Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium
1 listopada 2024
Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.
Cienkie endometrium jest powszechnie uznawane za krytyczną przyczynę niepłodności. Badania nad patogenezą cienkiego endometrium opierają się na modelach zwierzęcych, przy czym wybór odpowiedniego modelu ma kluczowe znaczenie. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który tworzy wiarygodny i powtarzalny cienki model endometrium u myszy.
Operacja jest traumatyczna, ponieważ musimy przeprowadzić sekcję myszy i wystawić róg macicy myszy na manipulację. Niewłaściwa operacja może spowodować infekcję, a nawet doprowadzić do śmierci myszy. Rzeczywiście, przed operacją eksperymentalną potrzebne jest staranne szkolenie i doświadczenie.
Udało nam się opracować model endometrium z czasem infuzji od jednej do trzech minut, aby odtworzyć różne stopnie objawów cienkiej endometrium obserwowanych w przypadkach klinicznych. Dzięki temu możemy tworzyć modele o różnych poziomach uszkodzeń, w zależności od konkretnych potrzeb naszych badań. Metoda zastosowana w naszym protokole ma tę zaletę, że jest niskokosztowa, odpowiednia, a także ma okres eksperymentalny.
Bada mechanizm patologiczny i leczenie w trzech początkowych w porównaniu z innymi technikami. Na początek umieść znieczuloną mysz na wznak na rozgrzanym stole operacyjnym i za pomocą taśmy medycznej zabezpiecz kończyny myszy. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w jamie brzusznej, znajdujące się około centymetra od ujścia cewki moczowej, rozciągające się do jamy otrzewnej.
Delikatnie odsuń wnętrzności na bok sterylnymi kleszczami, aby zlokalizować macicę. Odsłoń prawy róg macicy i załóż klamry hemostatyczne na bliższym końcu w pobliżu szyjki macicy i na dystalnym końcu w pobliżu jajnika. Za pomocą strzykawki o rozmiarze 25 wkraść około 50 mikrolitrów 95% etanolu do jamy macicy, trzymając igłę równolegle do rogu macicy.
Strzykawkę należy utrzymywać przez jedną do pięciu minut, w zależności od potrzeb. Następnie należy pobrać etanol z jamy macicy i przepłukać jamę macicy sterylnym roztworem soli fizjologicznej pięć razy, aby usunąć pozostały etanol. Teraz usuń zaciski hemostatyczne i przywróć macicę i wnętrzności do ich pierwotnej pozycji.
Za pomocą wchłanialnych szwów chirurgicznych 5/0 zszyj otrzewną, a następnie naskórek. Na początek umieść poddany eutanazji cienki model myszy endometrium na stole sekcyjnym i przetnij szwy za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić macicę. Następnie za pomocą kleszczy chirurgicznych należy ostrożnie usunąć całą macicę i oderwać macicę od otaczających wnętrzności.
Natychmiast usuń oba rogi macicy i podziel każdy róg na trzy do czterech małych segmentów. Umieść tkanki macicy w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu pobranym w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki. Umieścić próbki utrwalone formaliną w kasetach na tkanki i przenieść kasety tkankowe przez szereg stężeń etanolu, a następnie ksylenu i parafiny.
Napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 stopni Celsjusza. Użyj podgrzanych kleszczy, aby szybko przenieść naciekane segmenty tkanki z kasety do zatapiania do formy woskowej. Gdy segmenty tkanki zostaną prawidłowo ustawione, umieść spód kasety do zatapiania na wierzchu formy histologicznej.
Następnie umieść formę bezpośrednio na płycie chłodzącej ustawionej na cztery stopnie Celsjusza na co najmniej 20 minut, aby parafina zastygła. Następnie wyjmij próbkę z formy i użyj trymera do parafiny, aby przyciąć nadmiar wosku wokół niej. Grubość endometrium i liczba gruczołów endometrialnych istotnie zmniejszyły się w grupie jedno-, dwu- i trzyminutowej w porównaniu z grupą kontrolną.
W grupie cztero- i pięciominutowej zaobserwowano silne zrosty macicy i prawie niewidoczną jamę macicy, nie stwierdzono też żadnych gruczołów endometrialnych. Zwłóknienie endometrium nasilało się wraz z czasem trwania infuzji etanolu, na co wskazuje nadmierne barwienie w grupach od jednej do pięciu minut w porównaniu z grupą kontrolną.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje krytyczny problem cienkiego błony śluzowej endometrium oraz jego powiązania z niepłodnością poprzez opracowanie wiarygodnego i powtarzalnego modelu uszkodzenia endometrium u myszy. Protokół polega na wstrzyknięciu 95% etanolu do macicy myszy na 1-3 minuty, co skutecznie symuluje różne stopnie objawów cienkiego endometrium obserwowanych w przypadkach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Niepłodność
- Patologia błony śluzowej macicy
- Modele zwierzęce
Wprowadzenie
- Cienkie błona śluzowa endometrium jest uznawana za główną przyczynę niepłodności.
- Zrozumienie jej patogenezy opiera się na zastosowaniu odpowiednich modeli zwierzęcych.
- Praca ze zwierzętami wymaga startego przeszkolenia w celu zminimalizowania ryzyka dla badanych osobników.
Zastosowane metody
- Protokół wstrzykiwania etanolu w celu wywołania uszkodzeń błony śluzowej endometrium
- Model mysi do oceny stanu błony śluzowej endometrium
- Techniki histologiczne do analizy struktury błony śluzowej endometrium
Główne wyniki
- Osiągnięcie sukcesu w tworzeniu modeli cienkiego endometrium o różnym stopniu zaawansowania w zależności od czasu infuzji etanolu.
- Znaczący spadek grubości endometrium oraz liczby gruczołów w grupach poddanych działaniu preparatu.
- Stwierdzenie zwiększonego włóknienia endometrium przy dłuższym czasie infuzji etanolu.
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje metodę niezawodnego tworzenia modeli cienkiego błony śluzowej endometrium u myszy.
- Wyniki te są istotne dla przyszłych badań nad niepłodnością i schorzeniami endometrium.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Opracowanie powtarzalnego modelu mysiego z cienkim endometrium wypełnia istotną lukę w badaniach nad niepłodnością, umożliwiając kontrolowaną analizę patologii błony śluzowej macicy. Model ten wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w procesie odkrywania nowych terapii w obszarze zdrowia reprodukcyjnego. Jego niezawodność i skalowalność sprawiają, że stanowi on podstawowe narzędzie do przedklinicznej oceny potencjalnych interwencji ukierunkowanych na regenerację endometrium.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów uszkodzenia błony śluzowej endometrium istotnych w kontekście niepłodności.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w regenerację endometrium.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie klinicznie obserwowanego ścieńczenia endometrium.
- Zapewnia platformę do badań opartych na hipotezach dotyczących ścieżek naprawy endometrium.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Zapewnia zestandaryzowany system in vivo do oceny potencjalnych terapeutyków.
- Gwarantuje powtarzalność uszkodzeń błony śluzowej endometrium w kohortach eksperymentalnych.
- Generuje ilościowe wyniki histologiczne służące do opracowania i optymalizacji testów.
- Umożliwia ocenę zależności dawka-odpowiedź oraz efektów w czasie w kontrolowanych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z patologią istotną dla choroby, obserwowaną w ludzkich przypadkach cienkiego błony śluzowej macicy.
- Wspiera ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczne testy skuteczności.
- Stanowi punkt odniesienia dla oceny translacyjnych biomarkerów naprawy endometrium.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie klinicznie istotnych punktów końcowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model mysi wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych w obszarze zdrowia reprodukcyjnego, umożliwiając wczesną weryfikację hipotez, walidację celów oraz ocenę kandydatów w badaniach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia badania mechanistyczne nad uszkodzeniem i regeneracją błony śluzowej endometrium.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną platformę do oceny skuteczności in vivo nowych związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki, takie jak grubość endometrium, liczba gruczołów oraz ocena stopnia włóknienia.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w systemie odpowiadającym przebiegowi choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny i adaptacyjny model dla różnorodnych programów badawczych nad endometrium.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów i szlaków dla regeneracji błony śluzowej endometrium.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie in vivo przy niskiej śmiertelności i minimalnych zlewiskach zakłócających wyniki.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go w procesie rozwoju kandydatów na leki wspierające zdrowie reprodukcyjne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów terapeutycznych celujących w patologię endometrium w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia chirurgicznego i rygorystycznego przeszkolenia operatora w celu zminimalizowania ryzyka dla zwierząt.
- Wymaga dostępu do infrastruktury do przetwarzania histologicznego i analizy ilościowej.
- Wymaga ścisłej standaryzacji procedur w celu zapewnienia powtarzalności między badaniami.
- Możliwość dostosowania do różnego stopnia uszkodzenia błony śluzowej endometrium poprzez modulację czasu infuzji etanolu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują patologię specyficzną dla modelu oraz konieczność walidacji krzyżowej z danymi ludzkimi.
