Name: Jednoczesna zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa i zapis fotometrii światłowodowej w myszy swobodnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej zogniskowanej neuromodulacji ultradźwiękowej i fotometrii światłowodowej u swobodnie poruszających się myszy. Technika ta umożliwia rejestrację dynamiki wapnia jako wskaźnika aktywności nerwowej w badaniach nad funkcją mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32371151), Guangdong High Level Innovation Research Institute (2021B0909050004), Hong Kong Research Council Collaborative Research Fund (C5053-22GF), General Research Fund (15224323 i 15104520), Hong Kong Innovation Technology Fund (MHP/014/19), wewnętrzne finansowanie z Hong Kong Polytechnic University (G-SACD i 1-CDJM), oraz Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Liaoning - Wspólny Otwarty Fundusz Państwowego Kluczowego Laboratorium Robotyki (2022-KF-22-03). Autorzy pragną podziękować placówce i wsparciu technicznemu ze strony Uniwersyteckiego Ośrodka Badawczego Nauk Przyrodniczych (ULS) oraz Uniwersyteckiego Ośrodka Badawczego w Neuronauce Behawioralnej i Systemowej (UBSN) Politechniki w Hongkongu.

Wszystkie procedury i zasady obchodzenia się ze zwierzętami były zgodne z wytycznymi etycznymi NSFC oraz zatwierdzonymi wymogami protokołu Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology.
1. Przygotowanie przetwornika
<ol>
	<li>Przygotować płytkę piezoelektryczną o średnicy wewnętrznej 3 mm, średnicy zewnętrznej 7 mm i częstotliwości centralnej 500 kHz. 
	UWAGA: Średnicę zewnętrzną można dostosować w zależności od konkretnego obszaru mózgu będącego celem; należy ją zmaksymalizować, zachowując jednocześnie dokładność stymulacji i nie przekraczając granic czaszki myszy.</li>
	<li>Przymocować przewód do obu stron płytki piezoelektrycznej za pomocą srebrnej pasty epoksydowej (Rycina 1). Po zastygnięciu srebrnej pasty epoksydowej zmierzyć multimetrem rezystancję na obu końcach przewodu, aby upewnić się, że wynosi ona w przybliżeniu 0.</li>
	<li>Nanieść warstwę taśmy dwustronnej na czystą powierzchnię szklanej płytki. Mocno przykleić do szklanej płytki płytkę piezoelektryczną oraz pierścień miedziany o wysokości 8 mm, średnicy zewnętrznej 8 mm i średnicy wewnętrznej 7,6 mm. 
	UWAGA: Średnicę wewnętrzną pierścienia miedzianego dobiera się do rozmiaru płytki piezoelektrycznej, aby zapewnić pełne pokrycie płytki przez pierścień.</li>
	<li>Bezpiecznie wsunąć rurkę z polipropylenu o średnicy zewnętrznej 3 mm w środek płytki piezoelektrycznej i mocno przykleić ją do szklanej płytki (Rycina 1).</li>
	<li>Przygotować odpowiednią ilość żywicy epoksydowej i poddać ją próżniowaniu. Odessać żywicę za pomocą jednorazowej strzykawki i powoli wstrzyknąć ją do pierścienia miedzianego. Odczekać około 10 h do czasu zastygnięcia żywicy (Rycina 1).</li>
	<li>Przylutować wolne końce dwóch przewodów do złącza z nakrętką bagnetową za pomocą lutownicy elektronicznej. Usunąć szklaną płytkę. Oczyścić powierzchnię przetwornika alkoholem (Rycina 1).</li>
</ol>
2. Parametry raportowania dla FUN
<ol>
	<li>Umieść hydrofon i przetwornik w zbiorniku wypełnionym wodą dejonizowaną (Rysunek 2A). Upewnij się, że wiązka centralna (oś Z) systemu pozycjonowania jest wyrównana z osią przetwornika. Wyrównanie to można osiągnąć poprzez: po pierwsze, znalezienie maksimum pola w płaszczyźnie ogniskowej za pomocą skanowania 2D; po drugie, zidentyfikowanie maksimum pola w innej płaszczyźnie z wyraźnym maksimum; po trzecie, porównanie współrzędnych X i Y obu maksimów, a następnie iteracyjną regulację pozycji i/lub orientacji przetwornika, jeśli jest to konieczne28.</li>
	<li>Ustaw grot hydrofonu w odległości 1 mm od powierzchni przetwornika, utrzymując tę odległość na stałym poziomie podczas pozycjonowania hydrofonu na środku prawej krawędzi przetwornika. Uruchom program skanujący, aby zarejestrować swobodne pole akustyczne w płaszczyźnie XZ (Rysunek 2B). 
	UWAGA: Metodę konstrukcji hydrofonu można znaleźć pod adresem https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.</li>
	<li>Przesuń hydrofon wzdłuż osi Z, aby określić głębokości związane z przestrzennym ciśnieniem szczytowym. W tym doświadczeniu przestrzenne ciśnienie szczytowe pojawia się w odległości 3,4 mm od powierzchni przetwornika; zachowaj tę odległość podczas przesuwania hydrofonu do prawego dolnego rogu przetwornika w płaszczyźnie XY. Włącz zasilanie i uruchom program skanujący, aby zarejestrować swobodne pole akustyczne w płaszczyźnie XY (Rysunek 2B).</li>
	<li>Umieść przetwornik na czaszce myszy, która przeszła operację opisaną w kroku 4. Zarejestruj transkranialne pole akustyczne w płaszczyźnie XZ i XY (Rysunek 2D) poprzez skanowanie hydrofonem, jak opisano w punktach 2.1-2.3.</li>
	<li>Odczytaj amplitudy ciśnienia w punkcie ogniskowym, który jest obszarem przestrzennego szczytu w swobodnym polu akustycznym oraz w transkranialnym polu akustycznym. Amplituda ciśnienia w punkcie ogniskowym w swobodnym polu akustycznym wynosi 730k Pa, a w transkranialnym polu akustycznym 580k Pa. Odczytaj wymiary ogniska przy poziomie -3 dB (Rysunek 2C,E) oraz pozycję w płaszczyznach XY i XZ w obrębie transkranialnego pola akustycznego, aby ocenić, czy pole akustyczne tego przetwornika może pokryć docelowe obszary mózgu.</li>
	<li>Oblicz indeks mechaniczny (MI), który zgodnie z wytycznymi FDA musi być niższy niż 1,9 w celu ograniczenia kawitacji. Obliczenie MI odbywa się według równania: 
	<img alt="Wzór matematyczny, MI=pr,3/√f0, równanie do obliczeń statystycznych." src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     (1) 
	gdzie pr,.3 oznacza szczytowe ciśnienie rozrzedzenia w MPa skorygowane o współczynnik tłumienia 0,3 dB cm-1 MHz-1, a f0 to częstotliwość pracy w MHz. Zmierzone szczytowe ciśnienie rozrzedzenia w polu transkranialnym wynosi 580 kPa w odległości 3,4 mm od przetwornika, a f0 wynosi 500 kHz, zatem skorygowane pr,.3 wynosi 576,6 kPa. Wartość MI wynosi 0,82.</li>
	<li>Oblicz natężenie średnie z impulsu w szczycie przestrzennym (Isppa), które zgodnie z wytycznymi FDA w kierunku płaszczyzny musi być niższe niż 190 W/cm2. Obliczenie natężenia odbywa się według równania: 
	<img alt="Równanie natężenia ultradźwięków, Isppa, przedstawione jako wzór związany z całkowaniem mocy i ciśnienia." src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">     (2) 
	gdzie psp (t) jest zmiennym w czasie ciśnieniem akustycznym w miejscu szczytu przestrzennego, Z to charakterystyczna impedancja akustyczna ośrodka (około 1.5 x 106 Rayls dla tkanki miękkiej), a PD to czas trwania impulsu. W przypadku obwiedni prostokątnej równanie to sprowadza się do postaci: 
	<img alt="Równanie natężenia w akustyce, wzór \(I_{\text{sppa}} = \frac{A^2}{2Z}\)." src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">     (3) 
	gdzie A jest amplitudą przestrzennego ciśnienia szczytowego. Wartość A zmierzona w miejscu ogniskowania ultradźwięków wynosi 580 kPa, a Z mózgu wynosi około 1,58 x 106 Rayls, zatem Isppa dla obwiedni prostokątnej wynosi 10,65 W/cm2 i Isppa dla obwiedni sinusoidalnej wynosi 10,65 W/cm2.</li>
	<li>Oblicz natężenie średnie w czasie w szczycie przestrzennym (Ispta), które zgodnie z wytycznymi FDA w kierunku płaszczyzny musi być niższe niż 430 mW/cm2. Obliczenie natężenia odbywa się według równania: 
	<img alt="Równanie natężenia ultradźwięków \(I_{\text{spta}} = \frac{1}{T \ast Z} \int_0^T p_{\text{sp}}(t)^2 dt\) wzór" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4">     (4) 
	gdzie T to okres czasu, dla którego obliczana jest średnia. W przypadku obwiedni prostokątnej równanie to sprowadza się do postaci: 
	<img alt="Równanie pokazujące I&lt;sub&gt;spta&lt;/sub&gt; jako DC&lt;sub&gt;pulse train&lt;/sub&gt; I&lt;sub&gt;sppa&lt;/sub&gt;, wzór związany z pociągami impulsów." src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5">     (5) 
	gdzie DCpulse train to cykl pracy impulsu. W tym przypadku DC pulse train wynosi 1%, ponieważ zastosowano fale ciągłe, zatem Ispta jest równe natężeniu średniemu z impulsu w szczycie przestrzennym i wynosi 106,5 mW/cm2 dla obwiedni prostokątnej. Wartości MI, Isppa oraz Ispta można obliczyć za pomocą oprogramowania (Rysunek 3A). Kod oparty na MATLAB, ułatwiający użytkowanie, znajduje się pod adresem https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.</li>
	<li>Podaj parametry czasowe impulsu, w tym Amax, czas trwania impulsu, odstęp między impulsami, czas trwania pociągu impulsów oraz obwiednię (Rysunek 3B).</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierzęcia do zabiegu
<ol>
	<li>Zważyć 8-tygodniowe samce transgenicznych myszy GCaMP6s o przybliżonej masie ciała około 20 g. Przygotować roztwór zawierający ketaminę w stężeniu 10 mg/mL oraz ksylazynę w stężeniu 2 mg/mL w jałowej soli fizjologicznej. Podać roztwór ketaminy/ksylazyny drogą domięśniową w dawce 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny, używając igły 26G i jednorazowej strzykawki 1 mL. Rozpocząć przygotowania chirurgiczne po upewnieniu się, że zwierzę nie reaguje na bodźce bólowe, np. uciśnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Użyć maszynki do strzyżenia w celu usunięcia sierści z głowy zwierzęcia, a następnie zdezynfekować ten obszar 70% etanolem oraz powidonem jodowym przed przystąpieniem do zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Umieścić mysz w pozycji brzusznej w aparacie stereotaktycznym i upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana. Nałożyć ochronną maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
</ol>
4. Procedura chirurgiczna
<ol>
	<li>Wykonać nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od kości potylicznej aż do początku kości nosowej. Za pomocą nożyczek chirurgicznych usunąć skórę pokrywającą obie półkule.</li>
	<li>Użyć sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby oczyścić czaszkę i usunąć pozostałości okostnej.</li>
	<li>Na odsłoniętą czaszkę nanieść za pomocą patyczka higienicznego 3% nadtlenek wodoru na około 2 s-3 s w celu wytworzenia mikroporów. Dokładnie wypłukać sterylną solą fizjologiczną i upewnić się, że obszar jest całkowicie suchy.</li>
	<li>Wykonać trepanację za pomocą sterylnego, autoklawowanego wiertła o średnicy 0,6 mm nad obszarem mózgu wyznaczonym zgodnie z atlasem stereotaktycznym w odniesieniu do bregma i lambda. Wypłukać wszelkie zanieczyszczenia sterylną solą fizjologiczną i dokładnie osuszyć. Należy uważać, aby nie uszkodzić żadnej tkanki.</li>
	<li>Włożyć ferulę światłowodową (implant) do uchwytu sondy i połączyć go z ramieniem stereotaktycznym.</li>
	<li>Za pomocą ramienia stereotaktycznego ustawić implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania. Podczas wprowadzania światłowodu do tkanki mózgowej należy przesuwać go powoli z prędkością około 2 mm/min.</li>
	<li>Wymieszać cement dentystyczny do uzyskania lepkości umożliwiającej łatwe nakładanie na czaszkę. Za pomocą sterylnej wykałaczki rozprowadzić cienką warstwę cementu dentystycznego na czaszce oraz na dolnej części implantu. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Ostrożnie odłączyć uchwyt sondy. Przygotować rurkę polipropylenową o wysokości 3 mm, średnicy zewnętrznej 3 mm i średnicy wewnętrznej 2,6 mm, a następnie przeciąć rurkę wzdłuż jej długości.</li>
	<li>Przymocować rurkę do dołu implantu za pomocą pęsety. Wsypać proszek cementu dentystycznego do rurki, zapewniając wystarczającą długość powyżej implantu w celu rejestracji sygnału ze światłowodu. Dodać wymaganą ciecz i odczekać kilka minut do stwardnienia cementu dentystycznego.</li>
	<li>Zlokalizować otwór rurki i ostrożnie go zacisnąć, a następnie usunąć rurkę za pomocą pęsety. Przygotować mieszankę cementu dentystycznego do aplikacji, dbając o równomierne rozprowadzenie cienkiej warstwy na czaszce. Pokryć cementem dentystycznym tak dużą powierzchnię czaszki, jak to możliwe. Odczekać kilka minut do stwardnienia cementu dentystycznego. 
	UWAGA: Nie dopuścić do kontaktu cementu dentystycznego ze skórą myszy.</li>
	<li>Wywiercić trzy otwory (średnica 1 mm) w wydrukowanym w technologii 3D pierścieniu o wysokości 7 mm, średnicy zewnętrznej 10 mm i średnicy wewnętrznej 8,4 mm, rozmieszczone równomiernie w płaszczyźnie poziomej. Wkręcić śruby (długość 1 mm) w odpowiednie otwory.</li>
	<li>Włożyć górną część implantu do otworu gotowego przetwornika. Upewnić się, że wewnętrzna ścianka pierścienia wydrukowanego w 3D jest gładka, a następnie umieścić go wokół przetwornika umieszczonego na czaszce myszy. Upewnić się, że przetwornik jest wycentrowany w obrębie pierścienia.</li>
	<li>Nanieść cement dentystyczny na połączenie między pierścieniem a czaszką, a następnie odczekać kilka minut do stwardnienia cementu. Unikać nakładania cementu dentystycznego na miejsce połączenia przetwornika z czaszką.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć przetwornik i mocno dokręcić śruby. Przenieść mysz do ciepłej klatki i monitorować ją do czasu pełnego wybudzenia przed powrotem do oryginalnej klatki.</li>
	<li>Po operacji podać podskórnie Carprofen (2 mg/kg) w celu przeciwbólowego i kontynuować podawanie co 24 h przez 3 dni w celu opanowania stanu zapalnego i bólu. Codziennie monitorować zwierzęta pod kątem oznak stresu, nieprawidłowej utraty masy ciała, bólu lub infekcji. Zazwyczaj do 3ciego dnia po operacji wszystkie myszy powinny wykazywać normalne zachowanie. Jeśli po 3cim dniu u myszy zostaną zaobserwowane jakiekolwiek oznaki stresu lub choroby, należy postępować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi eutanazji. 
	UWAGA: Zgodnie z konkretnymi wytycznymi i zgodami instytucjonalnymi można rozważyć alternatywne schematy przeciwbólowe, takie jak podanie dawki leków przeciwbólowych przed zabiegiem.</li>
</ol>
5. Stymulacja i rejestracja sygnału
<ol>
	<li>W 7. dniu po operacji włącz dopływ tlenu do aparatu do znieczulenia gazowego i dostosuj regulator przepływu tlenu, aby ustawić przepływ gazu na 300-500 mL/min.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i zamknij dopływ gazu znieczulającego do maski. Obróć pokrętło parownika, aby ustawić odpowiednie stężenie środka znieczulającego (2%- 2,5%).</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy umieść ją w aparacie stereotaksycznym z maską anestezjologiczną. Zamknij linię indukcyjną, aby gaz znieczulający mógł przepływać do maski anestezjologicznej. Dostosuj odpowiednie stężenie podtrzymujące środka znieczulającego (1%-1,5%).</li>
	<li>Oczyść górną powierzchnię implantu alkoholem, a następnie wprowadź światłowodowy kabel połączeniowy do centrum przygotowanego przetwornika.</li>
	<li>Wstrzyknij wodę w przestrzeń między implantem a wydrukowanym w technologii 3D pierścieniem, używając igły 26G i jednorazowej strzykawki 1 mL, aby nawilżyć czaszkę. Nadmiar wody odsącz ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Wstrzyknij środek sprzęgający w przestrzeń między implantem a wydrukowanym w technologii 3D pierścieniem, używając igły 26G i jednorazowej strzykawki 1 mL, aby ułatwić propagację ultradźwięków z przetwornika do mózgu.</li>
	<li>Podłącz implant do światłowodowego kabla połączeniowego. Ostrożnie wprowadź przetwornik w obszar wypełniony środkiem sprzęgającym i mocno dokręć śruby.</li>
	<li>Umieść mysz w otwartym polu i poczekaj, aż się obudzi. Podłącz przetwornik do systemu wzbudzania ultradźwiękowego oraz podłącz światłowodowy kabel połączeniowy do systemu rejestracji światłowodowej, zapewniając myszy swobodę ruchu. 
	UWAGA: Światłowodowy kabel połączeniowy ma długość 2m i średnicę 1,25 mm. Natężenie światła dla kanału 405 wynosi 20 µW, a dla kanału 470 wynosi 40 µW.</li>
	<li>Uruchom zarówno urządzenie do wzbudzania ultradźwiękowego, jak i system rejestracji światłowodowej, aby zsynchronizować ultradźwiękową modulację neuronową z rejestracją sygnału światłowodowego.</li>
</ol>

Integrated Protocol for FUN and Fiber Photometry in Free-Moving Mice

<ol><li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+for+noninvasive%2C+focal+pharmacologic+neurointervention%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541(2020).</li>
<li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li>
<li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+%28tfus%29+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults%3A+A+double-blind%2C+sham-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li>
<li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).</li>
<li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).</li>
<li>Niu, X., Yu, K., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+induces+sustained+synaptic+plasticity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus.</a> Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).</li>
<li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+torpor-like+hypothermic+and+hypometabolic+state+in+rodents+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metabol%22%5BJournal%5D)">Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound.</a> Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).</li>
<li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote%2C+brain+region-specific+control+of+choice+behavior+with+ultrasonic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves.</a> Sci Adv. 6 (21), 4193(2020).</li>
<li>Deffieux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+focused+ultrasound+modulates+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Low-intensity focused ultrasound modulates monkey visuomotor behavior.</a> Curr Biol. 23 (23), 2430-2433 (2013).</li>
<li>Gaur, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+safety+of+transcranial+focused+ultrasound+neuromodulation+and+magnetic+resonance+acoustic+radiation+force+imaging+in+rhesus+macaques+and+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Histologic safety of transcranial focused ultrasound neuromodulation and magnetic resonance acoustic radiation force imaging in rhesus macaques and sheep.</a> Brain stimulation. 13 (3), 804-814 (2020).</li>
<li>Fouragnan, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macaque+anterior+cingulate+cortex+translates+counterfactual+choice+value+into+actual+behavioral+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The macaque anterior cingulate cortex translates counterfactual choice value into actual behavioral change.</a> Nat Neurosci. 22 (5), 797-808 (2019).</li>
<li>Folloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation+of+the+deep+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation of the deep brain.</a> Science. 377 (6606), 589-589 (2022).</li>
<li>Verhagen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offline+impact+of+transcranial+focused+ultrasound+on+cortical+activation+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Offline impact of transcranial focused ultrasound on cortical activation in primates.</a> Elife. 8, e40541(2019).</li>
<li>Yang, P. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+of+sensory+networks+in+monkey+brain+by+focused+ultrasound+with+mri+guidance+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation of sensory networks in monkey brain by focused ultrasound with mri guidance and detection.</a> Sci Rep. 8 (1), 7993(2018).</li>
<li>Yu, K., Niu, X., Krook-Magnuson, E., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+functional+neuron-type+selectivity+of+transcranial+focused+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Intrinsic functional neuron-type selectivity of transcranial focused ultrasound neuromodulation.</a> Nat Comm. 12 (1), 2519(2021).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+ion+channel+piezo1+contributes+to+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive ion channel piezo1 contributes to ultrasound neuromodulation.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (18), e2300291120(2023).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M4+muscarinic+receptor+signaling+ameliorates+striatal+plasticity+deficits+in+models+of+l-dopa-induced+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">M4 muscarinic receptor signaling ameliorates striatal plasticity deficits in models of l-dopa-induced dyskinesia.</a> Neuron. 88 (4), 762-773 (2015).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Meth. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+xcamps%2C+a+multicolor+geci+suite+for+in+vivo+imaging+of+complex+brain+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of xcamps, a multicolor geci suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics.</a> Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).</li>
<li>Legaria, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+photometry+in+striatum+reflects+primarily+nonsomatic+changes+in+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium.</a> Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).</li>
<li>Kamimura, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+of+cortical+and+subcortical+brain+structures+using+1.9+mhz%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz.</a> Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).</li>
<li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).</li>
<li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li>
<li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrasonics+Ferroelect+Freq+Cont%22%5BJournal%5D)">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podejście to łączy FUN z zapisem fotometrii optycznej, umożliwiając badanie funkcji mózgu myszy i mechanizmu FUN in vivo . Przedstawiono w zarysie cały proces operacyjny, od produkcji głowicy po zabiegi chirurgiczne, co pozwala naukowcom na niezależne wykonywanie FUN spoza terenu.
Jednym z kluczowych aspektów protokołu jest zapewnienie, że implant optyczny jest płynnie wprowadzany do głowicy, cement dentystyczny w poprzek czaszki jest wystarczająco cienki, aby przeniknąć ultradźwięki do mózgu, implant optyczny jest bezpiecznie połączony z czaszką, aby zapobiec przemieszczeniu się podczas eksperymentu, a energia wyjściowa przetwornika jest wystarczająca do skutecznej neuromodulacji. Grubość cementu dentystycznego otaczającego implant powinna być równa lub mniejsza niż średnica otworu przetwornika. Dlatego zaleca się stosowanie tej samej rury polipropylenowej zarówno w procesie produkcji przetwornika, jak i w chirurgii. Ponieważ rura polipropylenowa nie przylega do cementu dentystycznego, wybiera się ją do formowania cementu dentystycznego wokół implantu, z bocznym nacięciem, aby ułatwić usunięcie rurki polipropylenowej.
Zapis elektrofizjologiczny i zapis fotometrii optycznej są powszechnie stosowanymi technologiami monitorowania aktywności mózgu in vivo, oferującymi wysoką rozdzielczość czasowo-przestrzenną. Jednak zapis elektrofizjologiczny przechwytuje sygnał aktywności wystrzeliwania z neuronów przyczepionych bezpośrednio do elektrod. Fale ultradźwiękowe mogą bezpośrednio wibrować elektrody, wywołując niepotrzebne efekty mylące. Na szczęście technologia fotometrii światłowodowej, która jest mniej inwazyjna, wychwytuje aktywność neuronów znajdujących się pod nim, co może zmniejszyć mylący wpływ wibracji ultradźwiękowych na implant 7,19,26. W rezultacie, technologia jednoczesnej zogniskowanej neuromodulacji ultradźwiękowej i zapisu fotometrii światłowodowej u myszy swobodnie poruszających się pozwala na badanie in vivo mechanizmów neuromodulacji ultradźwiękowej i umożliwia obserwację reakcji behawioralnych myszy bez ingerencji znieczulenia.
Jednak rozdzielczość przestrzenna fotometrii światłowodowej jest ograniczona, ponieważ nie jest ona w stanie monitorować aktywności układów subkomórkowych i mikroukładów24. Co więcej, zapewnia pośrednią reprezentację aktywności neuronalnej, ponieważ nie rejestruje bezpośrednio sygnałów elektrycznych wytwarzanych przez aktywność neuronalną.

Skoncentrowana neuromodulacja ultradźwiękowa (FUN) stała się obiecującym i wszechstronnym narzędziem neuromodulacji, umożliwiającym badanie funkcji i organizacji mózgu o dużym potencjale1. FUN jest w stanie dostarczyć energię akustyczną w sposób nieinwazyjny do dowolnego miejsca w tkance mózgowej z najwyższą precyzją2. Jego zdolność do przejściowego i odwracalnego modulowania neuroaktywności w głębokiej strukturze mózgu, z wysoką specyficznością czasoprzestrzenną, w bezpieczny i nieinwazyjny sposób, stanowi atrakcyjną cechę, która uzupełnia istniejącą kliniczną technikę neuromodulacji3. Demonstracja skuteczności FUN została potwierdzona zarówno u ludzi4,5,6, jak i w różnych modelach zwierzęcych, obejmujących small7,8,9,10 i dużych gatunków11,12,13,14,15,16,17.
Obserwując wpływ FUN na określone typy neuronów poprzez monitorowanie neuroaktywności podczas FUN, możemy zagłębić się w mechanizm stojący za tym procesem18,19. Fotometria światłowodowa oparta na genetycznie kodowanych wskaźnikach wapnia (GECI) stała się szeroko stosowana w ciągu ostatniej dekady jako uniwersalna metoda śledzenia aktywności populacji specyficznej dla typu komórki in vivo20,21,22,23,24. W związku z tym jednoczesne zastosowanie FUN i fotometrii światłowodowej może znacznie wzbogacić naszą wszechstronną wiedzę na temat FUN. Niemniej jednak użycie nieporęcznych pojedynczych przetworników wymaga fiksacji do ramy, podczas gdy zwierzęta muszą zostać poddane znieczuleniu i unieruchomione w stereotaktycznej ramce7,19,25,26. Takie podejście może nie być odpowiednie dla niektórych typów eksperymentów związanych z percepcją, poznaniem i oceną zachowania. Kluczowe znaczenie ma ustanowienie protokołu, który ułatwi połączenie FUN i fotometrii światłowodowej bez utrudniania mobilizacji myszy7.
W tym badaniu prezentujemy wyrafinowany protokół używany w naszych poprzednich badaniach, aby bezproblemowo i z wdziękiem uzupełnić metodę tworzenia pojedynczego przetwornika i jego tymczasowego mocowania na myszach, a także bezpieczne mocowanie implantu światłowodowego w celu ułatwienia płynnego przejścia przetwornika7,19,26. Pozwala naukowcom rejestrować neuroaktywność modulowaną przez ultradźwięki u nieskrępowanych myszy. Zdecydowaliśmy się na gładszą obwiednię, taką jak obwiednia sinusoidalna, aby zmniejszyć zakłócenia słuchowe27. Wykonalność tego protokołu została potwierdzona poprzez jednoczesne rejestrowanie neuroaktywności w jądrze przedniego wzgórza swobodnie poruszających się myszy podczas FUN. Pokazuje, że energia przetwornika jest wystarczająca do osiągnięcia neuromodulacji, a metody mocowania implantu światłowodowego i przetwornika mogą zapewnić ich stabilność.

<table><tbody><tr><td>Jednorazowa strzykawka 1ml</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>Igły iniekcyjne</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 26 Jin</td><td>mao</td><td>JM-J02</td><td>Igły do preparatu</td></tr><tr><td>70%</td><td>etanolu Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0.7</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>alkoholu</td><td>Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0,75</td><td>Oczyść powierzchnię przetwornika</td></tr><tr><td>Złącze z nakrętką bagnetową</td><td>Risym</td><td>75-5</td><td>Drugi koniec przewodu połączeniowego jest podłączony do miedzianego pierścienia urządzenia do wzbudzania ultradźwiękowego</td></tr><tr><td></td><td>Materiały metalowe Guowei Średnica</td><td>zewnętrzna, grubość ścianki, wysokość (8 mm, 0,2 mm, 8 mm)</td><td>Zewnętrzna obudowa ochronna</td></tr><tr><td>jednorazowej strzykawki</td> przetwornika <td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>Wdychanie żywicy epoksydowej pozwala na precyzyjne wstrzykiwanie niewielkich ilości do rury miedzianej</td></tr><tr><td>taśma dwustronna</td><td>3M</td><td>3M55236</td><td>Służy do mocowania przetwornika i drutu, aby zapewnić, że klej epoksydowo-srebrny nie porusza się przed wyschnięciem</td></tr><tr><td>lutownicy elektronicznej</td><td>Victor</td><td>868A+</td><td>Lutowane przewody są połączone klejem z</td></tr><tr><td>żywicy epoksydowej</td> BNC <td>Kraft</td><td>K 9741</td><td>Uszczelnij tylną część przetwornika</td></tr><tr><td>epoksydowo-srebrnej pasty</td><td>Vonroll</td><td>CB-052</td><td>Drut jest przymocowany do dodatnich i ujemnych biegunów piezoelektrycznej blachy ceramicznej, a rezystancja jest utrzymywana na niskim</td></tr><tr><td>poziomie&nbsp;</td><td>JOQO</td><td>YP-7021</td><td>Usuń włosy na głowie mysiego</td></tr><tr><td>urządzenia do znieczulenia gazowego</td><td>RWD</td><td>R500</td><td>Służy do znieczulenia u myszy</td></tr><tr><td>tafla szkła</td><td>Szkło kwadratowe</td><td>80 mm * 80 mm</td><td>Tymczasowa powierzchnia robocza do umieszczania ceramiki piezoelektrycznej i drutów może być użyta do pokrycia powierzchni płyty szklanej taśmą dwustronną</td></tr><tr><td>ketamina/ksylazyna&nbsp;</td><td>Shutai / shengxin</td><td>Zoletil 50/2ml*10</td><td>Znieczulenie myszy</td></tr><tr><td>medyczny środek sprzęgający</td><td>Bestman</td><td>120g</td><td>Couplant działa jako medium do przewodzenia myszy sygnału ultradźwiękowego</td></tr><tr><td></td><td>Bai shi tong</td><td>GCaMp6</td><td>Maść</td></tr><tr><td>okulistyczna</td> z przedmiotem testu <td>Yun Zhi</td><td>0,5% x 2,5 g x1</td><td>Nawilża okolice oczu, zapobiegając ślepocie</td></tr><tr><td>&nbsp; płyta piezoelektryczna</td><td>Jiaming Electronics Factory</td><td>Średnica, pory, grubość (7 mm, 3 mm, 3,56 mm)</td> <td>Energia elektryczna jest emitowana w postaci ultradźwiękowej</td></tr><tr><td>rury polipropylenowej</td><td>Fabryka rur Baihao</td><td>Średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna, długość (3 mm, 2 mm, 500 mm)</td> <td>Zapobiegaj zatykaniu otworów przez żywicę epoksydową i pozostawianiu otworów</td></tr><tr><td>lefeke</td><td>powidonowo-jodowy</td><td>500ml</td><td>Dezynfekuj</td></tr><tr><td>zapis sygnału światłowodu</td><td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td><td>Trójkolorowy jednokanałowy system nagrywania światłowodu</td><td>Nagrywaj sygnały fotometryczne</td></tr><tr><td>stereotaktyczne ramka</td><td>RWD</td><td>68805</td><td>Napraw głowę myszy i zlokalizuj obszar mózgu</td></tr><tr><td>sterylna sól fizjologiczna</td><td>Shijiazhuang si yao</td><td>500ML, 4,5g</td><td>Jako rozpuszczalnik rozpuszcza stymulację lekową</td></tr><tr><td>ultradźwięków&nbsp;</td><td>Technologia Deep Brain</td><td>DB-USNM</td><td>Zapewnia stabilne wejście do</td></tr><tr><td>ważenia</td> przetwornika <td>Qin bo shi</td><td>1718</td><td>Zważ</td></tr><tr><td>przewód</td> myszy <td>Jinpeng Cable Factory</td><td>0,3 mm2</td><td>Napięcie jest dostarczane do przetwornika</td></tr></tbody></table>

jednoczesna zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa i zapis fotometrii światłowodowej w myszy swobodnej

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

Skoncentrowana neuromodulacja ultradźwiękowa (FUN) stanowi obiecujące podejście do nieinwazyjnych zaburzeń obwodów neuronalnych w głębokich obszarach mózgu. Jest on zgodny z większością istniejących metod monitorowania funkcji mózgu in vivo. Integracja z modalnościami rejestrowania funkcji mózgu nie tylko umożliwia nam reagowanie na porządki i zaburzenia określonych funkcji mózgu za pomocą sprzężenia zwrotnego w pętli zamkniętej, ale także zapewnia nam mechanistyczny wgląd w samą zabawę. Tutaj zapewniamy zmodyfikowany, prosty, niezawodny i solidny protokół do jednoczesnego zastosowania zapisu fluorescencji FUN i fotometrii światłowodowej GCaMP6s u myszy poruszających się. Wiąże się to z wyprodukowaniem dużego pojedynczego przetwornika i jego tymczasowym umieszczeniem na myszach, wraz z bezpiecznym zamocowaniem implantu światłowodowego, aby ułatwić płynne przejście przetwornika. Połączenie FUN i fotometrii światłowodowej zapewnia optyczne rejestrowanie reakcji obwodów nerwowych na FUN w czasie rzeczywistym w głębokich obszarach mózgu. Aby zademonstrować skuteczność tego protokołu, myszy Thy1-GCaMP6s użyto jako przykładu do rejestrowania neuroaktywności w przednim jądrze wzgórza podczas FUN, gdy myszy swobodnie się poruszają. Wierzymy, że protokół ten może promować powszechne stosowanie FUN zarówno w dziedzinie neurobiologii, jak i ultrasonografii biomedycznej.

Rozkład ciśnienia akustycznego w wolnym polu akustycznym w płaszczyźnie XY i XZ, znajdujących się 3,4 mm od powierzchni przetwornika, co odpowiada położeniu przedniego jądra wzgórza myszy, przedstawiono na Rysunku 2B,C. Pomiary te uzyskano poprzez skanowanie hydrofonem w dziedzinie XY i XZ. Rozkład ciśnienia akustycznego w przezczaszkowym polu akustycznym w płaszczyźnie XY i XZ, znajdujących się 3,4 mm od powierzchni przetwornika, przedstawiono na Rysunku 2D,E. Zmierzone wolne ciśnienie akustyczne wynosi 730 kPa, a zmierzone przezczaszkowe ciśnienie akustyczne wynosi 580 kPa dla częstotliwości środkowej 500 kHz. Zmierzona grubość czaszki wynosi średnio około 0,2 mm. Przyjmujemy, że zależność dyspersyjna jest w przybliżeniu liniowa, zatem czaszka posiada współczynnik tłumienia wynoszący 19,98 dB/cmMHz. Lekki przetwornik o masie około 1,66 g pozwala myszy na swobodne poruszanie się, co ułatwia obserwację behawioralnej odpowiedzi myszy pod wpływem FUN oraz ścieżki ruchu.
Sygnały z włókien optycznych rejestrowano podczas FUN (Rysunek 4B,D), stosując odpowiednio obwiednię prostokątną i sinusoidalną. W eksperymencie wykorzystano pięć samców myszy. Impuls prostokątny trwał 300 ms, natomiast ciągły impuls sinusoidalny trwał 471 ms, co zapewnia taką samą całkowitą energię w dwóch różnych FUN (Rysunek 4A,C). Wzmocnienie sygnału z włókna optycznego wskazuje na wzrost aktywności neuronalnej. Odpowiedź neuronalna w warunkach FUN jest szybka, co sugeruje, że przetwornik posiada wystarczającą energię i doskonałe możliwości ogniskowania.
<img alt="Schemat montażu czujnika drucianego z polipropylenu do badania przewodności elektrycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Proces produkcji przetwornika. Obejmuje on w kolejności podłączenie arkusza piezoelektrycznego do drutu, a następnie jego zapakowanie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja przetwornika ultradźwiękowego; obejmuje system silnika hydrofonu, generator sygnałowy, oscyloskop." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konfiguracja pomiaru pola ultradźwiękowego i charakterystyka przetwornika ultradźwiękowego. (A) Konfiguracja do pomiaru pola ultradźwiękowego obejmuje hydrofon, system silnika, oprogramowanie sterujące, generator sygnałowy oraz oscyloskop. (B, D) Schemat pomiarów przetwornika ultradźwiękowego w wolnym i transkranialnym polu akustycznym oraz wyniki pomiarów poprzecznego i podłużnego pola dźwiękowego. (C, E) Wykres poprzecznego pola dźwiękowego w pozycji ogniskowej przetwornika, gdzie czerwona linia wskazuje pole dźwiękowe w pozycji -3 dB. (F, G) Wykres przebiegu fali sygnału wyjściowego zmierzonego przez hydrofon dla przetwornika. Obszar wewnątrz czerwonej przerywanej ramki oraz obszar wewnątrz niebieskiej przerywanej ramki reprezentują odpowiednio okres przed osiągnięciem stabilnej amplitudy przebiegu oraz okres dzwonienia przetwornika na końcu. Obszar wewnątrz pomarańczowej przerywanej ramki reprezentuje stabilną część przebiegu fali, która jest wykorzystywana do obliczenia amplitudy ciśnienia, oznaczonej jako p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obliczanie parametrów ultradźwiękowych i schemat przebiegu impulsu; obwiednie sinusoidalne i prostokątne, wskaźniki intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Oprogramowanie do obliczeń i parametry ultradźwiękowe. (A) Własnoręcznie przygotowany interfejs do obliczania parametrów ultradźwiękowych. Obliczono wartości MI, Isppa oraz Ispta. Interfejs jest dostępny pod adresem https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) Schematy przebiegów ciśnienia ultradźwiękowego. Zastosowano obwiednię impulsu sinusoidalną oraz obwiednię impulsu prostokątną. Okres (T) reprezentuje czas trwania jednego cyklu częstotliwości roboczej. Impuls, znany jako pojedyncza ciągła sonikacja, trwa określony czas nazywany czasem trwania impulsu (PD). Zazwyczaj impulsy są powtarzane w sekwencji zwanej pociągiem impulsów. Odstęp czasu między dwoma kolejnymi impulsami w pociągu impulsów nazywany jest przerwą między powtórzeniami impulsów (PRI), obliczaną jako odwrotność częstotliwości powtarzania impulsów (PRF). Cała sekwencja impulsów, znana jako pociąg impulsów, ma określony czas trwania, nazywany czasem trwania pociągu impulsów. Czas odstępu oznacza czas trwania pojedynczej próby. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza kształtu fali; wykres z-score w funkcji czasu; fale prostokątne i sinusoidalne; dane dotyczące odpowiedzi sygnału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Sygnał fotometrii światłowodowej podczas FUN. (A, C) Parametry ultradźwiękowe w obwiedni prostokątnej (B) i sinusoidalnej (D). (B, D) Sygnał fotometrii światłowodowej odpowiednio podczas FUN w przypadku (A) oraz (C). Zielony cień oznacza czas trwania FUN. Linia ciągła reprezentuje średnią, a odcienie niebieskiego i czerwonego oznaczają średnią i odchylenie standardowe zarejestrowanych sygnałów. W eksperymencie wykorzystano pięć samców myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół obejmuje produkcję przetworników, raportowanie parametrów, zabieg chirurgiczny i rejestrację sygnału dla całego operacyjnego przepływu pracy jednoczesnej skoncentrowanej neuromodulacji ultradźwiękowej i rejestracji fotometrii światłowodowej u myszy o swobodnym ruchu.

Jednoczesna zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa i zapis fotometrii światłowodowej w myszy swobodnej

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

Nasze laboratorium zajmuje się punktowym zastosowaniem technologii opartych na ultradźwiękach do badania funkcji mózgu i rozwiązywania problemów z jego funkcjonowaniem. Nasze obecne badania koncentrują się przede wszystkim na dwóch kluczowych błędach: funkcjonalnym obrazowaniu ultrasonograficznym i skoncentrowanej neuromodulacji ultrasonograficznej. Neuromodulacja skoncentrowana na ultradźwiękach jest uważana za potencjalne podejście do interwencji w mózg u ludzi, jednak jej mechanizmy są niejasne.Niedawno zatwierdzono, że integracja optometrii światłowodowej i skupienie się na neuromodulacji ultradźwiękowej jest przydatne do badania parametrów efektywnych w celu modulowania określonych typów neuro w różnych rozwijających się regionach. Protokół ten ma na celu zarówno naukowcom, jak i wykrycie neuroaktywności modulowanej ultradźwiękami u swobodnie poruszających się myszy bez znieczulenia lub stereotaktycznego mocowania ramy przy użyciu minimalnie inwazyjnej technologii optometrii światłowodowej do uchwycenia dynamiki wapnia jako miary neuroaktywności pod implantem. Łagodzi to potencjalne zakłócające skutki wibracji dźwiękowych samej sondy.Ten protokół jest odpowiedni do badania percepcji, koordynacji i zachowania. Umożliwia to badanie enzymów dopasowania neuromodulacji ultradźwiękowej oraz opracowanie nowych miejsc parametrów do leczenia zaburzeń mózgu. Aby rozpocząć, przygotuj płytkę piezoelektryczną.Za pomocą pasty epoksydowo-srebrnej przymocuj drut po obu stronach płytki piezoelektrycznej. Gdy pasta epoksydowa zastygnie, użyj multimetru, aby zmierzyć rezystancję na obu końcach drutu, aby upewnić się, że wynosi ona w przybliżeniu zero. Następnie nałóż warstwę taśmy dwustronnej na czystą powierzchnię tafli szkła.Przyklej szczelnie płytkę piezoelektryczną i miedziany pierścień do tafli szkła. Bezpiecznie włóż rurkę polipropylenową o średnicy zewnętrznej trzech milimetrów do środka płyty piezoelektrycznej i mocno przyklej ją do tafli szkła. Teraz odkurz przygotowany klej z żywicy epoksydowej.Za pomocą jednorazowej strzykawki wyekstrahuj żywicę epoksydową i powoli wstrzyknij ją do miedzianego pierścienia. Za pomocą lutownicy elektronicznej luźne końce dwóch przewodów do złącza z nakrętką bagnetową. Po wyjęciu tafli szkła należy oczyścić powierzchnię przetwornika alkoholem.Na początek umieść hydrofon i przetwornik w zbiorniku na wodę wypełnionym wodą dejonizowaną. Odkryj maksimum pola w płaszczyźnie ogniskowej dzięki skanowaniu 2D. Następnie zidentyfikuj maksimum pola na innej płaszczyźnie z wyraźnym maksimum.Po porównaniu współrzędnych X i Y dwóch maksimów, w razie potrzeby dostosuj położenie i orientację przetwornika. Ustaw końcówkę hydrofonu tak, aby znajdowała się jeden milimetr od powierzchni przetwornika, umieszczając ją pośrodku prawej krawędzi. Następnie zainicjuj program skanujący, aby uchwycić swobodne pole akustyczne w płaszczyźnie XC.Przesuń hydrofon wzdłuż osi Z, aby określić głębokości związane z przestrzennym ciśnieniem szczytowym. Następnie przesuń hydrofon do prawego dolnego rogu przetwornika w płaszczyźnie XY. Włącz i zainicjuj program skanowania, aby uchwycić swobodne pole akustyczne w płaszczyźnie XY.Po umieszczeniu przetwornika na czaszce przygotowanej myszy, należy uzyskać XC w przezczaszkowym polu akustycznym płaszczyzny XY poprzez skanowanie hydrofonowe. Odczytaj amplitudy ciśnienia. Odczytaj wymiary ogniskowej przy 3 decybelach i położenie na płaszczyznach XY i XC w przezczaszkowym polu akustycznym, podaj parametry czasu trwania impulsu, w tym Amax, czas trwania impulsu, interwał powtarzania impulsów, czas trwania ciągu impulsów i obwiednię.Na początek użyj suwaka, aby przyciąć sierść na głowie znieczulonego zwierzęcia i zdezynfekuj obszar za pomocą 70% etanolu i jodu powidonu. Umieść mysz w pozycji leżącej na ramie stereotaktycznej. Wykonaj nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od kości potylicznej do początku kości nosowej.Po usunięciu skóry pokrywającej półkule użyj sterylnej soli fizjologicznej, aby oczyścić czaszkę i wyeliminować pozostałą okostną. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż 3% nadtlenek wodoru na odsłoniętą czaszkę na około dwie do trzech sekund, aby utworzyć mikropory. Następnie dokładnie spłucz sterylną solą fizjologiczną i upewnij się, że obszar jest całkowicie suchy.Następnie utwórz kraniotomię z otworem wiertła o średnicy 0,6 milimetra. Zmyj wszelkie zanieczyszczenia sterylną solą fizjologiczną. Włóż tuleję światłowodową do uchwytu sondy i podłącz ją do ramienia stereotaktycznego.Użyj ramienia stereotaktycznego, aby wyrównać implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania i włóż go do obszaru zainteresowania. Teraz za pomocą sterylnej wykałaczki rozprowadź cienką warstwę przygotowanego cementu dentystycznego na czaszce i na dolnej części implantu. Ostrożnie odłącz uchwyt sondy.Przygotuj rurę polipropylenową i przetnij ją na całej długości. Za pomocą pęsety przymocuj rurkę do dolnej części implantu. Po wsypaniu proszku cementu dentystycznego do rury, dodaj wymagany płyn i odczekaj kilka minut, aż cement dentystyczny stwardnieje.Zlokalizuj otwór rury i ostrożnie zaciśnij go, aby go usunąć za pomocą pęsety. Po przygotowaniu mieszanki cementu dentystycznego do aplikacji, upewnij się, że równomierna i cienka warstwa jest rozprowadzona na czaszce. Następnie wywierć trzy otwory w wydrukowanym w 3D pierścieniu.Wkręć w odpowiednie otwory. Włóż górną część implantu do otworu w prefabrykowanym przetworniku. Upewnij się, że wewnętrzna ściana pierścienia wydrukowanego w 3D jest gładka.Następnie umieść go wokół przetwornika umieszczonego na czaszce myszy. Nałóż cement dentystyczny na połączenie między pierścieniem a czaszką. Następnie odczekaj kilka minut, aż cement dentystyczny zastygnie.Ostrożnie wyjmij przetwornik i mocno dokręć. Po ustawieniu znieczulonej myszy na ramie stereotaktycznej należy oczyścić górną powierzchnię implantu alkoholem. Wstrzyknij wodę i środek sprzęgający do przestrzeni między implantem a pierścieniem wydrukowanym w 3D.Włóż patchcord światłowodowy do środka przygotowanego przetwornika. Następnie podłącz implant do patchcordu światłowodowego. Ostrożnie włóż przetwornik do tego obszaru.Następnie umieść mysz na otwartym polu i pozwól jej się obudzić. Podłącz przetwornik do ultradźwiękowego układu wzbudzenia i podłącz patchcord światłowodowy do światłowodowego systemu nagrywania. Aktywuj zarówno ultradźwiękowe urządzenie wzbudzające, jak i światłowodowy system nagrywania.Sygnały światłowodowe rejestrowano pod wpływem zogniskowanej neuromodulacji ultradźwiękowej, przy czym obwiedni były odpowiednio kwadratowe i sinusoidalne. Sygnał kwadratowy trwał 300 milisekund, podczas gdy ciągły sygnał sinusoidalny trwał 471 milisekund.

simultaneous-focused-ultrasound-neuromodulation-fiber-photometry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę rejestrowania aktywności neuronalnej w swobodnie poruszającej się myszy za pomocą fotometrii światłowodowej. W tej metodzie neurony w określonym regionie mózgu wyrażają genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia. Bodziec jest stosowany do tego obszaru mózgu, a zależna od bodźca zmiana fluorescencji jest mierzona w celu zidentyfikowania aktywności neuronalnej.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się myszy za pomocą fotometrii światłowodowej

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje, jak implementować i wykonywać zapisy fotometryczne z wieloma włóknami, jak korygować artefakty niezależne od wapnia, oraz ważne kwestie dotyczące obrazowania fotometrycznego dwukolorowego.

Fotometria wielowłóknowa do rejestrowania aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się zwierząt

Ten protokół opisuje kwantyfikację wolumetrycznych zmian hemodynamicznych mózgu w mózgu myszy za pomocą funkcjonalnych ultradźwięków (fUS). Procedury dla mapy aktywacji funkcjonalnej 3D po stymulacji sensorycznej, a także łączności funkcjonalnej w stanie spoczynku są przedstawione jako przykłady ilustracyjne u myszy znieczulonych i obudzonych.

Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Poznaj metodę jednoczesnej zogniskowanej neuromodulacji ultradźwiękowej i fotometrii światłowodowej u swobodnie poruszających się myszy. Technika ta umożliwia rejestrację dynamiki wapnia jako wskaźnika aktywności nerwowej w badaniach nad funkcją mózgu.

Jednoczesna zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa i zapis fotometrii światłowodowej w myszy swobodnej

Przeglądaj więcej filmów