Name: Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia badanie komunikacji chemicznej oraz mechanizmów molekularnych i neuronalnych percepcji feromonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Tingtao Zhou za zaprojektowanie i napisanie kodu dla wizualizacji trajektorii wykorzystanych w naszej analizie. Ta praca była wspierana przez finansowanie: R01 NS113119 (PWS), stypendium dla starszych doktorantów Chen oraz Instytut Neurologii Tianqiao i Chrissy Chen.

1. Surowe ekstrakcja feromonów płciowych z samic i hermafrodytów
<ol>
	<li>Protokół synchronizacji C. elegans
	<ol>
		<li>Przygotowanie dorosłych samic lub hermafrodytów
		<ol>
			<li>Monitoruj codziennie płyty kulturowe do momentu, gdy istnieje duża populacja dorosłych samic/hermafrodytów i źródło pokarmu OP50 wyczerpuje się. Używając fog-2 C. elegans i żeńskich C. remanei do surowej ekstrakcji feromonów płciowych, przygotuj zsynchronizowane jaja z zamężnych samic. 
			UWAGA: W tym protokole, C. elegans fog-2 mutant XX zwierzęta, które nie produkują plemników, są nazywane C. elegans samicami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mycie i osadzanie robaków
		<ol>
			<li>Zmyj dorosłe robaki z mieszanej płytki populacyjnej za pomocą buforu M9. Zbieraj zawiesinę robaków do 1,5 mL mikrocentryfugowej probówki. Wyśrodkuj przez 0,5-1 min przy 1 500 x g, aby osadzić robaki. 
			UWAGA: Wstępne oczyszczenie dla silnego zanieczyszczenia (opcjonalnie): Pozostaw robaki osiąść w probówce, jeśli są silnie zanieczyszczone. Wypiję nadstan do usunięcia bakterii i powtórz, aż nadstan stanie się przezroczysty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybielanie
		<ol>
			<li>Dodaj 200 µL buforu M9 do pelletu robaków. Przygotuj bufor lizy mieszając domowy bielak i 1 M NaOH w proporcji 1:1. Dodaj 500 µL tego bufora lizy do mieszaniny, wiruj przez 10 s, a następnie zatrzymaj się, aby monitorować warunki lizy pod mikroskopem sekcującym. Powtórz ten proces wirowania przez 10 s, a następnie obserwacji, aż dorosłe robaki zostaną całkowicie rozłożone.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zatrzymanie wybielania i osadzanie zarodków
		<ol>
			<li>Gdy dorosłe robaki zostaną zlizowane na małe fragmenty (ale nie całkowicie rozpuszczone), natychmiast dodaj 500 µL buforu M9, aby spowolnić reakcję. Wyśrodkuj przez 15 000 x g przez 30-60 s, aby osadzić zarodki. 
