Name: Model in vitro integrujący sztywność i przepływ podłoża w celu zbadania odpowiedzi komórek śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Odkryj model in vitro łączący sztywność podłoża i przepływ ścinający do badania odpowiedzi komórek śródbłonka. Ta metoda symuluje środowisko naczyniowe i pomaga zrozumieć mechanizmy miażdżycy oraz nadciśnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność Robertowi Eganowi za pomoc w budowie komory przepływowej. Autorzy dziękują Lucasowi McCauleyowi za jego pomoc podczas eksperymentów. Ponadto chcieliby podziękować Instytutowi Obrazowania Chemicznego Systemów Żywych (CILS) Uniwersytetu Północno-Wschodniego, które przyznały dostęp do mikroskopów konfokalnych. Autorzy doceniają wsparcie finansowe udzielone przez National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 przyznane SB) i National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 do SB i CMMI 1846962 do EE).

Studying Tissue Rigidity and Shear Stress Effects on Endothelial Cells

<ol><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Suowen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+atherosclerotic+cardiovascular+diseases+and+beyond%3A+From+mechanism+to+oharmacotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies.</a> Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).</li>
<li>Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+the+cell-matrix+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cel+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at the cell-matrix interface.</a> Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).</li>
<li>Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the glycocalyx.</a> J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).</li>
<li>Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+vascular+endothelial+genes+differentially+responsive+to+fluid+mechanical+stimuli%3A+cyclooxygenase-2%2C+manganese+superoxide+dismutase%2C+and+endothelial+cell+nitric+oxide+synthase+are+selectively+up-regulated+by+steady+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+and+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness and cardiovascular events.</a> Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).</li>
<li>Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
<li>Mensah, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+glycocalyx+determines+metastatic+cancer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity.</a> FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).</li>
<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacryloyl+and+its+hydrogels+with+an+exceptional+degree+of+controllability+and+batch-to-batch+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency.</a> Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).</li>
<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
<li>Orr, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subendothelial+extracellular+matrix+modulates+NF-kappaB+activation+by+flow%3A+a+potential+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis.</a> J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mechanisms+of+subcutaneous+preconditioning+incubation+for+neural+stem+cell+embedded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).</li>
<li>Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid-co-gelatin+cryogels+for+tissue-engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications.</a> Materials. 11 (8), 1374(2018).</li>
<li>Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics in endothelial permeability.</a> Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).</li>
<li>Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+encapsulated+cells+on+the+physical-mechanical+properties+and+microstructure+of+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels.</a> Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+small-diameter+vascular+vessel+with+endothelium+and+smooth+muscle+by+the+approach+of+two-step+crosslinking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).</li>
<li>Villard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclavable+and+injectable+cryogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications.</a> Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
<li>Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives.</a> Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).</li>
<li>James, B. D., Allen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+behavior+in+complex+mechanical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments.</a> ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).</li>
<li>Yeh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulates+endothelial+cell+proliferation+through+septin+9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9.</a> PLoS One. 7 (10), e4688(2012).</li>
<li>Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+substrate+stiffness+on+circulating+progenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate.</a> J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).</li>
<li>Geemen, D. v, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin-anchored+focal+adhesions+distinguish+endothelial+phenotypes+of+human+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).</li>
<li>Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+substrate-+and+flow-derived+stresses+in+endothelial+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology.</a> Comm Biol. 4 (1), 764(2021).</li>
<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że zostało złożone tymczasowe zgłoszenie patentowe (nr 63/634,853) pod tytułem Komora przepływowa z mechanicznie przestrajalnym substratem i że nie istnieją żadne inne konkurencyjne interesy.

Układ naczyniowy jest dynamicznym środowiskiem, w którym różne siły znacząco wpływają na zachowanie komórek. Badanie zdarzeń biologicznych w chorobach sercowo-naczyniowych bez uwzględnienia tych sił byłoby niedokładne. Dlatego kluczowe znaczenie mają modele komórkowe zdolne do naśladowania mechanicznego środowiska naczyniowego. Naukowcy poczynili już znaczne postępy w podkreślaniu wpływu tych sił na zachowanie komórek11. Jednak, aby zrozumieć zachowanie komórek zarówno w warunkach patologicznych, ...

