Name: Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji i analizy proteomicznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza krwi w celu odkrywania biomarkerów sercowo-naczyniowych. Protokół zapewnia niezawodność w warunkach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Heidi Deigentasch, Amelie Werner i Elisabeth Mertz za ich wsparcie organizacyjne podczas tego projektu.

Do tego protokołu, zrekrutowano przykładową kohortę pacjentów, składającą się z trzech zdrowych pacjentów kontrolnych bez widocznych lub podstawowych objawów choroby sercowo-naczyniowej oraz dwóch pacjentów z zawałem mięśnia sercowego bez odcinka ST (NSTEMI). Uprzednia zgoda została udzielona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Heidelbergu (zgoda IRB #S-351/2015), a przed rekrutacją uzyskano pisemną zgodę od wszystkich pacjentów. Pacjenci zostali zrekrutowani z Oddziału Bólu Klatki Piersiowej Oddziału Kardiologii Szpitala Uniwersyteckiego w Heidelbergu na podstawie wstępnego obrazu klinicznego, wywiadu medycznego i wyników badań diagnostycznych.
Kryteria włączenia dla zdrowych pacjentów kontrolnych obejmowały nietypowy lub niespecyficzny obraz kliniczny, poziomy biomarkerów serca w normalnych granicach, brak historii chorób sercowo-naczyniowych oraz normalne wyniki dalszych badań diagnostycznych. Kryteria wykluczenia obejmowały historię nowotworu złośliwego lub terapię cytostatykami w ciągu ostatnich pięciu lat, hemodializę, rodzinne zespoły hiperlipidemii oraz wszelkie choroby sercowo-naczyniowe w wywiadzie. NSTEMI zdiagnozowano zgodnie z aktualnymi wytycznymi12, z hemodynamicznie istotnym zwężeniem tętnicy wieńcowej potwierdzonym koronarografią. Dla każdego pacjenta pobrano do 36 ml krwi z żyły łokciowej do probówek zbiorczych z cytrynianem za pomocą standardowej flebotomii13, a próbki krwi natychmiast przetransportowano w temperaturze 4 °C do dalszego przetwarzania. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Izolacja EV za pomocą wirowania różnicowego
UWAGA: Zastosowano protokół wirowania różnicowego do izolacji EV od próbek ludzkiego osocza. Przeprowadzono dwa cykle ultrawirowania (UC) ze zwiększającą się siłą odśrodkową, aby zmaksymalizować czystość otrzymanego granulatu EV.
<ol>
	<li>Izolacja plazmowa
	<ol>
		<li>Przetwarzanie próbek krwi pełnej, schłodzonej w temperaturze 4 °C, należy rozpocząć w ciągu 120 minut od pobrania, aby zapewnić integralność EV osocza. Używaj probówek do pobierania krwi uzupełnionych cytrynianem (0,106 mol/l cytrynianu), aby zapobiec krzepnięciu.</li>
		<li>Rozcieńczyć 9 ml cytrynowanej krwi pełnej w stosunku 1:1 w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu zmniejszenia lepkości. Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości (1,077 g/ml) w celu oddzielenia podczas wirowania.</li>
		<li>Wirować przy 600 × g przez 25-30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odpipetować frakcję osocza z górnej części każdej kolumny do specjalistycznych probówek wirowych. Przejdź do kolejnych kroków lub zamroź w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie resztek komórkowych i ciał apoptotycznych
	<ol>
		<li>Odwirować osocze o stężeniu 20 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia, bez hamowania. Na dnie probówki powinna uformować się widoczna osadka resztek komórkowych i ciał apoptotycznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja EV
	<ol>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki. Ultrawirować przy 100 000 × g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, bez hamowania, w celu wyizolowania EV, które utworzy widoczną osadkę na ściance rury.</li>
		<li>Ostrożnie odpipetować supernatant za pomocą pipety elektronicznej, pozostawiając około 1 ml osocza zubożonego w EV. Przełącz się na pipetę o pojemności 1000 μl w celu uzyskania pozostałego osocza, pipetując powoli, aby uniknąć naruszenia granulki EV. Podczas pipetowania należy stopniowo przechylać probówkę, aby upewnić się, że w probówce nie pozostało osocze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do dalszej analizy
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić izolowaną osadkę EV zgodnie z wymaganiami dalszej analizy: w celu śledzenia nanocząstek, ponownie zawiesić osad EV z 9 ml krwi pełnej w 200 μl PBS; w przypadku LC-MS/MS ponownie zawiesić EV wyizolowany z 36 ml krwi pełnej w 50 μl 1x buforu RIPA z 1% inhibitorem proteazy/fosfatazy</li>
		<li>Przenieś zawieszony granulat EV do probówki o pojemności 1,5-2 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy lub postępować w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza śledzenia nanocząstek
UWAGA: Kwantyfikacja średniego rozkładu wielkości EV w próbkach ludzkiego osocza została przeprowadzona przy użyciu Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), laserowej metody detekcji, która analizuje ruchy Browna nanocząstek.