			UWAGA: Nadmierne lizanie może uszkodzić zarodki. Zatrzymaj reakcję, gdy ciała dorosłych robaków rozpadły się na małe fragmenty. Lizowanie trwa podczas wyśrodkowania i kroków mycia, aż zostanie usunięty cały bufor lizujący.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyśrodkuj zarodki 5x z 1 mL buforu M9, wyśrodkując przez 15 000 x g przez 30-60 s po każdym myciu. Usuń nadstan po wyśrodkowaniu.</li>
		<li>Synchronizacja
		<ol>
			<li>Ponownie zawieś zarodki w 800 µL buforu M9 w 1,5 mL mikrocentryfugowej probówce. Obróć probówkę w 20°C przez 12-15 h dla wylęgu L1 i zatrzymania robaków na etapie L1 z powodu braku pokarmu. Uwolnij i hoduj robaki w 20°C przez 3 dni, aż osiągną etap L4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Surowa ekstrakcja feromonów płciowych z jednodniowych panienek ( Rysunek 1A)
UWAGA: Stosujemy wcześniej ustalony protokół24 do ekstrakcji feromonów płciowych z jednodniowych panienek fog-2 (feminizacja linii zarodkowej) mutantek C. elegans i żeńskich C. remanei.
<ol>
	<li>Przygotowanie dorosłych samic
	<ol>
		<li>Wybierz i wyizoluj około 200 żeńskie fog-2 na etapie L4 jeden dzień przed ekstrakcją feromonów. Aby upewnić się, że zebrano tylko panienki, starannie oddzielaj te żeńskie fog-2 według płci i rozłóż je na trzech oddzielnych 6 cm płytkach OP50 NGM. Umieść małą ilość bakterii OP50 w środku każdej płytki. 
		UWAGA: Rozłóż 200 żeńskich robaków na etapie L4 na trzech oddzielnych płytkach, aby uniknąć ryzyka przypadkowego wprowadzenia samca na płytkę. Jeśli wybrano samca, prawdopodobnie sparzy się on z wieloma samicami, w wyniku czego większość samic zostanie zapłodniona następnego dnia, gdy staną się dorosłymi. Zapłodnione samice nie emitują lotnych feromonów płciowych, dopóki plemniki nie zostaną wyczerpane, co wpływa na wyniki ekstrakcji. Ograniczone źródło pokarmu ogranicza hermafrodytów do mniejszego obszaru w środku płytki, minimalizując szansę na ucieczkę z płytki podczas okresu izolacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces ekstrakcji
	<ol>
		<li>W dniu ekstrakcji (dzień 1 dojrzałości rozrodczej, 3 dni po wypuszczeniu robaków z zatrzymania na etapie L1), wybierz i izoljuj 100 panieńskich, jednodniowych żeńskich fog-2 do mikrocentryfugowej probówki zawierającej 1 mL buforu M9. Myj samiczki 5x buforem M9, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne i inkubuj je w 100 µL buforu M9 przez 6 h w 20°C, aby pozwolić na produkcję i akumulację feromonów w podłożu.</li>
		<li>Przeprowadź podobny proces ekstrakcji dla żeńskich <