Śródbłonek, wyściełający wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia naczyń krwionośnych. Komórki śródbłonka (EC) odgrywają kluczową rolę w regulacji różnych funkcji sercowo-naczyniowych, w tym kontroli tonu naczyń krwionośnych, selektywnej przepuszczalności, hemostazy i mechanotransdukcji1,2. Badania mocno powiązały dysfunkcję EC z pierwszorzędną rolą w rozwoju miażdżycy. Warto zauważyć, że EC napotykają różne siły mechaniczne na powierzchniach międzyfazowych, gdzie oddziałują z przepływem krwi i leżącymi pod nią tkankami naczyń krwionośnych3,4. W kilku badaniach powiązano dysfunkcję EC z nieprawidłowymi zmianami czynników mechanicznych w środowisku naczyniowym, takich jak naprężenie ścinające płynu spowodowane przepływem krwi i sztywnością tkanek5,6,7.
Jednakże, wcześniejsze badania nie poświęciły zbyt wiele uwagi zrozumieniu łącznego wpływu sztywności tkanki i naprężenia ścinającego na funkcję EC. Aby zwiększyć zdolność do przełożenia wyników badań na skuteczne metody leczenia miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych, konieczne jest ulepszenie modeli komórkowych stosowanych w tej dziedzinie. Znaczący postęp osiągnięto w humanizacji modeli komórkowych poprzez zastosowanie ludzkich EC i poddanie ich naprężeniom ścinającym lub substratom o różnych poziomach sztywności8,9,10. Jednak przyjęcie i udoskonalenie modeli komórkowych, które integrują środowiska dynamicznego przepływu z podłożami EC o regulowanych właściwościach sztywności, postępuje powoli. Wyzwanie polega na opracowaniu niepęczniejących substratów EC, aby zapobiec zmianom parametrów przepływu w kanale przepływowym, a jednocześnie ułatwić uprawę nienaruszonych i dobrze przylegających monowarstw EC. Model in vitro zdolny do pokonania tych przeszkód może ułatwić skuteczniejsze badania nad tym, w jaki sposób nadciśnienie, starzenie się i warunki przepływu wpływają na mechanotransdukcję EC, zdrowie naczyń krwionośnych i ostatecznie na rozwój miażdżycy. Opracowano różne metody wywierania naprężeń ścinających na komórki przy jednoczesnej kontroli sztywności podłoża, w tym obracające się płyty i urządzenia mikroprzepływowe. W metodzie płyty obrotowej komórki są umieszczane między dwiema płytami, a naprężenie ścinające jest przykładane poprzez ruch obrotowy płyt. Ta metoda jest mniej skomplikowana i zapewnia szybki model; Cierpi jednak z powodu przestrzennej zmienności naprężeń ścinających, z zerowym naprężeniem ścinającym w środku i maksymalnym naprężeniem ścinającym na obrzeżach11.
Z drugiej strony, urządzenia mikroprzepływowe reprezentują nową generację narzędzi z możliwością kontrolowania sztywności podłoża i warunków przepływu. Systemy te nadają się do naśladowania mikrokrążeń w warunkach przepływu laminarnego. Jednak badanie miażdżycy za pomocą takich urządzeń jest niepraktyczne, ponieważ miażdżyca występuje w dużych naczyniach o zaburzonym przepływie11. Niniejszy artykuł ma na celu wniesienie wkładu w krytyczną dziedzinę badawczą, jaką są badania EC, poprzez przedstawienie opłacalnego systemu zdolnego do badania wpływu różnych poziomów sztywności w podłożach EC w różnych warunkach przepływu. System integruje podłoża o różnej sztywności, aby naśladować patologiczne i fizjologiczne naczynia krwionośne. Protokół ten przedstawia metodę tworzenia hydrożeli na bazie żelatyny o poziomach pęcznienia i sztywności 5 kPa i 10 kPa, reprezentujących odpowiednio sztywność fizjologiczną i patologiczną. Dodatkowo szczegółowo opisano konstrukcję komory przepływowej z równoległą płytą, która jest w stanie zintegrować te podłoża. Obliczeniowa dynamika płynów (CFD) została wykorzystana do oceny naprężeń ścinających i warunków przepływu. Opisano przygotowanie hydrożeli do hodowli EC oraz przeprowadzenie 6-godzinnego eksperymentu przepływowego, a następnie omówiono poeksperymentowe barwienie immunologiczne.