<ol>
	<li>Rozcieńczenia robocze dla NTA
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy EV (granulat EV zawieszony w 200 μl PBS) lodowatym PBS w proporcjach 1:10, 1:50, 1:100 i 1:200. Twórz różne robocze rozcieńczenia, aby określić najbardziej odpowiednie rozcieńczenie do osiągnięcia końcowej liczby 10-100 nanocząstek na klatkę podczas śledzenia nanocząstek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie programu NTA
	<ol>
		<li>Włącz przyrząd NTA i uruchom odpowiednie oprogramowanie na podłączonym komputerze. Umieść komorę w trumnie lasera i kliknij przycisk Start Camera, aby ją aktywować.</li>
		<li>Pobrać 1 ml PBS do strzykawki. Podłączyć strzykawkę do przedniej rurki i dokładnie przepłukać system przewodów, upewniając się, że w komorze nie pozostało powietrze. Monitoruj kamerę, aby wykryć wszelkie pęcherzyki powietrza lub cząstki zanieczyszczeń.</li>
		<li>Pobrać przygotowany rozcieńcz roboczy EV do strzykawki o pojemności 1 ml i wstrzyknąć go do komory.</li>
		<li>Dostosuj wzmocnienie ekranu, aby dopasować je do jasności monitora na kartach Przechwytywanie i Przetwarzanie. Zmodyfikuj poziom kamery, aby wyraźnie rozróżnić nanocząsteczki na ekranie.</li>
		<li>Ustaw odpowiedni próg wykrywania na karcie Proces, aby dostosować czułość odróżniania cząstek od szumu tła. Utrzymuj tę wartość na stałym poziomie dla wszystkich pomiarów w tym samym eksperymencie.</li>
		<li>Ustaw ostrość aparatu za pomocą pokrętła po obu stronach instrumentu, aż nanocząsteczki staną się ostre na ekranie.</li>
		<li>Ustaw stałą temperaturę (najlepiej 22 °C) dla wszystkich pomiarów w ustawieniach sprzętowych, ponieważ ruch Browna jest zależny od temperatury.</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pomiar. Wprowadź identyfikator próbki i rozpuszczalnik w wyskakującym okienku.</li>
		<li>Nagraj co najmniej trzy 30-sekundowe filmy dla każdego przykładowego przebiegu. Przesuwaj próbkę między pomiarami, aby uchwycić reprezentatywną próbkę roztworu nanocząstek. Jeśli dostępna jest pompa strzykawkowa, ustaw ją na stałą prędkość i nagrywaj w sposób ciągły.</li>
		<li>Po zarejestrowaniu oprogramowanie automatycznie oblicza stężenie i rozkład wielkości nanocząstek. Kliknij przycisk Zmień, aby wprowadzić współczynnik rozcieńczenia użyty dla próbki, a następnie zapisać wyniki, klikając przycisk Eksportuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Analizuj wyniki za pomocą plików wyjściowych w programie statystycznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Bezznacznikowa analiza proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)
UWAGA: Analiza proteomu EV bez znaczników została przeprowadzona przy użyciu początkowej separacji białek poprzez elektroforezę żelową białek EV po lizie błony. Po trawieniu białek w żelu za pomocą trypsyny, peptydy analizowano za pomocą LC-MS/MS, z indywidualnymi widmami dopasowanymi do bazy danych ludzkiego proteomu. Warto zauważyć, że jeśli pożądana jest nieukierunkowana analiza lizatów EV, zalecana jest proteomika typu shotgun bez uprzedniego wyboru określonego zakresu masy cząsteczkowej, co sprawia, że kroki 3.1.1-3.1.7 tego protokołu są zbędne.
