęste i mogą składać się z wielu plamek, zaleca się stosowanie uśrednionej intensywności na obszar do oznaczania ilościowego21.
Test ligandów zbliżeniowych należy podchodzić z ostrożnością, ponieważ pozytywny sygnał może być generowany z oddziaływań pośrednich. Główne ograniczenia PLA są związane z kosztem odczynników, z wymogiem specyficznych przeciwciał, które muszą być wcześniej przetestowane za pomocą immunofluorescencji, oraz ze stosowaniem kontroli technicznych i biologicznych. W przypadku jednoczesnego wykonywania testu z markerem lokalizacji specyficznej dla komórki, przeciwciało musi pochodzić z innego gatunku niż wszystkie inne przeciwciała stosowane w teście PLA. Co więcej, kolokalizację kropek ze markerem można określić tylko za pomocą mikroskopów konfokalnych.
Zalety są związane z mniejszą liczbą potrzebnych komórek w porównaniu z badaniami immunoprecypitacji, większą czułością, ponieważ sygnał z kilku cząsteczek jest wzmacniany, generując silny sygnał, oraz jednoczesną informacją dotyczącą interakcji i jej lokalizacji komórkowej. Przedstawiliśmy tutaj prosty protokół lokalizacji interakcji białek w kontekście uszkodzenia DNA oraz przyjazne dla użytkownika makro do wykorzystania w analizie danych. Protokół ten umożliwia przestrzenną i czasową lokalizację interakcji po różnych bodźcach genotoksycznych stresu.

Uszkodzenia DNA komórkowego występują codziennie z powodu spontanicznych reakcji chemicznych i są również zwiększane przez czynniki egzogenne, takie jak czynniki genotoksyczne (promieniowanie i chemikalia, takie jak etopozyd) oraz stres oksydacyjny1,2,3. Komórki mają złożoną maszynerię, która koryguje niezliczone różne rodzaje uszkodzeń DNA, od usuwania zasad, przez replikacyjne skręcanie widełek lub przerwanie, aż po najbardziej szkodliwą zmianę: złamanie dwuniciowej DNA4,5.
Kilka białek biorących udział w DDR zostało już scharakteryzowanych, a doskonałe wersje badają szlaki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) i rekombinacji homologicznej (HR), głównych ścieżek implikowanych w naprawie pęknięć dwuniciowych (DSB)5,6. Fosforylacja wariantu histonu H2A, H2AX, w serynie 139 (później nazwanej y-H2AX) jest stosowana od wielu lat jako czuły i wiarygodny marker pęknięcia dwuniciowego. Fosforylacja H2AX jest obserwowana w pierwszych minutach po uszkodzeniu i może utrzymywać się przez wiele godzin7.
Zaletą korzystania z detekcji immunofluorescencyjnej ognisk γ-H2AX jest charakterystyka czasowego i przestrzennego rozkładu ognisk, a także jego współbarwienia z innymi białkami. Co więcej, immunofluorescencja nie wymaga lizy, co zachowuje informacje o kontekście komórkowym i sprawia, że są one bardziej informacyjne. Poza tym, ponieważ γ-H2AX powstaje de novo, nie występuje obficie przy braku uszkodzenia DNA, co czyni go specyficznym markerem7.
H2AX jest głównie fosforylowany przez kinazę białkową zmutowaną ataksję-teleangiektazję (ATM) i kinazę białkową zależną od DNA (DNA-PK), czujniki DSB. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6 / XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) i podjednostka katalityczna kinazy białkowej DNA (DNA-PKcs) są odpowiedzialne za identyfikację DSB i ochronę końców DNA, podczas gdy Artemis przeprowadza przetwarzanie końcowe w celu ułatwienia ligacji przez kompleks XRCC4-Ligaza IV. Fosforylacja H2AX w miejscach po bokach DSB działa jak sygnał do rekrutacji kilku białek naprawczych i sygnalizacji zatrzymania cyklu komórkowego, śmierci lub przeżycia8.
Analiza zmian w ogniskach y-H2AX jest najczęstszym testem do badania, czy interesujące białko jest zaangażowane w odpowiedź na uszkodzenie DNA. Niezależnie od tego, czy spodziewana jest bezpośrednia rola w miejscu uszkodzenia DNA, mikroskopia fluorescencyjna służy do weryfikacji kolokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z ogniskami y-H2AX. Jednak z wyjątkiem nowych metod fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, stwierdzenie lokalnej interakcji z miejscami uszkodzenia DNA może być trudne. Co więcej, detekcja immunofluorescencji zwykle zależy od wielu cząsteczek białka w miejscu uszkodzenia DNA, co utrudnia identyfikację rzadkich białek9.
Tutaj pokazujemy test do oceny lokalizacji białek zaangażowanych w szlak DDR, używając y-H2AX jako markera miejsca uszkodzenia. Ten test może być wykorzystany do scharakteryzowania lokalizacji czasowej pod różnymi zniewagami, które powodują uszkodzenie DNA.
Test ligandów zbliżeniowych (PLA) pojawił się jako narzędzie do szacowania interakcji między białkami, jak również przestrzennej bliskości między organellami lub strukturami komórkowymi10,11i umożliwia na przykład analizę lokalizacji czasowej i kolokalizacji w warunkach stresu. Metoda jest prosta, ponieważ przypomina konwencjonalną immunofluorescencję i umożliwia jednoczesne barwienie organelli lub markerów specyficznych dla struktury komórkowej, takich jak mitochondria, retikulum endoplazmatyczne, ciała PML lub marker dwuniciowy DNA, yH2AX. Zastosowanie PLA pozwala na identyfikację interakcji białek podczas uszkodzenia DNA w czuły, specyficzny i niezawodny sposób, który może być wykorzystany do monitorowania interakcji podczas cyklu komórkowego, w odpowiedzi na różne bodźce i w różnym czasie po stresie genotoksycznym.
Pokazujemy tutaj użycie PLA równocześnie z konwencjonalną immunofluorescencją γ-H2AX do lokalizacji interakcji Nek4-Ku70 po uszkodzeniu DNA wywołanym przez etopozyd. Nek4, członek rodziny Nek (kinazy związane z NIMA), nie odgrywa jasnej roli w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W 2012 roku Nguyen i współpracownicy wykazali, że Nek4 oddziałuje z białkami Ku70/Ku80, a pod nieobecność Nek4 białka te nie są rekrutowane do miejsca uszkodzenia DNA, a fosforylacja H2AX jest upośledzona12. Komórkowa lokalizacja tej interakcji jest do tej pory nieznana. Zaobserwowaliśmy zmniejszenie fosforylacji Ku70 w komórkach eksprymujących mutanta kinazy Nek4 martwego 13, ale to, czy Nek4 fosforyluje bezpośrednio Ku70, pozostaje do wyjaśnienia. Biorąc pod uwagę, że interakcja Nek4 z Ku70 jest zwiększona po leczeniu etopozydem zgodnie z badaniami immunoprecypitacyjnymi12, próbujemy zlokalizować tę interakcję za pomocą PLA i markera γ-H2AX.
Zazwyczaj, badania interakcji opierają się na testach immunoprecypitacji, ale są one in vitro i nie dostarczają informacji o lokalizacji interakcji. Jeśli to możliwe, można przeprowadzić immunoprecypitację frakcjonowanych komórek (jądra, mitochondriów, błony komórkowej lub cytozolu), ale przeprowadzenie przebiegu interakcji w czasie jest kosztowne i pracochłonne. Immunofluorescencja może dostarczyć informacji o lokalizacji komórkowej białek, ale udowodnienie interakcji może być trudne i zależy od rozdzielczości mikroskopów. Tutaj pokazujemy zalety stosowania testu ligandów zbliżeniowych do monitorowania interakcji dwóch białek w kontekście uszkodzenia DNA.

<table><tbody><tr><td>Czarne płytki 384-dołkowe</td><td>Perkin Elmer Płytki</td><td></td><td></td>nośne komórek</tr><tr><td>Osioł&nbsp; anty- Królik Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Donkey anty Mouse Minus</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink roztwór blokujący 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Duolink Detection Far red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti goat plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti rabbit plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-5517</td><td>koza anty Nek4 została użyta w rozcieńczeniu 1:50</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0,6 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DMI</td> Mysz <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>mysz anty Ku70 została użyta w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>Mysz anty TOPII&beta;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Królik anty Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Królik anty Y H2AX</td><td>Cell Signalling</td><td>9718S</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Linia komórkowa U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia dna

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Odpowiedź na uszkodzenie DNA to zabezpieczenie informacji genetycznej, które chroni komórki przed utrwalaniem uszkodzonego DNA. Charakterystyka białek, które współpracują w tym procesie, pozwala na identyfikację alternatywnych celów interwencji terapeutycznej w wielu chorobach, takich jak nowotwory, choroby związane ze starzeniem się i przewlekłe stany zapalne. Test ligandów zbliżeniowych (PLA) pojawił się jako narzędzie do szacowania interakcji między białkami, a także bliskości przestrzennej między organellami lub strukturami komórkowymi i umożliwia na przykład analizę lokalizacji czasowej i kolokalizacji w warunkach stresowych. Metoda jest prosta, ponieważ jest podobna do konwencjonalnej immunofluorescencji i umożliwia jednoczesne barwienie organelli, struktury komórkowej lub określonego markera, takiego jak mitochondria, retikulum endoplazmatyczne, ciała PML lub marker dwuniciowy DNA, yH2AX. Fosforylacja S139 w wariancie histonu 2A, H2AX, określanym wówczas jako yH2AX, jest szeroko stosowana jako bardzo czuły i specyficzny marker pęknięć dwuniciowych DNA. Każde ognisko barwienia yH2AX odpowiada jednemu pęknięciu w DNA, które następuje kilka minut po uszkodzeniu. Analiza zmian w ogniskach yH2AX jest najczęstszym testem do badania, czy białko będące przedmiotem zainteresowania jest zaangażowane w odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR). Niezależnie od tego, czy spodziewana jest bezpośrednia rola w miejscu uszkodzenia DNA, mikroskopia fluorescencyjna służy do weryfikacji kolokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z ogniskami yH2AX. Jednakże, z wyjątkiem nowych metod fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, podsumowując, lokalna interakcja z miejscami uszkodzenia DNA może być nieco subiektywna. Tutaj pokazujemy test do oceny lokalizacji białek w szlaku DDR przy użyciu yH2AX jako markera miejsca uszkodzenia. Ten test może być wykorzystany do scharakteryzowania lokalizacji czasowej pod różnymi zniewagami, które powodują uszkodzenie DNA.

Zaobserwowano oddziaływanie Nek4-Ku70 w przypadku braku traktowania etoposydem. Oddziaływanie to może jednak zachodzić poza jądrem komórkowym (Rysunek 1A). Interakcja Nek4-Ku70 nasila się po uszkodzeniu DNA i koncentruje się w jądrze (Rysunek 1A). W przypadku oddziaływania Nek5-topoizomerazy II β (TOPIIβ), wykorzystanej w tym teście jako kontrola pozytywna w oparciu o wyniki literaturowe18, interakcja ta jest znacznie nasilona po traktowaniu etoposydem (Rysunek 1B).
Leczenie etoposydem powoduje wzrost o niemal 40% (średnio 9 kropek/jądro w komórkach traktowanych nośnikiem w porównaniu do 12–14 kropek/jądro w komórkach traktowanych etoposydem). Interakcja Nek4 i Ku70 nie występuje wyłącznie w warunkach uszkodzenia DNA. Rzeczywiście, Nguyen i wsp.12 wykazali, że białka te mogą wchodzić w interakcję w przypadku braku uszkodzeń komórkowych i nie są od nich zależne, co oznacza, że interakcja ta nie zawsze ma miejsce w miejscach uszkodzeń DNA.
Barwienie γ-H2AX nie występuje w warunkach kontrolnych, ale wzrasta po 20 min traktowania etoposydem i utrzymuje się do 3 h trwania zabiegu (Rysunek 1C). Niektóre kropki interakcji znajdują się blisko barwienia γ-H2AX (Rysunek 1C). Po 1 h traktowania większość kropek interakcji Nek4-Ku70 koncentruje się w ogniskach uszkodzeń DNA (Rysunek 1C).
