Name: Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Poznaj protokół wstrzyknięcia etanolu do macicy myszy w celu stworzenia niezawodnego modelu cienkiego endometrium. Ta metoda pozwala symulować różne stopnie uszkodzenia endometrium obserwowane w przypadkach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy anonimowym recenzentom za ich ważne i pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez Shenzhen Science and Technology Project (No. JCYJ20220818103207016) oraz Fundacja Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych i Stosowanych w Guangdong (nr 2024A1515010478).

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Położniczo-Ginekologicznego Shenzhen Zhongshan (dawniej Szpitala Urologicznego Shenzhen Zhongshan), gdzie przeprowadzono wszystkie eksperymenty na zwierzętach. W badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6 (wiek 6-8 tygodni, waga 18-20 g). Wszystkie zwierzęta trzymano w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF) w tym samym pomieszczeniu i aklimatyzowano przez tydzień przed eksperymentami w pomieszczeniu bez określonych patogenów w temperaturze (22 ± 1) °C w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zapewniono im swobodny dostęp do żywności i wody. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Identyfikacja rui
UWAGA: Faza rui u myszy jest porównywalna do późnej fazy lutealnej u ludzi, z dość grubą wyściółką endometrium w tym czasie. Wybór myszy w rui do indukcji modelu zapewnia, że są one w stosunkowo stałym stanie fizjologicznym. Dodatkowo wyniki ścieńczenia endometrium są bardziej wyraźne, gdy grubość endometrium jest stosunkowo gruba. Szczegółowe informacje na temat tej procedury można znaleźć w poprzednio opublikowanych raportach25,26.
<ol>
	<li>Przygotuj 20 μl soli fizjologicznej za pomocą pipety. Chwytając za uszy myszy po obu stronach i mocując ogonek myszy, delikatnie włóż końcówkę pipety do otworu pochwy na głębokość około 2 mm. Wlej 20 μl soli fizjologicznej do pochwy i delikatnie spłukuj przez 5 cykli.</li>
	<li>Odjąć sól fizjologiczną i przenieść ją równomiernie na czyste szkiełko. Pozwól mu odparować i wyschnąć naturalnie w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nałóż 30 μl etanolu na każde szkiełko, aby utrwalić komórki. Pozostawić etanol do odparowania przez 5 minut, aż szkiełko wyschnie.</li>
	<li>Nanieść 50 μl roztworu barwiącego fioletu krystalicznego na każde szkiełko i barwić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Opłucz każde szkiełko wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar barwnika i zmniejszyć niespecyficzne przebarwienia.</li>
	<li>Obserwuj morfologię komórek i określ proporcje typów komórek pod mikroskopem.</li>
	<li>Obserwuj cykle rujowe myszy dwa razy z rzędu, aby zapewnić stabilność. Do eksperymentu wybierz myszy w trzeciej rui. 
	UWAGA: Cykl rujowy u myszy trwa zwykle 4-5 dni i jest podzielony na cztery etapy: proestrus, estrus, metestrus i diestrus. Proestrus trwa około 24 godzin i charakteryzuje się okrągłymi lub owalnymi jądrzastymi komórkami nabłonkowymi (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A). Ruja trwa od 12 godzin do 48 godzin i charakteryzuje się głównie jądrzastymi zrogowaciałymi komórkami nabłonkowymi (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2B). Metestrus trwa do 24 godzin i charakteryzuje się mieszanką bezjądrzastych zrogowaciałych komórek nabłonkowych i neutrofili (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3C). Diestrus trwa od 48 godzin do 72 godzin i charakteryzuje się kombinacją neutrofili, jądrzastych komórek nabłonkowych i kilku jądrzastych komórek rogowacących (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2D).</li>
</ol>
2. Projektowanie grupowe
UWAGA: Aby ocenić wpływ różnych czasów infuzji 95% etanolu na stabilność modelu TE, ustalono sześć grup leczenia. Jedna grupa przeszła pozorowaną operację bez podawania etanolu, aby służyć jako kontrola efektów zabiegowych. Myszy z TE wywołanym etanolem zostały losowo podzielone na pięć grup leczonych na podstawie czasu infuzji (n = 5 na grupę) w następujący sposób:
<ol>
	<li>Grupa 1-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 1 minutę.</li>
	<li>Grupa 2-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 2 minuty.</li>
	<li>Grupa 3-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 3 minuty.</li>
	<li>Grupa 4-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 4 minuty.</li>
	<li>Grupa 5-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 5 minut.</li>
</ol>
3. Indukcja modelu TE u myszy
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą urządzenia do znieczulania z 5% izofluranem i 100% tlenem przez 3 minuty (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem). Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1%-3% izofluranu za pomocą stożka nosowego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Monitoruj częstość oddechów za pomocą szczypania palca u nogi przez cały zabieg.</li>
	<li>Użyj taśmy medycznej, aby zabezpieczyć kończyny myszy i utrzymuj je w pozycji leżącej na stole operacyjnym nagrzanym kocem elektronicznym. Delikatnie pociągnij lekko za język myszy, aby zapobiec niedrożności dróg oddechowych. 
	UWAGA: Utrzymywanie myszy w cieple podczas operacji pomaga utrzymać funkcje odpornościowe i krążenie krwi oraz zapobiega krzepnięciu. Dodatkowo wyciągnięcie języków myszy zapewnia udrożnienie dróg oddechowych, aby uniknąć uduszenia się podczas znieczulenia.</li>
	<li>Nałóż krem do depilacji zwierzęcej na dolną część brzucha myszy na 3 minuty. Usuń włosy czystymi chusteczkami. Zdezynfekuj obszar 75% etanolem i jodoforem.</li>
	<li>Wykonaj 1 cm nacięcie w jamie brzusznej, 1 cm od ujścia cewki moczowej. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby przedłużyć nacięcie aż do jamy otrzewnej.</li>
	<li>Delikatnie odsuń wnętrzności na bok za pomocą sterylnych kleszczy, aby zlokalizować macicę i odsłonić prawy róg macicy. Zastosuj klamry hemostatyczne na bliższym końcu w pobliżu szyjki macicy i na dystalnym końcu w pobliżu jajnika. 
	UWAGA: Zaciśnięcie obu końców rogu macicy zapewnia brak wycieku podczas wstrzykiwania etanolu, zapobiegając uszkodzeniu szyjki macicy, pochwy i jajnika.</li>
	<li>Wkraść około 50 μl 95% etanolu27 do jamy macicy za pomocą strzykawki 25 G, z igłą ułożoną równolegle do kierunku rogu macicy. Włóż igłę do jamy macicy pod kątem 30 stopni. Utrzymywać strzykawkę przez 1 minutę, 2 minuty, 3 minuty, 4 minuty lub 5 minut, w zależności od przypadku. Pobrać etanol i przepłukać jamę macicy sterylnym roztworem soli fizjologicznej 5 razy, aby usunąć pozostały etanol. Podobnie, wkraść równą objętość sterylnego soli fizjologicznej do lewego rogu macicy jako kontrolę, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami. 
	UWAGA: Upewnij się, że igła strzykawki jest równoległa do kierunku rogu macicy. Należy unikać wkładania igły pod zbyt dużym kątem, aby uniemożliwić jej przejście przez cały róg macicy. Wycofać etanol tak całkowicie, jak to możliwe, aby uniknąć trwałych uszkodzeń i niestabilności eksperymentalnej.</li>
	<li>Usuń zaciski i przywróć macicę i wnętrzności do ich pierwotnej pozycji.</li>
	<li>Zszyj otrzewną wchłanialnymi szwami chirurgicznymi z poliglikolidu 5-0, a następnie zszyj naskórek niewchłanialnymi szwami chirurgicznymi z polipropylenu 5-0.</li>
	<li>Zdezynfekuj nacięcie 75% etanolem i jodoforem, a następnie wróć do klatki zwierząt. Po operacji uważnie obserwuj, czy tętno myszy stopniowo i stabilnie wzrasta, aż mysz w pełni wyzdrowieje i będzie mogła normalnie się poruszać (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-H). 
	UWAGA: Doustny lek przeciwbólowy (3,2 mg/ml paracetamolu w wodzie do picia) podawano w dniu poprzedzającym operację i kontynuowano przez pozostałą część badania.</li>
	<li>Obserwuj myszy o 9:00 i 15:00 każdego dnia i dezynfekuj nacięcie jodoforem, aby upewnić się, że są w dobrym stanie.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie kręgosłupa szyjnego w głębokim znieczuleniu 7 dni po leczeniu 95% etanolem (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem).</li>
	<li>Przetnij szwy, aby odsłonić macicę za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli usuń całą macicę za pomocą kleszczy chirurgicznych. Odłącz macicę od otaczających wnętrzności.</li>
	<li>Natychmiast usuń oba rogi macicy i podziel każdy róg na 3-4 małe segmenty.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Zachowaj tkankę macicy w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny w celu utrwalenia.</li>
</ol>
5. Odwodnienie tkanek
UWAGA: Odwodnienie tkanek odbywa się za pomocą automatycznego procesora tkanek (zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Umieść próbki utrwalone formaliną w kasetach na tkanki.</li>
	<li>Przenieś kasety tkankowe przez serię rosnących stężeń etanolu, aby odwodnić tkankę w następujący sposób: 70% etanolu przez 1 godzinę, 85% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu dwa razy (po 1 godzinie) i 100% etanolu dwa razy (po 1 godzinie).</li>
	<li>Zastąp etanol 100% ksylenem (135 minut przy pierwszym zanurzeniu, 20 minut przy każdym kolejnym zanurzeniu dwukrotnie), aby upewnić się, że parafina wniknie w tkankę.</li>
	<li>Zanurzyć kasety z tkankami w parafinie w inkubatorze w temperaturze 60-65 °C (3 razy po 140 minut każda) i utrzymywać kasety w cieple aż do ich zatopienia.</li>
</ol>
6. Osadzanie parafiny
UWAGA: Wykonaj te kroki za pomocą modułowego centrum osadzania tkanek (zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 °C.</li>
	<li>Użyj podgrzanych kleszczyków, aby szybko przenieść infiltrowane segmenty z kasety do zatapiania do formy woskowej, upewniając się, że przekrój każdego segmentu spoczywa równolegle do podstawy formy.</li>
	<li>Po prawidłowym ustawieniu segmentów umieść spód kasety do zatapiania na wierzchu formy histologicznej.</li>
	<li>Umieścić formę bezpośrednio na płycie chłodzącej ustawionej na 4 °C na co najmniej 20 minut, aby parafina mogła zastygnąć.</li>
	<li>Po zestaleniu się wosku wyjmij próbkę z formy i użyj trymera do parafiny, aby przyciąć nadmiar wosku wokół niej.</li>
</ol>
7. Cięcie parafiny
<ol>
	<li>Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 42 °C. Przed cięciem umieścić bloki parafiny na zimnym talerzu, aby mogły ostygnąć i łatwiej było je przycinać.</li>
	<li>Zawiesić próbkę zatopioną w parafinie na obrotowym mikrotomie powierzchnią tkanki skierowaną do góry.</li>
	<li>Ciąć 20 μm na raz, aby usunąć nadmiar parafiny pokrywającej tkankę, aż do osiągnięcia pożądanej płaszczyzny tkanki.</li>
	<li>Wycinaj jednorazowo odcinki o grubości 4 μm.</li>
	<li>Przenieść wstęgę z podziałem parafiny do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 2 minuty.</li>
	<li>Podnieś skrawki z powierzchni wody i po rozłożeniu umieść je na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Suszyć szkiełka w inkubatorze w temperaturze 60 °C przez 30 minut.</li>
</ol>
8. Barwienie hematoksyliną i eozyną
UWAGA: Barwienie Hematoksyliną i Eozyną odbywa się za pomocą automatycznej maszyny do barwienia szkiełek (patrz Tabela Materiałów).
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki z wyprzedzeniem przed rozpoczęciem procedury barwienia.</li>
	<li>Namocz szkiełka w 100% ksylenie odpowiednio przez 10 minut, 5 minut i 3 minuty.</li>
	<li>Uwodnić szkiełka w zmniejszającej się serii etanolu w wodzie dejonizowanej w następujący sposób: 100% etanolu, 95% etanolu (dwukrotnie) i 80% etanolu przez 2 minuty każda.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Szkiełka należy barwić w roztworze hematoksyliny przez 10 minut. Płukać szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 1 minutę lub do momentu, gdy woda przestanie być fioletowa.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 0,5% kwaśnym roztworze do różnicowania etanolu dwukrotnie na 3-5 s za każdym razem. Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 1 min.</li>
	<li>Umieść szkiełka w buforze do niebieszczenia (1% roztwór amoniaku) na 1 minutę. Płucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 1 minutę.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka 80% etanolem, a następnie zanurzyć je w roztworze roboczym eozyny-Y na 10 sekund.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do 95% etanolu i płucz dwukrotnie przez 10 sekund każde. Następnie przenieś szkiełka do absolutnego etanolu i odwadniaj je dwukrotnie przez 10 sekund każde.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 100% ksylenie, aby oczyścić tkankę dwukrotnie, na 2 minuty każde.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce i uszczelnij je naturalną żywicą.</li>
</ol>
9. Barwienie Massona
<ol>
	<li>Odparafinować tkankę, mocząc szkiełka w 100% ksylenie odpowiednio przez 10 minut, 5 minut i 3 minuty.</li>
	<li>Po odparafinowaniu namocz szkiełka w malejącej serii etanolu w wodzie dejonizowanej: 100% etanolu, 95% etanolu (dwukrotnie) i 80% etanolu, na 2 minuty każda.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka w roztworze żelaza hematoksyliny Weigerta przez 5 minut, a następnie umyć szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 30 sekund.</li>
	<li>Różnicować kolory barwionych struktur tkankowych, inkubując szkiełka w 1% alkoholu kwasu solnego przez 15 s.</li>
	<li>Płucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 30 s.</li>
	<li>Inkubuj tkankę w roztworze do barwienia przez 3-5 minut.</li>
	<li>Płucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 30 s.</li>
	<li>Umieść szkiełka w roztworze fuksyny kwasu ponceau na 5-10 min. 
	UWAGA: Wymieszaj wodę dejonizowaną i roztwór słabego kwasu w stosunku 2:1, aby przygotować roztwór roboczy słabego kwasu.</li>
	<li>Płukać szkiełka roztworem roboczym słabego kwasu przez 30 s.</li>
	<li>Różnicować tkankę w roztworze kwasu fosfomolibdenowego przez 1-2 minuty, a następnie płukać skrawki roztworem roboczym słabego kwasu przez 30 sekund.</li>
	<li>Wybarwieć skrawki tkanki roztworem błękitu anilinowego przez 1-2 minuty.</li>
	<li>Szybko odwodnij skrawki tkanki w 95% etanolu przez 2-3 s, a następnie 100% etanolu dwa razy przez 5-10 s każdy. Wyczyść szkiełka w ksylenie dwukrotnie, po 1-2 minuty każde.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce i uszczelnij je naturalną żywicą.</li>
	<li>Odcedź nadmiar żywicy i pozostaw szkiełka do wyschnięcia.</li>
</ol>
10. Obrazowanie i analiza
<ol>
	<li>Przechwytywanie obrazów przekrojów za pomocą systemu skanera slajdów. 
	UWAGA: Użyj obiektywu 4x lub 10x, aby uzyskać przegląd sekcji; Aby uzyskać bardziej szczegółowe obrazy, użyj obiektywów od 20x do 100x.</li>
	<li>Wykonaj analizę ilościową grubości endometrium, liczby gruczołów i stopnia zwłóknienia tkanek za pomocą platformy do analizy obrazu HALO. 
	UWAGA: Średnią grubość uzyskuje się poprzez pomiar pionowej odległości od jamy macicy do mięśniówki macicy w 5 losowo wybranych polach widzenia.</li>
</ol>
11. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).</li>
	<li>Oceń istotność statystyczną różnic eksperymentalnych między grupą kontrolną a grupą modelową, wykonując najpierw test rozkładu normalnego.</li>
	<li>Przedstaw dane, które mają rozkład normalny jako średnia ± SEM.</li>
	<li>Analizuj dane z różnych grup leczenia za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA. Dostosuj do wielokrotnych porównań liczby badanych alleli w każdym locus przy użyciu metody Bonferroniego. Uznajmy, że wartość P <0,05 jest statystycznie istotna.</li>
</ol>

Optimized Thin Endometrium Mouse Model with Low Mortality and Minimal Adhesions

<ol><li>Mahajan, N., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endometrium+in+assisted+reproductive+technology%3A+How+thin+is+thin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">The endometrium in assisted reproductive technology: How thin is thin.</a> J Hum Reprod Sci. 9 (1), 3-8 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+endometrium+is+associated+with+the+risk+of+hypertensive+disorders+of+pregnancy+in+fresh+IVF%2FICSI+embryo+transfer+cycles%3A+A+retrospective+cohort+study+of+9%2C266+singleton+births%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Thin endometrium is associated with the risk of hypertensive disorders of pregnancy in fresh IVF/ICSI embryo transfer cycles: A retrospective cohort study of 9,266 singleton births.</a> Reprod Biol Endocrinol. 19 (1), 55(2021).</li>
<li>Liu, K. E., Hartman, M., Hartman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+thin+endometrium+in+assisted+reproduction%3A+A+clinical+practice+guideline+from+the+Canadian+Fertility+and+Andrology+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Management of thin endometrium in assisted reproduction: A clinical practice guideline from the Canadian Fertility and Andrology Society.</a> Reprod Biomed Online. 39 (1), 49-62 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Tang, Z., Teng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+advances+in+the+treatment+of+thin+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">New advances in the treatment of thin endometrium.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1269382(2024).</li>
<li>Saad-Naguib, M. H., Kenfack, Y., Sherman, L. S., Chafitz, O. B., Morelli, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+receptivity+of+thin+endometrium%3A+Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Impaired receptivity of thin endometrium: Therapeutic potential of mesenchymal stem cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1268990(2023).</li>
<li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+endometrial+niche+of+human+thin+endometrium+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deciphering the endometrial niche of human thin endometrium at single-cell resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (8), e2115912119(2022).</li>
<li>Gharibeh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+in+thin+endometrium+and+Asherman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy in thin endometrium and Asherman syndrome.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 33(2022).</li>
<li>Lei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+microspheres+for+the+treatment+of+a+thin+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Angiogenic microspheres for the treatment of a thin endometrium.</a> ACS Biomater Sci Eng. 7 (10), 4914-4920 (2021).</li>
<li>Maekawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+endometrium+transcriptome+analysis+reveals+a+potential+mechanism+of+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Thin endometrium transcriptome analysis reveals a potential mechanism of implantation failure.</a> Reprod Med Biol. 16 (2), 206-227 (2017).</li>
<li>Xu, L., Fan, Y., Wang, J., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+intercellular+communication+and+metabolic+signaling+pathways+in+thin+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional intercellular communication and metabolic signaling pathways in thin endometrium.</a> Front Physiol. 13, 1050690(2022).</li>
<li>Hu, J., Song, K., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+menstrual+blood-derived+stem+cells+on+endometrial+injury+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of menstrual blood-derived stem cells on endometrial injury repair.</a> Mol Med Rep. 19 (2), 813-820 (2019).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+murine+uterine+damage+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient production of murine uterine damage model.</a> Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 119-129 (2019).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+repair+thin+endometrium+and+restore+fertility+based+on+menstruation-derived+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method to repair thin endometrium and restore fertility based on menstruation-derived stem cell.</a> Reprod Sci. 31 (6), 1662-1673 (2024).</li>
<li>Hu, J., Yuan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+C-kit+and+telomerase+in+a+rat+model+of+chronic+endometrial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of C-kit and telomerase in a rat model of chronic endometrial ischemia.</a> Med Sci Monit. 17 (4), Br103-Br109 (2011).</li>
<li>Wang, G., Ren, C., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+repair+and+receptivity+of+damaged+endometrium+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Obstet+Gynaecol+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on repair and receptivity of damaged endometrium in rats.</a> J Obstet Gynaecol Res. 47 (9), 3223-3231 (2021).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-protected+exosome-hydrogel+for+facilitating+endometrial+regeneration%2C+fertility+restoration%2C+and+live+birth+of+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-protected exosome-hydrogel for facilitating endometrial regeneration, fertility restoration, and live birth of offspring.</a> Small. 17 (11), e2007235(2021).</li>
<li>López-Martínez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+endometrial+hydrogels+with+growth+factors+promote+tissue+regeneration+and+restore+fertility+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Bioengineered endometrial hydrogels with growth factors promote tissue regeneration and restore fertility in murine models.</a> Acta Biomater. 135, 113-125 (2021).</li>
<li>Haghighi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+lipid-based+drug+delivery+system+%28phytosolve%29+for+treatment+of+a+thin+endometrium+in+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Angiogenic lipid-based drug delivery system (phytosolve) for treatment of a thin endometrium in animal model.</a> Tissue Cell. 90, 102481(2024).</li>
<li>Saleem Raheem, S., Falah Hasan, H., Hashim Abid Ali, A., Mansour Jasim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+histopathological+changes+of+induced+thin+layer+endometrium+by+pentoxifylline+and+pentoxifylline-loaded+poly+lactic-co-glycolic+acid+on+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Razi+Inst%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of histopathological changes of induced thin layer endometrium by pentoxifylline and pentoxifylline-loaded poly lactic-co-glycolic acid on female rats.</a> Arch Razi Inst. 78 (6), 1762-1770 (2023).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal+model+of+intrauterine+adhesions+after+surgical+abortion+and+curettage+in+pregnant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal model of intrauterine adhesions after surgical abortion and curettage in pregnant rats.</a> Ann Transl Med. 8 (4), 56(2020).</li>
<li>Bazoobandi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Asherman%27s+syndrome+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Infertil%22%5BJournal%5D)">Induction of Asherman's syndrome in rabbit.</a> J Reprod Infertil. 17 (1), 10-16 (2016).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effect+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+rat+models+of+intrauterine+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effect of human amniotic epithelial cells in rat models of intrauterine adhesions.</a> Cell Transplant. 29, 963689720908495(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+and+mechanisms+of+GM-CSF+on+endometrial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The effects and mechanisms of GM-CSF on endometrial regeneration.</a> Cytokine. 125, 154850(2020).</li>
<li>Yan-Ping, L. Establishment and identification of rat thin endometrium model. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYan-Ping%2C+L+%22Life+Sci+Res%22">Life Sci Res</a>. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:88150888 (2011).</li>
<li>Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+cytology+of+the+laboratory+rat+and+mouse%3A+Review+and+criteria+for+the+staging+of+the+estrous+cycle+using+stained+vaginal+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears.</a> Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).</li>
<li>Quignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+vaginal+smears+to+assess+reproductive+stage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of vaginal smears to assess reproductive stage in mice.</a> Curr Protoc. 3 (9), e887(2023).</li>
<li>Yi, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+cells+or+C-X-C+motif+chemokine+12+%28CXCL12%29+treatment+improve+thin+endometrium+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">marrow-derived cells or C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12) treatment improve thin endometrium in a mouse model.</a> Biol Reprod. 100 (1), 61-70 (2019).</li>
<li>Nakada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+heart+regeneration+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces heart regeneration in adult mice.</a> Nature. 541 (7636), 222-227 (2017).</li>
<li>Mylonas, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+inhibits+renal+regeneration+after+injury+in+mice%2C+with+senolytic+treatment+promoting+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence inhibits renal regeneration after injury in mice, with senolytic treatment promoting repair.</a> Sci Transl Med. 13 (594), eabb0203(2021).</li>
<li>Mckellar, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+integration+of+single-cell+transcriptomic+data+captures+transitional+progenitor+states+in+mouse+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale integration of single-cell transcriptomic data captures transitional progenitor states in mouse skeletal muscle regeneration.</a> Commun Biol. 4 (1), 1280(2021).</li>
<li>Elzat, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+mouse+contusion+spinal+cord+injury+model+based+on+a+minimally+invasive+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique.</a> J Vis Exp. 187, e64538(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

TE charakteryzuje się niewystarczającą proliferacją komórek i dysfunkcjonalnymi komórkami, ściśle związanymi z niepłodnością, nawracającymi poronieniami i nieprawidłowościami łożyska 2,3. Niestety, obecnie nie ma skutecznej terapii TE. Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w badaniu tego schorzenia. W latach 2014-2024 szczury wykorzystano jako organizmy modelowe w 16,4% z 208 000 badań (34 200 badań), a myszy w 22,7% (47 300 badań). Coraz częstsze wykorzystanie myszy w eksperymentach można przypisać ich przewadze nad innymi modelami, w szczególności ich potencjałowi w badaniach nad regeneracją 28,29,30. Biorąc pod uwagę znaczenie spójności modelu, rośnie zapotrzebowanie na bardziej kompatybilne narzędzia do prowadzenia badań z wykorzystaniem myszy jako modeli31.
Powszechne metody indukowania modeli TE, jak opisano w poprzednich badaniach, obejmują drapanie11,12, niedokrwienie14, uraz wywołany termicznie15 i uraz wywołany chemikaliami 16,17,23. Aby ułatwić wykorzystanie modeli zwierzęcych w badaniach TE i położyć podwaliny pod skuteczne leczenie, Gao i wsp.24 najpierw ustalili model TE u szczurów SD, wstrzykując absolutny etanol na 5 minut w celu uszkodzenia endometrium. Chociaż metoda ta ogranicza wzrost endometrium, często prowadzi do poważnych zrostów w jamie brzusznej, przy wskaźniku przeżycia wynoszącym zaledwie 70%.
Wcześniej 95% etanol był stosowany głównie u szczurów ze względu na łatwość aplikacji, ale ta metoda wygenerowała niewiele modeli mysich do badań TE. Po obserwacjach klinicznych, kompleksowym przeglądzie literatury, eksperymentach wstępnych, wielokrotnych dyskusjach i analizach opracowano ulepszoną metodę z krótszym czasem infuzji macicy. Wykwalifikowane techniki pozwalają na wstrzyknięcie 95% etanolu do jamy macicy w celu stworzenia modelu TE o różnym czasie infuzji.
Model mysi przedstawiony w tym badaniu opiera się na zasadach modelu24 Gao. Wprowadzono jednak kilka modyfikacji, w tym skrócenie czasu infuzji etanolu i zwiększenie częstotliwości spłukiwania solą fizjologiczną. W tym modelu macice myszy zostały odsłonięte poprzez rozwarstwienie jamy brzusznej, a 95% etanolu wstrzyknięto po jednej stronie rogów macicy na różne czasy: 1 min, 2 min, 3 min, 4 min i 5 min. Dzięki precyzyjnej kontroli czasu infuzji etanolu i ustandaryzowanej procedurze, uzyskano stabilne dane w eksperymentach na myszach, co zminimalizowało odchylenia wynikające z indywidualnych różnic między myszami.
Wyniki histologiczne wykazują wyraźne zmiany w grubości endometrium, liczbie gruczołów endometrialnych i zwłóknieniu endometrium w różnym stopniu wśród myszy TE, potwierdzając wiarygodność modelu ustalonego w tym badaniu 3,6,9. Warto zauważyć, że gdy czas infuzji etanolu przekraczał 4 minuty lub 5 minut, obserwowano ciężkie zrosty wewnątrzmaciczne (IUA). Odkrycia te sugerują, że mysi model TE można skutecznie ustalić po 1-3 minutach infuzji 95% etanolu, podczas gdy czas infuzji przekraczający 3 minuty może wywołać ciężką wkładkę wewnątrzmaciczną.
Do tej pory opracowano kilka modeli zwierzęcych do badania TE, w tym modele drapania, niedokrwienia, indukowane termicznie i chemicznie. Model wywołany drapaniem, choć łatwiejszy do wykonania, często prowadzi do zrostów wewnątrzmacicznych (IUA), a nie TE. Model TE wywołany niedokrwieniem wymaga znacznie dłuższego czasu trwania niż model indukowany chemicznie, a metoda indukowana termicznie jest bardziej złożona i trudniejsza do wykonania w porównaniu z indukcją chemiczną. Chociaż model indukowany chemikaliami jest efektywny czasowo i stabilny, ma potencjalne ograniczenia, takie jak uraz zwierząt i ryzyko infekcji lub śmierci z powodu niewłaściwej techniki. Problemy te można złagodzić dzięki starannemu szkoleniu i doświadczeniu.
Podsumowując, wyniki pokazują, że mysi model TE można skutecznie ustalić, wstrzykując 95% etanolu do jamy macicy na 1-3 minuty. Podejście to stanowi obiecującą metodę badania mechanizmów patologicznych i procesów naprawczych TE oraz opracowywania skutecznych metod leczenia pacjentów z tym schorzeniem.

Cienkie endometrium (TE) to poważna choroba w położnictwie i ginekologii, która często dotyka kobiety w wieku rozrodczym. TE rozpoznaje się, gdy grubość endometrium wynosi mniej niż 7 mm w badaniu ultrasonograficznym, towarzyszy mu normalna jama macicy i jest ściśle związana z niepowodzeniem ciąży1,2. Szacuje się, że około 1,5%-9,1% kobiet poddawanych leczeniu zapłodnieniem in vitro (IVF) doświadczy TE, co sprawia, że jest to coraz większe wyzwanie w medycynie reprodukcyjnej3,4,5. Najczęstsze przyczyny TE to nieprawidłowa naprawa endometrium po chirurgicznym oddzieleniu zrostów wewnątrzmacicznych (IUA) i łyżeczkowanie, którym często towarzyszy zaburzona dystrybucja naczyń krwionośnych i rzadkie gruczoły6,7,8. Do tej pory mechanizmy komórkowe i molekularne leżące u podstaw TE pozostają niejasne. Odzyskanie endometrium u pacjentek z TE jest czasochłonne, chociaż leczenie estrogenami i terapia aspiryną w niskich dawkach były badane jako potencjalne interwencje9. Dlatego dogłębne badanie patogenezy TE jest najbardziej bezpośrednim podejściem do sprostania wyzwaniom związanym z tym schorzeniem. Jednak badania nad patogenezą TE opierają się na modelach zwierzęcych, co sprawia, że wybór odpowiedniego modelu ma kluczowe znaczenie.
Większość badań histopatologicznych cienkiego endometrium (TE) wykazała, że upośledzona proliferacja komórek nabłonkowych i makrofagów, zmniejszona ekspresja receptorów hormonów steroidowych w jajnikach, nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej i starzenie się komórek są najważniejszymi cechami patologicznymi TE6,9,10. Obecnie opracowano różne modele szczurów naśladujące TE, w tym modele wywołane przez drapanie11,12,13, ischemia14, uraz termiczny15 i uraz chemiczny16,17,18,19. Model szczurzy jest wywoływany przez drapanie endometrium igłą lub cewnikiem, co często skutkuje zrostami wewnątrzmacicznymi (IUA), a nie TE11,12,20,21,22. Opisano również model TE wywołany niedokrwieniem u szczurów, w którym niedokrwienie endometrium uzyskuje się poprzez wykonanie obustronnego podwiązania tętnicy macicznej, co prowadzi do zmniejszenia grubości endometrium. Jednak ta metoda jest czasochłonna, wymaga trzech miesięcy i nie jest powszechnie stosowana do badań14. W modelu wywołanym urazem termicznym sztuczna rurka do inseminacji jest używana do wtłaczania wody podgrzanej o temperaturze 85 °C do jednej strony rogu macicy przez zbieg dwóch stron, co czyni go bardziej złożonym niż inne metody15. Model indukowany chemicznie polega na wstrzyknięciu 95% etanolu do odsłoniętego rogu macicy w celu uszkodzenia całego endometrium. Model ten oferuje zalety niskich kosztów i krótkiego okresu eksperymentalnego do badania mechanizmów patologicznych i leczenia TE, ale jest stosowany głównie u szczurów, a nie u myszy16,17,23. Chociaż istnieją różne modele zwierzęce, zwłaszcza modele szczurów, każdy z nich ma swoje ograniczenia. Mogą symulować tylko niektóre aspekty TE, a niewiele modeli mysich ściśle odwzorowuje charakterystykę choroby TE, a jednocześnie jest wygodnych i wszechstronnych w badaniach.
W tym kontekście, opracowaliśmy nowatorski model cienkiego endometrium (TE), wprowadzając 95% etanolu do jamy macicy przy użyciu podejścia gradientu czasowego ze zmodyfikowaną metodą24 (Rysunek 1). Wyniki wykazały, że u wszystkich myszy pomyślnie rozwinął się TE, gdy czas infuzji wahał się od 1 do 3 minut, wykazując typowe cechy, takie jak zmniejszona grubość endometrium, zmniejszenie gruczołu i zwiększone zwłóknienie endometrium. Odkrycia te sugerują, że nasz mysi model jest odpowiednim narzędziem do badania TE i może służyć jako platforma do opracowywania przyszłych metod leczenia TE.

<table><tbody><tr><td>Aparat anestezjologiczny</td><td>RWD Life Science</td><td>R530</td><td>Mobilny aparat do znieczulenia wziewnego dla małych zwierząt</td></tr><tr><td>0,9% soli fizjologicznej</td><td>Hubei Kelun Pharmaceutical&nbsp;</td><td>C230817A2</td><td>10 mL, zastrzyk medyczny</td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>LIRCON</td><td>6303060031</td><td>500 mL, odczynnik dezynfekujący</td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td><td>64-17-5</td><td>500 mL, odczynnik chemiczny</td></tr><tr><td>Szwy wchłanialne</td><td>Jinhuan Medical</td><td>CR537</td><td>Grubość: 5-0; Długość: 90 cm</td></tr><tr><td>Wodny roztwór amoniaku</td><td>MilliporeSigma</td><td>1336-21-6</td><td>1000 mL, odczynnik chemiczny</td></tr><tr><td>Automatyczny procesor tkanek</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td>100 pudełek do zatapiania może być przetwarzanych jednorazowo</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6&nbsp;</td><td>Centrum Zwierząt Doświadczalnych Południowego Uniwersytetu Medycznego&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>BASO</td><td>BA4024</td><td>1000 mL, służy do barwienia skrawków parafiny, skrawków zamrożonych itp</td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>BASO</td><td>BA4041</td><td>1000 mL, służy do barwienia skrawków parafinowych, skrawków zamrożonych itp</td></tr><tr><td>Platforma analizy obrazu HALO</td><td>Laboratoria</td><td></td> Indica <td>Urządzenie charakteryzuje się łatwością obsługi i skalowalnością, potężnymi możliwościami analitycznymi i najszybszym przetwarzaniem prędkość</td></tr><tr><td>Zaciski hemostatyczne</td><td>HUAYON</td><td>18-5021</td><td>1,8 cm długości całkowitej ze szczęką 0,7 cm</td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne</td><td>HUAYON</td><td>18-5020</td><td>10 cm długości całkowitej</td></tr><tr><td>Mikrotom rotacyjny HistoCore</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1</td><td>Grubość plastra waha się od 1 do 60 &mu; m</td></tr><tr><td>Indorphor</td><td>ADF</td><td>1005</td><td>500 mL, odczynnik dezynfekujący</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-22-10</td><td>100 mL, składnik aktywny 100% izofluranu</td></tr><tr><td>Barwienie trichromowe Massona</td><td>SOLARBIO</td><td>G1340</td><td>7 &times; 100 mL na 100 testów</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Gene Tech</td><td>GT100511</td><td>Długość: 75 cm; Szerokość: 25 cm</td></tr><tr><td>Modułowe Centrum Osadzania Tkanek</td><td>Leica</td><td>EG1150 C</td><td>Instrument zawiera zimny stolik i podgrzewany moduł dystrybucji parafiny, co zapewnia elastyczność podczas prac związanych z zatapianiem</td></tr><tr><td>Żywica naturalna</td><td>SAKURA</td><td>4770</td><td>Folia pokryta żywicą, Nadaje się do barwienia histologicznego</td></tr><tr><td>Olympus SLIDEVIEW VS200</td><td>PANOVUE</td><td>VS200</td><td>Przyrząd rejestruje wysokiej jakości wirtualne obrazy slajdów i umożliwia zaawansowaną ilościową analizę obrazu&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający paraformaldehyd</td><td>Servicebio</td><td>G1011</td><td>500 mL, uniwersalny utrwalacz tkankowy (neutralny)</td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>HUAYON</td><td>18-1300</td><td>2,2 mm proste, 12,5 cm szerokości</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>HUAYON</td><td>18-0110</td><td>10 cm, nożyczki chirurgiczne ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Uprzejmie</td><td>60017031</td><td>1 mL, jednorazowa sterylna strzykawka z igłą</td></tr><tr><td>Tkanka kasety</td><td>CITOTEST</td><td>80106-1100-16</td><td>Biały; szczeliny przepływowe; 0-częściowa zintegrowana pokrywa; obszary etykietowania znajdują się z trzech stron</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus</td><td>SAKURA</td><td>DRS-Prisma-P-JCS</td><td>Wydajność przetwarzania wynosi jednorazowo 60 szkiełek</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1330-20-7</td><td>1000 mL, rozpuszczalnik organiczny</td></tr></tbody></table>

ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Establishing a Mouse Model of Thin Endometrium

Cienkie endometrium (TE) jest powszechnie uznawane za krytyczną przyczynę niepłodności. Jednak patogeneza TE pozostaje niejasna i nadal pilnie potrzebne są zadowalające opcje leczenia. Opracowano kilka zwierzęcych modeli TE, ale model mysi obejmujący operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie 95% etanolu stanowi ogromne wyzwanie ze względu na wysoką śmiertelność i ryzyko zrostów wewnątrzmacicznych, jeśli nie zostanie wykonany prawidłowo. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół, który wytwarza niezawodny i powtarzalny TE o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy przy różnym czasie infuzji. Wyniki wykazały, że u wszystkich myszy pomyślnie rozwinął się TE z czasem infuzji w zakresie 1-3 minut, charakteryzującym się typowym zmniejszeniem grubości endometrium i liczby gruczołów, a także nadmiernym zwłóknieniem endometrium. Odkrycia te sugerują, że ten mysi model nadaje się do badania cienkiego endometrium i może służyć jako platforma do opracowywania przyszłych metod leczenia TE.

Kluczowymi cechami cienkiego endometrium (TE) są zmniejszona grubość błony śluzowej macicy i gęstość gruczołowa, a także zwiększone włóknienie endometrium. Niniejsza metoda z powodzeniem odtworzyła te charakterystyki w modelu mysim. Analiza danych wykazała istotny spadek grubości endometrium w grupie 1-min (222,3 µm ± 13,96 µm vs. 359,2 µm ± 12,41 µm, P &lt; 0,05), grupie 2-min (168,7 µm ± 17,57 µm vs. 359,2 µm ± 12,41 µm, P &lt; 0,05) oraz grupie 3-min (131,8 µm ± 3 µm vs. 359,2 µm ± 12,41 µm, P &lt; 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną. Jednakże między grupami 2-min i 3-min nie zaobserwowano istotnej różnicy w grubości endometrium (168,7 µm ± 17,57 µm vs. 131,8 µm ± 3 µm, P &gt; 0,05) (Rysunek 3A,B).
Liczba gruczołów błony śluzowej macicy była istotnie zmniejszona w grupie 1-min (4.4 ± 2.38 vs. 24.4 ± 1.6, P &lt; 0.05), grupie 2-min (0.8 ± 0.49 vs. 24.4 ± 1.6, P &lt; 0.05) oraz grupie 3-min (4.4 ± 3.20 vs. 24.4 ± 1.6, P &lt; 0.05) w porównaniu z grupą kontrolną (Rycina 3A,C). Jednakże nie zaobserwowano istotnych różnic w liczbie gruczołów błony śluzowej macicy pomiędzy grupami 1-min, 2-min i 3-min.
Ponieważ TE wystąpiły po leczeniu 95% etanolem przez 7 dni, postawiono hipotezę, że grubość błony śluzowej endometrium może być powiązana z czasem infuzji. Aby to zbadać, dwie dodatkowe grupy poddano leczeniu 95% etanolem odpowiednio przez 4 min i 5 min. Co interesujące, wyniki wykazały ciężkie zrosty maciczne wraz ze zwiększeniem czasu infuzji (Rysunek 4), przy czym jama macicy stała się niemal niewidoczna. Ponadto w macicy myszy przy wydłużonym czasie infuzji nie zaobserwowano gruczołów endometrium (Rysunek 4).
Ponadto stopień włóknienia błony śluzowej macicy wzrastał wraz z czasem infuzji 95% etanolu, co potwierdzono barwieniem Massona, wskazując na nadmierne włóknienie w uszkodzonej błonie śluzowej macicy (Rycina 5A,B).
<img alt="Schemat osi czasu identyfikacji cyklu rujowego, indukcji cienkiego endometrium oraz barwienia HE i Massona." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67084/67084fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy ustanowienia modelu mysiego TE. Cała procedura obejmuje następujące etapy: Najpierw myszy poddano aklimatyzacji przez 1 tydzień przed eksperymentem. Następnie monitorowano dwa cykle rujowe. Myszy w trzeciej ruji wybrano do ustanowienia modelu poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do jamy macicy. Siedem dni po wstrzyknięciu etanolu myszy uśmiercono, a rogi macicy pobrano do dalszej analizy za pomocą barwienia HE i barwienia Massona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67084/67084fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik barwienia komórek pod mikroskopem; analiza cytologiczna, obraz mikroskopowy, identyfikacja struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67084/67084fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Identyfikacja fazy rui u myszy. (A) Proestrus charakteryzuje się przewagą jądrowych komórek nabłonka (strzałka). (B) Estrus charakteryzuje się przewagą bezjądrowych zrogowaciałych komórek nabłonka (gwiazdki). (C) Metestrus charakteryzuje się obecnością bezjądrowych zrogowaciałych komórek nabłonka oraz neutrofili (trójkąt). (D) Diestrus charakteryzuje się obecnością neutrofili, jądrowych komórek nabłonka oraz niewielkiej liczby bezjądrowych komórek zrogowaciałych. Powiększenie obiektywu 20x. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67084/67084fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces wycinania guza u gryzoni; procedura chirurgiczna, usuwanie tkanek, przygotowanie próbek, badania medyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67084/67084fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Procedura indukcji TE poprzez infuzję 95% etanolu. (A) Myszy są znieczulane przy użyciu aparatu do znieczulania. (B) Usuwa się owłosienie brzucha. (C) Wykonuje się cięcie o długości 1 cm w odległości 1 cm od ujścia cewki moczowej. (D) Lokalizuje się macicę i odsłania jedną stronę rogu macicy. (E) Po obu stronach rogu macicy zakłada się kleszczyki hemostatyczne. (F) Do rogu macicy wprowadza się 95% etanol, a następnie przepłukuje go sterylną solą fizjologiczną. (G) Usuwa się kleszczyki i umieszcza macicę na miejscu. (H) Cięcie zostaje zaszyte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67084/67084fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna; grupa uszkodzona vs. kontrolna; obrazy mikroskopowe, wykresy grubości endometrium, badanie porównawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67084/67084fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obserwacja morfologii endometrium u myszy z wykorzystaniem barwienia HE pod mikroskopem. (A) Zbadano morfologię endometrium po stronie uszkodzonej i kontrolnej. Do macicy po prawej stronie wstrzyknięto 95% etanolu, natomiast do macicy po lewej stronie wstrzyknięto sterylną sól fizjologiczną jako kontrolę. Paski skali = 200 µm. (B) Porównanie grubości endometrium w grupie Con oraz grupach 1 min, 2 min i 3 min. (C) Porównanie liczby gruczołów w endometrium w grupie Con oraz grupach 1 min, 2 min, 3 min, 4 min i 5 min. Con, kontrola; **P &lt; 0.01, ****P &lt; 0.0001 przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA). Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67084/67084fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza histologiczna i wykres stosunku obszaru włóknistego w czasie, porównujący próbki uszkodzone i kontrolne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67084/67084fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Włóknienie błony śluzowej macicy u myszy. (A) Barwienie trichromem Massona zostało wykorzystane do oceny włóknienia błony śluzowej macicy we wskazanych grupach terapeutycznych, gdzie kolor niebieski wskazuje rozkład włókien kolagenu. Paski skali = 200 µm. (B) Podsumowujący wykres słupkowy przedstawia poziom włóknienia kolagenowego w różnych grupach. **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001 przy zastosowaniu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67084/67084fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory ...

Cienkie endometrium jest powszechnie uznawane za krytyczną przyczynę niepłodności. Badania nad patogenezą cienkiego endometrium opierają się na modelach zwierzęcych, przy czym wybór odpowiedniego modelu ma kluczowe znaczenie. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który tworzy wiarygodny i powtarzalny cienki model endometrium u myszy.Operacja jest traumatyczna, ponieważ musimy przeprowadzić sekcję myszy i wystawić róg macicy myszy na manipulację. Niewłaściwa operacja może spowodować infekcję, a nawet doprowadzić do śmierci myszy. Rzeczywiście, przed operacją eksperymentalną potrzebne jest staranne szkolenie i doświadczenie.Udało nam się opracować model endometrium z czasem infuzji od jednej do trzech minut, aby odtworzyć różne stopnie objawów cienkiej endometrium obserwowanych w przypadkach klinicznych. Dzięki temu możemy tworzyć modele o różnych poziomach uszkodzeń, w zależności od konkretnych potrzeb naszych badań. Metoda zastosowana w naszym protokole ma tę zaletę, że jest niskokosztowa, odpowiednia, a także ma okres eksperymentalny.Bada mechanizm patologiczny i leczenie w trzech początkowych w porównaniu z innymi technikami. Na początek umieść znieczuloną mysz na wznak na rozgrzanym stole operacyjnym i za pomocą taśmy medycznej zabezpiecz kończyny myszy. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w jamie brzusznej, znajdujące się około centymetra od ujścia cewki moczowej, rozciągające się do jamy otrzewnej.Delikatnie odsuń wnętrzności na bok sterylnymi kleszczami, aby zlokalizować macicę. Odsłoń prawy róg macicy i załóż klamry hemostatyczne na bliższym końcu w pobliżu szyjki macicy i na dystalnym końcu w pobliżu jajnika. Za pomocą strzykawki o rozmiarze 25 wkraść około 50 mikrolitrów 95% etanolu do jamy macicy, trzymając igłę równolegle do rogu macicy.Strzykawkę należy utrzymywać przez jedną do pięciu minut, w zależności od potrzeb. Następnie należy pobrać etanol z jamy macicy i przepłukać jamę macicy sterylnym roztworem soli fizjologicznej pięć razy, aby usunąć pozostały etanol. Teraz usuń zaciski hemostatyczne i przywróć macicę i wnętrzności do ich pierwotnej pozycji.Za pomocą wchłanialnych szwów chirurgicznych 5/0 zszyj otrzewną, a następnie naskórek. Na początek umieść poddany eutanazji cienki model myszy endometrium na stole sekcyjnym i przetnij szwy za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić macicę. Następnie za pomocą kleszczy chirurgicznych należy ostrożnie usunąć całą macicę i oderwać macicę od otaczających wnętrzności.Natychmiast usuń oba rogi macicy i podziel każdy róg na trzy do czterech małych segmentów. Umieść tkanki macicy w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu pobranym w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki. Umieścić próbki utrwalone formaliną w kasetach na tkanki i przenieść kasety tkankowe przez szereg stężeń etanolu, a następnie ksylenu i parafiny.Napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 stopni Celsjusza. Użyj podgrzanych kleszczy, aby szybko przenieść naciekane segmenty tkanki z kasety do zatapiania do formy woskowej. Gdy segmenty tkanki zostaną prawidłowo ustawione, umieść spód kasety do zatapiania na wierzchu formy histologicznej.Następnie umieść formę bezpośrednio na płycie chłodzącej ustawionej na cztery stopnie Celsjusza na co najmniej 20 minut, aby parafina zastygła. Następnie wyjmij próbkę z formy i użyj trymera do parafiny, aby przyciąć nadmiar wosku wokół niej. Grubość endometrium i liczba gruczołów endometrialnych istotnie zmniejszyły się w grupie jedno-, dwu- i trzyminutowej w porównaniu z grupą kontrolną.W grupie cztero- i pięciominutowej zaobserwowano silne zrosty macicy i prawie niewidoczną jamę macicy, nie stwierdzono też żadnych gruczołów endometrialnych. Zwłóknienie endometrium nasilało się wraz z czasem trwania infuzji etanolu, na co wskazuje nadmierne barwienie w grupach od jednej do pięciu minut w porównaniu z grupą kontrolną.

establishing-a-mouse-model-of-thin-endometrium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium przeszczepionych myszom. Metoda pozwala na badanie wpływu wybranych leków na wielkość zmiany endometriotycznej poprzez monitorowanie i kwantyfikację fluorescencji emitowanej przez reporter fluorescencyjny w czasie...

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Przedstawiona metoda umożliwia powtarzalne wykonywanie seryjnych cięć w kriosztacie z małych, trudnych w obsłudze fragmentów tkanek, takich jak biopsjaty i skrawki mózgu. Wykorzystujemy prosty aluminiowy blok mrożący, aby ułatwić manipulację tkanką, oraz standardowy kriosztat do rutynowego przygotowywania seryjnych przekrojów o grubości 5-10 micron z fragmentów mózgu o grubości 400 micron.

Przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii

Iniekcja doszklistkowa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad naukami o widzeniu w kontekście chorób oczu lub jako metoda bezpośredniego zastosowania miejscowego leczenia. W tym filmie zaprezentowano protokół iniekcji doszklistkowej z użyciem strzykawki o pojemności 1ml z szklaną pipetą. Przedstawiono praktyczne wskazówki dotyczące unikania masywnych krwawień oraz uszkodzeń soczewki.

Iniekcja doplastycznej w głąb ciała szklistego w celu ustanowienia modelu chorób oczu

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Poznaj protokół wstrzyknięcia etanolu do macicy myszy w celu stworzenia niezawodnego modelu cienkiego endometrium. Ta metoda pozwala symulować różne stopnie uszkodzenia endometrium obserwowane w przypadkach klinicznych.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Przeglądaj więcej filmów