<ol>
	<li>Trawienie trypsyny w żelu
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór EV zawieszony w 1x buforze RIPA, dodając bufor ładujący Laemmli zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów). Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Załaduj próbki EV, uzupełnione buforem ładującym, wraz z drabinką białkową na 4%-12% żele Bis-Tris do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu (SDS-PAGE)14. Zabarwić żel Coomassie Blue przez 1-4 godziny, aby uwidocznić pasma białkowe. Odbarwić żel wodą, inkubując przez noc.</li>
		<li>Za pomocą ostrza skalpela należy wyciąć pasma barwione Coomassie z regionów żelowych zawierających białka będące przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Przemyć kawałki żelu 60 μl 1:1 (v/v) 50 mM buforu wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i acetonitrylu (ACN) o pH 8,5 przez 10 minut. Skurczyć kawałki żelu trzy razy po 10 minut każdy w 60 μl ACN. Umyć ponownie 60 μl 50 mM HERBATY o pH 8,5.</li>
		<li>Zredukować białka za pomocą 10 mM ditiotreitolu (DTT) w 100 mM TEAB w temperaturze 57 °C przez 30 minut i odwodnić kawałki żelu.</li>
		<li>Alkilować białka 10 mM jodoacetamidem (IAA) w 100 mM TEAB w temperaturze 25 °C przez 20 minut w ciemności.</li>
		<li>Umyj kawałki żelu 60 μl 100 mM TEAB i obkurcz je dwukrotnie po 10 minut w 60 μl ACN.</li>
		<li>Dodać 50 mM roztworu trypsyny TEAB, odpowiednio stężonego, do suchych kawałków żelu. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Ugasić reakcję, dodając 20 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA).</li>
		<li>Otrzymane peptydy należy wyekstrahować przez inkubację z 30 μl 1:1 (v/v) 0,1% TFA i ACN przez 30 minut. Odwodnić żele 20 μl ACN przez 20 minut, a następnie ponownie przemyć 30 μl 100 mM TEAB przez 20 minut.</li>
		<li>Skurcz żel dwukrotnie z 20 μl ACN przez 20 minut każdy.</li>
		<li>Zagęścić supernatant zebrany z każdego etapu ekstrakcji w wirówce próżniowej i rozpuścić próbkę w 15 μl 0,1% TFA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza LC-MS/MS
	<ol>
		<li>Wykonaj analizę nanoflow LC-MS/MS przy użyciu spektrometru masowego do chromatografii cieczowej o wysokiej rozdzielczości sprzężonego z elektrostatycznym analizatorem pułapki jonowej.</li>
		<li>Użyj 0,1% kwasu mrówkowego (FA)/1% ACN jako rozpuszczalnika A i 0,1% FA/89,9% ACN jako rozpuszczalnika B.</li>
		<li>Oddziel peptydy w 25-minutowym gradieniu liniowym: zacznij od 3% rozpuszczalnika B, zwiększ B do 23% w ciągu 21 minut, następnie do 38% w ciągu 4 minut i kontynuuj wymywanie w 95% B.</li>
		<li>Używaj spektrometru mas w trybie akwizycji zależnej od danych, automatycznie przełączając się między MS i MS2. Pozyskaj widma MS (m/z 400-1600) z rozdzielczością 60 000 przy m/z 400, generując widma MS2 dla maksymalnie 15 prekursorów przy użyciu znormalizowanej energii zderzenia 27 i szerokości izolacji 1,4 m/z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszukiwanie bazy danych białek
	<ol>
		<li>Przeszukaj widma MS/MS w bazie danych białek Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, czerwiec 2020) i dostosowanej bazie danych zanieczyszczeń (część MaxQuant, MPI Martinsried15,16) przy użyciu Proteome Discoverer 2.5 z Sequest HT.</li>
		<li>Skonfiguruj ustawienia programu w następujący sposób: ustaw tolerancję masy jonów fragmentów na 0,02 Da, a tolerancję masy jonu macierzystego na 5 ppm. Określ trypsynę jako enzym używany do trawienia i ustaw karbamidometyl jako stałą modyfikację cysteiny, z utlenianiem (metionina) i deamidacją (asparagina, glutamina) jako zmiennymi modyfikacjami. Obejmują acetylację, utratę metioniny i ich kombinację jako zmienne modyfikacje końca białka.</li>
		<li>Określ ilościowo peptydy przy użyciu trybu kwantyfikatora jonów prekursorowych, stosując metodę Top N Average (n = 3) do obliczania obfitości białek17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Cardiovascular Biomarker Studies Using Plasma Extracellular Vesicle Proteome

<ol><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367, 6478(2020).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).</li>
<li>Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cardiovascular diseases.</a> Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).</li>
<li>Ontoria-Oviedo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+hypoxic+ac10+cardiomyocytes+modulate+fibroblast+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility.</a> Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).</li>
<li>Zara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+exosome+profile+in+st-elevation+myocardial+infarction+patients+with+and+without+out-of-hospital+cardiac+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest.</a> Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).</li>