<table><tbody><tr><td>Metakrylan (trimetoksysililo)propylu, tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Hydrożel Produkcja</td></tr><tr><td>3-(trimetoksysililo)metakrylanu propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Zasolenie szkła</td></tr> 4<tr><td>',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Nośniki montażowe Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA Synteza</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Falloidyna&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8953S</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Hydrożel Produkcja</td></tr><tr><td>Przezroczysty, odporny na zarysowania i promieniowanie UV odlewany arkusz akrylowy (45/64 '')</td> <td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td> Mikroskop konfokalny do <td>produkcji komory przepływowej</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Barwienie</td><td></td></tr> <tr><td>immunologiczne Zeiss LSM 800Covidien Monoject Rigid Pack 60 ml strzykawki bez igieł</td><td>Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>22-031-375</td> Zestaw do wzrostu <td>EC Flow Experiment</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-041</td><td>Etanol do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>Zasolenie szkła</td></tr><tr><td>Żelatyna typu A (300 kwitnienia) ze skóry świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA Synteza</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>Zasolenie szkła</td></tr><tr><td>Silikon wysokotemperaturowy o wysokiej czystości Arkusz gumowy</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>Produkcja komory przepływowej</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td> <td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td> <td>PSC-100-010</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>maszynowe M3x30mm Śruba z okrągłym z gniazdem sześciokątnym 304 mocujące ze stali nierdzewnej 20 sztuk</td><td>Uxcell</td><td>B07Q5RM2TP</td><td>Produkcja</td></tr> <tr><td>komory przepływowejNapęd cyfrowy Masterflex L/S z funkcją Easy-Load&reg; 3 Głowica pompy do przewodów precyzyjnych; Eksperyment przepływu 115/230 VAC</td><td>VWR</td><td>#MFLX77921-65</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Przewody pompy precyzyjnej Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; Eksperyment</td> z przepływem <td>25 stóp VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bezwodnik metakrylowy (MAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelMA Synteza</td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td>Ogólny</td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>Synteza GelMA</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>Synteza GelMA</td></tr><tr><td>Wersja edukacyjna</td><td></td><td></td><td></td>SOLIDWORKS Wersja edukacyjna</tr><tr><td>SOLIDWORKS Student Edition, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Flow Chamber Design</td></tr><tr><td>Vascular Basal Medium</td> American <td>Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-030 Hodowla</td><td>komórkowa</td></tr></tbody></table>

model in vitro integrujący sztywność i przepływ podłoża w celu zbadania odpowiedzi komórek śródbłonka

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

Prezentujemy innowacyjny model in vitro, którego celem jest zbadanie łącznego wpływu sztywności tkanki i naprężeń ścinających na funkcję komórek śródbłonka (EC), które są kluczowe dla zrozumienia zdrowia naczyń krwionośnych i wystąpienia chorób takich jak miażdżyca. Tradycyjnie, badania dotyczyły wpływu naprężeń ścinających i sztywności podłoża na EC, niezależnie. Jednak ten zintegrowany system łączy te czynniki, aby zapewnić bardziej precyzyjną symulację środowiska mechanicznego układu krwionośnego. Celem jest zbadanie mechanotransdukcji EC na różnych poziomach sztywności tkanek i warunkach przepływu przy użyciu ludzkich EC. Szczegółowo opisujemy protokół syntezy hydrożeli metakrylanu żelatyny (GelMA) o regulowanej sztywności i zasiewania ich EC w celu uzyskania konfluencji. Dodatkowo opisujemy projekt i montaż ekonomicznej komory przepływowej, uzupełnionej symulacjami obliczeniowej dynamiki płynów, w celu wygenerowania fizjologicznych warunków przepływu charakteryzujących się przepływem laminarnym i odpowiednimi poziomami naprężeń ścinających. Protokół obejmuje również znakowanie fluorescencyjne dla mikroskopii konfokalnej, umożliwiając ocenę odpowiedzi EC zarówno na podatność tkanek, jak i warunki przepływu. Poddając hodowane EC wielu zintegrowanym bodźcom mechanicznym, model ten umożliwia kompleksowe badania nad tym, w jaki sposób czynniki takie jak nadciśnienie i starzenie się mogą wpływać na funkcjonowanie EC i choroby naczyniowe, w których pośredniczy EC. Wnioski uzyskane dzięki tym badaniom będą miały zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw chorób naczyniowych oraz dla opracowania skutecznych strategii leczenia.