Wyciszenie ekspresji Nek4 wynosi około 70% (dane nie przedstawiono), co oznacza, że sygnał nie zostanie całkowicie wyeliminowany. Uważamy, że różnica w liczbie punktów/jąder nie jest równoważna z całkowitym ubytkiem białka, ponieważ pozostałe białko zostanie przeznaczone do odpowiedzi na uszkodzenia DNA, a następnie wejdzie w interakcję z Ku70. Średnia liczba punktów/jądro w komórkach z wyciszonym Nek4, traktowanych przez 3 h etoposydem, wynosi 10, co oznacza redukcję o około 30% w porównaniu do kontrolnych komórek PLKO w tych samych warunkach. Jeśli przyjmiemy, że etoposyd zwiększa interakcję Nek4-Ku o 40% w stosunku do komórek traktowanych nośnikiem, a wyciszenie Nek4 wynosi 70%, komórki z wyciszonym genem będą wykazywać około 10 punktów/jądro. Interakcja Nek4 i Ku70 nie ogranicza się wyłącznie do odpowiedzi na uszkodzenia DNA i choć wzrasta ona po uszkodzeniu DNA, główna zmiana następuje w lokalizacji tej interakcji.
Przedstawione tutaj wyniki prezentują istotne narzędzie do lokalizacji oddziaływań białek w kontekście odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Białka Nek4 i Ku70 były już wcześniej wiązane z DDR, a Nek4 wydaje się być ważne dla rekrutacji kompleksu Ku70/Ku80 do ognisk uszkodzeń DNA12. Niemniej jednak, przestrzenne i czasowe charakterystyki tego oddziaływania mogą być badane za pomocą metody PLA równocześnie z barwieniem γ-H2AX.
Inne techniki, takie jak ko-immunoprecypitacja i immunofluorescencja, mogą dostarczyć podobnych informacji, ale w oddzielnych analizach. Wykorzystanie markeru γ-H2AX jako punktu odniesienia umożliwia czasowe i przestrzenne monitorowanie interakcji.
<img alt="Ogniska uszkodzeń DNA Nek4-Ku70 i Nek5-TOPIIββ; obrazy mikroskopowe i wykresy słupkowe dawka/jądro." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Interakcja Nek4 - Ku70 w warunkach uszkodzenia DNA. (A) Komórki U2OS inkubowano z etoposydem (25 µM) przez 20 min, 1 h i 3 h. Jako nośnik zastosowano DMSO (0,05% przez 3 h). Po traktowaniu komórki utrwalono lodowatym metanolem, a następnie przeprowadzono analizę PLA, stosując przeciwciała kozie anty-Nek4 i mysie anty-Ku70 jako przeciwciała pierwszorzędowe. Jądra komórkowe barwiono Hoechst 33342 (kolor niebieski); kropki PLA przedstawiono w kolorze czerwonym. Komórkami kontrolnymi były komórki traktowane etoposydem przez 1 h i inkubowane tylko z jednym przeciwciałem pierwszorzędowym (kozie anty-Nek4) oraz obydwoma przeciwciałami drugorzędowymi. Kontrolą biologiczną były komórki z wyciszeniem Nek4 (shRNA Nek4) traktowane etoposydem przez 3 h. (B) Kontrola pozytywna testu oparta na wynikach z literatury: komórki U2OS inkubowano z 25 µM etoposydu przez 1 h, a analizę PLA przeprowadzono z użyciem przeciwciał mysich anty-Nek5 i króliczych anty-TOPIIβ. Wykres jest reprezentatywny dla jednego eksperymentu i przedstawia średnią wraz ze standardowym błędem średniej (SEM) ze wszystkich komórek objętych co najmniej 4 różnymi polami (co najmniej 35 komórek dla kontroli i 50 komórek dla wszystkich pozostałych warunków). Istotność uzyskano za pomocą testu t: * p&lt;0,05, ** p&lt;0,01 i *** p&lt;0,001 w porównaniu do nośnika DMSO. (C) Po analizie PLA komórki przedstawione w (A) przemyto PBS i inkubowano z przeciwciałem króliczym anty- γ-H2AX. Po 1 h inkubacji zastosowano przeciwciało drugorzędowe anty-królicze do detekcji ognisk uszkodzeń DNA (kolor zielony). Powiększono obszary zawierające współbarwienie PLA i γ-H2AX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Struktura folderów. Obrazy obrazowania jądra i PLA powinny zostać umieszczone w osobnych folderach, zgodnie z przedstawionym schematem. Nazwy plików powinny zaczynać się od określonego prefiksu (np. DAPI, PLA), a w każdym folderze powinien znajdować się odpowiadający im obraz (np. DAPI_control1.tif oraz PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Okno parametrów makra. Po otwarciu/uruchomieniu makra w programie ImageJ/FIJI użytkownik zostanie poproszony o wybór folderów z danymi i wprowadzenie parametrów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 1: Plik makra utworzony dla programu ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

Odpowiedź na uszkodzenie DNA to system komórkowy, który utrzymuje stabilność i integralność genomu. Dysfunkcje w tym procesie powodują wiele chorób, takich jak rak, choroby związane ze starzeniem się i przewlekłe stany zapalne. Naszym celem jest identyfikacja białek, które współpracują w tym procesie, co pozwala na identyfikację alternatywnych celów do integracji terapeutycznej.Aby scharakteryzować udział białka w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, zwykle stosuje się badania immunofluorescencyjne z ufosforylowaną formą markera histonowego uszkodzenia DNA H2AX. Co więcej, testy zbierania białek, takie jak koimmunoprecypitacja, mogą być wykonywane po uszkodzeniu DNA w celu określenia roli białka w sygnalizacji. Badania interakcji są zwykle oparte na testach immunoprecypitacji, ale są one in vitro i nie dostarczają informacji o lokalizacji interakcji.Immunofluorescencja może dostarczyć informacji o lokalizacji białek w komórkach, ale udowodnienie interakcji może być trudne i zależy od rozdzielczości mikroskopu. Pokazujemy tutaj, że prosty protokół łączący test ligandów zbliżeniowych z barwieniem Gamma-H2AX pozwala na przestrzenną i czasową charakterystykę interakcji białek w kontekście uszkodzenia DNA. Ponadto udostępniliśmy przyjazne dla użytkownika makro do analizy danych.Na początek weź hodowane komórki U2OS o konfluencji od 60% do 70% i podziel je za pomocą 0,25% Trypsyny-EDTA. Przygotuj 60-milimetrowe płytki, dodając okrągłe 13-milimetrowe szkiełka nakrywkowe. Płytka 400 000 komórek w 60-milimetrowej płycie zawierającej wiele 13-milimetrowych okrągłych szkiełek nakrywkowych.Następnie usuń pożywkę hodowlaną z płytek. Dodać pożywkę hodowlaną zawierającą 25 mikromolowych etopozydów i inkubować komórki przez 20 minut, godzinę i trzy godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę z płytek.Umyj komórki trzykrotnie PBS. Aby utrwalić komórki, dodaj lodowaty metanol w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 10 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe PBS i przenieś je do komory wilgotnościowej.Po stuknięciu PBS dodać 30 do 40 mikrolitrów buforu przepuszczalnego i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka okładki trzy razy za pomocą PBS. Następnie odczep PBS od próbek.Dodaj 30 do 40 mikrolitrów roztworu blokującego dostarczonego w zestawie PLA do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować płytkę w nagrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Teraz rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w rozcieńczalniku do przeciwciał dostarczonym w zestawie.Po stuknięciu roztworu blokującego dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w komorze wilgotnościowej. Rozcieńczyć sondy minus i plus od jednego do pięciu w rozcieńczalniku przeciwciał. Używaj kombinacji takich jak osioł anty-mysz minus z osłem anty-kozioł plus i osioł anty-mysz minus z osłem anty-królik plus.Teraz stuknij roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyj raz TBST. Po stuknięciu nadmiaru TBST dodać 20 mikrolitrów roztworu sondy PLA do szkiełek nakrywkowych, a następnie inkubować w nagrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Rozcieńczyć pięciokrotny bufor do podwiązywania w wodzie o wysokiej czystości.Stuknąć roztwór sondy PLA i umyć raz TBST. Teraz dodać ligazę do roztworu ligacyjnego w rozcieńczeniu od 1 do 40 bezpośrednio przed nałożeniem go na próbki. Inkubować w podgrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie rozcieńczyć pięciokrotny bufor wzmacniający w wodzie o wysokiej czystości. Po usunięciu roztworu do ligacji z próbek należy je jednokrotnie przemyć TBST. Dodać polimerazę do roztworu amplifikacyjnego w rozcieńczeniach od 1 do 80 bezpośrednio przed nałożeniem go na próbki.Inkubować w nagrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 100 minut. Odczep bufor wzmacniający, a następnie przemyj dwa razy buforem SSC przez 10 minut każdy. Po dwukrotnym umyciu próbek PBS, dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Pod koniec inkubacji strzepnąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i trzykrotnie przemyć TBST. Następnie dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie przemyj pięć razy buforem TBST, dwa razy buforem SSC i dwa razy buforem SSC 0,01x.Na koniec uzyskaj obrazy z różnych dołków lub regionów szkiełek nakrywkowych, aby uniknąć artefaktów spowodowanych niejednorodną inkubacją i zapisz wszystkie kanały o tym samym wzorcu nazwy. Po wykonaniu akwizycji kropki PLA w celu zlokalizowania interakcji białek, otwórz obrazy z różnych warunków, aby dostosować parametry do analizy w ImageJ. Określ i określ te parametry wraz z danymi w programie makra.Aby usunąć tło, kliknij przycisk Przetwarzaj i odejmij tło. Użyj funkcji podglądu, aby przetestować różne promienie toczącej się kulki. Aby usunąć szumy, kliknij proces, szum i usuń plamki.Następnie kliknij process i smooth w menu jądra, aby zastosować funkcję smooth i poprawić wypełnienie. Teraz kliknij obraz, a następnie wpisz i wybierz 8-bitowy, aby przekonwertować na obraz 8-bitowy. Następnie dostosuj próg, przechodząc do obrazu, dostosuj, a na końcu próg.Dostosuj próg, aby uwidocznić wszystkie jądra lub kropki na obrazie, unikając przesycenia i zapadania się struktur. Zanotuj również wartości i przetestuj na różnych obrazach. Aby przekonwertować na maskę, kliknij opcję Procesowy, Binarny i Konwertuj na maskę.W przypadku jądra kliknij pozycję proces, binarny i wypełnij otwory, a następnie proces, binarny i zlewnia. W przypadku kropek PLA kliknij pozycję proces, binarny i zlewnia. Aby policzyć jądra, zmierz powierzchnię lub długość różnych jąder, aby oszacować średni rozmiar.Użyj przybliżonej wartości, aby przeanalizować cząstki, klikając przycisk Analizuj i Analizuj cząstki. Ustaw rozmiar na 15-nieskończoność i sprawdź opcje pokaż maskę, wyświetl wyniki, wyczyść wyniki, dodaj do menedżera i wyklucz na krawędziach. Aby policzyć kropki PLA, zmierz ich powierzchnię lub promień, aby oszacować ich średni rozmiar.Dla każdego ROI w menedżerze ROI kliknij Analizuj i analizuj cząstki. Ustaw rozmiar na 0,02 na 3, zaznacz opcje pokaż maskę, wyświetl wyniki, wyczyść wyniki, sumuj i wyklucz na krawędziach. Zapisz wyniki pokazujące liczbę punktów na jądro w każdym jądrze obecnym na obrazie.Interakcja Nek4-Ku70 zwiększyła się w jądrze po uszkodzeniu DNA po 20 minutach, jednej godzinie i trzech godzinach leczenia etopozydem w porównaniu z komórkami kontrolnymi i leczonymi DMSO. Leczenie etopozydem istotnie zwiększało interakcję Nek4 topoizomerazy 2-beta w porównaniu z kontrolą DMSO. Barwienie Gamma H2AX nasiliło się po 20 minutach leczenia etopozydem i utrzymywało się na podwyższonym poziomie do trzech godzin, co wskazuje na utrzymującą się odpowiedź na uszkodzenie DNA.

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Podczas gdy zderzenia widełek replikacyjnych z adduktami DNA mogą powodować pęknięcia podwójnej nici, mniej wiadomo o interakcji między replikosomami a zmianami blokującymi. Zastosowaliśmy test ligacji zbliżeniowej, aby zobrazować te spotkania i scharakteryzować konsekwencje dla składu repliksome'owego.

Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Opisujemy prosty protokół służący do identyfikacji białek mózgowych wiążących się z pełną sekwencją końca C receptorów P2X2 bramkowanych przez ATP. Przewiduje się, że rozszerzenie i systematyczne zastosowanie tego podejścia do wszystkich receptorów P2X doprowadzi do lepszego zrozumienia sygnalizacji receptorów P2X.

Proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z ligandowo-bramkowanymi kanałami kationowymi P2X2

Poznaj metodę testu ligandów zbliżeniowych do badania interakcji białek w miejscach uszkodzenia DNA w liniach komórkowych U2OS. Ta technika umożliwia wizualizację interakcji białkowych in vivo z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Przeglądaj więcej filmów