Name: Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Naucz się izolować wysokiej jakości mitochondria z tkanki serca gryzoni. Ta metoda wykorzystuje wysokorozdzielczą respirometrię do oceny czynności mitochondrialnej w badaniach nad chorobami serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Danielowi A. Beardowi i Kalyanowi C. Vinnakocie za ich fundamentalny wkład w ten protokół. Ta praca została sfinansowana z grantu NSF CAREER MCB-2237117.

Użytkowanie i leczenie wszystkich kręgowców zostało przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, sprawdzonymi i zaakceptowanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Protokół ten został opracowany przy użyciu zarówno samców, jak i samic świnek morskich albinosów Hartley oraz szczurów Sprague Dawley (SD). W celu wyizolowania mitochondriów sercowych od świnek morskich zwierzęta uśmierano w wieku od 4 do 6 tygodni (300-450 g). Mitochondria serca od szczurów SD obu płci uzyskano w wieku 10-13 tygodni (250-400 g). Przepisy na są opisane w tabeli 1 i powinny być przygotowane z wyprzedzeniem. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem izolacji oznacz dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml jako "Spiny 1 i 2" oraz "Wirowanie 3".</li>
	<li>Na lodzie umieścić probówki, świeżo rozmrożony bufor izolacyjny (IB), ostre nożyczki do mielenia mięsa, zmontowaną sondę homogenizacyjną i zlewkę o pojemności 5 ml lub pojemnik o równoważnej wielkości.</li>
	<li>Umieść świeżo rozmrożony bufor oddechowy (RB) w inkubatorze, aby się ogrzał do kolejnych testów oddechowych.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić wirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Upewnij się, że cały sprzęt jest ułożony i 20 μl proteazy 7-15 U/mg z Bacillus licheniformis zostało dodane do probówki oznaczonej "Spiny 1 i 2".</li>
	<li>Skonfiguruj zależny od grawitacji system ciśnieniowy do perfuzji przez kaniulację za pomocą buforu Cardioplegia (CB, Tabela 1), szklanej kaniuli i plastikowej rurki z dołączonym zaworem odcinającym.</li>
	<li>Ułóż narzędzia chirurgiczne i dołącz odpowiednie nożyczki i kleszcze do preparowania i kaniulacji serca. 
	UWAGA: Cała woda powinna być czystej jakości (18,2 MΩ·cm)</li>
</ol>
2. Sekcja tkanek
<ol>
	<li>Zwierzętom wstrzykiwać jałowy siarczan heparyny dootrzewnowo w dawce 500 j./kg.</li>
	<li>Pozostawić zwierzę w komorze indukcyjnej na 15 minut po podaniu heparyny. W tym czasie należy dostarczyć 2 l/min czystego gazuO2, aby w pełni natlenić zwierzęta, uspokoić je i zminimalizować stres, który może mieć niekorzystne konsekwencje dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Indukcję znieczulenia należy rozpocząć od ciągłego przepływu izofluranu w stężeniu 0,5%. Po 1 minucie zwiększ do 1%. Kontynuujzwiększaj o 1% co minutę, aż zostanie osiągnięte 5%. Po osiągnięciu 5% odczekaj 1 minutę i monitoruj wzorzec oddychania zwierzęcia.</li>
	<li>Gdy oddech zwolni i stanie się ciężki (mniej więcej po 6,5 minuty), wyłącz przepływ izofluranu i tlenu.</li>
	<li>Szybko wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i sprawdź, czy jest odpowiednia głębokość znieczulenia, ściskając łapę i sprawdzając, czy nie ma odruchu rogówkowego. Jeśli zwierzę zareaguje na którykolwiek z bodźców, umieść je z powrotem w komorze indukcyjnej, przeczytajpodać znieczulenie i powtórz kontrolę głębokości znieczulenia.</li>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy szybko odciąć głowę gilotyną, aby zranić kręgosłup szyjny i położyć leżące ciało na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj dwa równoległe pionowe nacięcia od obojczyków biegnące wzdłuż bocznej klatki piersiowej w dół klatki piersiowej. Upewnij się, że nacięcia są wystarczająco głębokie, aby przeciąć żebra po bocznej stronie klatki piersiowej, ale unikaj uszkadzania struktur wewnątrz klatki piersiowej, takich jak serce lub duże naczynia. 
	UWAGA: Rozmiary pionowych nacięć zależą od użytego zwierzęcia. Jeśli używasz świnek morskich i szczurów, przytnij do przepony (około 6,35 cm dla szczurów i 11 cm dla świnek morskich). Jeśli używasz myszy, wykonaj standardową torakotomię27.</li>
	<li>Odsłoń serce za pomocą hemostatu, aby przemieścić przednią część klatki piersiowej i wypełnij odsłoniętą klatkę piersiową lodem. Ten krok minimalizuje czas ciepłego niedokrwienia i zwiększa żywotność wyizolowanych organelli.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby tępo wypreparować grasicę i osierdzie oraz całkowicie odsłonić serce.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zastosuj delikatną dolną trakcję na sercu, aby odsłonić i zidentyfikować aortę. Aorta jest najgrubszym dużym naczyniem rozgałęziającym się od podstawy serca. Inne duże naczynia, takie jak żyła płucna, są zauważalnie bardziej przezroczyste niż aorta.</li>
	<li>Przetnij aortę około 4-6 mm powyżej korzenia aorty, ale poniżej punktów rozgałęzień tętnicy szyjnej.</li>
	<li>Kanalenuj aortę i perfunduj serce28,29 lodowatym roztworem kardioplegii (CB) za pomocą zależnej od grawitacji głowicy ciśnieniowej, aż tętnice wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a narząd stanie się zblednięty. 