Rysunek 1 przedstawia układ eksperymentalny, opisując proces syntezy GelMA poprzez reakcję metakrylowania. Otrzymany produkt wykorzystano następnie do wytworzenia podłoża hydrożelowego, na którym zasiano EC. Następnie komórki wprowadzono do komory przepływowej w celu przeprowadzenia 6-godzinnego eksperymentu przepływowego przy wartości 12 dyne/cm2.
1Do oceny sukcesu reakcji metakrylowania wykorzystano spektroskopię H NMR (<strong clas...

Zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy przestrajalny substrat na bazie żelatyny do hodowli komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) w odpowiednich warunkach przepływu naczyniowego. Ta biomimetyczna powierzchnia odtwarza zarówno warunki fizjologiczne, jak i patologiczne, umożliwiając badanie sił mechanicznych wpływających na zachowanie EC i pogłębiając naszą wiedzę na temat zdrowia naczyń krwionośnych i mechanizmów chorobowych.

Model in vitro integrujący sztywność i przepływ podłoża w celu zbadania odpowiedzi komórek śródbłonka

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

Niniejsze badanie koncentruje się na mechanobiologii w kontekście miażdżycy i nadciśnienia tętniczego. Głównymi kwestiami, które chcemy rozstrzygnąć, są: po pierwsze, w jaki sposób można dokładniej odtworzyć środowisko naczyniowe w warunkach fizjologicznych i patologicznych? Po drugie, jakie są odpowiedzi komórkowe komórek śródbłonka w przypadku jednoczesnej ekspozycji na te bodźce mechaniczne?Celem badania jest zapewnienie dokładniejszej symulacji środowiska naczyniowego poprzez zintegrowanie sztywności podłoża i warunków przepływu w jednym systemie. Poprzednie modele in vitro badały albo sztywność podłoża w warunkach statycznych, albo wpływ przepływu na ECs hodowane na sztywnym podłożu, co w obu przypadkach jest nieistotne fizjologicznie. Na początek należy dodać 10 gramów żelatyny typu A, 300 bloom ze skóry wieprzowej do 100 mililitrów buforu węglanowo-wodorowęglanowego.Rozpuścić żelatynę w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C, mieszając roztwór z prędkością 700 RPM za pomocą mieszadła magnetycznego. Po całkowitym rozpuszczeniu skorygować pH roztworu żelatyny do poziomu 9,5, używając 0,1 M wodorotlenku sodu. Aby rozpocząć metakrylowanie, dodać kroplowo do roztworu 938 µL bezwodni

in-vitro-model-integrating-substrate-stiffness-flow-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Hodowla całego narządu krążka międzykręgowego (IVD) zachowuje natywną macierz zewnątrzkomórkową, fenotypy komórkowe i interakcje między komórką a macierzą. W tym miejscu opisujemy system hodowli IVD z wykorzystaniem mysich lędźwiowych i ogonowych IVD w ich funkcjonalnych jednostkach kręgosłupa oraz kilka zastosowań wykorzystujących ten system.

Model hodowli narządowej in vitro mysiego krążka międzykręgowego

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Odkryj model in vitro łączący sztywność podłoża i przepływ ścinający do badania odpowiedzi komórek śródbłonka. Ta metoda symuluje środowisko naczyniowe i pomaga zrozumieć mechanizmy miażdżycy oraz nadciśnienia.

Model in vitro integrujący sztywność i przepływ podłoża w celu zbadania odpowiedzi komórek śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów