Procedury operacyjne i hermetyzacji biologicznej w obiekcie dla myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem: procedura immunofenotypowania
13 grudnia 2024
Tutaj opisujemy strukturę i procedury operacyjne, w tym środki powstrzymywania mikroorganizmów w obiekcie dla "dzikich myszy", używając próbki krwi do immunofenotypowania jako przykładu.
Badamy wpływ odżywiania na układ odpornościowy. Szczególnie interesują nas przeciwstarzeniowe i przeciwzapalne działanie diety ograniczającej kalorie i głodówki, a także rola mikrobioty w tych procesach. Dzikie myszy łączą dobrze scharakteryzowane tło genetyczne laboratoryjnych szczepów myszy i naturalny mikrobiom myszy wolno żyjących.
Jednak naturalny mikrobiom tych dzikich myszy zawiera wirusy, bakterie, a także pasożyty, co stanowi wyzwanie dla obiektów hodowli zwierząt. Wkładem QUEST Center for Responsible Research było opracowanie ramy sześciu R, która wzmacnia trzy R, które znamy z Russella i Burcha, zastępstwo, udoskonalenie i redukcję, poprzez włączenie trzech dodatkowych R: solidności, rejestracji i raportowania. Ramy te mają na celu zwiększenie odtwarzalności i przejrzystości badań przedklinicznych.
Chodzi o to, że wyniki eksperymentalne są bardziej wiarygodne, godne zaufania i ostatecznie można je przełożyć na kontekst kliniczny. W ciągu ostatnich czterech lat opracowaliśmy koncepcję obiektu dla dzikich myszy z odrębnymi procedurami bioizolacyjnymi. Chcielibyśmy podzielić się naszą wiedzą z naukowcami, aby umożliwić im włączenie do swojej pracy myszy z naturalnym mikrobiomem.
Udar mózgu występuje najczęściej u osób starzejących się. Układ odpornościowy posiada komórki pamięci, które zwalczają cząsteczki zakaźne i żyją z niejednorodną mikrobiotą. Tak więc modelowanie udaru u dzikich myszy jest wyrafinowanym modelem u gryzoni, który lepiej odzwierciedla stan pacjentów.
Po przebraniu się w spodnie obszarowe, kozackie i jednorazowe ochraniacze na buty, zdejmij buty i skarpetki w przedpokoju prysznica powietrznego. Załóż skarpety i środki ochrony osobistej na całe ciało, w tym kombinezon Tyvek, siatkę na włosy, bawełniane rękawiczki, rękawice nitrylowe i maski na twarz. Wejdź do skarpet w obszarze noszenia prysznica powietrznego przez samoprzylepną wykładzinę podłogową.
Podczas kąpieli powietrznej podnieś ręce i wykonaj obrót o 360 stopni. Wyjdź z prysznica powietrznego i załóż obuwie po drugiej stronie. Przenieś mysz z ich pokoju w zamkniętej, indywidualnie wentylowanej klatce do sali zabiegowej.
Ułóż znieczuloną mysz leżącą na zdezynfekowanym stole i chwyć za kark, aby ścisnąć żyły szyi. Jedną ręką zabezpiecz głowę myszy kciukiem i palcem wskazującym. Wprowadzić świeżą kapilarnę do przyśrodkowej kanty oka pod błoną nazębną pod kątem 45 stopni.
Osiowo obróć naczynia włosowate przez błonę zatokową z tyłu oczodołu, aż zacznie płynąć krew. Zebrać co najmniej 15 mikrolitrów krwi w probówce do pobierania krwi zawierającej kroplę EDTA. Poluzuj uchwyt na karku szyi przed usunięciem naczynia włosowatego, aby zminimalizować krwawienie do tkanki.
Użyj czystego gazika lub wacika, aby zatrzymać krwawienie i zapewnić hemostazę. Lekko obróć probówkę, aby wymieszać krew i EDTA bez potrząsania nią i przechowywać próbkę krwi na lodzie. Po zakończeniu pobierania krwi zmień rękawiczki i zdezynfekuj wszystkie materiały i powierzchnie.
Załóż nową odzież ochronną w dostępie do laminarnego przepływu powietrza (LAF), znajdującym się przed kabiną LAF. Zdezynfekować pojemniki na próbki i wyjąć je przez przesuwane drzwi w szklanej ścianie kabiny LAF. Po przekazaniu pojemników z próbkami osobie drugiej, należy zdezynfekować wszystkie powierzchnie.
Odbiór zdezynfekowanych pojemników na próbki z obszaru dzikich zwierząt bez bezpośredniego kontaktu przez drzwi przesuwne w szklanej ścianie kabiny LAF. Następnie zostaw jednorazowe kombinezony i obuwie terenowe w wyznaczonym miejscu. Wyrzuć siatkę na włosy, gumowe rękawiczki i maskę na twarz.
Natychmiast wejdź do prysznica powietrznego w skarpetkach obszarowych. Podnieś ręce i wykonaj obrót o 360 stopni podczas kąpieli powietrznej. Pozostaw prysznic powietrzny i umieść skarpetki w kolektorze na pranie.
Załóż osobiste skarpetki, buty i jednorazowe ochraniacze na buty. Zdeponuj odzież w przebieralni, kolektorze pralni i przebierz się w zwykłe ubrania.
Przegląd
Niniejszy artykuł bada wpływ żywienia na układ odpornościowy, koncentrując się na działaniach przeciwstarzeniowych i przeciwzapalnych ograniczenia kalorycznego oraz postu. Zwraca on uwagę na wyzwania, jakie w warunkach badawczych stwarza naturalny mikrobiom „myszy dzikich” (Wilding mice).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Hodowla zwierząt
Wstęp
- Myszy typu „wilding” łączą genetykę myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem myszy żyjących na wolności.
- Naturalny mikrobiom obejmuje wirusy, bakterie i pasożyty, co komplikuje hodowlę zwierząt.
- Centrum QUEST for Responsible Research opracowało ramy 6R w celu zwiększenia odtwarzalności badań.
- Ramy te opierają się na tradycyjnych trzech R: zastąpieniu (replacement), udoskonaleniu (refinement) i ograniczeniu (reduction).
Cel badania
- Zbadanie wpływu żywienia na odpowiedzi immunologiczne.
- Ocena roli ograniczenia kalorycznego i postu w procesach starzenia oraz zapalenia.
- Ocena wpływu mikrobioty na te procesy.
Zastosowane metody
- Pobieranie krwi do immunofenotypowania.
- Środki ograniczania rozprzestrzeniania drobnoustrojów w placówkach badawczych.
- Zastosowanie ram sześciu R (six R framework) w celu zapewnienia przejrzystości badań.
- Analiza składu mikrobiomu u myszy Wilding.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano wyzwania związane z wykorzystaniem myszy dzikich (Wilding mice) w badaniach ze względu na ich mikrobiom.
- Wykazano potencjalny wpływ ograniczenia kalorycznego i postu na zdrowie immunologiczne.
- Podkreślono znaczenie zasad „szof sześciu R” (six R framework) w doskonaleniu praktyk badawczych.
- Przedstawiono zależności pomiędzy żywieniem, mikrobiotą a funkcjami odpornościowymi.
Wnioski
- Odżywianie ma istotny wpływ na układ odpornościowy oraz procesy starzenia się organizmu.
- Myszami dzikimi charakteryzują się specyficzne wyzwania, które wymagają uważnego zarządzania.
- Zasady ramy „six R” mogą poprawić jakość i powtarzalność badań przedklinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Włączenie do procesów immunofenotypowania myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem, takich jak myszy typu Wildling, pozwala na wypełnienie krytycznej luki w zakresie relewantności translacyjnej modeli przedklinicznych. Niniejsza infrastruktura i ramy proceduralne umożliwiają bardziej predykcyjne profilowanie immunologiczne poprzez dokładne odzwierciedlenie złożoności ludzkiego układu odpornościowego, co zwiększa pewność w fazie wczesnego odkrywania i minimalizacji ryzyka mechanistycznego. Takie podejście usprawnia podejmowanie decyzji portfelowych, dostarczając solidnych i powtarzalnych danych, które pozwalają na lepsze planowanie rozwoju projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków odpornościowych w systemie o złożoności mikrobiomu istotnej dla ludzi.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez ujawnianie fenotypów odpornościowych, których nie wykazują modele SPF.
- Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celów terapeutycznych dzięki rzetelnym wynikom immunofenotypowania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie walidowanych populacji komórek odpornościowych do dalszych analiz.
- Standaryzuje protokoły pobierania i przechowywania krwi w celu zapewnienia powtarzalności między badaniami.
- Umożliwia ilościowe profilowanie immunologiczne, co wspiera wiarygodną ocenę związków w procesach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne modele odpornościowe do systemów istotnych dla chorób ludzkich poprzez utrzymanie naturalnego mikrobiomu.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji dzięki wsparciu odczytów dojrzałego układu odpornościowego.
- Zmniejsza ryzyko w procesie translacyjnym poprzez generowanie danych o wyższej możliwości przełożenia na wyniki kliniczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza jednostka oraz procedura immunofenotypowania stanowią pomost między wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając rzetelną weryfikację hipotez oraz wyjaśnienie szlaków immunologicznych w modelach o zwiększonej wartości translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących modulacji odporności w kontekście naturalnego mikrobiomu.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe pomiary komórek odpornościowych do rozwoju testów analitycznych.
- Analityka: Zapewnia ustandaryzowane wyniki immunofenotypowania do porównywania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Dostosowuje odczyty immunologiczne do biomarkerów istotnych dla ludzi i modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną infrastrukturę i proces roboczy dla bieżących programów B+R skoncentrowanych na układzie odpornościowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowane, skalowalne i powtarzalne procedury immunofenotypowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki poprawie istotności modelu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów immunomodulujących.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chowu zwierząt, immunologii oraz protokołów bioasekuracji.
- Wymaga specjalistycznej infrastruktury placówki w celu zapewnienia izolacji mikrobiomu i rozdzielenia etapów pracy.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja procedur pobierania próbek i dezynfekcji pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych szczepów myszy lub modeli chorobowych.
- Złożoność operacyjna rośnie wraz z koniecznością zachowania ścisłej bioasekuracji i przeszkolenia personelu.