<li>Anselmo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+hypoxic+stress+mediates+functional+cardiac+extracellular+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release.</a> Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review.</a> Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+Novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+acute+coronary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome.</a> J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).</li>
<li>Gidlof, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+reveals+additional+diagnostic+biomarkers+for+myocardial+infarction+compared+to+plasma+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone.</a> Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).</li>
<li>Byrne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+guidelines+for+the+management+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J+Acute+Cardiovasc+Care%22%5BJournal%5D)">ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes.</a> Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).</li>
<li>Garcia-Castrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+blood+sampling+in+emergency+departments+from+the+European+Society+for+Emergency+Medicine+%28EUSEM%29%2C+European+Society+for+Emergency+Nursing+%28EUSEN%29%2C+and+European+Federation+of+Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine+%28EFLM%29+working+group+for+the+pre-analytical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase.</a> Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+maxquant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxquant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Blein-Nicolas, M., Zivy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thousand+and+one+ways+to+quantify+and+compare+protein+abundances+in+label-free+bottom-up+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics.</a> Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).</li>
<li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination%3A+Results+of+the+international+society+on+thrombosis+and+haemostasis+SSC+collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop.</a> J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li>
<li>Nieuwland, R., Siljander, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+study+extracellular+vesicles+in+human+blood+plasma+and+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum.</a> J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).</li>
<li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+parameters+on+the+measurement+of+circulating+microparticles%3A+Towards+standardization+of+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol.</a> J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).</li>
<li>Coumans, F. aW., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+towards+a+roadmap+for+collection%2C+handling+and+storage+of+blood+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Considerations towards a roadmap for collection, handling and storage of blood extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1647027(2019).</li>
<li>Lucien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miblood-EV%3A+Minimal+information+to+enhance+the+quality+and+reproducibility+of+blood+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Miblood-EV: Minimal information to enhance the quality and reproducibility of blood extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 12 (12), e12385(2023).</li>
<li>Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+serum+and+plasma+as+a+source+of+blood+extracellular+vesicles%3A+Increased+levels+of+platelet-derived+particles+in+serum+extracellular+vesicle+fractions+alter+content+profiles+from+plasma+extracellular+vesicle+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions.</a> PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).</li>
<li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart%3A+Position+paper+from+the+working+group+on+cellular+biology+of+the+heart+of+the+European+Society+of+Cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position paper from the working group on cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovasc Res. 114 (1), 19-34 (2018).</li>
<li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+identification+and+characterization+of+extracellular+vesicles+in+cardiovascular+studies%3A+From+exosomes+to+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Methods for the identification and characterization of extracellular vesicles in cardiovascular studies: From exosomes to microvesicles.</a> Cardiovasc Res. 119 (1), 45-63 (2023).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Brennan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+the+isolation+and+separation+of+extracellular+vesicles+from+protein+and+lipid+particles+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum.</a> Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).</li>