Extraction and Quantification of Volatile Sex Pheromone Responses in C. elegans

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Ten protokół zapewnia solidną metodologię wyodrębniania lotnych feromonów płciowych z C. elegans, wraz z ustanowieniem solidnego testu chemoatrakcji w celu zmierzenia reakcji chemoatrakcji samców. Dodatkowe informacje można znaleźć w podręczniku użytkownika WormLab (patrz Tabela Materiałów); podstawowy kod do wizualizacji trajektorii ruchu robaków znajduje się w sekcji protokołu 7.3.8.5. Kilka kluczowych kroków w protokole jest istotnych dla wyniku. Po pierwsze, staranne synchronizacja populacji robaków jest niezbędna do kontroli wieku i stanu reprodukcyjnego, zapewniając skuteczne wyodrębnienie lotnych feromonów płciowych z panienek lub hermafrodytów pozbawionych plemników29,34. Po drugie, wielokrotne kroki mycia są konieczne, aby dokładnie usunąć bakterie, minimalizując zanieczyszczenia, które mogłyby zakłócić sygnalizację feromonów w następnych testach chemotaksji. Następnie, wybór parametrów testu, takich jak stężenie przyciągającego czynnika, wielkość płytki i czas trwania testu, wszystkie te czynniki mogą wpływać na wyniki i muszą być dostosowane do określonych celów eksperymentu.
Dokładne czasy suszenia i spójne rozmieszczenie miejsc testowych są kluczowe dla niezawodnych wyników testu chemotaksji. Mokre płytki znacząco wpływają na wskaźnik chemotaksji. Jeśli warstwa wody pozostaje na powierzchni agaru, siły kapilarne mogą uwięzić robaki na początkowym punkcie. Może to utrudniać ich ruch, prowadząc do fałszywie negatywnych wyników w teście. Ponadto przedłużone czasy suszenia stanowią inne wyzwanie dla robaków uwalnianych później. Gdy płytka wysycha, lotne składniki feromonów parują i dyfundują, tworząc mniej wyraźny gradient stężenia. Utrudnia to później uwolnionym robakom zlokalizowanie docelowego feromonów, nawet jeśli są wolne od ograniczenia ruchu. Dlatego należy upewnić się, że płytki są wystarczająco suche, aby wyeliminować wszelką wilgoć na powierzchni, która mogłaby wpłynąć na wyniki eksperymentu.
Objętość roztworu agaru dodanego do płytek musi być dostosowana do specyficznych wymagań eksperymentu, zapewniając optymalne warunki testu. Grubość warstwy agaru, dostosowywana poprzez zmianę ilości roztworu agaru wlanego na talerz. Zazwyczaj krótsza odległość między czynnikiem przyciągającym a płytką agarową prowadzi do bardziej niezawodnych wyników. Z kolei większa odległość może pomóc wyeliminować wpływ nielotnych składników, zapewniając czystszą ocenę wpływu lotnego czynnika przyciągającego. Grubość agaru może być dostosowana do specyficznych potrzeb eksperymentu, jak pokazano na Rysunku 2B.
Proces wybierania 20 robaków nie powinien przekraczać 1-2 minut, aby uniknąć wysychania i pogorszenia stanu zdrowia wcześniej wybranych robaków, co mogłoby wpłynąć na wyniki. Upewnij się, że robaki są uwalniane na płytkę testową jednocześnie, aby zapobiec losowemu oddalaniu się wcześniej wypuszczonych robaków od punktu startowego. Opóźnienia w tym kroku mogą prowadzić do różnych pozycji startowych w próbkach, co skutkuje niesprawiedliwymi porównaniami. Cały proces od wybierania samców do zamknięcia pokrywy powinien zająć od 2 do 5 minut.
Dostosuj odstęp między miejscami eksperymentalnymi/kontrolnymi a punktem startowym na płytce testowej zgodnie z wielkością płytki i określonymi celami eksperymentu. Zwiększenie odległości między miejscami może uczynić test bardziej wymagającym, co jest korzystne dla wykrycia subtelnych efektów. Z kolei zmniejszenie odległości tworzy bardziej solidny test, który wyróżnia poważne defekcje.
Rozwiązywanie problemów może być konieczne w różnych punktach protokołu. Jeśli wyodrębniony feromon nie wywołuje reakcji chemotaksji, należy dokładnie zweryfikować wiek i stan reprodukcyjny żeńskich i hermafrodytycznych źródeł. Tylko panienki lub hermafrodyty pozbawione plemników wytwarzają docelowy feromon. Ze względu na wysoką efektywność kojarzenia się samców C. elegans, obecność nawet jednego samca na płytce izolacji L4 samic może znacząco wpłynąć na wyniki. Dodatkowo, upewnij się kontroli zakażenia bakteryjnego w całym procesie ekstrakcji. Chociaż ten protokół ekstrakcji oferuje prosty sposób uzyskania surowych lotnych feromonów płciowych, ma pewne ograniczenia. Surowy ekstrakt feromonów może zawierać śladowe ilości innych cząsteczek sygnałowych, co utrudnia jednoznaczne izolowanie specyficznych efektów samego feromonów płciowych. Funkcjonalne składniki lotnego feromonów płciowych nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Chociaż nie zgłoszono żadnych funkcjonalnych różnic między feromonami płciowymi jednodniowych panienek a sześciodniowych hermafrodytów, nie można wykluczyć subtelnej różnicy.
W teście chemoatrakcji, niski wskaźnik chemotaksji może wskazywać na problem ze zdrowiem lub stadium rozwojowym testowanych samców. Aby zapewnić optymalne wyniki, użyj zdrowych jednodniowych dorosłych samców wyhodowanych w temperaturze 20 °C na czystej płytce OP50 bez zanieczyszczenia.

Współdziałanie między komunikacją chemiczną a sukcesem reprodukcyjnym jest podstawową zasadą w całym królestwie zwierząt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Feromony płciowe wywołują szeroki zakres zachowań seksualnie dymorficznych, niezbędnych do zlokalizowania partnerów, koordynowania kroków związanych z znalezieniem i przyciąganiem partnera, a ostatecznie promują rozmnażanie danego gatunku11,12,13,14,15,16,17. Osiągnięto znaczny postęp w zrozumieniu sygnalizacji feromonowej, ale mechanizmy molekularne, obwody neuronowe i procesy obliczeniowe rządzące tymi interakcjami często pozostają niedokładnie określone18,19,20,21,22,23,24,25,26.
Niematoda Caenorhabditis elegans zapewnia potężny model do rozważania tych pytań. Co godne odnotowania, C. elegans wykazuje niezwykłą strategię rozrodczą - hermafrodyci mogą się samozapłodnić, ale także krzyżować się z samcami27,28,29,30,31,32,33. Ta elastyczność wymaga solidnego systemu komunikacji do sygnalizowania statusu rozrodczego. C. elegans jest znany ze swoich dobrze scharakteryzowanych feromonów rozpuszczalnych w wodzie, askarozydów, które odgrywają różnorodne role w rozwoju, zachowaniu i interakcjach społecznych. Ostatnie odkrycia ujawniły odrębną klasę lotnych feromonów płciowych stosowanych przez nicienie. Feromony te są specyficznie produkowane przez dojrzałe seksualnie C. elegans i C. remanei samica niewinna oraz hermafrodyci z wyczerpanym nasieniem i służą jako środek przyciągający dla dorosłych samców29,34,35. Atrakcyjność ta wykazuje znaczący dymorfizm płciowy w swojej produkcji i percepcji. Gonada somatyczna samicy reguluje syntezę tego lotnego feromon płciowego, a produkcja dynamicznie odzwierciedla status rozrodczy, ustając po kopulacji i wznowiona kilka godzin później29,34.
Rozumienie komunikacji feromonowej u nicieni zapewnia wgląd w ewolucję systemów komunikacji chemicznej, współdziałanie między stanem rozrodczym a zachowaniem oraz mechanizmy leżące u podstaw seksualnie dymorficznego przetwarzania neuronowego24,26,36,37,38,39. Badania implikują neuron amfidow AWA u samców jako kluczowy dla wykrywania feromonów, przy czym receptor sprzężony z białkiem G SRD-1 odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu feromonów u samców24. C. elegans jest dobrze przystosowany do badania chemicznej komunikacji zwierząt, szczególnie sygnalizacji feromonowej płciowej, ze względu na jego uzależnienie od układu węchowego w poszukiwaniu partnera. Podczas gdy wiele jest znane o sygnalizacji askarozydów, system lotnych feromonów płciowych oferuje unikalne możliwości porównania25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50, 
51,52,53,54,55,56,57. Ponadto C. elegans jest potężnym modelem genetycznym ze względu na jego w pełni sekwencjonowany genom, wyraźnie zdefiniowaną linię komórkową i dobrze scharakteryzowane mutanty węchowe.
Jednakże pełna obwódka neuron

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>25373-100</td><td>Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>25373-085</td><td>Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>C. remanei (EM464)</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>centrifuge 5418</td><td>&nbsp;Any brand should work.</td></tr><tr><td>Chemoattraction assay plates</td><td>Homemade solution</td><td>N/A</td><td>1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Leica</td><td>LeicaMZ75</td><td>&nbsp;Any brand should work.</td></tr><tr><td>E. Coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>fog-2(q71) (JK574)</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>him-5(e1490)(CB4088)</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Household bleach</td><td>Clorox Germicidal bleach concentrated</td><td></td><td>&nbsp;Bleach</td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>Homemade solution</td><td>N/A</td><td>3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder</td><td>Macron</td><td>M1063-500GM-EA</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>TOSHIBA</td><td>N/A</td><td>&nbsp;Any brand should work.</td></tr><tr><td>N2</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S318-3</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NGM plates solution</td><td>Homemade solution</td><td>N/A</td><td>2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 &deg;C. Put on a hotplate at 65 &deg;C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR</td><td>97063-324</td><td></td></tr><tr><td>Pipet- aid</td><td>Drummond Scientific&nbsp;</td><td>4-000-100</td><td>&nbsp;Any brand should work.</td></tr><tr><td>Plastic paper&nbsp;</td><td>Octago</td><td>Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film</td><td>https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-aldrich</td><td>SLBP2366V</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Spectrum</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006</td><td>20 - 200 &micro;L, 100 - 1000 &micro;L, any brand should work.</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Labnet</td><td>SKU: LI-H5500</td><td>&nbsp;Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-aldrich</td><td>SLCG3888</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl&nbsp;</td><td>Roche</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>97063-390</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td>&nbsp;Any brand should work.</td></tr><tr><td>WormLab system&nbsp;</td><td>MBF Bioscience</td><td>N/A</td><td>https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/</td></tr><tr><td>Wormpicker</td><td>Homemade&nbsp;</td><td>N/A</td><td>made with platinum and glass pipet tips</td></tr></tbody></table>

lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w caenorhabditis elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Komunikacja chemiczna jest niezwykle ważna dla zdrowia organizmu, rozmnażania i ogólnego dobrego samopoczucia. Rozumienie ścieżek molekularnych, procesów nerwowych i obliczeń rządzących tymi sygnałami jest nadal aktywnym dziedziną badań. Nitkownik Caenorhabditis elegans zapewnia potężny model do badania tych procesów, ponieważ produkuje lotny feromon płciowy. Feromon ten jest syntetyzowany przez niezapłodnione samice lub hermafrodytów pozbawionych plemników i służy jako atrakcyjny czynnik dla samców.
Ten protokół opisuje szczegółową metodę izolowywania lotnego feromon płciowego z kilku szczepów C. elegans (szczep WT N2, daf-22 i fog-2) oraz C. remanei. Dostarczamy również protokołu do ilościowego określania reakcji chemotaksji samców na lotny feromon płciowy. Nasza analiza wykorzystuje pomiary takie jak indeks chemotaksji (C.I.), czas przybycia (A.T.) oraz wykres trajektorii, aby dokładnie porównać reakcje samców w różnych warunkach. Ta metoda umożliwia porównania pomiędzy samcami o różnym pochodzeniu genetycznym lub etapach rozwojowych. Ponadto, opisany tutaj układ eksperymentalny jest przystosowany do badania innych chemikaliów chemoatrakcyjnych.

