Name: Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów. Technika ta zwiększa stabilność egzosomów poprzez suszenie i umożliwia efektywne przenikanie barier biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.L.Q. docenia wsparcie wspierane przez Pioneer R&D Program of Zhejiang (2022C03031), National Key Research and Development Program of China (2021YFA0910103), National Natural Science Foundation of China (22274141, 22074080), Natural Science Foundation of Shandong (ZR2022ZD28) oraz Taishan Scholar Program of Shandong Province (tsqn201909106). H.C. dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chiny (82202329). Autorzy przyznają, że instrumenty są używane w Shared Instrumentation Core Facility w Instytucie Medycyny w Hangzhou (HIM) Chińskiej Akademii Nauk.

Niniejsze badanie nie wymaga zgody komisji etycznej, ponieważ skóra wieprzowa użyta w eksperymentach opisanych w sekcji 3 została zakupiona na rynku jako jadalne uszy wieprzowe i nie pochodziła od zwierząt doświadczalnych.
1. Izolacja egzosomów
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Hodować mysie komórki raka nabłonkowego jajnika ID8 w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% roztworu penicyliny i streptomycyny (100×) (patrz Tabela materiałów) w szalkach Petriego o średnicy 15 cm.</li>
		<li>Inkubować komórki ID8 w inkubatorze CO2 (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 do momentu osiągnięcia 90% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja egzosomów
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z szalek Petriego i przemyć dwukrotnie roztworem DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline). Dodać 20 mL pożywki DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej (patrz Tabela materiałów) i bez roztworu penicyliny i streptomycyny (patrz Tabela materiałów). Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 48 h.</li>
		<li>Zebrać supernatant z hodowli komórkowej z 20 szalek Petriego o średnicy 15 cm. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w celu usunięcia wolnych komórek.</li>
		<li>Wirować przy 2000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w celu usunięcia debris komórkowego.</li>
		<li>Podłączyć jednorazowy system filtracji próżniowej 0,22 µm (patrz Tabela materiałów) do pompy próżniowej z obiegiem wody (patrz Tabela materiałów). Stworzyć podciśnienie, aby supernatant przeszedł przez membranę z polietersulfonu 0,22 µm i trafił do dolnej komory systemu filtracji, co skutecznie usunie z supernatantu pęcherzyki lub zanieczyszczenia większe niż 0,22 µm.
		<ol>
			<li>Aby podłączyć pompę próżniową, włączyć przełącznik pompy, a następnie podłączyć ją do wlotu powietrza systemu filtracji próżniowej. Podczas zamykania układu, najpierw rozłączyć połączenie z pompą, a następnie wyłączyć pompę próżniową. Procedura ta pomaga zapobiec cofaniu się zawartości pompy i zanieczyszczeniu płynu hodowlanego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 15 mL supernatantu do wewnętrznej rurki probówki do ultrafiltracji 100 kDa (patrz Tabela materiałów). Wirować przy 3500 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i usunąć ciecz z rurki zewnętrznej. 
		UWAGA: Cząstki większe niż 100 kDa zostają zatrzymane na membranie wewnętrznej rurki, natomiast białka mniejsze niż 100 kDa zostaną odwirowane do rurki zewnętrznej wraz z roztworem. Egzosomy są większe niż 100 kDa i uległy agregacji na membranie wewnętrznej rurki.</li>
		<li>Powtarzać powyższe kroki, aż całkowita objętość cieczy wyniesie mniej niż 5 mL. Zebrać ciecz z wewnętrznej rurki i dodać 1 mL DPBS. Użyć pipety do wielokrotnego pipetowania wewnątrz rurki, aby zapewnić resuspensję przyklejonych egzosomów w DPBS, a następnie je zebrać.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 60 min w temperaturze 4 °C i przelać supernatant do 6 mL probówki wirówkowej typu quick-snap (patrz Tabela materiałów). Uszczelnić probówkę za pomocą zgrzewarki termicznej.</li>
		<li>Wirować przy 100 000 x g przez 2 h w temperaturze 4 °C w ultracentryfudze (patrz Tabela materiałów). Przeciąć probówkę wirówkową typu quick-snap, usunąć supernatant i resuspendować osad w 100 µL DPBS. Otrzymany roztwór to roztwór egzosomów. 
		UWAGA: Podczas procesu resuspensji osadu konieczne jest pipetowanie i uderzanie o ściankę probówki pipetą co najmniej 200 razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytwarzanie exo@MN
<ol>
	<li>Przygotowanie formy matki
	<ol>
		<li>Zaprojektować w oprogramowaniu CAD model mikroiły w układzie macierzy 10 x 10 z końcówkami o kształcie stożka o następujących parametrach: wysokości 1200 µm, średnicy podstawy 400 µm i skoku (odległości między sąsiednimi mikroigłami) 900 µm.</li>
		<li>Wykorzystać żywicę HTL jako materiał i wydrukować formę matki mikroigieł za pomocą drukarki 3D (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Zanurzyć formę matki w absolutnym etanolu na 1 h w celu usunięcia żywicy przylegającej do powierzchni.</li>
		<li>Naświetlać formę światłem ultrafioletowym przez 5 min w celu jej utwardzenia.</li>
		<li>Ponownie zanurzyć formę w absolutnym etanolu na 1 h, a następnie suszyć w temperaturze 60 °C w suszarce przez 1 h. Forma matki jest gotowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie formy produkcyjnej
	<ol>
		<li>Wymieszać składniki A i B polidimetylosiloksanu (PDMS, patrz Tabela materiałów) w stosunku 10:1. Dobrze wymieszać i wlać mieszaninę do formy matki.</li>
		<li>Umieścić formę PDMS pod ciśnieniem 1 psi przez 15 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS.</li>
		<li>Utwardzić formę PDMS w temperaturze 60 °C przez 2 h, a następnie wyjąć z formy, aby otrzymać formę produkcyjną mikroigieł.</li>
		<li>Przed użyciem oczyścić formę produkcyjną wodą ultrapurozną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Oznaczyć zawartość białka w roztworze egzosomów za pomocą zestawu do analizy BCA (patrz Tabela materiałów). Dodać odpowiednią ilość DPBS, aby uzyskać stężenie 10 µg/µL dla roztworu egzosomów.</li>
		<li>Przygotować roztwór trehalozy o stężeniu 200 mg/mL (patrz Tabela materiałów), stosując DPBS jako rozpuszczalnik. Mieszać przez 20 min do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Przygotować roztwór kwasu hialuronowego (HA, patrz Tabela materiałów) o stężeniu 200 mg/mL, stosując DPBS jako rozpuszczalnik. Mieszać przez noc w celu zapewnienia pełnego rozpuszczenia.</li>
		<li>Przygotować roztwór poliwinylopirolidonu (PVP, patrz Tabela materiałów) o stężeniu 150 mg/mL, stosując absolutny etanol jako rozpuszczalnik. Mieszać przez noc w celu zapewnienia pełnego rozpuszczenia.</li>
		<li>Wymieszać roztwór egzosomów (10 µg/µL) i roztwór trehalozy (200 mg/mL) w stosunku objętościowym 1:1. Następnie dodać taką samą objętość roztworu HA (200 mg/mL). Dokładnie wymieszać, aby otrzymać roztwór do końcówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie exo@MN
	<ol>
		<li>Obrobić powierzchnię formy PDMS za pomocą oczyszczacza plazmowego (patrz Tabela materiałów) przez 30 s przy niskiej mocy w celu zwiększenia jej hydrofilowości.</li>
		<li>Dodać 40 µL roztworu do końcówek do formy PDMS. Wirować w temperaturze pokojowej (RT) przy 3000 x g przez 3 min, aby upewnić się, że ciecz wypełnia warstwę igieł w formie.</li>
		<li>Usunąć nadmiar cieczy z formy i suszyć w temperaturze RT w próżniowej suszarce (patrz Tabela materiałów) przez 1 dzień.</li>
		<li>Dodać 200 µL roztworu PVP do formy PDMS. Wirować przy 3000 x g przez 3 min w temperaturze RT, aby upewnić się, że ciecz wypełnia warstwę podkładu w formie.</li>
		<li>Suszyć formę w temperaturze RT w suszarce przez 1 dzień, a następnie wyjąć z formy, aby otrzymać plaster exo@MN. 
		UWAGA: Przechowywać plaster exo@MN w suszarce aż do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu enkapsulacji egzosomów z wirowaniem, suszeniem, przy użyciu roztworów trehalozy/HA i PVP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Proces wytwarzania plastrów exo@MN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Charakterystyka plastrów exo@MN
<ol>
	<li>Obserwacja morfologii
	<ol>
		<li>Przykleić podkład plastra do powierzchni nachylonej pod kątem 45° i ustawić go pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Włączyć oświetlenie i utrwalić morfologię plastra przy użyciu obiektywu 4x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
	<ol>
		<li>Przymocować plaster do stolika obiektowego za pomocą przewodzącego kleju i poddać go naparowaniu w urządzeniu auto fine coater (patrz Tabela materiałów) przez 30 s.</li>
		<li>Wykonać obrazy plastra exo@MN za pomocą SEM (patrz Tabela materiałów) przy napięciu przyspieszającym 1 kV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania mechaniczne
	<ol>
		<li>Wyciąć z plastra macierz o rozmiarze 3 x 3 i umieścić ją końcówkami skierowanymi do góry na sztywnej platformie pomiarowej maszyny do badań rozciągania (patrz Tabela materiałów). Dostosować wysokość sondy tak, aby znajdowała się blisko końcówek igieł, ale ich nie dotykała.</li>
		<li>Ustawić parametry tak, aby pomiar zatrzymał się automatycznie po osiągnięciu nacisku 20 N. Ścisnąć końcówki igieł w pionie z prędkością 0,5 mm/min i zapisać profil obciążenia w funkcji przemieszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuszczanie
	<ol>
		<li>Zakupić świeże uszy wieprzowe na targu i pokroić je na kawałki (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Rozłożyć skórę wieprzową na stole i osuszyć powierzchnię za pomocą papieru.</li>
		<li>Przygotować cztery suche plastry z mikroiğłami, kładąc je końcówkami igieł skierowanymi w dół na skórze wieprzowej w niewielkich odstępach. Docisnąć każdy plaster z mikroiğłami pionowo, używając kciuka i palca wskazującego. Usuwać jeden plaster co 15 s.</li>
		<li>Usunięty plaster natychmiast umieścić w suszarce i suszyć przez 5 min. Odciąć kolumnę końcówek mikroiğieł, ułożyć je poziomo pod mikroskopem (patrz Tabela materiałów) i użyć obiektywu 4x, aby zaobserwować rozpuszczanie końcówek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka egzosomów w plastrze exo@MN
UWAGA: Końcówki mikroigieł exo@MN rozpuszcza się w 100 µL roztworu DPBS, aby przeprowadzić następującą charakterystykę uwolnionych egzosomów.
<ol>
	<li>Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
	<ol>
		<li>Poddać siatkę miedzianą (patrz Tabela materiałów) obróbce hydrofilowej przy użyciu czyściela jonowego (patrz Tabela materiałów) przez 5 min.</li>
		<li>Nanieść 10 µL próbki na stronę z węglem siatki miedzianej. Pozostawić na 1 min, a następnie usunąć nadmiar cieczy, osuszając krawędzie papierem filtracyjnym.</li>
		<li>Dodać 10 µL 3% octanu uranylu (patrz Tabela materiałów) do próbki. Pozostawić na 10 s, a następnie usunąć nadmiar cieczy, osuszając krawędzie papierem filtracyjnym.</li>
		<li>Dodać 10 µL 3% octanu uranylu do próbki. Pozostawić na 1 min, a następnie usunąć nadmiar cieczy, osuszając krawędzie papierem filtracyjnym i wysuszyć na powietrzu w RT.</li>
		<li>Wykonać obrazy egzosomów za pomocą TEM (patrz Tabela materiałów) przy napięciu przyspieszającym 80 kV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór egzosomów w DPBS, aby uzyskać stężenie cząstek 1 x 107 cząstek/mL. Powoli wstrzyknąć 1 mL roztworu egzosomów do komory próbkowej NTA, używając strzykawki 1 mL (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Ustawić typ standardowej procedury operacyjnej (SOP) instrumentu na EV-488, aby wykryć rozkład wielkości egzosomów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blotting (WB)
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do lizy, mieszając bufor do lizy RIPA (radioimmunoprecipitation assay): fluorek fenylometanosulfonylu (patrz Tabela materiałów) w stosunku 100:1. Lizować egzosomy na lodzie przez 20 min, mieszając w vorteksie co 10 min.</li>
		<li>Odwirować roztwór przy 12 000 x g przez 10 min w 4 °C. Zebrać nadsącz w celu oznaczenia stężenia białek.</li>
		<li>Dodać do nadsączu bufor do nakładania SDS-PAGE 5x (patrz Tabela materiałów) w stosunku objętościowym 1 : 4 i dokładnie wymieszać. Podgrzewać w 100 °C przez 10 min, aby zdenaturować białka.</li>
		<li>Dodać 5 µL markeru białkowego pre-stain 180 kDa (patrz Tabela materiałów) oraz 10 µg zdenaturowanej próbki do gotowego żelu 4%-20% (patrz Tabela materiałów). Prowadzić elektroforezę (patrz Tabela materiałów) przy 60 V przez 10 min, a następnie przy 140 V przez 50 min.</li>
		<li>Przenieść białka z żelu na membranę PVDF (patrz Tabela materiałów) uprzednio aktywowaną metanolem. Prowadzić elektroforezę przy 290 mA przez 90 min na lodzie.</li>
		<li>Inkubować membranę PVDF w 5% roztworze mleka odtłuszczonego przez 1 h. Przemyć trzy razy solą buforową z Tweenem (TBST, patrz Tabela materiałów) po 5 min każdego płukania.</li>
		<li>Wyciąć docelowe prążki na podstawie pozycji białka. Inkubować prążki z przeciwciałem anty-mysim CD63 i przeciwciałem anty-mysim Alix (patrz Tabela materiałów) rozcieńczonymi do odpowiedniego stężenia zgodnie z instrukcją producenta, inkubując przez noc w 4 °C.</li>
		<li>Przemyć prążki trzy razy TBST. Inkubować z przeciwciałem anty-króliczym IgG sprzężonym z HRP (patrz Tabela materiałów) w RT przez 1 h. Następnie ponownie przemyć trzy razy TBST.</li>
		<li>Nanieść odczynnik detekcyjny super ECL (patrz Tabela materiałów), aby pokryć powierzchnię prążków, a następnie niezwłocznie naświetlić i zarejestrować prążki za pomocą obrazowacza żeli (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfokalna mikroskopia skaningowa (CLSM)
	<ol>
		<li>Hodować 5 x 105 DC w naczyniu konfokalnym w 2 mL pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (patrz Tabela materiałów). Dodać egzosomy lub exo@MN i inkubować w 37 °C przez 24 h.</li>
		<li>Dodać kroplę Hoechst 33342 do każdego naczynia konfokalnego i inkubować w ciemności w 37 °C przez 20 min.</li>
		<li>Wykonać obrazowanie za pomocą CLSM (patrz Tabela materiałów) przy użyciu obiektywu 60x. Nanieść kroplę oleju immersyjnego (patrz Tabela materiałów) na obiektyw i umieścić naczynie konfokalne na stoliku. Dostosować osie x/y/z, aby zlokalizować odpowiednią płaszczyznę ogniskową komórek.</li>
		<li>Rozpocząć obrazowanie w kanałach DAPI/TRITC/TD, wybrać rozdzielczość 1024 px i ustawić tryb szybki na 1/8 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Hodować DC w płytce 6-dołkowej, gdzie każdy dołek zawiera 5 x 105 komórek i 2 mL pożywki 1640. Dodać równe objętości roztworu DPBS, egzosomów, mikroigieł bez egzosomów oraz exo@MN odpowiednio i inkubować w 37 °C przez 24 h.</li>
		<li>Przenieść pożywkę z każdego dołka do probówek wirówkowych. Odwirować przy 300 x g przez 3 min w 4 °C i usunąć nadsącz.</li>
		<li>Dodać 0,5 µL przeciwciała FITC-CD11c, 2,5 µL przeciwciała APC-CD80 oraz 0,5 µL przeciwciała Pacific Blue I-A/I-E (patrz Tabela materiałów) do 100 µL 5% roztworu BSA (patrz Tabela materiałów). Dokładnie wymieszać, resuspender komórki i inkubować na wytrząsarce na lodzie i w ciemności przez 20 min.</li>
		<li>Dodać 1 mL DPBS i odwirować przy 300 x g przez 3 min w 4 °C, a następnie usunąć nadsącz. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie przystąpić do analizy odpowiadających kanałów fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej (patrz Tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Najpierw, na wykresie rozrzutu FSC-A/SSC-A, wyznaczyć bramkę dla głównej populacji komórek jako P1. Na wykresie rozrzutu SSC-A/SSC-H populacji komórek P1 wyznaczyć kwadratowy obszar P2 wzdłuż przekątnej, aby usunąć zagregowane komórki.</li>
			<li>Przeprowadzić analizę fluorescencji populacji komórek P2 przy użyciu kanałów FITC, APC i Pacific Blue. Ustawić warunek stopu na zebranie 10 000 komórek w bramce P2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Dane ilościowe przedstawić jako średnie ± odchylenia standardowe (SD). Istotność statystyczną ocenić za pomocą analizy testem t, wykorzystując odpowiednie oprogramowanie do analizy danych. Wartości p mniejsze niż 0,05 uznać za wskazujące na istotność statystyczną. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001.</li>
</ol>

Microneedle Patches for Sustained Delivery of Exosomes in Biomedical Applications

<ol><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), 6977(2020).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly%28amidoamine%29+dendrimers%3A+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li>
<li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH%2C+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li>
<li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li>
<li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li>
<li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644(2022).</li>
<li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+of+injections+in+young+adults%3A+Prevalence+and+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li>
<li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305(2022).</li>
<li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).</li>
<li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li>
<li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Colorectal+Dis%22%5BJournal%5D)">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid%3A+More+than+a+carrier%2C+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li>
</ol>

H. C., F. L. Q i S. J. M są wynalazcami w zgłoszeniu patentowym, które zostało złożone na podstawie danych zawartych w tym manuskrypcie. H.C. jest naukowym założycielem Medcraft Biotech. Inc.

Obecnie główne metody izolacji egzosomów obejmują ultrawirowanie, wirowanie w gradiencie gęstości, ultrafiltrację, wytrącanie, kulki magnetyczne powinowactwa immunologicznego i mikrofluidykę24. Ze względu na ograniczoną ładowność mikroigieł spowodowaną małą przestrzenią na końcówce igły, konieczne jest zwiększenie stężenia egzosomów, aby załadować więcej. Dlatego wybraliśmy ultrafiltrację, aby zagęścić supernatant hodowli komórkowej, a następnie zastosowaliśmy ultrawirowanie do wyizolowania egzosomów. Stężenie egzosomów zostało zwiększone przez niewielką ilość płynnej reuspensji, tak aby mikroigły można było załadować dziesiątkami do setek mikrogramów egzosomów. Jednak metoda ta skutkuje znaczną obecnością białek w wyizolowanym roztworze egzosomu. Dodatkowo podczas procesu wirowania dochodzi do znacznej utraty egzosomów. W dzisiejszych czasach jednym z ograniczeń terapeutycznego zastosowania egzosomów jest brak skutecznych metod izolowania egzosomów o wysokiej czystości i w dużych ilościach. Ponieważ potencjał kliniczny egzosomów jest coraz częściej badany, istnieje potrzeba opracowania w przyszłości bardziej zaawansowanych technik, aby sprostać wyzwaniom związanym z ich ekstrakcją.
Kluczową technologią w tym badaniu jest konstrukcja mikroigieł na bazie egzosomów. W celu zminimalizowania marnotrawstwa egzosomów i osiągnięcia silniejszych efektów terapeutycznych, do wytwarzania plastrów exo@MN zastosowano dwuetapową metodę odlewania. Trehaloza została wcześniej opisana jako odpowiedni materiał do liofilizowanej konserwacji egzosomów25, podczas gdy HA wykazuje doskonałą biokompatybilność, hydrofilowość i funkcje w hamowaniu stanu zapalnego i promowaniu naprawy skóry26. Wytwarzanie końcówek igieł obciążonych egzosomami przy użyciu tych dwóch materiałów pomaga utrzymać aktywność biologiczną egzosomów, umożliwiając ich szybkie rozpuszczanie i uwalnianie w skórze. Co więcej, takie podejście minimalizuje ryzyko infekcji i przyczynia się do szybkiej regeneracji skóry. Poprzez wirowanie i suszenie próżniowe egzosomy zostały skoncentrowane na końcach mikroigieł. Biorąc pod uwagę niekompatybilność etanolu i trehalozy, jako materiał podkładowy wybrano PVP rozpuszczony w absolutnym etanolu. Ta warstwowa metoda wytwarzania skutecznie poprawiła wydajność dostarczania egzosomów.
Słaba stabilność egzosomów in vitro, niezależnie od tego, czy są przechowywane w temperaturze 4 °C, 37 °C czy -80 °C, może prowadzić do zmian w strukturze egzosomu lub degradacji11. Aby rozwiązać ten problem, w kilku badaniach przeanalizowano metody przechowywania egzosomów, takie jak liofilizacja. Technologia mikroigłowa zapewnia kolejną nowatorską strategię. Susząc w temperaturze pokojowej, technologia mikroigłowa może poprawić stabilność egzosomów i może być bezpośrednio stosowana do dostarczania egzosomów bez innych zabiegów. Co więcej, proces ekstrakcji egzosomów jest złożony i podatny na degradację, co sprawia, że zastosowania na dużą skalę są trudne. Przechowywanie wyekstrahowanych egzosomów przy użyciu technologii mikroigłowej nie upraszcza etapów ekstrakcji, ale zmniejsza liczbę wymaganych ekstrakcji. Pojedyncza ekstrakcja może wytworzyć dużą ilość exo@MN plastrów, które mogą być przechowywane przez dłuższy czas. Wykorzystanie mikroigieł egzosomów z tej samej partii do każdego zabiegu minimalizuje potencjalny wpływ różnic między różnymi partiami na wyniki terapeutyczne, zwiększając w ten sposób powtarzalność i niezawodność nanoplatformy egzosomów27. Daje to więcej możliwości klinicznego zastosowania egzosomów.
W przyszłych badaniach warto przyjrzeć się metodom, które umożliwią precyzyjną kontrolę ładunku i zminimalizują różnice w działaniu leku między końcówkami igieł. Można to osiągnąć poprzez optymalizację procesów, wdrożenie środków kontroli jakości i wykorzystanie zaawansowanych technik. Zajęcie się tymi aspektami w znacznym stopniu przyczyni się do opracowania niezawodnych i spójnych systemów dostarczania leków.

Egzosomy, które są małymi pęcherzykami uwalnianymi przez komórki do macierzy zewnątrzkomórkowej, zostały zaproponowane jako potencjalne bioterapeutyki i wektory dostarczania leków do leczenia wielu chorób i nowotworów1. Podczas procesu biogenezy egzosomy otaczają różne biologicznie aktywne cząsteczki z wnętrza komórek, w tym funkcjonalne białka i kwasy nukleinowe2. W rezultacie, gdy są pobierane przez komórki biorcy podczas procesu transportu, egzosomy mają zdolność do modulowania ekspresji genów i funkcji komórkowych w komórkach docelowych3. Jako rodzaj naturalnego przekaźnika informacji, egzosomy zostały w pełni wykorzystane w regeneracji tkanek, regulacji odporności oraz jako nośnik dostaw4. Dzięki technikom inżynieryjnym określone ligandy mogą być wzbogacane na powierzchni egzosomów, umożliwiając indukcję lub hamowanie zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach biorcy lub celując w określone typy komórek5. Środki chemoterapeutyczne mogą być również ładowane do egzosomów w celu leczenia raka6. Co więcej, egzosomy mają zdolność przekraczania bariery krew-mózg w celu dostarczania ładunku terapeutycznego, co czyni je bardzo obiecującymi w leczeniu zaburzeń mózgu7. W porównaniu z liposomami, egzosomy wykazują zwiększony wychwyt komórkowy i lepszą biokompatybilność8. Są one zdolne do skutecznego wnikania do innych komórek, wykazując jednocześnie lepszą tolerancję i niższą toksyczność9. Jednak tradycyjne wstrzyknięcie egzosomów w bolusie jest podatne na sekwestrację i szybkie usuwanie przez wątrobę, nerki i śledzionę w krwiobiegu10. Co więcej, egzosomy mają słabą stabilność in vitro i są podatne na warunki przechowywania, co ogranicza ich zastosowania kliniczne11.
Mikroigły, zestaw mikrometrycznych końcówek igieł, mają zdolność przenikania przez fizjologiczne bariery w celu dostarczania leków małocząsteczkowych12, białka13, kwasy nukleinowe14, oraz nanomedicines15. Mikroigły są precyzyjnie zaprojektowane do celowania w zmiany chorobowe na powierzchni skóry, a ich rozproszone końcówki zapewniają równomierne rozprowadzenie leku w miejscu docelowym, wzmacniając w ten sposób ich działanie terapeutyczne16. Konstrukcja i skład materiałowy mikroigieł ułatwiają przechowywanie substancji bioaktywnych w suchym stanie, takich jak białka i kwasy nukleinowe, zwiększając ich stabilność17. Tradycyjne metody iniekcji mają stosunkowo krótki czas działania i mogą powodować ból, wywołując strach u pacjentów18. Mikroigłowa o długości mikrometra minimalizuje uszkodzenia tkanek i zapobiega stymulacji nerwów, eliminując w ten sposób ból i poprawiając przestrzeganie zaleceń pacjenta19. Dodatkowo, przyjazny dla użytkownika charakter mikroigieł pozwala pacjentom na samodzielne podawanie leczenia bez konieczności korzystania z wyspecjalizowanego personelu16. Oprócz skóry, mikroigły mogą być również stosowane w tkankach, takich jak oczy20, błona śluzowa jamy ustnej21, heart22 i naczynia krwionośne23. Zastosowanie mikroigieł do klinicznego dostarczania egzosomów stanowi obiecującą i perspektywiczną strategię.
Dlatego wprowadzamy łatkę mikroigłową (exo@MN) z egzosomami i ujawniamy metodę jej wytwarzania. Plastry mikroigłowe zostały wyprodukowane przy użyciu dwuetapowej metody odlewania, wraz z wirowaniem i suszeniem próżniowym, co sprzyja agregacji egzosomów na końcach mikroigieł, zwiększając w ten sposób wydajność dostarczania. Zarówno końcówki igieł, jak i podłoże zostały skonstruowane z materiałów, które wykazują doskonałą biokompatybilność i rozpuszczalność w wodzie. Trehaloza i kwas hialuronowy (HA) zostały włączone jako materiały końcówek, aby zapewnić ochronę egzosomów, a jako materiał podkładowy wybrano poliwinylopirolidon (PVP) rozpuszczony w absolutnym etanolu. Morfologię plastra mikroigłowego scharakteryzowano za pomocą mikroskopii i skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Testy mechaniczne mikroigieł oceniono za pomocą miernika rozciągania, aby potwierdzić ich zdolność do penetracji skóry, a szybkość uwalniania na skórze świni zbadano na 60 s. Ponadto scharakteryzowano morfologię, wielkość i zawartość białka zarówno w świeżych egzosomach, jak i egzosomach w exo@MN za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blottingu (WB). Internalizację egzosomów przez komórki dendrytyczne (DC) scharakteryzowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM), a dojrzewanie DC oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Charakterystyka morfologiczna i funkcje biologiczne tych dwóch typów egzosomów są zasadniczo spójne.

<table><tbody><tr><td>100x roztwory penicyliny i streptomycyny</td><td>Jrunbio Scientific</td><td>MA0110</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>180 kDa wstępnie wybarwiony marker białkowy</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>3% octan uranylu</td><td>Henan Ruixin Materiały eksperymentalne</td><td>GZ02625</td><td>Charakterystyka morfologiczna egzosomów</td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Technologia</td><td>BMF nanoArch S130</td><td>Mold Przygotowanie</td></tr><tr><td>4%&ndash; 20% żel prefabrykowany</td><td>Genscript</td><td>ExpressPlus PAGE GEL</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>5 razy; Bufor ładujący SDS-PAGE</td><td>Titan</td><td>04048254</td><td>Western blott</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Alix</td><td>Biolegend</td><td>12422-1-AP</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD63</td><td>Biolegend</td><td>ab217345</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>APC przeciwciało przeciw myszom CD80</td><td>Biolegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało automatyczne drobnoziarniste</td><td>ZIZHU</td><td>JBA5-100</td><td>Charakterystyka morfologiczna</td></tr><tr><td>zestawu do oznaczania BCA</td> mikroigłowego <td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>Test stężenia białka</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher</td><td>Muitifuge X1R pro</td><td>Wirówka komórkowa</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa do wody obiegowej</td><td>Yuhua Instrument</td><td>SHZ-D(III)</td><td>filtracja</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Eppendorf</td><td>CellXpert C170</td><td>Hodowla</td></tr> <tr><td>komórkowaKonfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Siatka miedziana</td><td>Pekin Zhongjingkeyi Technologia&nbsp;</td><td>JF-ZJKY/300</td><td>Charakterystyka morfologiczna egzosomów</td></tr><tr><td>D- (+) -Trehaloza dwuhydrat</td><td>Aladdin</td><td>5138-23-4</td><td>Wytwarzanie mikroigły&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium</td><td>Meilunbio</td><td>MA0212</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Meilunbio</td><td>MA0010</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>System elektroforezy</td><td>Bio-rad</td><td>PowerPac-basic</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Jrunbio Scientific</td><td>JR100</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-mysie CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Detekcja fluorescencji</td></tr><tr><td>Obrazownik żelowy</td><td>Cytiva</td><td>Amersham ImageQuant 800</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>IgG IgG CST sprzężone z HRP</td><td></td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Żywica HTL</td><td>Technologia</td><td></td> BMF <td>Przygotowanie pleśni</td></tr><tr><td>Kwas hialuronowy (MW = 300 kDa)</td><td>Bloomage Biotechnology</td><td>9004-61-9</td><td>Produkcja mikroigły&nbsp;</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia jonów</td><td>JEOL</td><td>EC-52000IC</td><td>Charakterystyka morfologiczna egzosomów</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Obserwuj proces rozpuszczania końcówki mikroigłowej</td></tr><tr><td>Mysia komórka nabłonka jajnika ID8</td><td>MeisenCTCC</td><td>&nbsp; CC90105</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Analiza śledzenia nanocząstek</td><td>Cząstka Metrix</td><td>ZetaView</td><td>Analiza wielkości egzosomów</td></tr><tr><td>Pacific Blue przeciwciało anty-mysie I-A/I-E Biolegend</td><td></td><td>107619</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu</td><td>Beyotime</td><td>ST507</td><td>Inhibitory proteazy</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Hefei Kejing Technologia materiałowa</td><td>PDC-36G</td><td>Wytwarzanie mikroigieł&nbsp;</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan</td><td>Dow Corning</td><td>9016-00-6</td><td>Przygotowanie formy</td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon (MW = 40 kDa)</td><td>Aladdin</td><td>9003-39-8</td><td>Wykonanie mikroigły&nbsp;</td></tr><tr><td>Pryzmat&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>Wersja 9</td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Wirówka szybkozatrzaskowa</td><td>Beckman</td><td>344619</td><td>Ekstrakcja egzosomów</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RIPA</td><td>Applygen</td><td>C1053</td><td>Membrana do lizy</td></tr><tr><td>Roswell park memorial institute 1640</td><td>Meilunbio</td><td>MA0548</td><td>Hodowla</td></tr> <tr><td>komórkowaSkaningowy mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT800</td><td>Charakterystyka morfologiczna mikroskopu mikroigłowego</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Charakterystyka morfologii</td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania Super ECL</td><td>Applygen</td><td>P1030</td><td>Western blott</td></tr><tr><td>Miernik rozciągania</td><td>Instron</td><td>68SC-05</td><td>Badania mechaniczne</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>Charakterystyka morfologiczna egzosomów</td></tr><tr><td>Tris buforowana sól fizjologiczna</td><td>Sangon Biotech</td><td>JF-A500027-0004</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Ekstrakcja egzosomów</td></tr><tr><td>Rurka ultrafiltracyjna</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Koncentracja egzosomów</td></tr><tr><td>Piec do suszenia próżniowego</td><td>Shanghai Yiheng Technology</td><td>DZF-6024</td><td>Produkcja mikroigieł</td></tr><tr><td>System filtracji próżniowej</td><td>Filtracja Biosharp</td><td>BS-500-XT</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

Egzosomy, jako wyłaniające się bioterapeutyki nowej generacji i wektory dostarczania leków, mają ogromny potencjał w różnych dziedzinach biomedycznych, począwszy od dostarczania leków i medycyny regeneracyjnej, a skończywszy na diagnostyce chorób i immunoterapii nowotworów. Jednak szybki klirens przez tradycyjne wstrzyknięcie bolusa i słaba stabilność egzosomów ograniczają ich zastosowanie kliniczne. Mikroigły służą jako rozwiązanie, które wydłuża czas przebywania egzosomów w miejscu podania, utrzymując w ten sposób stężenie leku i ułatwiając utrzymanie efektów terapeutycznych. Ponadto mikroigły posiadają również zdolność do utrzymywania stabilności substancji bioaktywnych. Dlatego wprowadzamy plaster mikroigłowy do ładowania i dostarczania egzosomów oraz dzielimy się metodami, w tym izolacją egzosomów, wytwarzaniem i charakteryzacją plastrów mikroigłowych obciążonych egzosomami. Plastry mikroigłowe zostały wyprodukowane przy użyciu trehalozy i kwasu hialuronowego jako materiałów końcówek oraz poliwinylopirolidonu jako materiału podkładowego za pomocą dwuetapowej metody odlewania. Mikroigły wykazały się solidną wytrzymałością mechaniczną, a końcówki były w stanie wytrzymać 2 N. Skóra świni została użyta do symulacji ludzkiej skóry, a końcówki mikroigieł całkowicie stopiły się w ciągu 60 s po nakłuciu skóry. Egzosomy uwolnione z mikroigieł wykazywały morfologię, wielkość cząstek, białka markerowe i funkcje biologiczne porównywalne z świeżymi egzosomami, umożliwiając wychwyt komórek dendrytycznych i sprzyjając ich dojrzewaniu.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół izolacji egzosomów oraz wytwarzania i charakterystyki plastra exo@MN. Rysunek 1 ilustruje schemat procesu wytwarzania plastra exo@MN. Egzosomy zmieszano z trehalozą i HA, a następnie mieszaninę dodano do formy mikroigieł i poddano wirówkowaniu. Proces ten ułatwił agregację egzosomów w końcówkach igieł, co sprzyja ich szybkiemu uwalnianiu. Po wysuszeniu dodano roztwór PVP i poddano wirówkowaniu w celu całkowitego wypełnienia formy. Po pełnym wysuszeniu formę usunięto, aby uzyskać plastry exo@MN. Morfologię mikroigieł scharakteryzowano za pomocą mikroskopii i SEM, co przedstawiono na Rysunku 2. Końcówki w plastrze exo@MN miały kształt stożkowy, ułożony w matrycę 10 x 10, z ostrymi i nienaruszonymi wierzchołkami igieł. Końcówka mikroigły może wytrzymać siłę 2 N, co pozwala jej na przeniknięcie przez barierę skóry. Ponadto skórę świńską wykorzystano jako substytut skóry ludzkiej do symulacji aplikacji plastrów exo@MN. Plastry dociskano do skóry świńskiej, aby zaobserwować czas uwalniania; końcówki mikroigieł całkowicie rozpuściły się w ciągu 60 s. Plastry exo@MN rozpuszczono w DPBS i scharakteryzowano, jak pokazano na Rysunku 3. Obrazy TEM ukazały pęcherzyki o typowej strukturze w kształcie filiżanki, co jest zgodne z morfologią egzosomów. Rozkład wielkości cząsteczek roztworu exo@MN wyznaczony metodą NTA wykazał, że cząsteczki koncentrowały się głównie w zakresie 50-250 nm. Obecne były jednak również niektóre większe cząstki, co można przypisać właściwościom adhezyjnym materiału HA, powodującym agregację egzosomów. Analiza WB białek CD63/Alix w roztworze exo@MN wykazała, że exo@MN jest w stanie częściowo zatrzymać białka egzosomów. Funkcjonalność biologiczną egzosomów uwolnionych z exo@MN zwalidowano na Rysunku 4, koncentrując się na pobieraniu egzosomów przez komórki oraz aktywacji komórek dendrytycznych w porównaniu z egzosomami świeżymi. Obrazy CLSM potwierdziły efektywne pobieranie zarówno świeżych egzosomów, jak i egzosomów w exo@MN przez komórki DC. Reprezentatywne obrazy i statystyki proporcjonalne z cytometrii przepływowej wykazują, że egzosomy w exo@MN posiadają funkcje biologiczne promujące aktywację komórek DC w sposób podobny do świeżych egzosomów.
<img alt="Macierze mikroiłeczek, obraz SEM, wykres ciśnienie-przemieszczenie, badanie kinetyki dynamicznej absorpcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka plastrów exo@MN. (A) Obrazy z mikroskopu stereoskopowego plastrów exo@MN. Pasek skali = 400 µm. (B) Obraz SEM plastrów exo@MN. Pasek skali = 200 µm. (C) Profile obciążenia w funkcji przemieszczenia plastra exo@MN. (D) Obrazy mikroskopowe plastrów exo@MN wprowadzonych w skórę świni w różnych odstępach czasu. Pasek skali = 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy TEM egzosomów, wykres rozkładu wielkości nanocząstek oraz analiza markerów białkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka świeżych egzosomów oraz egzosomów w exo@MN. (A) Morfologia egzosomów w TEM. Pasek skali = 100 nm. (B) Rozkład wielkości cząstek egzosomów w NTA. (C) CD63 i Alix w egzosomach w WB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza wychwytu egzosomów na podstawie obrazów mikroskopowych, wykresów cytometrii przepłyewej i wyników przedstawionych na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Testy biologiczne świeżych egzosomów oraz egzosomów w exo@MN. (A) Obrazy CLSM egzosomów pochłoniętych przez DC. Pasek skali = 10 µm. (B) Reprezentatywne wykresy aktywacji DC metodą cytometrii przepływowej. (C) Ilościowe oznaczenie procentowego udziału komórek DC CD11c+CD80+MHCII+. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Egzosomy mają znaczny potencjał kliniczny, ale ich praktyczne zastosowanie jest ograniczone ze względu na łatwą klirens in vivo i słabą stabilność. Mikroigły stanowią rozwiązanie, umożliwiając miejscowe dostarczanie poprzez przebijanie barier fizjologicznych i zachowanie stanu suchego, rozwiązując w ten sposób ograniczenia podawania egzosomów i rozszerzając ich użyteczność kliniczną.

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

Moje badania koncentrują się na efektywnym rozwoju egzosomów. Opracowanie strategii mikroigłowej może zwiększyć stabilność egzomu i daje więcej możliwości klinicznego zastosowania egzosomów. Z powodzeniem opracujemy rząd komórek, gdy systemy dostarczania mikroigieł.Należą do nich samonaprawiające się perły, mikroigły do długotrwałego dostarczania leków, ultra doskonałe urządzenie mikroigłowe do szybkiego ładowania i dostarczania leków oraz dodatkowe mikroigły do dostarczania żywych komórek i mikroigły cukrowe do dostarczania egzomatów. Za pomocą mikroigły przebijamy barierę biologiczną, a następnie sprawnie dostarczamy egzosomy bezpośrednio do obszaru wektora. Wyrzucając je do sucha, mamy ich stabilność, dzięki czemu proces jest łatwy i wygodny zarówno do użytku klinicznego, jak i domowego.W moim laboratorium skupiliśmy się na kluczowych technologiach do opracowania zaawansowanych, opartych na mikroigłach systemów dostarczania, które mogą ładować i dostarczać różne środki terapeutyczne, w tym mRNA małocząsteczkowe przeciwciała przeciwcząsteczkowe, komórki utajone i egzomy. Zajmujemy się również badaniem ich właściwości chemicznych i fizycznych oraz skuteczności terapeutycznej w różnych zastosowaniach biomedycznych. Na początek weź hodowane komórki nabłonka raka jajników myszy.Usunąć pożywkę hodowlaną z szalek Petriego i przemyć dwukrotnie DPBS. Dodaj 20 mililitrów zmodyfikowanej pożywki dobecos eagle bez FBS i roztworu streptomycyny penicyliny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin.Następnie zbierz supernatant do hodowli komórkowej z 20 szalek Petriego o średnicy 15 centymetrów. Wirować przy 300 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant. Odwirować supernatant w temperaturze 2 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych.Teraz włącz pompę próżniową i podłącz ją do wlotu powietrza systemu filtracji próżniowej. Przefiltruj supernatant przez membranę telefonu komórkowego z polieteru o grubości 0,22 mikrona, aby usunąć pęcherzyki lub zanieczyszczenia większe niż 0,22 mikrona. Dodaj 15 mililitrów przefiltrowanego supernatantu do wewnętrznej rurki ultrafiltracyjnej o mocy 100 kilodaltonów.Wirować przy 3 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń płyn z rurki zewnętrznej. Następnie zbierz płyn z dętki.Kilkakrotnie dodawaj jeden mililitr DPBS do pipety z rurką wewnętrzną, aby ponownie zawiesić egzosomy, a następnie je zbierz. Odwirować ciecz o stężeniu 10 000 G przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do sześciomililitrowej probówki wirówkowej z szybkim zatrzaskiem i uszczelnić ją zgrzewarką.Rozciąć probówkę po ultrawirowaniu supernatantu przez dwie godziny. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach DPBS, aby uzyskać roztwór egzosomu. Na początek zmieszane składniki A i B polidimetylosiloksanu lub PDMS w stosunku 10 do jednego.Po dokładnym wymieszaniu mieszaniny wlej mieszaninę do formy głównej. Umieść formę PDMS pod ciśnieniem jednego funta na cal kwadratowy na 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Utwardź pleśń PDMS w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Wyjęć z formy, aby uzyskać formę produkcyjną mikroigły, a następnie wyczyść formę produkcyjną ultraczystą wodą przed użyciem. Określ ilościowo zawartość białka w przygotowanym roztworze egzosomu za pomocą zestawu do oznaczania BCA. Dodaj odpowiednią ilość DPBS do roztworu egzosomu.Teraz przygotuj roztwór 200 miligramów na mililitr trehalozy, używając DPBS jako rozpuszczalnika. Mieszaj przez 20 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Następnie przygotuj roztwór kwasu hialuronowego i poliperonu winylowego lub PVP, używając odpowiednio DPBS i etanolu jako rozpuszczalnika.Mieszaj przez noc, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Wymieszaj roztwór egzosomu i roztwór trehalozy w równych proporcjach. Dodaj równą objętość roztworu kwasu hialuronowego i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać roztwór końcówki.Za pomocą myjki plazmowej przetwarzaj powierzchnię formy PDMS przez 30 sekund w niskiej jakości, aby zwiększyć jej hydrofilowość. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu końcówki do formy PDMS. Wirować przy 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że płyn wypełni warstwę igły formy.Usuń nadmiar z formy i susz w temperaturze pokojowej w suszarce próżniowej przez jeden dzień. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu PVP do formy PDMS. Wirować przy 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że ciecz wypełni warstwę spodnią formy.Po wysuszeniu formy przez jeden dzień wyjmij formę, aby uzyskać plaster z mikroigłami załadowany egzosomem. Na początek przygotuj plaster mikroigłowy obciążony egzosomem i wklej jego spód na powierzchnię nachyloną pod kątem 45 stopni. Umieść plaster pod mikroskopem stereoskopowym.Włącz oświetlacz i uchwyć morfologię łaty za pomocą czterokrotnej soczewki obiektywowej. Do testów mechanicznych wytnij matrycę trzy na trzy z łatki i umieść ją końcówkami skierowanymi do góry na sztywnej platformie miernika rozciągania. Dostosuj wysokość sondy, aby zbliżyć ją do końcówek igieł bez ich dotykania.Ustaw parametry tak, aby zatrzymywały się automatycznie, gdy ciśnienie osiągnie 20 niutonów. Ściskaj końcówki igieł pionowo z prędkością 0,5 milimetra na minutę przed zarejestrowaniem profilu obciążenia w funkcji przemieszczenia. Końcówki w łacie mikroigłowej załadowanej egzosomem wykazywały stożkowy kształt ułożony w układ 10 na 10 z ostrymi i nienaruszonymi końcówkami igieł.Końcówka mikroigły wytrzymuje siłę dwóch niutonów, co pozwala jej przeniknąć przez barierę skórną.

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj prezentujemy protokół opisujący proces wytwarzania mikroigieł polimerowych bez formy za pomocą fotolitografii.

Wytwarzanie polimerowych matryc mikroigłowych za pomocą fotolitografii

Niniejszy artykuł przedstawia unikalną metodę wytwarzania form głównych z otworem wentylacyjnym, który zapobiega uwięzieniu powietrza podczas odlewania lepkiego polimeru, umożliwiając wytwarzanie mikroigieł żelatynowych z ostrymi końcówkami. Zmniejszając objętość odlewania żelatyny o wysokiej lepkości, można było również wytwarzać cienkościenne, puste piramidalne mikroigły.

Wykonanie głównej formy do mikroigieł z otworem wentylacyjnym o wielkości mikrona

Protokół ten opisuje wytwarzanie rozpuszczalnych plastrów mikronakłutych zawierających nanomicele α-laktalbuminy wypełnione kapsaicyną. Metoda ta oferuje powtarzalne, minimalnie inwazyjne podejście do ukierunkowanego transdermalnego dostarczania hydrofobowych bioaktywnych substancji do tkanki tłuszczowej, ułatwiając efektywną lokalną redukcję tłuszczu i potencjalnie rozszerzając zastosowanie w leczeniu otyłości.

Wytwarzanie rozpuszczalnych plastrów mikroigiełkowych wypełnionych nanomicelami α-laktalbuminy do transdermalnego dostarczania kapsaicyny i redukcji tkanki tłuszczowej

Niniejsze prace mają na celu służyć jako praktyczny przewodnik, umożliwiający badaczom przygotowanie własnych urządzeń DMAP przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnika, znanej również jako mikroformowanie, oraz przeprowadzenie podstawowej charakterystyki.

Rozpuszczające plastry mikroigłowych wytwarzane techniką odlewania rozpuszczalnika oraz niezbędna charakterystyka urządzeń biomedycznych opartych na mikroigłach

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje konstrukcję multipleksowego czujnika opartego na mikroiigłach. Urządzenie to jest opracowywane w celu prowadzenia pobierania próbek in situ oraz analizy elektrochemicznej wielu analitów w sposób szybki i selektywny. Przewidujemy zastosowanie tych czujników opartych na mikroigłach w medycynie klinicznej oraz badaniach biomedycznych.

Czujnik oparty na pustych mikroiğłach do multipleksowego transdermalanego detekcji elektrochemicznej

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Dwa sąsiadujące ze sobą płyny przechodzące przez rowkowany kanał mikroprzepływowy mogą być skierowane tak, aby tworzyły osłonę wokół rdzenia prepolimerowego; określając w ten sposób zarówno kształt, jak i przekrój. Polimeryzacja inicjowana foto, taka jak chemia tiolowa, doskonale nadaje się do szybkiego zestalania płynu rdzeniowego w mikrofibrę o określonym rozmiarze i kształcie.

Mikroprzepływowa produkcja włókien polimerowych i biohybrydowych o wstępnie zaprojektowanym rozmiarze i kształcie

Ten artykuł przedstawia metody wytwarzania i charakteryzowania konformalnego, podobnego do skóry systemu elektronicznego oraz protokoły do wykorzystania w zastosowaniach klinicznych, szczególnie w leczeniu ran skórnych.

Wytwarzanie i charakterystyka konforemnego, przypominającego skórę elektronicznego systemu do ilościowego leczenia ran skórnych

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Poznaj metodę wytwarzania plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów. Technika ta zwiększa stabilność egzosomów poprzez suszenie i umożliwia efektywne przenikanie barier biologicznych.

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

Przeglądaj więcej filmów