<li>Palviainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+plasma+and+serum+are+carriers+of+extravesicular+cargo-implications+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery.</a> PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+A+position+statement+from+the+international+society+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the international society for extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Gemoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+serum+extracellular+vesicles+reveals+qualitative+and+quantitative+differences+after+differential+ultracentrifugation+and+ExoQuick+TM+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of serum extracellular vesicles reveals qualitative and quantitative differences after differential ultracentrifugation and ExoQuick TM isolation.</a> J Clin Med. 9 (5), 1429(2020).</li>
<li>Kreimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+molecular+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Lipidomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based molecular characterization of extracellular vesicles: Lipidomics and proteomics.</a> J Proteome Res. 14 (6), 2367-2384 (2015).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Bateman, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+peptide+identification+events+in+proteomic+workflows+using+data-dependent+acquisition+%28dda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Maximizing peptide identification events in proteomic workflows using data-dependent acquisition (dda).</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 329-338 (2014).</li>
<li>Pino, L. K., Just, S. C., Maccoss, M. J., Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquiring+and+analyzing+data+independent+acquisition+proteomics+experiments+without+spectrum+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Acquiring and analyzing data independent acquisition proteomics experiments without spectrum libraries.</a> Mol Cell Proteomics. 19 (7), 1088-1103 (2020).</li>
</ol>

EG otrzymała honoraria dla wykładowców od Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; otrzymał instytucjonalne granty badawcze od Roche Diagnostics i Daiichi Sankyo, a poza zgłoszoną pracą pełni funkcję konsultanta dla Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis i Boehringer Ingelheim. JBK otrzymał dofinansowanie związane z projektem od Niemieckiego Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK) i Roche Diagnostics. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego ze zgłoszoną pracą.

Protokół ten zapewnia praktyczną, krok po kroku, gotową do użycia metodologię separacji i charakterystyki EV plazmy, a także wprowadzenie do nieznakowanej analizy proteomu, która nadaje się do integracji z rutynową praktyką kliniczną. Szczegółowy opis i ścisłe przestrzeganie ujednoliconej metodologii izolacji EV z próbek osocza są ważne dla zapewnienia powtarzalności uzyskanych wyników. Aktualna literatura wskazuje, że warunki przedanalityczne mogą znacząco wpływać na późniejsze pomiary i dalsze analizy izolatów EV. Dlat...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), według nomenklatury niejednolicie zdefiniowane, to nanocząstki otoczone dwuwarstwą lipidową i uwalniane przez różne typy komórek, które nie mają zdolności do replikacji1. Ta zróżnicowana grupa obejmuje egzosomy, subpopulację EV pochodzenia endosomalnego, zwykle o średnicy od około 40 nm do 160 nm2. Wykrywalne w licznych płynach ustrojowych3, EV ułatwiają komunikację międzykomórkową poprzez przenoszenie różnych aktywnych biomolekuł, takich jak białka, mRNA, mikroRNA i lipidy. W ten sposób EV dostarczają informacji o swojej komórce, z której pochodzą, za pomocą specyficznych dla komórki markerów powierzchniowych i biomolekuł, przy czym na ich właściwości duży wpływ ma stan komórki macierzystej i jej środowisko4. Cechy te doprowadziły do rosnącego zainteresowania potencjalną rolą EV jako biomarkerów, szczególnie w kontekście chorób sercowo-naczyniowych.
Liczne badania in vitro i in vivo wykazały, że stres hipoksyjny mięśnia sercowego prowadzi do zwiększonego uwalniania EV5,6,7. Współczesne badania nad ładunkami pojazdów elektrycznych w dużej mierze koncentrują się na mikroRNA związanym z pojazdami elektrycznymi, które może służyć jako biomarker w diagnostyce różnych chorób sercowo-naczyniowych8,9,10. W przeciwieństwie do tego, dowody na krążący proteom EV pozostają stosunkowo nieliczne, z jeszcze mniejszą liczbą badań badających EV w osoczu u pacjentów sercowo-naczyniowych. W dwóch kompleksowych badaniach nad EV pochodzącym z osocza od pacjentów cierpiących na zawał mięśnia sercowego, autorzy zidentyfikowali specyficzny profil proteomu EV wywołany niedokrwieniem o potencjalnym znaczeniu diagnostycznym6,11.
Metodologiczne przetwarzanie EV historycznie okazało się wyzwaniem, a obecnie nie ma ostatecznej rekomendacji dotyczącej optymalnego podejścia do izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji EV. Powszechnie stosowane metody izolacji EV obejmują ultrawirowanie różnicowe, wirowanie w gradiencie gęstości oraz metody filtracji, takie jak chromatografia wykluczania wielkości1. Zgodnie z obecnymi wytycznymi, charakterystyka izolatów EV powinna obejmować dowody na istnienie co najmniej trzech typowych markerów białkowych powierzchni EV, takich jak tetraspaniny lub aneksyny, w połączeniu z modalnością obrazowania1. Do badania ładunku EV na poziomie białka najczęściej stosuje się metody oparte na przeciwciałach, takie jak Western blot lub ELISA.
Biorąc pod uwagę wyzwania metodologiczne związane z izolacją i przetwarzaniem krążących EV, ten protokół przedstawia kompleksową ścieżkę od rekrutacji pacjentów i pobierania próbek do późniejszej izolacji EV, charakterystyki i kwantyfikacji izolatów EV w osoczu. Ponadto badanie to przedstawia przebieg pracy polegający na natychmiastowej izolacji EV pochodzącej z osocza od pacjentów zgłaszających się na oddział ratunkowy (Oddział Bólu Klatki Piersiowej) w ośrodku opieki trzeciego stopnia w południowo-zachodnich Niemczech, a następnie bezznacznikową analizę proteomu EV osocza specyficznego dla choroby przy użyciu chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas tandem (LC-MS/MS). Celem jest ułatwienie wysokoprzepustowej analizy w celu zidentyfikowania różnie wzbogaconych białek związanych z EV w dużej kohorcie pacjentów z różnymi niedokrwiennymi, wrodzonymi lub (auto)immunologicznymi chorobami sercowo-naczyniowymi na etapie wstępnej diagnozy oraz w trakcie progresji i/lub ustąpienia choroby. To proteomiczne podejście przesiewowe ma na celu zidentyfikowanie wzorców wzbogacania białek specyficznych dla EV związanych z różnymi szlakami chorobowymi, a ostatecznym celem jest odkrycie nowych biomarkerów białkowych związanych z EV w celu usprawnienia obecnej diagnostyki i monitorowania terapeutycznego w chorobach sercowo-naczyniowych.

<table><tbody><tr><td>4x Bufor do próbek Laemmli</td><td>Bio-rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor RIPA</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z poliwęglanu 26,3 ml z zespołem nakrętki do ultrawirowania</td><td>Beckman Coulter</td><td>355654</td><td></td></tr><tr><td>5810R Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Biosolve</td><td>0001204101BS</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotriitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy 99% ULC/MS 100</td><td>Biosolve</td><td>0006914143BS</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque - 1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125-5G</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr mas Orbitrap Q Exactive HF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS działający bufor</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical&nbsp;</td><td>Oprogramowanie NS300</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA 3.2</td><td>Malvern Panalytical&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strona 4&nbsp; bis 12&nbsp;%, Żele białkowe Bis-Tris</td><td>Invitrogen</td><td>NP0323</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka podłogowa Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td>521-4180</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy/fosfatazy (100X)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>Marker białkowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.5</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrydowy spektrometr mas kwadrupolowo-orbitrapowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie barwienie coomasssie</td><td>Serva</td><td>35081.01</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 &micro; m 1 g</td><td>Dr. Maisch</td><td>r119.aq.0001</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE żel handlowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW00100BOX</td><td></td></tr><tr><td>S-Monovette&nbsp; Citrat 9NC 0,106 mol/l 3,2%</td><td>Sarstedt</td><td>02.1067.001</td><td></td></tr><tr><td>Szybki koncentrator</td><td>próżniowy Savant Swiss-Prot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Uniprot) Baza danych białek Homo sapiens (UP000005640, czerwiec 2020)</td><td>UniProt</td><td>https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA) do HPLC >99%, 100 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna MS-Grade</td><td>Thermo Fisher</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Typ 50.2 Ti Rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>Beckman Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC Dionex Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Biosolve</td><td>0023214102BS</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to dwuwarstwowe nanocząsteczki pochodzenia komórkowego, zamknięte w dwuwarstwie lipidowej, niereplikowalne. EV przyciągają obecnie uwagę w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na ich rolę w regulacji komunikacji międzykomórkowej, potencjalnie służąc jako cenne biomarkery chorób sercowo-naczyniowych. Jednak proteom EV i jego potencjał jako biomarkera w diagnostyce sercowo-naczyniowej pozostają słabo poznane. Protokół ten przedstawia znormalizowaną metodę izolacji i kwantyfikacji EV pochodzących z osocza oraz analizy ich ładunku białkowego przy użyciu próbek osocza od pacjentów zgłaszających się na Oddział Bólu Klatki Piersiowej dużego szpitala uniwersyteckiego. Po rutynowej flebotomii EV są izolowane z osocza za pomocą ultrawirowania różnicowego. Wzbogacenie specyficznych białek markerowych EV w izolatach EV jest wizualizowane za pomocą immunoblottingu, a średni rozkład wielkości i stężenia EV w osoczu są określane ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Wreszcie, ultrasprawna chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas jest wykorzystywana do bezznacznikowej analizy proteomu EV. Protokół ten zapewnia zatem kompleksowe podejście do badania i wykorzystania EV pochodzących z osocza jako potencjalnych nośników krytycznych informacji biologicznych, a także do zbadania ich potencjału jako nowych biomarkerów.

EV wyizolowano z próbek osocza (n = 3) pacjentów bez jawnej choroby sercowo-naczyniowej, a także z próbek pacjentów z zawałem mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI; n = 2), stosując uznany protokół różnicowego ultrawirowania. Prawidłową separację EV z osocza potwierdzono za pomocą immunoblottingu białek wzbogaconych w EV: TSG-101, anneksyny 5 (Anx5) oraz CD9 w izolatach EV w porównaniu z osoczem pozbawionym EV od tych samych pacjentów (Rysunek 1A). Transferyna, służąca jako kon...

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...

Krążące pęcherzyki zewnątrzkomórkowe jako biomarkery to stosunkowo nowa dziedzina w badaniach nad biomarkerami o ogromnym potencjale. Nasz protokół ma na celu zapewnienie praktycznego podejścia do wdrażania odkrywania i wykrywania biomarkerów związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi na oddziale ratunkowym. Pojawiające się dowody wykazały, że ładunek molekularny znajdujący się w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych i krążeniu zawiera białka i RNA, które są interesujące w wielu kontekstach chorobowych.Kilka nowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, zamkniętych biomarkerów powiązano z diagnostyką i rokowaniem różnych jednostek chorób sercowo-naczyniowych. Głównymi wyzwaniami w dziedzinie odkrywania biomarkerów krążących pęcherzyków zewnątrzkomórkowych są zachowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i akwizycja osocza w zależności od dynamiki uwalniania EV. W związku z tym konieczny jest rygorystyczny protokół wbudowany w rutynę kliniczną, aby uniknąć degradacji EV i utrzymać powtarzalne wyniki, szczególnie w przypadku stosowania metod analizy na szeroką skalę, takich jak proteomika.Odkrycie biomarkerów białkowych zamkniętych w krążącej EV jest silnie zależne od czasu początkowego pobrania krwi w stosunku do wystąpienia objawów oraz czasu przechowywania próbki ze względu na naturalną degradację EV. Protokół ten oferuje praktyczny protokół izolacji EV osocza i wprowadzenia go do analizy proteomicznej, który można zintegrować z przepływem pracy klinicznej na oddziale ratunkowym. Nasze nadchodzące badania będą koncentrować się na integracji różnych grup pacjentów w naszej metodologii, wśród których są pacjenci z niewyrównaną niewydolnością serca, arytmią lub kardiomiopatią tachykardiologiczną, a także badania podłużne pacjentów poddawanych operacji pomostowania.Korzystając z tego protokołu, dążymy do zidentyfikowania nowych biomarkerów związanych z EV, które przyczyniają się do diagnozowania i prognozowania wyżej wymienionych patologii. Aby rozpocząć wirowanie ludzkiego osocza krwi, za pomocą ultra wirówki z wirnikiem o stałym kącie bez pękania. Po opadnięciu szczątków i ciała apoptotycznego przenieś supernatant do nowej probówki i ultra wiruj w temperaturze 100 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez pękania w celu wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Ostrożnie wyjmij probówkę po ultrawirowaniu. Za pomocą pipety elektronicznej delikatnie odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra osocza zubożonego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Przełącz się na pipetę o pojemności 1000 mikrolitrów, aby ostrożnie odpipetować pozostałe osocze bez naruszania osadu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Podczas pipetowania należy stopniowo przechylać rurkę, aby upewnić się, że nie pozostało osocze i ponownie zawiesić osad w PBS. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lodowatym PBS w różnych proporcjach, aby uzyskać końcowy zakres zliczania od 10 do 100 nanocząstek na klatkę podczas śledzenia. Włącz przyrząd NTA i uruchom odpowiednie oprogramowanie na podłączonym komputerze.Włóż komorę do trumny laserowej i kliknij uruchom kamerę, aby ją aktywować. Pobrać jeden mililitr PBS do strzykawki i podłączyć go do przedniej rurki. Dokładnie przepłucz system przewodów, upewniając się, że w komorze nie pozostały pęcherzyki powietrza.Monitoruj kamerę, aby wykryć wszelkie pęcherzyki powietrza lub cząstki zanieczyszczeń. Teraz narysuj przygotowane rozcieńczenie robocze pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do jednomililitrowej strzykawki i wstrzyknij je do komory. Przejdź do kart przechwytywania i przetwarzania, aby dostosować wzmocnienie ekranu do jasności monitora.Zmodyfikuj poziom kamery, aby poprawić różnicowanie nanocząstek na ekranie. Ustaw odpowiedni próg wykrywania w zakładce procesu, aby odróżnić cząstki od szumu tła. Ustaw ostrość aparatu za pomocą pokrętła ostrości po obu stronach instrumentu, aż nanocząsteczki staną się ostre na ekranie.Po ustawieniu stałej temperatury 22 stopni Celsjusza dla wszystkich pomiarów w ustawieniach sprzętowych, kliknij przycisk uruchom, aby rozpocząć pomiar. Nagraj co najmniej trzy filmy wideo po 30 sekund każdy dla każdego przykładowego przebiegu. Kliknij zmień, aby wprowadzić współczynnik rozcieńczenia próbek, a na koniec kliknij eksport, aby zapisać wyniki.Korzystając z analizy śledzenia nanocząstek, zidentyfikowano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i zwizualizowano je na podstawie brownie i ruchu. Analiza wykazała średnie stężenie cząstek od 1,2 razy 10 do potęgi 10 cząstek na mililitr w osoczu zdrowych osób, co wykazało obecność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Średni rozmiar pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osocza zmierzono na 184,7 nanometrów, co jest zgodne z typowymi wymiarami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

isolation-characterization-proteomic-analysis-plasma-derived

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Niniejszy film przedstawia skuteczną technikę różnicowania i preparowania poszczególnych półprzezroczystych struktur ciała szklistego ludzkiego oka w materiale pośmiertnym.

Disekcja elementów ludzkiego ciała szklistego do analizy proteomicznej

Poznaj metodę izolacji i analizy proteomicznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza krwi w celu odkrywania biomarkerów sercowo-naczyniowych. Protokół zapewnia niezawodność w warunkach klinicznych.

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Przeglądaj więcej filmów