Analiza trajektorii percepcji wadliwej substancji feromonowej z wadliwą chemoatraktacją w badaniu chemoatraktacji 
To badanie chemoatraktacji niezawodnie odróżnia szczepy dzikie i mutanty C. elegans w ich reakcji na lotne feromony płciowe. Sukcesywne eksperymenty z samcami him-5 konsekwentnie wykazują mocną chemotaksję w kierunku źródła feromonów. Odzwierciedla to wysokiej wartości indeksu chemotaksji (C.I.) (Rycina 2), często przekraczającej 0,5, co wskazuje na silne preferowanie źródła feromonów. Z kolei eksperymenty z mutantami receptorów feromonów srd-1 konsekwentnie dają negatywne wyniki. C.I. dla samców srd-1 wynosi zazwyczaj około zera24. Potwierdza to zdolność badania do wykrycia braku reakcji chemotaktycznej.
W nieoptymalnych eksperymentach liczne czynniki mogą wpływać na wyniki. Na przykład niewystarczające stężenie feromonów może prowadzić do słabych reakcji u samców him-5, podczas gdy skażenie lub niewłaściwe postępowanie mogą powodować nieprzewidywalne ruchy u obu szczepów. Scenariusze te prowadzą do niższych wartości C.I. dla samców him-5 i potencjalnie mylących niezerowych wartości dla samców srd-1. Dlatego też, pomyślna implementacja tego protokołu charakteryzuje się wyraźnym rozróżnieniem indeksów chemotaksji pomiędzy szczepami dzikimi a mutantami, wspieranym przez analizę trajektorii wizualnie potwierdzającą różnice w zachowaniu (Rycina 3). Analiza danych powinna obejmować statystyczne porównania wartości C.I. aby upewnić się, że obserwowane różnice są istotne.
Demonstracja analizy i wizualizacji danych z badania chemoatraktacji opartego na wideo 
Sukcesywne wyniki badania: Rycina 3 przedstawia mocną reakcję chemotaktyczną samców him-5 na lotny feromon płciowy. Kolorowe trajektorie ujawniają (A) koszt czasowy, (B) odległość: rosnąca bliskość źródła feromonów w czasie, potwierdzając przyciąganie robaków. (C) prędkość: różne prędkości wzdłuż trajektorii, dostarczające wglądu w dynamikę reakcji chemotaktycznych. (D) prostowność: jak bezpośrednio robaki poruszają się w kierunku źródła feromonów. Im prostsza ścieżka, tym bardziej efektywne i ukierunkowane jest ich przemieszczanie się w reakcji na chemiczny atraktant. (E) Poprawność kierunku: to pokazuje zdolność robaków do dokładnego orientowania się i przemieszczania w kierunku źródła feromonów, chemicznego atraktanta. W zasadzie mierzy to, jak dobrze robaki potrafią wyczuć gradient chemiczny i poruszać się wzdłuż niego, aby osiągnąć swój cel.
Spadek prędkości do zera zazwyczaj wskazuje na zatrzymanie lub zwrot. Łączenie informacji o prędkości z danymi dotyczącymi prostowności może pomóc w identyfikacji zdarzeń skrętu. Konkretnie, zdarzenie skrętu jest wskazane, gdy prędkość spada do zera, a prostowność jest również bardzo niska. Natomiast eksperymenty z mutantami o wadliwych zmysłach lub te przeprowadzone w nieoptymalnych warunkach (np. niska koncentracja feromonów, nieodpowiednia gęstość robaków) mogą prowadzić do różnych wyników.
Porównując trajektorie i mierząc parametry takie jak kierunkowość, prędkość i prostowność, naukowcy mogą zdobyć wgląd w podstawowe mechanizmy chemotaksji. Sukcesywne eksperymenty z jasnymi, ukierunkowanymi trajektoriami w stronę źródła feromonów potwierdzają zdolność badania do wykrywania stymulantów przyciągających. Z kolei brak takich wzorców w negatywnych kontrolach lub u mutantów potwierdza specyficzność badania i jego zdolność do identyfikacji defektów sensorycznych. Oparty na wideo metoda masowego badania chemoatraktacji, jak pokazano na Rycinie 3, dostarcza potężnego narzędzia do analizy szczegółów zachowania chemotaksycznego robaków. Analizując indywidualne trajektorie, naukowcy mogą odkryć nie tylko obecność lub brak przyciągania, ale również różnicę w reakcji, oferując głębsze zrozumienie podstawowych mechanizmów genetycznych i nerwowych rządzących chemotaksją.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67115/67115fig01v2.jpg" /> 
Rycina 1: Przepływ ekstrakcji surowych feromonów płciowych. Surowe feromony płciowe są ekstraktowane z zsynchronizowanych, jednodniowych, niezamężnionych samic mutanta fog-2 C. elegans oraz samic dzikich C. remanei, gdzie robaki są zsynchronizowane, przemywane, izolowany i inkubowany w buforze M9 na potrzeby produkcji feromonów. Wyekstrahowany surowy surowiec zawierający feromony jest przechowywany w temperaturze -80 °C do 1 roku do stosowania w badaniach chemoatraktacji, z testami kontroli jakości przeprowadzanymi za pomocą samców N2 lub him-5 aby zweryfikować przyciągającość. W przypadku masowej ekstrakcji z 6-d