	UWAGA: W przypadku dużych gryzoni dobrze sprawdza się średnica kaniuli 1,8-2,2 mm, natomiast w przypadku mniejszych gryzoni zalecany jest zakres średnic 1,4-1,8 mm. Retroperfuzja nie powinna trwać dłużej niż 15-30 sekund, aby naczynia wieńcowe oczyściły się z krwi.</li>
	<li>Odizoluj mięsień sercowy komory, wycinając przedsionki, chrzęstną tkankę zastawkową i tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Umieść komory we wstępnie schłodzonej zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 0,1-0,2 ml lodowatego IB.</li>
	<li>Zmiel tkankę ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, aż kawałki będą miały około 1 mm3.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie mitochondriów i kwantyfikacja białek
<ol>
	<li>Przenieść zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej oznaczonej jako "Spiny 1 i 2" zawierającej roztwór proteazy.</li>
	<li>Dodaj lodowaty IB do końcowej objętości 25 ml.</li>
	<li>Za pomocą zmotoryzowanego ręcznego homogenizatora wirnikowo-stojanowego rozprowadź tkankę z prędkością 18 000 obr./min na lodzie przez 20-25 s.</li>
	<li>Odwirować homogenizowaną tkankę w probówce oznaczonej jako "Spiny 1 i 2" przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant (który zawiera proteazę), wlewając go do pojemnika na odpady i delikatnie przepłukać osad 5 ml IB w celu usunięcia pozostałości proteazy.</li>
	<li>Po wyrzuceniu płukania, ponownie zawiesić osad ze świeżym, lodowatym IB do końcowej objętości 25 ml za pomocą delikatnego wiru.</li>
	<li>Wirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń supernatant (zawiera mitochondria), delikatnie wlewając go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 50 ml oznaczonej "Spin 3". Podczas nalewania należy uważać, aby nie przesunąć luźnej górnej części granulki. Alternatywnie do pobrania supernatantu można użyć pipety transferowej lub stripette.</li>
	<li>Odwirować supernatant o stężeniu 8000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić powstały supernatant i zachować osad zawierający mitochondria.</li>
	<li>Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wchłonąć nadmiar supernatantu z wewnętrznej ścianki probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przechowywać granulki w temperaturze 4 °C na lodzie tak długo, jak to możliwe.</li>
	<li>Aby ponownie zawiesić mitochondria, dodaj 80 μl lodowatego IB na dno probówki. Delikatnie zawiesić osad, wielokrotnie myjąc IB nad osadem.</li>
	<li>Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ustaw mikropipetę na zasysanie i dostarczanie od 40 do 60 μl objętości.</li>
	<li>W miarę rozpraszania się osadu mitochondrialnego należy zwiększyć objętość mikropipety, aby skutecznie zawiesić granulowane mitochondria. Unikaj dotykania granulki końcówką pipety i unikaj tworzenia pęcherzyków.</li>
	<li>Po ponownym zawieszeniu przenieś mitochondria do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej i oznacz ją jako mitochondria podstawowe. Zanotuj całkowitą objętość ponownego zawieszenia.</li>
	<li>Aby określić stężenie białka mitochondrialnego w próbce, należy przeprowadzić test białka całkowitego przy użyciu dobrze znanych testów białkowych BCA lub Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Alternatywną lub uzupełniającą strategią oceny plonu jest określenie aktywności syntazy cytrynianu. Dla porównania, zawartość mitochondriów można określić ilościowo, postępując zgodnie z protokołem opisanym w Vinnakota et al.30.</li>
</ol>
4. Kontrole jakości
<ol>
	<li>We wstępnie schłodzonej probówce do mikrowirówek rozcieńczyć materiał mitochondrialny do pożądanego stężenia roboczego za pomocą IB. 
	UWAGA: Zapasy mitochondrialne rozcieńcza się do 40 mg / ml, aby działały przy końcowym stężeniu 0,1 mg / ml do testów respirometrycznych przy użyciu izolatów z tkanki serca.</li>
	<li>Przepłukać komory oksygraficzne, korki i strzykawki mikrolitrowe dziesięć razy wodą destylowaną, aby je wyczyścić przed użyciem w testach respirometrycznych.</li>
	<li>Aby przetestować żywotność i jakość izolatów mitochondrialnych, należy załadować 2,3 ml buforu oddechowego (RB) do komór oksygraficznych i pozwolić, aby sygnał zużycia tlenu zrównoważył się w temperaturze 37 °C przez około 10 minut lub gdy szybkość jest bliska 0.</li>
	<li>Po wyrównaniu sygnału należy wcisnąć korki i zassać nadmiar bufora, który wyłania się z kapilary korka</li>.
	<li>Dodać 1 mM EGTA za pomocą mikrolitrowej strzykawki, aby chelatować resztki wapnia w lub próbce mitochondrialnej.</li>
	<li>Aby wspomóc oddychanie, dodaj 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu.</li>
	<li>Po dodaniu substratów dodać bolus rozcieńczonych mitochondriów, aby osiągnąć stężenie robocze i umożliwić oddychanie przez 5 minut. Okres ten określa się mianem LEAK lub oddychania w stanie 2.</li>
	<li>Po 5 minutach dodaj bolus 500 μM ADP, aby zainicjować oddychanie w stanie 3, zwanym również OXHPOS, i pozwól mitochondriom oddychać aż do niedotlenienia.</li>
	<li>Oblicz współczynnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc maksymalną szybkość zużycia tlenu w stanie 3 przez szybkość zużycia tlenu tuż przed dodaniem ADP w stanie 2 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Alternatywne wyrażenie RCR od 1 do 1/RCR może być również używane jako metryka jakości, która jest ograniczona między 0 a 1; jednak utrudnia to rozróżnienie jakości za pomocą tej metryki, gdy RCR > 10 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przepłukać komory i korki 10 razy czystą wodą, aby oczyścić oksygraf do kolejnych testów. Jeśli respirometria jest zakończona, napełnij komory 70% etanolem i umieść korki w komorach do następnego użycia.</li>
</ol>

Mitochondrial Isolation from Rodents for High-Quality Bioenergetic Studies

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma nic do ujawnienia.

