Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Krążące pęcherzyki zewnątrzkomórkowe jako biomarkery to stosunkowo nowa dziedzina w badaniach nad biomarkerami o ogromnym potencjale. Nasz protokół ma na celu zapewnienie praktycznego podejścia do wdrażania odkrywania i wykrywania biomarkerów związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi na oddziale ratunkowym. Pojawiające się dowody wykazały, że ładunek molekularny znajdujący się w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych i krążeniu zawiera białka i RNA, które są interesujące w wielu kontekstach chorobowych.

Kilka nowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, zamkniętych biomarkerów powiązano z diagnostyką i rokowaniem różnych jednostek chorób sercowo-naczyniowych. Głównymi wyzwaniami w dziedzinie odkrywania biomarkerów krążących pęcherzyków zewnątrzkomórkowych są zachowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i akwizycja osocza w zależności od dynamiki uwalniania EV. W związku z tym konieczny jest rygorystyczny protokół wbudowany w rutynę kliniczną, aby uniknąć degradacji EV i utrzymać powtarzalne wyniki, szczególnie w przypadku stosowania metod analizy na szeroką skalę, takich jak proteomika.

Odkrycie biomarkerów białkowych zamkniętych w krążącej EV jest silnie zależne od czasu początkowego pobrania krwi w stosunku do wystąpienia objawów oraz czasu przechowywania próbki ze względu na naturalną degradację EV. Protokół ten oferuje praktyczny protokół izolacji EV osocza i wprowadzenia go do analizy proteomicznej, który można zintegrować z przepływem pracy klinicznej na oddziale ratunkowym. Nasze nadchodzące badania będą koncentrować się na integracji różnych grup pacjentów w naszej metodologii, wśród których są pacjenci z niewyrównaną niewydolnością serca, arytmią lub kardiomiopatią tachykardiologiczną, a także badania podłużne pacjentów poddawanych operacji pomostowania.

Korzystając z tego protokołu, dążymy do zidentyfikowania nowych biomarkerów związanych z EV, które przyczyniają się do diagnozowania i prognozowania wyżej wymienionych patologii. Aby rozpocząć wirowanie ludzkiego osocza krwi, za pomocą ultra wirówki z wirnikiem o stałym kącie bez pękania. Po opadnięciu szczątków i ciała apoptotycznego przenieś supernatant do nowej probówki i ultra wiruj w temperaturze 100 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez pękania w celu wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Ostrożnie wyjmij probówkę po ultrawirowaniu. Za pomocą pipety elektronicznej delikatnie odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra osocza zubożonego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Przełącz się na pipetę o pojemności 1000 mikrolitrów, aby ostrożnie odpipetować pozostałe osocze bez naruszania osadu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Podczas pipetowania należy stopniowo przechylać rurkę, aby upewnić się, że nie pozostało osocze i ponownie zawiesić osad w PBS. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lodowatym PBS w różnych proporcjach, aby uzyskać końcowy zakres zliczania od 10 do 100 nanocząstek na klatkę podczas śledzenia. Włącz przyrząd NTA i uruchom odpowiednie oprogramowanie na podłączonym komputerze.

Włóż komorę do trumny laserowej i kliknij uruchom kamerę, aby ją aktywować. Pobrać jeden mililitr PBS do strzykawki i podłączyć go do przedniej rurki. Dokładnie przepłucz system przewodów, upewniając się, że w komorze nie pozostały pęcherzyki powietrza.

Monitoruj kamerę, aby wykryć wszelkie pęcherzyki powietrza lub cząstki zanieczyszczeń. Teraz narysuj przygotowane rozcieńczenie robocze pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do jednomililitrowej strzykawki i wstrzyknij je do komory. Przejdź do kart przechwytywania i przetwarzania, aby dostosować wzmocnienie ekranu do jasności monitora.

Zmodyfikuj poziom kamery, aby poprawić różnicowanie nanocząstek na ekranie. Ustaw odpowiedni próg wykrywania w zakładce procesu, aby odróżnić cząstki od szumu tła. Ustaw ostrość aparatu za pomocą pokrętła ostrości po obu stronach instrumentu, aż nanocząsteczki staną się ostre na ekranie.

Po ustawieniu stałej temperatury 22 stopni Celsjusza dla wszystkich pomiarów w ustawieniach sprzętowych, kliknij przycisk uruchom, aby rozpocząć pomiar. Nagraj co najmniej trzy filmy wideo po 30 sekund każdy dla każdego przykładowego przebiegu. Kliknij zmień, aby wprowadzić współczynnik rozcieńczenia próbek, a na koniec kliknij eksport, aby zapisać wyniki.

Korzystając z analizy śledzenia nanocząstek, zidentyfikowano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i zwizualizowano je na podstawie brownie i ruchu. Analiza wykazała średnie stężenie cząstek od 1,2 razy 10 do potęgi 10 cząstek na mililitr w osoczu zdrowych osób, co wykazało obecność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Średni rozmiar pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osocza zmierzono na 184,7 nanometrów, co jest zgodne z typowymi wymiarami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.