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Nasze badania badają, jak lotny feromon płciowy wpływa na zachowanie samców zastępczych za pomocą testu chemotaksji. Celem jest zidentyfikowanie mechanizmu molekularnego produkcji feromonów i mechanizmu neuronowego jego percepcji. Indywidualna różnorodność reakcji robaków na feromon, w połączeniu z wpływem czynników środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność i światło, może wprowadzić znaczący hałas do danych.Ponadto, złożona natura zachowań robaków komplikuje interpretację danych. Rozwiązanie tych wyzwań wymaga starannej konstrukcji eksperymentu. Protokół jest prosty i wysoce powtarzalny.Został zaprojektowany w celu optymalizacji zdrowia feromonów przy minimalizacji zużycia czasu i zasobów. Test chemotaksji dostarcza ilościowych danych na temat przyciągania samców, umożliwiając analizę statystyczną i porównanie. Ten protokół zapewnia kompletny obraz komunikacji feromonowej.Aby rozpocząć, oddziel 200 samic dorosłych w stanie L4 FOG-2 Caenorhabditis elegans dzień przed wyodrębnieniem feromonów. Rozłóż samice na trzy osobne sześciocentymetrowe płytki OP50 NGM. W dniu wyodrębnienia przenieś 100 jednodniowych samic FOG-2 do mikrocentrfużującej probówki zawierającej jeden mililitr buforu M9.Po ostatnim płukaniu, inkubatoruj samice w 100 mikroliterach buforu M9 przez sześć godzin w 20 stopniach Celsjusza, aby umożliwić produkcję feromonów. Podobnie, izoluj 15 do 20 samic w stanie L4 Caenorhabditis remanei na trzech płytkach OP50 NGM. Po płukaniu, inkubatoruj pięć samic w 100 mikroliterach buforu M9 przez sześć godzin w 25 stopniach Celsjusza.Wyśrodkuj robaki w centryfuzience przy 15 000 G przez 30 do 60 sekund. Ostrożnie przenieś nadstan zawierający feromony do czystej probówki. Wyrzuć probówkę zawierającą pellet robaczy.Przechowuj zebrany lotny feromon płciowy w ekstrakcie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po synchronizacji zdrowych dorosłych robaków Caenorhabditis elegans, przemyj je pięć razy buforem M9. Aby synchronizować robaki na etapie L1, obracaj je w buforze M9 przez 12 do 15 godzin, aby zatrzymać rozwój.Obserwuj zatrzymane robaki L1 na 10-centymetrowej płytce kultury NGM wysiewanej bakteriami OP50. Aby zminimalizować obecność samców na płytce hermafrodytów, sprawdź płytkę dwa dni po uwolnieniu robaków i usuń zaobserwowanych samców. Po trzech dniach rozwoju, obserwuj pojawienie się zarodków, co wskazuje, że robaki stały się dojrzałymi dorosłymi osobnikami rozmnażającymi się.Przemywaj zarodki powtarzalnie buforem M9 i pozwól im osiąść, aż większość dorosłych znajdzie się na dnie probówki. Pipetą oddziel dorosłe osobniki i przenieś je na nową płytkę NGM wysianą OP50. Aby rozpocząć, usuń płytkę kultury zawierającą dorosłe hermafrodytki z inkubatora.Po synchronizacji robaków him-5, przemyj robaki pięć razy buforem M9. Przenieś jednodniowych dorosłych samców z wysiewanej płytki do probówki zawierającej bufor M9. Umieść robaki na niewysiewanej płytce NGM, aby wyeliminować resztkowe bakterie i zapobiec interferencji z pokarmem podczas testu.Przygotuj płytkę do testu chemoatrakcji zawierającą 1,5% agaru, 25 milimolarów chlorku sodu, 1,5 milimolarów Tris-bazy i 3,5 milimolarów Tris-chlorowodorku. Podgrzej agar w roztworze chemoatrakcji w mikrowfalówce do całkowitego rozpuszczenia. Po schłodzeniu, użyj pipety, aby równomiernie rozprowadzić roztwór agaru chemoatrakcji w naczyniach Petriego.Zostaw pokrywki otwarte w czystym miejscu, aby powierzchnia agaru lekko wyschła. Gdy powierzchnia odpowiednio wyschnie, zamknij pokrywki. Aby przeprowadzić test chemoatrakcji, oznaczyć trzy odrębne miejsca na pokrywce i spodzie płytki Petriego.Nanieść dwa mikrolitery jednomolarnego azydu sodu na każde miejsce eksperymentalne i kontrolne na płytce. Wybierz 20 zdrowych i swobodnie poruszających się samców za pomocą zbieraczy robaków. Pod mikroskopem sekcjonującym, uwolnij robaka w punkcie startowym.Szybko dodaj dwa mikrolitery buforu M9 do kontrolnego miejsca i dwa mikrolitery feromonów płciowych do eksperymentalnego miejsca na pokrywce. Delikatnie zamknij pokrywkę i umieść płytkę w cichym, stabilnym temperaturowo miejscu. Po 30 minutach oceń test, licząc liczbę robaków w każdym miejscu.Aby uzyskać lepszą ocenę chemotaksji, nagrywaj trajektorie robaków za pomocą kamery. Wskaźnik chemotaksji dla samców him-5 był konsekwentnie powyżej 0,5, co wskazuje na silne przyciąganie do źródła feromonów płciowych, podczas gdy wskaźnik chemotaksji dla samców SRD-1 był około zera. Pomyślne testy chemoatrakcji wykazały, że samce him-5 poruszają się bliżej źródła feromonów z czasem, a kod kolorów trajektorii wskazuje czas, odległość, prędkość, prostoliniowość i poprawność kierunku.