Przestrzeganie metod zwięźle opisanych w tym protokole zapewni izolację dobrze sprzężonych mitochondriów z tkanki serca małych gryzoni, a także innych typów tkanek i źródeł. Ogólnie rzecz biorąc, proces powinien trwać łącznie 3-3,5 godziny, podczas których wszystkie tkanki zwierzęce, próbki i izolaty powinny pozostać na lodzie w temperaturze 4 °C w jak największym stopniu, aby ograniczyć degradację. Ta procedura jest solidna i może być zmieniona na kilka sposobów, aby lepiej dopasować się do celów eksperymentalnych i wykorzystywanych modeli. Jedną z modulacji, którą można wykonać podczas procesu rozwarstwiania tkanki, jest wykluczenie heparyny. Heparyna jest podawana w celu zapobieżenia tworzeniu się skrzepów krwi31 , ale nie jest konieczna, jeśli serce jest kaniulowane i perfuzjowane wystarczająco szybko (w ciągu 1,5 minuty od dekapitacji). Ponadto w przypadku większych gryzoni zaleca się perfuzję serca za pomocą CB, dlatego podczas pracy z sercami myszy lub innymi narządami zaleca się włączenie płukania IB przed mieleniem i wstępną homogenizacją. Ten etap pozwala na odrzucenie krwi przeniesionej z procesu preparacji. Inne zmiany obejmują zmiany w prędkościach homogenizacji i wirowania w celu zwiększenia wydajności białka mitochondrialnego. Te opisane powyżej służą do izolowania mitochondriów serca od świnek morskich i szczurów. Co ważne, protokół ten można dostosować do izolowania mitochondriów od wątroby, nerek, serc i komórek myszy gryzoni. Zalecane zmiany objętości proteazy, homogenizacji i wirowania w oparciu o określone typy tkanek i zwierzęta są bardziej szczegółowo opisane w Tabeli 3.
Po utworzeniu oczyszczonego osadu mitochondrialnego z końcowego etapu wirowania, mitochondria należy ponownie zawiesić we wstępnie schłodzonym IB. Objętość dodanego IB zależy od wielkości osadu mitochondrialnego, ale wynosi około 80 μl dla świnek morskich i szczurów. W przypadku izolacji od serc myszy dodaje się 60 μl IB w celu ponownego wymieszania. Podczas pierwszego izolowania mitochondriów zaleca się dodanie mniejszych objętości IB, aby nie rozcieńczać roztworu podstawowego. Ze względu na konsystencję granulek mitochondrialnych powstałych po oczyszczeniu próbek z wątroby i nerek, do ponownego wymieszania należy dodać znacznie mniej IB (20 μL). Inne metody sugerują zastosowanie mechanicznego ponownego zawieszenia poprzez skrobanie, które może być ścierne dla błon mitochondrialnych i zmniejszać ogólną integralność32,33. Podczas stosowania tego protokołu zaleca się delikatne mycie osadu IB w celu poprawy jakości mitochondriów. Podczas tego procesu należy uważać, aby nie wytwarzać pęcherzyków ani nie naruszać osadu końcówką pipety, ponieważ może to prowadzić do pęknięcia błony i nieprawidłowego fałdowania białka34. Tylko dociśnięcie pipety do pierwszego oporu może pomóc zmniejszyć prawdopodobieństwo tworzenia się pęcherzyków. Delikatne mycie pipetami należy przeprowadzać do momentu, gdy cała osadka znajdzie się w zawiesinie. Całkowita wydajność reprodukcji powinna wynosić 150-200 μl w przypadku mitochondriów serca świnek morskich i szczurów i mieć jasnobrązowy kolor. Bardziej skoncentrowane próbki będą miały ciemniejszy odcień brązu i można je rozcieńczyć, aby dopasować się do pożądanego zakresu stężeń roboczych po ilościowym określeniu białka mitochondrialnego.
Standardowe testy białkowe z wykorzystaniem BSA są optymalne do ilościowego oznaczania białek mitochondrialnych35. Oznaczanie białek powinno być opóźnione i inkubowane przez zalecany czas i temperaturę, zgodnie z protokołem producenta. W przypadku izolowanych mitochondriów inkubacja w temperaturze 37 °C przez 30 minut pozwala na dobrze rozprowadzone opracowanie koloru i dokładną ocenę ilościową białka. Podczas ilościowego określania całkowitej ilości białka zaleca się najpierw rozcieńczenie zawieszonych mitochondriów i IB w proporcjach 1:50, 1:100 i 1:200, aby upewnić się, że wyniki testu białka będą mieścić się w zakresie kalibracyjnym. Dalsze szczegóły dotyczące sposobu przeprowadzania testów białek przy użyciu BSA jako standardu znajdują się w zestawie producenta, więc zalecenia wymienione w niniejszym dokumencie mogą nie mieć zastosowania. Należy również wykonać test CS w celu określenia zawartości mitochondriów w każdej próbce. Ten test jest dobrze ugruntowany i pozwala na dalszą normalizację w przypadku badania różnic biologicznych między podtypami mitochondriów36.
Po oznaczeniu białka materiał mitochondrialny należy rozcieńczyć w celu uzyskania pożądanego końcowego stężenia roboczego do testów respirometrycznych. Mitochondria wyizolowane od świnek morskich i serc szczurów rozcieńcza się do 40 mg/ml, a 5 μl tego bulionu dodaje się do komory oddechowej, uzyskując stężenie robocze 0,1 mg/ml. W przypadku izolacji z pojedynczych serc myszy lub z nerek i wątroby, rozcieńczenie materiału mitochondrialnego może nie być konieczne. Można również dodać większe objętości mitochondriów w celu uzyskania pożądanych stężeń. Wskaźniki zużycia tlenu w stanie 2, które wynoszą od 35 do 55 pmol/ml/s, są dopuszczalne dla większości analiz respirometrycznych28. Szczegółowe informacje dotyczące sposobu przeprowadzania i analizowania RCR przedstawiono na rysunku 1 oraz w sekcji poświęconej reprezentatywnym wynikom; Należy jednak pamiętać, że oddychanie jest napędzane przez pirogronian i jabłczan. Inne warunki substratowe, takie jak bursztynian i rotenon, spowodują różne wartości RCR, ponieważ stosunek P/O i inne zmienne bioenergetyczne są różne37. Zastosowanie pirogronianu i jabłczanu jako paliw do układu oddechowego pozwala osiągnąć niemal maksymalny obrót w cyklu TCA i produkcję ekwiwalentów redukujących; jednak maksymalną aktywność cyklu TCA i sprzężoną funkcję ETS uzyskuje się za pomocą 5 mM pirogronianu, 1 mM L-jabłczanu i 20 mM bursztynianu. Podczas stymulacji fosforylacji oksydacyjnej w celu ilościowego określenia szybkości zużycia tlenu w stanie 3, ADP dodaje się w stężeniach co najmniej 10 razy większych niż szacowanyK D dla ADP translokatora nukleotydów adeninowych38. Można to osiągnąć za pomocą bolusów większych niż 350 μM ADP, dlatego we wszystkich testach eksperymentalnych stosowano 500 μM. Jeśli czas trwania stanu 3 jest zbyt krótki, do jego przedłużenia można zastosować niższe stężenia mitochondriów. W celu dalszej analizy oddychania można dokonać modulacji stężenia ADP, które jest wprowadzane do systemu, aby lepiej dopasować parametry eksperymentalne39. Podczas pierwszego opracowywania tego protokołu zastosowano test cytochromu C do oceny integralności błony zewnętrznej izolatów mitochondrialnych40. Jeśli wartości RCR są poniżej oczekiwanych zakresów, wykonaj test cytochromu C, aby ocenić, czy uszkodzenie błony zewnętrznej jest znaczące. Aby to zrobić, dodaj 10 μM cytochromu C do komory oddechowej i potwierdź, że wzrost oddychania jest poniżej 5 lub 10% szybkości stanu 4. Oczekiwane zakresy pochodzą z wcześniej opublikowanych badań i są specyficzne dla gatunku, tkanki i substratu. Jeśli dodanie cytochromu c stymuluje oddychanie w stanie 4 powyżej 10%, ostatnie 8 000 x g wirowania można powtórzyć w celu usunięcia uszkodzonych mitochondriów. To powiedziawszy, uszkodzenie błony zewnętrznej może być częścią fenotypu choroby, a zatem test cytochromu C powinien być interpretowany z myślą o tym41. Po uzyskaniu konsekwentnie wysokich wartości RCR z niskimi (<10%) efektami stymulowanymi cytochromem C, badanie to staje się konieczne i zalecane tylko wtedy, gdy wartości RCR leżą poza dopuszczalnymi zakresami. Jeżeli wynik testu na obecność cytochromu C wynosi <10%, a wartości RCR wykraczają poza oczekiwany zakres, jak wyszczególniono w Tabeli 2, należy powtórzyć test respirometryczny z nowym RB po 10-krotnym przemyciu wodą destylowaną. Jeśli nadal obserwuje się zmniejszone wskaźniki, należy wykonać nowe odczynniki (pirogronian, jabłczan, EGTA i ADP) w celu zdiagnozowania problemu. Dodatkowo testy cytochromu C można przeprowadzać za pomocą testów ELISA i przy użyciu barwników mitochondrialnych, takich jak TMRE33,42. W zależności od rodzaju tkanki i źródła, opcje te mogą być lepiej odpowiednie do określenia integralności błony zewnętrznej.
Chociaż nie ma większych ograniczeń związanych z używaniem tego protokołu do izolowania mitochondriów serca, ważne jest, aby pamiętać, że podczas korzystania z tych metod należy wziąć pod uwagę pewne kwestie. Na jakość izolatów mitochondrialnych duży wpływ ma temperatura i czas potrzebny zarówno do perfuzji serca, jak i ponownego zawieszenia oczyszczonego osadu. W związku z tym znajomość tych procesów może być wymagana w celu uzyskania RCR porównywalnych z tymi zgłoszonymi w niniejszym dokumencie. Dodatkowo ważny jest skład i roztworów stosowanych podczas procesu izolacji, ponieważ bezpośrednio wpływa na integralność i funkcję mitochondriów43. Bufor wymienione w tabeli 1 są podane jako odniesienia i pozwoliły na izolację dobrze sprzężonych mitochondriów z różnych źródeł tkankowych, ale można wprowadzić zmiany w celu ograniczenia ilości chlorku w analizach oddychania, ponieważ może to zakłócać translokację nukleotydów adeninowych i funkcję ETS28. Skład buforu można również zmienić, aby lepiej wyizolować mitochondria wątroby. Ponieważ wątroba jest narażona na wysokie stężenia kwasów tłuszczowych, zaleca się, aby narząd i tkankę mieloną przemyć buforem zawierającym podwyższone stężenia BSA, jeśli zaobserwowane są RCR wykraczające poza oczekiwany zakres. Chociaż jakość izolatów mitochondrialnych uzyskanych z odcinków wątroby jest dobrze sprzężona i spójna, zmiana ta może skutkować poprawą funkcji organelli. Należy również pamiętać, że izolacja mitochondriów od komórek wykorzystujących te metody wymaga dużej ilości hodowanych komórek, co stanowi potencjalne ograniczenie. Co więcej, protokół ten nie jest specjalnie zaprojektowany dla izolatów komórkowych, ale okazał się skuteczny po wdrożeniu. W związku z tym ukierunkowane metody izolacji hodowanych komórek mogą być lepiej przydatne. Alternatywnie, aby ocenić jakość mitochondriów, naukowcy mogą zdecydować się na sondy fluorescencyjne do obliczenia RCR. Metody spektrofluorometryczne są popularnym wyborem, zwłaszcza jeśli ekstrahowane są mniejsze ilości białka44,45.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być stosowany do konsekwentnego izolowania dobrze sprzężonych mitochondriów sercowych od małych zwierząt, takich jak świnki morskie i szczury. Można go łatwo zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności białka poprzez zmianę prędkości homogenizacji, czasu wirowania i liczby spinów, aby umożliwić izolację mitochondriów od serc, wątroby, nerek i komórek myszy. Co więcej, protokół ten jest na tyle ogólny i solidny, że został wykorzystany do zbadania funkcji mitochondriów u gatunków innych niż ssaki, takich jak minóg morski46, a także do przeprowadzenia analizy strukturalnej przy użyciu klasycznej mikroskopii elektronowej i krioelektronowej 40,47. Podczas gdy wiele ostatnich badań koncentruje się na badaniu zachowania mitochondriów w nienaruszonych systemach komórkowych i tkankowych, zakres i głębokość informacji uzyskanych z izolowanych mitochondriów przy użyciu tych metod ujawnia wpływ na metabolomikę, stres oksydacyjny i produkcję ATP, który nigdy nie będzie bezpodstawny. Izolacja dobrze sprzężonych mitochondriów pozwala naukowcom na zbadanie kluczowych aspektów rozwoju i progresji choroby, które nie są możliwe w innych modelach komórkowych. Ze względu na wszechstronność tego protokołu, zmiany w energetyce mitochondriów obserwowane w patologiach, takich jak choroby sercowo-naczyniowe, cukrzyca i zaburzenia neurologiczne, mogą być badane przy użyciu opisanej w nim metodologii.

Mitochondria to subkomórkowe organelle, które tworzą cytoplazmatyczne warunki energetyczne zoptymalizowane pod kątem określonych funkcji komórki. Podczas gdy badania na poziomie komórek, tkanek i organizmów mogą dostarczyć informacji na temat funkcji mitochondriów, izolacja organelli zapewnia poziom kontroli eksperymentalnej, który nie jest możliwy w inny sposób. Izolacje mitochondrialne są wykonywane od 1940 roku, umożliwiając mechanistyczne badania metabolizmu i oddychania w różnych komórkach i tkankach1,2. Historyczne znaczenie mitochondriów jest również dobrze udokumentowane3. Jako główni producenci ATP, mitochondria odgrywają wiele kluczowych ról, które są niezbędne dla optymalnego funkcjonowania komórek i narządów4. W macierzy mitochondrialnej substraty są utleniane w cyklu TCA, wytwarzając redukujące odpowiedniki i ruchome nośniki elektronów, takie jak NADH i UQH25,6. Cytochrom C jest trzecim głównym ruchomym nośnikiem elektronów w mitochondrialnej sieci reakcji biochemicznych7. Cząsteczki te są następnie utleniane przez kompleksy transbłonowe systemu transportu elektronów (ETS) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej8. Reakcje redoks ETS są sprzężone z translokacją protonów z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. Procesy te ustanawiają elektrochemiczny gradient protonów, który jest używany do fosforylacji ADP za pomocą Pi przez syntazę F1F0 ATP w celu wytworzenia ATP9,10. Poszczególne procesy zachodzące w każdym kompleksie można badać za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości przy użyciu elektrod typu Clark lub testów zużycia tlenu na mikropłytkach11,12. Ponadto modele chorób i terapie wykorzystujące izolowane mitochondria mogą określić wpływ lub znaczenie funkcji mitochondriów w postępie niektórych patologii. Okazało się to owocne w dziedzinie kardiologii, gdzie zmiany w dostarczaniu paliwa i substratu zostały wykorzystane do wyjaśnienia, w jaki sposób dysfunkcja mitochondriów wpływa na niewydolność serca13,14,15,16. Wiadomo również, że mitochondria wpływają na rozwój innych stanów chorobowych, takich jak cukrzyca, rak, otyłość, zaburzenia neurologiczne i miopatie17,18. W związku z tym zastosowanie wyizolowanych lub oczyszczonych mitochondriów umożliwia mechanistyczne badania metabolizmu oksydacyjnego i produkcji ATP w tkance źródłowej.
Nie brakuje protokołów izolacji mitochondriów ze względu na ich znaczenie w badaniach bioenergetycznych. Ponadto można znaleźć wysoce specyficzne metody dostosowane do subpopulacji mitochondriów w tkankach i komórkach19,20. Podstawowe etapy proceduralne są podobne między metodami izolacji, ale można wprowadzić zmiany w składzie bufora, etapach homogenizacji i wirowaniu w celu poprawy ilości i jakości mitochondriów. Zmiany w tych aspektach opierają się na zapotrzebowaniu metabolicznym tkanki, ogólnej funkcji narządów, gęstości mitochondriów i innych czynnikach. W tkankach takich jak wątroba i mięśnie szkieletowe stosuje się ręczne homogenizatory w celu zachowania integralności mitochondriów i ograniczenia uszkodzeń błon mitochondrialnych21. Jednak w przypadku izolacji od nerek niektóre protokoły sugerują użycie ręcznej homogenizacji lub komercyjnych zestawów w celu uzyskania lepszych wyników22. Chociaż obie metody dają funkcjonalne mitochondria, jakość organelli może zostać zagrożona przez dodatkowy czas potrzebny na ukończenie izolacji przy użyciu tych protokołów. Wirowanie jest również niezbędne do ekstrakcji białka mitochondrialnego, ponieważ oddziela składniki komórkowe, takie jak jądra i inne organelle, od mitochondriów23. Podczas procesu izolacji zastanawia się, czy należy zastosować wirowanie różnicowe, czy oparte na gęstości, aby uzyskać czystsze izolaty24. Podczas gdy wirowanie gęstości może oddzielić mitochondria od organelli o podobnym ciężarze właściwym, takich jak peroksysomy, nie jest dobrze ustalone, czy mitochondria z tych metod lepiej reprezentują funkcję organelli in situ w porównaniu z mitochondriami wyizolowanymi za pomocą wirowania różnicowego. W dziedzinie fizjologii mitochondriów preferowane jest wirowanie oparte na gęstości i można je łatwo zmienić w celu zwiększenia czystości izolatu. Przed eksperymentami należy rozważyć, czy zmiany sił g, czasu wirowania i liczby spinów wirowania są uwzględniane ze względu na ich wpływ na oczyszczanie mitochondriów. Co więcej, resuspension mitochondriów, prawdopodobnie najważniejszy etap podczas izolacji, różni się znacznie między badaniami, z zastosowaniem skrobania, mieszania na bazie wirów lub homogenizacji23,25,26. Mechaniczne ponowne zawieszenie tego typu może być zbyt ścierne i naruszać integralność błony mitochondriów. Z tego powodu należy przeprowadzić delikatne mycie, aby to skorygować. Pomimo mnogości modulacji i sugerowanych metodologii, istnieje mniej kompleksowych protokołów o wysokiej odtwarzalności i zdolności adaptacyjnych dla modeli gryzoni.
Metody opisane tutaj opisują szczegółowy, solidny i wysoce powtarzalny protokół, który daje oczyszczone, dobrze sprzężone mitochondria z tkanki serca małych zwierząt. Jak wykazano, metodę tę można łatwo dostosować do specyficznych potrzeb każdego eksperymentu i/lub środowiska laboratoryjnego w zakresie izolowania mitochondriów od nerek, wątroby i hodowanych komórek. Dalsze modyfikacje można wprowadzić w celu wyizolowania mitochondriów z tkanek i innych zwierząt niewymienionych tutaj. Dostępne są receptury używane dla wszystkich izolacji, które w razie potrzeby mogą być modyfikowane. Podobnie jak w przypadku innych opublikowanych protokołów, wdraża się homogenizację zmotoryzowaną i wirowanie różnicowe; Jednak w zależności od źródła izolacji dokonuje się korekt zarówno czasu ścinania, jak i siły, z jaką próbki są odwirowywane, aby konsekwentnie dostarczać wysokiej jakości izolaty mitochondrialne. Warto zauważyć, że protokół ten różni się od innych tym, że wykorzystuje delikatne mycie za pomocą pipetowania w celu ponownego zawieszenia granulowanych mitochondriów, co pomaga zachować integralność błony mitochondrialnej i utrzymać ogólną funkcjonalność organelli. Białko mitochondrialne określa się ilościowo albo przez oznaczenie całkowitego białka, albo przez pomiar aktywności syntazy cytrynianu. Użyteczność i szerokie zastosowanie tej metody izolacji są dodatkowo poparte wartościami współczynników kontroli oddechowej (RCR) uzyskanymi w różnych organizmach i źródłach tkankowych.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml probówki do mikrowirówek Zlewka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>szklana 10 ml</td><td>Do rozwarstwiania i mielenia narządów</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td> wirówkowe 50 ml <td>Wirowanie</td></tr><tr><td>Adenozyno5'-difosforan sól monopotasowa dwuwodny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5285</td><td>Testy respirometryczne</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BSA</td><td>Thermo Scentific</td><td>PI23225</td><td>Kwantyfikacja białek mitochondrialnych</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DX0145</td><td>Do buforu (CB)</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoeter etylowy)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E4378</td><td>Do (CB i IB) i testów respirometrycznych</td></tr><tr><td>Kaniula szklana</td><td>Radnoti</td><td></td><td>Perfuzja serca świnki morskiej i szczura</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa błona śluzowa świni</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>SRE0027-250KU</td><td>Zwierzęce wstrzykiwanie IP</td></tr><tr><td>Respirometr</td><td></td><td></td> o wysokiej rozdzielczości <td>Elektroda typu Clark; oksygraf z komorami 2 ml</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td>indukcyjna</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>792632</td><td>Znieczulenie&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas L-jabłkowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>02288-50G</td><td>Testy respirometryczne</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M9272</td><td>Do bufora (RB)</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>Do strzykawek</td></tr><tr><td></td><td></td> buforowych (IB) <td>Microlitr</td><td>Rozmiary od 5 & ndash; 50 &mikro; L</td></tr><tr>Czytnik <td></td><td></td><td>mikropłytek</td><td>Musi być w stanie inkubować w temperaturze 37 & stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>475898</td><td>Do wszystkich zbiorników</td></tr><tr><td>O2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator OMNI THQ OMNI</td><td>International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>Podobne homogenizatory stojana wirnika będą działać</td></tr><tr><td>pipety</td><td></td><td></td><td>Objętości&nbsp; 2&ndash; 20 &mikro; L; 20&ndash; 200 i mikro; L; 200&ndash; 1000 &mikro; L</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Do (RB i CB)</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496</td><td>Dla (IB i RB)</td></tr><tr><td>Proteaza z Bacillus licheniformis</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9888</td><td>Do buforu (CB)</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Odczynniki Fishera</td><td>BP356-100</td><td>Testy respirometryczne</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>Do bufora (IB)</td></tr> <tr>Zestaw <td></td><td></td><td>do chirurgicznego rozwarstwiania</td><td>W zależności od źródła pochodzenia zwierzęcego i tkankowego</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> stołowa <td>Musi schłodzić do 4 & stopni; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Izolacja mitochondrialna jest praktykowana od dziesięcioleci, zgodnie z procedurami ustanowionymi przez pionierów w dziedzinie biologii molekularnej i biochemii do badania zaburzeń metabolicznych i chorób. Stała jakość mitochondriów jest niezbędna do prawidłowego zbadania fizjologii mitochondriów i bioenergetyki; Jednak dla badaczy dostępnych jest wiele różnych opublikowanych metod izolacji. Chociaż różne strategie eksperymentalne wymagają różnych metod izolacji, podstawowe zasady i procedury są podobne. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę zdolną do ekstrakcji dobrze sprzężonych mitochondriów z różnych źródeł tkanek, w tym małych zwierząt i komórek. Przedstawione kroki obejmują sekcję narządów, oczyszczanie mitochondriów, kwantyfikację białek i różne kontrole jakości. Podstawowym wskaźnikiem kontroli jakości używanym do identyfikacji mitochondriów wysokiej jakości jest współczynnik kontroli oddechowej (RCR). RCR to stosunek częstości oddechów podczas fosforylacji oksydacyjnej do szybkości przy braku ADP. Omówiono alternatywne wskaźniki. Chociaż za pomocą tego protokołu uzyskuje się wysokie wartości RCR w stosunku do ich tkankowego źródła, kilka kroków można zoptymalizować w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb badaczy. Procedura ta jest solidna i konsekwentnie prowadzi do powstania izolowanych mitochondriów z ponadprzeciętnymi wartościami RCR w modelach zwierzęcych i źródłach tkankowych.

Po zakończeniu izolacji mitochondriów należy przetestować jakość i funkcjonalność izolatów poprzez ilościowe oznaczenie szybkości zużycia tlenu (JO2) przy użyciu respirometrii wysokiej rozdzielczości. W tym celu zapasy mitochondriów rozcieńczono do 40 mg/mL, aby uzyskać stężenia robocze 0,1 mg/mL w 2 mL buforu RB dla wszystkich testów respirometrycznych z użyciem izolowanych mitochondriów serca. Oddychanie stymulowano za pomocą 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu w obecności 1 mM EGTA, chelatora wapnia, i pozostawiono do wyrównania przez 5 min w celu ustanowienia oddychania w stanie 2. W tym stanie szybkość zużycia tlenu powinna wynosić średnio 45-55 pmol/mL/s lub 27-33 nmol/mg/min. Należy wziąć pod uwagę zależną od elektrody szybkość zużycia tlenu i w razie potrzeby przeprowadzić odpowiednie korekty tła. Fosforylację oksydacyjną (stan 3) inicjuje się w 5. minucie poprzez dodanie 500 µM ADP. Dodawanie substratów oraz reprezentacyjny przebieg pomiaru szczegółowo przedstawiono na Rysunku 1. Funkcjonalne mitochondria wykazują natychmiastowy wzrost JO2 po dodaniu ADP, którego zakres zależy od źródła tkanki, co pokazano na Rysunku 2. Bez użycia EGTA resztkowy wapń ma zmienny wpływ na maksymalne szybkości JO2 podczas OXPHOS, w zależności od stężenia mitochondriów, dostępności substratów i innych czynników środowiskowych. Skład buforu jest istotny dla zachowania integralności błony mitochondrialnej i jej funkcjonalności. Wszystkie przepisy na bufory wspomniane w protokole są szczegółowo opisane w Tabeli 1 i mogą być wykorzystywane dla wszystkich opisanych tutaj preparatów mitochondrialnych.
O pomyślnym wyizolowaniu mitochondriów świadczy uzyskanie wartości RCR mieszczących się w podanym zakresie dla każdego gatunku i źródła tkanki, co przedstawiono w Tabeli 2. Na podstawie danych zebranych przy użyciu tego protokołu, w przypadku izolacji mitochondriów serca świnki morskiej, szczura lub myszy, wartości RCR powinny wynosić odpowiednio ≥16, ≥8 i ≥5. W przypadku izolacji z wątroby lub nerek szczura, wartości RCR powinny wynosić ≥6, natomiast wartości RCR z komórek uznaje się za dopuszczalne, jeśli są wyższe niż 3,8. Jeśli wartości RCR spadną poniżej tych zakresów lub wystąpią różnice jakościowe w zapisach respirometrycznych, zaleca się przeprowadzenie dodatkowego pomiaru z nowym RB i substratami w celu wykluczenia problemów wynikających z zanieczyszczeń. Chociaż transformacja 1-1/RCR ogranicza wartości do przedziału od 0 do 1, nie zaleca się stosowania tej metryki przy porównywaniu jakości mitochondriów między płciami lub gatunkami, gdy wartość RCR jest większa niż 10. Z tego powodu podczas wszystkich eksperymentów ilościowo określano standardowe wartości RCR (Stan 3/Stan 2 lub OXPHOS/LEAK). Informacje dotyczące modyfikacji, jakie można wprowadzić do tego protokołu w celu lepszej izolacji mitochondriów z serca, wątroby, nerek i komórek myszy, szczegółowo opisano w Tabeli 3.
<img alt="Wykres oddychania mitochondrialnego, Jo2 w funkcji czasu, pokazujący przejścia między stanami 2, 3 i 4 stymulowanymi przez ADP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obszary zainteresowania dla kontroli jakości z wykorzystaniem respirometrii wysokiej rozdzielczości. Komory oddechowe napełniono 2 mL RB i pozostawiono do wyrównania temperatury w 37 °C, aż szybkość zużycia tlenu zbliżyła się do 0. Po wyrównaniu dodano 1 mM EGTA, chelatora wapnia, wraz z 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu. Po dodaniu tych substratów wprowadzono mitochondria w pożądanym stężeniu roboczym (0,1 mg/mL) i pozostawiono do oddychania przez 5 min w celu uzyskania oddychania w stanie 2 (kolor żółty). W 5. minucie dodano 500 µM ADP, aby zainicjować oddychanie w stanie 3 (kolor czerwony). Wartości RCR określono poprzez uśrednienie w czasie szybkości zużycia tlenu zaznaczonych czerwonym i żółtym prostokątem, aby porównać stan 3 ze stanem 2. Stan 4 jest zaznaczony zielonym prostokątem i reprezentuje okres pozamitochondrialnej hydrolizy ATP przez ATPase; może on być wykorzystany do oceny integralności błony zewnętrznej w testach z cytochromem C. Przedstawione dane zebrano z wykorzystaniem mitochondriów serca szczura SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki badań na zwierzętach i komórkach; wykresy zależne od czasu, wykresy słupkowe; analiza serca, wątroby i nerek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne zapisy JO2 oraz współczynniki kontroli oddychania dla różnych źródeł zwierzęcych i tkankowych. Jakość wyizolowanych mitochondriów sprawdzono poprzez ilościowe określenie szybkości zużycia tlenu z wykorzystaniem respirometrii wysokiej rozdzielczości. Oddychanie było zasilane przez 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-malonianu w obecności 1 mM EGTA. Pozwolono mitochondriom i substratom oddychać przez 5 min, aby ustabilizować oddychanie w stanie 2. Maksymalne szybkości zużycia tlenu po dodaniu ADP porównano z szybkościami zużycia tlenu w stanie 2 przed dodaniem ADP, aby obliczyć współczynniki kontroli oddychania (RCR) dla każdej tkanki. Jakość mitochondriów oceniono dodatkowo, obliczając wartości 1-1/RCR zgodnie ze standardami wydajności kontroli P-L. Wykresy słupkowe po prawej stronie każdego zapisu przedstawiają średnie wartości RCR oraz 1-1/RCR ± SD dla samców (kolor niebieski) i samic (kolor zielony) dla danej tkanki. (A), (B) i (C) odnoszą się odpowiednio do danych zebranych z serc świnki morskiej, szczura Sprague Dawley (SD) i myszy Friend leukemia virus B (FVB). (D) i (E) szczegółowo przedstawiają wyniki dla wątroby i nerek szczura SD, natomiast (F) odnosi się do komórek HEK293. Pobrano trzy większe płaty wątroby, natomiast do izolacji wykorzystano obie nerki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Składy buforów. Bufor kardioplegiczny (CB), bufor do izolacji (IB) oraz bufor do respiracji (RB), stosowane w całym procesie izolacji, należy przygotować z wyprzedzeniem zgodnie z zamieszczonymi instrukcjami. CB można przechowywać do miesiąca w temperaturze 4 °C, natomiast IB i RB można przechowywać przez 4 miesiące w temperaturze -80 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Analiza współczynnika kontroli oddechowej. Izolacja mitochondriów do analiz funkcjonalnych została przeprowadzona w szerokim zakresie gatunków i źródeł tkankowych u gryzoni obu płci, a także w komórkach HEK293. Wielkość próby dla każdej płci, źródła tkanki i gatunku została szczegółowo opisana wraz ze średnimi wartościami RCR oraz 1-1/RCR ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Zalecane modyfikacje protokołu izolacji mitochondriów dla różnych tkanek w celu zwiększenia wydajności białka. Zmiany w ilościach proteazy i liczbie wirowań są przedstawione w zależności od źródła tkanki. Średnie ilości całkowitego białka (mg) obliczono na podstawie wyników testu białka BSA oraz objętości resuspensji końcowego osadu mitochondrialnego. Wartości podano jako średnia ± SD. Pogrubione instrukcje w kolumnie wirowania wskazują, czy supernatant należy odrzucić, zachować, czy połączyć. Odrzucenie odnosi się do utylizacji supernatantu w pojemniku na odpady biologiczne, natomiast zachowanie i łączenie odnoszą się odpowiednio do przeniesienia supernatantu do kolejnej probówki do wirowania lub jego gromadzenia do końcowego wirowania. Dalsze szczegóły dotyczące zmian w protokole znajdują się w sekcji dyskusji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Mitochondria zaangażowane w wiele patologii chorobowych. Są to niezbędne organelle, które działają jak ładowalne i odnawialne baterie biologiczne. Często określa się je mianem elektrowni komórki.Sprawiają, że złożone życie staje się możliwe. Nasze laboratorium jest przede wszystkim zainteresowane tym, jak te biologiczne baterie działają w stanach zdrowia i choroby, aby odkryć skuteczne środki lecznicze i opracować nowe terapie. Nasze laboratorium zidentyfikowało obecność granulek fosforanu wapnia osadzonych w macierzy mitochondriów, które zaburzają ich zdolność do dostarczania energii chemicznej komórce.Stwierdziliśmy również, że efekt ten ma charakter dymorficzny płciowo. Nasz protokół to prosty i skuteczny sposób na generowanie wysokiej jakości mitochondriów do zaawansowanych badań biomedycznych. Protokół konsekwentnie wytwarza oczyszczone mitochondria o wysokich współczynnikach sprzęgania, co jest jednym z kilku mierników jakości.W związku z tym zbierane przez nas dane są mniej podatne na artefakty izolacji i lepiej odzwierciedlają ich zachowanie NC2. Generowanie danych z wysokiej jakości izolatów mitochondrialnych pozwala nam lepiej zrozumieć, jak mitochondria działają w różnych warunkach, a tym samym zbadać możliwe mechanizmy choroby. Zidentyfikowane przez nas granulki fosforanu wapnia mogą być przyczyną niewydolności serca.Powodują one upośledzenie produkcji ATP, co może pomóc wyjaśnić nieprawidłowości bioenergetyczne obserwowane u pacjentów z ciężkim przerostem lewej komory i niewydolnością serca.

robust-mitochondrial-isolation-from-rodent-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy protokół izolacji czystych, silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura do funkcjonalnych lub strukturalnych badań bioenergetyki komórkowej, pomiarów biofizycznych, proteomiki oraz analizy mitochondrialnego DNA i lipidów.

Przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Naucz się izolować wysokiej jakości mitochondria z tkanki serca gryzoni. Ta metoda wykorzystuje wysokorozdzielczą respirometrię do oceny czynności mitochondrialnej w badaniach nad chorobami serca.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Przeglądaj więcej filmów