volatile-sex-pheromone-extraction-chemoattraction-assay

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną tablicę do dołków, która jest zestawem testów behawioralnych, który zawiera cechy otwartego pola i tradycyjnej tablicy do dołków. Układ ten umożliwia analizę różnicową nieuwarunkowanych zachowań małych ssaków laboratoryjnych, a także analizę zdolności poznawczych.

Zmodyfikowana tablica z otworami - pomiar zachowania, funkcji poznawczych i interakcji społecznych u myszy i szczurów

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni.

Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

Ten protokół opisuje test behawioralny, oparty na teście labiryntu Barnesa, w celu zbadania, jak instynktowne działania obronne są modyfikowane przez wiedzę o środowisku przestrzennym.

Test behawioralny do badania roli pamięci przestrzennej podczas instynktownej obrony u myszy

Ten artykuł przedstawia nieinwazyjny system biomonitoringu do ciągłego rejestrowania i analizowania aktywności serca i lokomotoryki raków. System ten składa się z czujnika optycznego bliskiej podczerwieni, modułu śledzenia wideo oraz oprogramowania do oceny bicia serca raków, które odzwierciedla ich stan fizjologiczny i charakteryzuje zachowanie raków podczas wahań bicia serca.

Ciągły nieinwazyjny pomiar czynności serca i zachowania raków

Paraliż wywołany pływaniem (SWIP) jest dobrze znanym testem behawioralnym używanym do badania mechanizmów leżących u podstaw sygnalizacji dopaminowej u Caenorhabditis elegans (C. elegans). Brakuje jednak szczegółowej metody przeprowadzenia testu. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół SWIP.

Paraliż wywołany pływaniem w celu oceny sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę ekstrakcji feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia badanie komunikacji chemicznej oraz mechanizmów molekularnych i neuronalnych percepcji feromonów.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów