Name: Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj skalowalną metodę wytwarzania jednorodnych organoidów naczyniowych z ludzkich komórek iPSC przy użyciu inhibitorów ROCK i mikropłytek. To podejście zwiększa powtarzalność i umożliwia modelowanie chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie techniczne ze strony Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource of Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia, częściowo przez NIH Center Grant (P30CA013696). Praca ta jest wspierana przez NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Rysunek 1A został utworzony przy użyciu BioRender.

Rysunek 1 przedstawia przegląd kroków związanych z tym protokołem. Szczegółowe informacje dotyczące odczynników i materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów. Zaleca się, aby wszystkie podłoża zostały wstępnie podgrzane w temperaturze 37 °C przed użyciem, chyba że określono inaczej. Wszystkie materiały i materiały do hodowli komórkowych powinny być albo autoklawowane, albo sterylne, a obsługa komórek powinna odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo wartość pH mieszanki kolagenu I należy dokładnie dostosować do pH 7,3, aby uniknąć ewentualnych problemów z krzepnięciem.
1. Konserwacja ludzkiego iPSC
<ol>
	<li>Rozmrozić ekstrakt z macierzy błony podstawnej na lodzie, delikatnie wstrząsnąć butelką, aby wymieszać roztwór, a następnie przygotować 0,5 ml porcji w 1,5 ml probówek do mikrowirówek za pomocą pipety P1000 i wstępnie schłodzonych końcówek. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Rozmrozić jedną porcję ekstraktu z matrycy (0,5 ml) na lodzie. Wymieszać z 49,5 ml wstępnie schłodzonego podłoża DMEM/F12 w probówce o pojemności 50 ml. Rozprowadź mieszaninę do każdego dołka (1,5 ml / dołek) na płytkach 6-dołkowych, a następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że płynny roztwór pokrywa całą studzienkę. Uszczelnij płytki folią parafinową i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.</li>
	<li>Przygotować pożywkę rozszerzającą hiPSC zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przygotować porcje kompletnego podłoża (40 ml/probówkę) i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Umieścić wstępnie pokrytą płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę przed hodowlą hiPSC.</li>
	<li>Ogrzać pożywkę ekspandującą hiPSC (40 ml) w temperaturze 37 °C i przygotować pożywkę wysiewającą hiPSC zgodnie z opisem w tabeli 2.</li>
	<li>Przenieść pokrytą płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C do komory bezpieczeństwa biologicznego. Zastąp podłoże w powlekanej płytce podłożem wysiewającym hiPSC (1 ml/dołek).</li>
	<li>Rozmrażać kriokonserwowaną fiolkę z hiPSC z kriozbiornika w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodaj 5 ml pożywki DMEM/F12, a następnie odwiruj przy 100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1,5 ml pożywki wysiewającej hiPSC. Delikatnie zawiesić komórki w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Podaniec 10 μl zawiesiny komórek i wymieszać z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Przenieść mieszaninę 10 μl na szkiełko hemacytometryczne i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko na uchwycie i włóż je do automatycznego licznika komórek. Poczekaj, aż instrument znajdzie ostrość lub ręcznie wyreguluj ostrość, naciskając przycisk ostrości +/- na ekranie. Następnie użyj ustawienia domyślnego i naciśnij przycisk Przechwyć. Użyj odczytu gęstości komórek NA ŻYWO jako stężenia zawiesiny hiPSC przygotowanej z kroku 1.9.</li>
	<li>Wysiew 2 × 105 komórek w każdym dołku i upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i po 24 godzinach zastąpić pożywkę pożywką ekspandującą hiPSC (1,5 ml/dołek).</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną zbieg 80%. Rutynowo sprawdzaj morfologię komórki i wielkość kolonii, aby upewnić się, że nie dochodzi do spontanicznego różnicowania. Odrzuć kulturę i uruchom ponownie z nową partią hiPSC, jeśli obserwuje się rozległe (>5%) spontaniczne różnicowanie.</li>
</ol>
2. Formacja EB (Dzień 0)
<ol>
	<li>W dniu 0 przygotować i ogrzać pożywkę DMEM/F12, pożywkę wysiewającą hiPSC i roztwór do oddzielania komórek w temperaturze 37 °C przez 20-30 min.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej i dodać wstępnie podgrzany roztwór do odrywania komórek (1,5 ml/dołek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.</li>
	<li>Przenieś płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego, postukaj w płytkę, aby odłączyć kolonie hiPSC i rozbić agregaty.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 4,5 ml pożywki DMEM/F12. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół za pomocą pięciokrotnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby zdysocjować komórki w zawiesinę jednokomórkową. Unikaj generowania bąbelków.</li>
	<li>Wirować przy 100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki z 1 ml pożywki wysiewającej hiPSC za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Przenieść 10 μl mieszaniny na szkiełko hemacytometryczne i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Zamontuj szkiełko na uchwycie i włóż je do automatycznego licznika komórek. Po tym, jak przyrząd znajdzie ostrość, naciśnij przycisk Capture i użyj odczytu gęstości komórek NA ŻYWO, aby określić stężenie zawiesiny hiPSC.</li>
	<li>Zasiej komórki na płytce mikrodołkowej o okrągłym dnie o bardzo niskim przyleganiu o gęstości 2,7 × 105 komórek / dołek, aby uzyskać 500-1,000 komórek na EB.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki wysiewającej hiPSC do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Różnicowanie naczyń krwionośnych (Dzień 1 - 5)
<ol>
	<li>W dniu 1 przygotować pożywkę do indukcji mezodermy (MIM) zgodnie z opisem w Tabeli 3 i Tabeli 4 i podgrzać ją w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Pożywka MIM musi być przygotowana na świeżo.</li>
	<li>Użyj pipety P200, aby ostrożnie zassać pożywkę z płytki mikrodołkowej, nie naruszając EB na dnie.</li>
	<li>Powoli dodawaj 2,5 ml MIM za pomocą pipety P200. Hodować EB w MIM w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.</li>
	<li>W dniu 3 delikatnie zastąp pożywkę podgrzanym, świeżo przygotowanym 2,5 ml pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych 1 (VDM1, Tabela 5) bez naruszania EB na dnie mikrostudzienki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 2 dni.</li>
</ol>
4. Osadzanie hydrożelu (Dzień 5)
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę kolagenu I zgodnie z opisem w Tabeli 6. Umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie i dodaj następnie roztwór kolagenu I,H2O, 10× pożywkę DMEM/F12, wodorowęglan sodu i HEPES. Dokładnie wymieszaj, delikatnie potrząsając tubką. Dodawać kroplami 1 M roztwór NaOH, potrząsając zmieszanym roztworem, aby dostosować wartość pH do 7,3 i sprawdzić wartość pH mieszaniny za pomocą pH-metru. 
	UWAGA: Wszystkie roztwory należy przed użyciem wstępnie schłodzić na lodzie. Procedurę należy cały czas wykonywać na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodanie roztworu NaOH ma kluczowe znaczenie i konieczna jest szybka dyspersja w celu uzyskania jednorodnego roztworu, aby uniknąć miejscowego utwardzania kolagenu I. Objętość NaOH może się różnić w zależności od liczby partii użytego roztworu kolagenu I. Nie pipetować energicznie do mieszania, ponieważ naprężenia ścinające mogą spowodować niepożądane utwardzenie wstępne.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę kolagenu I i macierzy błony podstawnej zgodnie z opisem w Tabeli 7. Dodać 1,25 ml matrycy błony podstawnej do 5 ml mieszaniny kolagenu I przygotowanej z kroku 4.1. Delikatnie wymieszać roztwór, potrząsając probówką.</li>
	<li>Umieść 12-dołkową płytkę na lodzie na 2 minuty.</li>
	<li>Powoli dodawaj mieszaninę kolagenu I-macierzy błony podstawnej do 12-dołkowej płytki (1,5 ml / dołek) za pomocą końcówek o szerokim otworze. Upewnij się, że mieszanina jest równomiernie rozprowadzona.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny w celu zestalenia pierwszej warstwy hydrożelu.</li>
	<li>Pozostałą mieszaninę kolagenu I i macierzy błony podstawnej należy przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Przenieś agregaty ~60 komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i schładzaj probówkę na lodzie przez 5 minut. Ostrożnie usuń pożywkę za pomocą końcówki do pipety P200. 
	UWAGA: Rozpocznij ten krok 1.5 godziny po kroku 4.5.</li>
	<li>Kroplami dodaj 1,5 ml mieszanki kolagenu I-błona podstawna do agregatów i delikatnie wymieszaj je za pomocą końcówek do pipet P200 o szerokim otworze.</li>
	<li>Przenieść płytkę z pierwszą warstwą hydrożelu z inkubatora (krok 4.5) do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml zawiesiny kruszywa na utwardzoną warstwę. Delikatnie potrząśnij płytą, aby równomiernie rozprowadzić kruszywa. Unikaj generowania bąbelków.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować podłoże do różnicowania naczyniowego 2 (VDM2; Tabela 8) i podgrzać podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dodać 2 ml VDM2 do każdej studzienki i hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3 dni na podgrzany, świeżo przygotowany VDM2. 
	UWAGA: (Opcjonalnie) Organoidy naczyniowe można uwolnić z mieszaniny żelu poprzez usunięcie żelu za pomocą igły strzykawki. Organoidy naczyniowe pobrane z żelu mogą być utrzymywane pojedynczo w 96-dołkowej płytce z VDM2 (200 μL/dołek). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
</ol>
5. 3D Test immunofluorescencyjny
<ol>
	<li>Organoidy naczyniowe powinny osiągnąć dojrzałość mniej więcej w 13 dniu. W przypadku organoidów zatopionych w hydrożelu należy ostrożnie odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS trzy razy (za każdym razem 10 minut). W przypadku organoidów pobranych z żelu (po kroku 4.14) należy zebrać 6-10 organoidów w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml, odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS trzykrotnie (10 minut każdy).</li>
	<li>Dodać 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do próbki i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc z uszczelnieniem warstwy parafinowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór PFA i przemyć próbkę 2 ml PBS cztery razy (za każdym razem 15 minut).</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu blokującego (tabela 9) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący i dodać 1,5 ml przeciwciał pierwszorzędowych (informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów; przeciwciała należy rozcieńczyć w buforze blokującym). Inkubować próbkę z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 4 °C przez 2 dni, delikatnie wstrząsając. 
	UWAGA: Zaleca się rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (CD31, PDGFRβ i ERG1) w buforze blokującym w stosunku 1:400 (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów).</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemywać 2 ml PBST przez 1 godzinę sześć razy.</li>
	<li>Dodać 2 ml przeciwciał drugorzędowych (informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli Materiałów; przeciwciała należy rozcieńczyć w PBST). Owinąć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 dni, delikatnie wstrząsając. 
	UWAGA: Zaleca się rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego w PBST w stosunku 1:1000 (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów). Trzymaj płytkę z dala od światła podczas inkubacji, a następnie umyj ją od tego etapu.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć 2 ml TBST sześć razy (za każdym razem 1 godzina). Dodać DAPI (1 μg/ml) do buforu do płukania używanego na ostatnim etapie płukania, jeśli konieczne jest barwienie jąder.</li>
	<li>W przypadku tych organoidów zatopionych w żelu pokrój żel na 4 części i ostrożnie przenieś je szpatułką do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml. W przypadku odzyskanych organoidów należy usunąć bufor do płukania.</li>
	<li>Użyj chusteczek, aby wchłonąć pozostały roztwór bez dotykania żelu lub organoidów.</li>
	<li>Dodać 2 ml rozpuszczalnego w wodzie odczynnika do oczyszczania tkanek (współczynnik załamania światła = 1,49) do każdej probówki. Próbki inkubować z odczynnikiem czyszczącym w temperaturze pokojowej w ciemności, aż organoidy staną się przezroczyste (zwykle przez noc). Nie potrząsaj próbkami.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść organoidy z odczynnikiem czyszczącym na środek naczynia ze szklanym dnem za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Przykryj organoidy lub kawałek żelu szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 24 mm × 24 mm.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aż będzie płaskie, a następnie umieść próbki na szklanym dnie.</li>
	<li>Usuń zbędny odczynnik czyszczący z naczynia i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
	<li>Do obrazowania 3D należy użyć mikroskopu konfokalnego z obiektywem 10×. Użyj skanowania kafelków i skanowania stosu Z, aby uzyskać obrazy organoidów w całości.</li>
</ol>

hiPSC-Derived Vascular Organoids for Drug Screening and Disease Modeling

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
<li>Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKosyakova%2C+N+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2019).</li>
<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany protokół obejmuje dwie kluczowe modyfikacje w celu uzyskania jednorodnego i powtarzalnego wytwarzania wysokiej jakości organoidów naczyniowych. Pierwszą modyfikacją jest zastosowanie płytki mikrodołkowej, aby umożliwić lepszą kontrolę jednorodności EB. Jako punkt wyjścia do różnicowania naczyń krwionośnych, wielkość EB ma kluczowe znaczenie, ponieważ reguluje los komórek macierzystych i skuteczność różnicowania w kierunku różnych linii. Różnice w wielkości EB zwykle prowadzą do niejednorodnych organoidów o niespójnej strukturze i organizacji16,17. Konwencjonalna metoda generowania EB poprzez podnoszenie kolonii hiPSC 11,12 utrudnia kontrolowanie liczby komórek dla poszczególnych EB i zwykle prowadzi do niejednorodnego tworzenia EB. W tym protokole hiPSC są dysocjowane do zawiesiny pojedynczej komórki i ponownie agregowane w mikrodołkach16,18. Dostosowując liczbę komórek wysiewu, można zoptymalizować rozmiar EB, aby zapewnić spójne i skuteczne różnicowanie mezodermalne. Do wysiewu mikrostudzienek używa się 500-1,000 komórek, co pozwala uzyskać stosunkowo małe EB (o średnicy 100-200 μm). Metoda ta może w powtarzalny sposób generować jednolite EB o pożądanych rozmiarach z partii na partię (Rysunek 1F) i między różnymi liniami komórkowymi13. Od dnia 0 morfologia EB zmieniała się z czasem podczas różnicowania: kształt staje się mniej kulisty, a powierzchnia staje się bardziej szorstka (ryc. 1), ale objętość nie zwiększa się znacząco. Morfologia naczyń krwionośnych 3D zależy od gęstości osadzenia i rozmiarów osadzonych organoidów. Zbyt duże (>500 μm) organoidy zwykle powodują niewystarczające różnicowanie komórek naczyniowych, podczas gdy zbyt małe organoidy mają zwykle słabo rozwinięte unaczynienie.
Drugą modyfikacją jest włączenie koktajlu CEPT w celu poprawy żywotności hiPSC podczas tworzenia EB. Żywotność komórek ma kluczowe znaczenie oprócz jakości kolonii hiPSC podczas tego procesu. Kiedy hiPSC są dysocjowane do zawiesiny pojedynczej komórki, zwykle dodaje się inhibitor ROCK Y27632 w celu poprawy żywotności komórek. Wykazano jednak, że Y27632 jest nieoptymalny dla hiPSC o niskiej gęstości i może powodować niepożądane naprężenia błonowe, podczas gdy koktajl CEPT (składający się z chromanu 1, emricasanu, poliamin i trans-ISRIB) może znacznie zmniejszyć stres komórkowy i poprawić żywotność podczas tego procesu tworzenia EB z hiPSC o mniejszej gęstości15.
Przed osadzeniem organoidów w żelu, organoidy są utrzymywane w płytce mikrodołka, a zmiana podłoża powinna być delikatna, aby uniknąć ewentualnych zakłóceń. Lepiej byłoby użyć pipety o pojemności 200 μl do zmiany pożywki przez pierwsze 5 dni. Wszystkie podłoża używane do wytwarzania organoidów naczyniowych muszą być wstępnie podgrzane przed użyciem. Zwłaszcza po zatopieniu żelu zastosowanie zimnych mediów może częściowo upłynnić macierz błony podstawnej i wpłynąć na niszę hydrożelową 3D do tworzenia sieci naczyniowej. Gęstość osadzenia i równomierne rozmieszczenie organoidów są również krytycznymi czynnikami tworzenia sieci naczyniowej. Gęste osadzanie organoidów może potencjalnie prowadzić do nadmiernej fuzji sieci naczyniowych, podczas gdy niska gęstość osadzania może prowadzić do niewystarczającego tworzenia sieci. Wysiewanie 60-80 organoidów na studzienkę i delikatne przesuwanie płytki w przód iw tył natychmiast po dodaniu ich do pierwszej warstwy żelu 3D może lepiej rozprowadzić te organoidy.
Protokół ten może być dalej modyfikowany dla różnych zastosowań. Na przykład wskazówki bariery krew-mózg (BBB) mogą być stosowane w celu dalszego powstrzymywania komórek śródbłonka naczyń krwionośnych przed tworzeniem interfejsu BBB 19,20,21,22,23,24,25. Skład hydrożelu 3D można również dostosować. Na przykład fibryna i witronektyna są powszechnie stosowane do tworzenia sieci naczyniowych in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. Macierz błony podstawnej bez kolagenu I może być używana do osadzania, co może uprościć proces osadzania i dostarczać różnych bodźców mechanicznych.
Chociaż organoidy naczyniowe wygenerowane w wyniku tego protokołu mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania chorób lub badań przesiewowych leków, jednym z ograniczeń jest to, że organoidy te rekapitulują głównie naczynia włosowate z kilkoma większymi naczyniami. W przypadku badań koncentrujących się na większych naczyniach generowanie organoidów może wymagać dodatkowych bodźców mechanicznych 24,31,32,33. Połączenie organoidów naczyniowych z recyrkulacją, taką jak przeszczep zwierzętom34 lub urządzenia mikro-/makrofluidyczne z pompami perfuzyjnymi33, może potencjalnie rozwiązać ten problem.

Modele mikrofizjologiczne in vitro, w tym systemy organoidowe i tkanka na chipie, pojawiły się w ciągu ostatniej dekady1,2,3. Te trójwymiarowe (3D) systemy pochodzące z komórek ludzkich rozwiązują problemy związane z konwencjonalnymi dwuwymiarowymi (2D) hodowlami komórkowymi i modelami zwierzęcymi, takimi jak brak wielu składników w mikrośrodowisku fizjologicznym i różnice genetyczne między gatunkami. Zapewniają one więcej wglądów fizjologicznych i są bardziej odpowiednie do modelowania chorób i badań przesiewowych leków niż modele konwencjonalne. Wśród modeli mikrofizjologicznych udowodniono, że organoidy pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) skutecznie rekapitulują cechy architektoniczne rodzimych tkanek ludzkich i zostały opracowane w celu naśladowania różnych narządów ludzkich, w tym mózgu4,5, kidney6, liver7,8 i retina9. W tym przypadku skupiamy się szczególnie na generowaniu organoidów naczyniowych z hiPSC i nakreślamy uproszczony protokół, który ma na celu zminimalizowanie różnic między różnymi próbkami i partiami organoidów, poprawiając w ten sposób ogólną odtwarzalność.
Unaczynienie odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu fizjologicznej homeostazy we wszystkich organach ludzkich. Tworzenie się układu krwionośnego obejmuje procesy waskulogenezy i angiogenezy, koordynowane poprzez interakcje między komórkami śródbłonka i ściany (np. perycytów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych) i pod wpływem różnych bodźców10. Penninger, Wimmer i współpracownicy opracowali pierwszą metodę generowania organoidów naczyniowych11,12, która naśladuje te dwa procesy. Dzięki organoidom wygenerowanym tą metodą, ich group12 i us13,14 wykazały potencjał organoidów naczyniowych w modelowaniu nieprawidłowego funkcjonowania naczyń krwionośnych w chorobach. Na przykład w naszych ostatnich pracach13,14 zaobserwowano różne fenotypy, takie jak kiełkowanie naczyń krwionośnych i różnice w składzie komórek ściennych, między organoidami naczyniowymi naśladującymi chorobę a ich dzikimi odpowiednikami. Przykłady te podkreślają, że model organoidów naczyniowych może służyć jako platforma do badań przesiewowych leków, naśladując nieprawidłowe funkcjonowanie naczyń krwionośnych związane z chorobą.
Zbudowany na początkowym procesie generowania organoidów naczyniowych works11,12, przedstawiono poprawiony protokół, który obejmuje użycie mikrostudzienki w celu ułatwienia tworzenia jednorodnego ciała zarodkowego (EB), co jest krytycznym czynnikiem minimalizującym często obserwowane różnice w tej samej partii generacji organoidów. Dodatkowo, koktajl CEPT, połączenie chromanu 1, emricasanu, poliamin i zintegrowanego inhibitora odpowiedzi na stres (trans-ISRIB)15, jest stosowany w celu poprawy żywotności hiPSC i zróżnicowanych komórek podczas procesu tworzenia EB. Modyfikacja ta ma na celu głównie zmniejszenie różnic między różnymi próbkami i partiami organoidów. Jednolite organoidy naczyniowe można wytworzyć za pomocą tego około dwutygodniowego protokołu, w którym indukowana jest waskulogeneza, aby pomóc śródbłonkowi zorganizować się w prymitywne sieci kanalikowe w dniu 1, a następnie indukcja angiogenezy w dniu 5 w celu rozwinięcia złożonych sieci naczyniowych w organoidach. W dniach 12-15 wygenerowane organoidy powinny wykazywać dojrzałe sieci naczyniowe składające się zarówno ze śródbłonka, jak i komórek ściennych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>rozpuszcza się w 0,25 ml 50% glicerolu,&nbsp; przechowywać w temperaturze -20 stopni; C przez okres do 1 roku, stosunek rozcieńczenia do stosowania: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anti-Goat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>rozpuszcza się w 0,25 ml 50% glicerolu,&nbsp; przechowywać w temperaturze -20&deg; C przez okres do 1 roku, stosunek rozcieńczenia do stosowania: 1:1000</td></tr><tr><td>suplement B27 minus witamina A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>rozmrozić w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td><td>rozpuszcza się w sterylnym ddH2O w stężeniu 100 ng / &mikro; L, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; Przeciwciało C</td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>Stosunek rozcieńczenia: 1:400</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td><td>przygotować roztwór podstawowy przy 12 mM za pomocą DMSO i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C przez okres do 1 roku.</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td><td>przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 &mikro; M z DMSO i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C przez okres do 1 roku.</td></tr><tr><td>Kolagen I&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Elplasia Plates</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, proszek</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>przygotować 10x roztwór podstawowy z biograde ddH2O i wysterylizować go 0,2 &mikro; m filtr. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>wytwarza roztwór podstawowy w temperaturze 1 mM za pomocą DMSO i przechowuje w temperaturze -20 & stopni; C przez okres do 1 roku.</td></tr><tr><td>Przeciwciało ERG</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>współczynnik rozcieńczenia: 1:400</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C&nbsp; i podwielokrotność, przechowywać w&nbsp; -20 &stopni; C przez okres do pięciu lat lub przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do miesiąca</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td><td>rozpuścić w sterylnym ddH2O w stężeniu 100 ng/&mikro; L, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fluorodish Cell Culture Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td>rozpuścić w DMSO w stężeniu 12 mM, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna, 100 kU</td><td>MiliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>rozpuścić w sterylnym ddH2O w stężeniu 4 kU/ml</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum do nokautowania</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>rozmrożenie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&deg; C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80&deg; C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych MEM (NEAA, 100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Klasa Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus zestaw</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&deg; C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>suplementu N2 (100x)</td> <td>Gibco</td><td>17502048</td><td>rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&deg; C, unikać cyklu zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Roztwór NaOH (1 M)</td><td>Cytiva&nbsp; HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>rozpuszczone w 10 ml sterylnego ddH2O, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do dwóch tygodni</td></tr><tr><td>paraformaldehyd, 20%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15713S</td><td>rozcieńczony PBS</td></tr><tr><td>PBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta; przeciwciało</td><td>R& Stosunek</td> rozcieńczenia D <td>AF385</td><td>: 1:400</td></tr><tr><td>suplement poliaminowy (1000x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik klarujący Rapiclear, 1,49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu monohydrat</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td><td>rozpuścić z ddH2O do uzyskania 1% (wag./v) roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>TBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>przygotować roztwór podstawowy w temperaturze 1 mM z DMSO i przechowywać w temperaturze -20&deg; C przez okres do 1 roku.</td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td><td>rozpuszcza się w sterylnym ddH2O w stężeniu 100 ng/&mikro; L, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&deg; Z</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Organoidy naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) podsumowują różnorodność typów komórek i złożoną architekturę ludzkich sieci naczyniowych. Ten trójwymiarowy (3D) model ma znaczny potencjał w modelowaniu patologii naczyń krwionośnych i badaniach przesiewowych leków in vitro. Pomimo najnowszych osiągnięć, kluczowym wyzwaniem technicznym pozostaje powtarzalne wytwarzanie organoidów o stałej jakości, co ma kluczowe znaczenie dla dalszych testów i zastosowań. W tym miejscu przedstawiono zmodyfikowany protokół, który poprawia zarówno jednorodność, jak i odtwarzalność wytwarzania organoidów naczyniowych. Zmodyfikowany protokół obejmuje wykorzystanie mikrostudzienek i koktajlu CEPT (chroman 1, emricasan, poliaminy i zintegrowany inhibitor odpowiedzi na stres, trans-ISRIB) w celu poprawy tworzenia ciał zarodków i przeżywalności komórek. Zróżnicowane, dojrzałe organoidy naczyniowe wygenerowane przy użyciu tego protokołu charakteryzują się całościową mikroskopią immunofluorescencyjną 3D w celu analizy ich morfologii i złożonego unaczynienia. Protokół ten umożliwia produkcję wysokiej jakości organoidów naczyniowych w skalowalny sposób, potencjalnie ułatwiając ich wykorzystanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków.

Rysunek 1A przedstawia schemat tego protokołu, w tym kluczowe komponenty wykorzystane na każdym etapie. Różnicowanie rozpoczęło się od formowania ciałek zarodkowych (EB), po których nastąpiła indukcja mezodermy i specyfikacja linii naczyniowej (Rysunek 1B-D). Agregaty z czasem stawały się większe i mniej sferyczne. Organoidy zaczęły wykazywać nieregularne krawędzie w 5. dniu. Po osadzeniu w mieszaninie kolagenu I i macierzy błony podstawnej, komórki śródbłonka naczyniowego oraz perycyty zaczęły kiełkować i przerastać, tworząc złożone sieci naczyniowe już w 7. dniu (Rysunek 1E). Ponieważ głównym celem tej zmodyfikowanej metody jest zminimalizowanie różnic między różnymi partiami generowanymi, zmierzyliśmy rozmiar EB z dwóch niezależnych partii; zarówno pomiary rozmiarów, jak i analiza statystyczna potwierdziły spójność i jednorodność uzyskanych wyników przy zastosowaniu tej metody (Rysunek 1F).
Aby potwierdzić różnicowanie naczyniowe, organoidy zebrano w 5. dniu przed zatopieniem i zabarwiono markerami naczyniowymi, w tym CD31, ERG1 i PDGFRβ. Organoidy wykazywały ekspresję CD31, ERG1 i PDGFRβ (Rysunek 2), co wskazuje na obecność komórek śródbłonka naczyniowego i pericytów.
Po przejrzyszczaniu tkanek sieci naczyniowe przeanalizowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej preparatów całych (Rycina 3A). Dojrzałe organoidy barwiono na CD31, ERG1 i PDGFRβ w 17. dniu (Rycina 3B, próbka w bloku żelu) oraz w 28. dniu (Rycyna 3C; próbkę wyjęto z bloku żelu i hodowano indywidualnie na płytce 96-dołkowej; należy zauważyć, że po wyjęciu z bloku żelu sieć naczyniowa na krawędziach owinęła sferoidy zamiast rozszerzać się promieniście).
<img alt="Hodowla iPSC do sieci naczyniowej; schemat, obrazy A-E z eksperymentami, wykres F z wynikami wielkości ciał embrioidalnych (EB)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Generowanie organoidów naczyniowych. (A) Schemat etapów i harmonogram generowania organoidów naczyniowych. (B-E) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów naczyniowych na różnych etapach. Paski skali: 100 µm. (F) Analiza statystyczna wielkości EB z dwóch różnych partii generowania EB przy użyciu metody mikrootworów przedstawionej w niniejszej pracy. Do generowania EB wykorzystano 1 000 komórek na mikrootwór, a dla partii 1 i 2 odpowiednio n = 42 i n = 40. Istotność przedstawiono jako ns, brak istotności statystycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej struktur komórkowych, analiza lokalizacji białek, wynik eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Immunobarwienie organoidów naczyniowych przed zatopieniem w żelu. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne organoidów barwionych markerami śródbłonkowymi (A) CD31 (zielony) i (B) ERG1 (zielony), a także (C) markerem perycytów, PDGFRβ (zielony). Jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (niebieski). Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja urządzenia do spektroskopii, mikroskopia fluorescencyjna komórek, obrazowanie wolumetryczne 3D struktury komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Charakterystyka immunofluorescencyjna sieci naczyniowej w organoidach naczyniowych. (A) Reprezentatywny obraz przedstawia osadzone w żelu organoidy naczyniowe w szalkach szklanych po procesie klarowania tkanek. Organoidy były przezroczyste, lecz widoczne w świetle UV o długości fali 385 nm. (B) Reprezentatywny obraz 3D całego preparatu (whole-mount) organoidu naczyniowego w 17. dniu. Organoid naczyniowy został zabarwiony DAPI (niebieski), markerem komórek śródbłonkowych naczyń CD31 (zielony) oraz markerem perycytów PDGFRβ (magenta). (C) Reprezentatywne obrazowanie 3D całego preparatu odzyskanego organoidu naczyniowego w 28. dniu, zabarwionego markerami śródbłonkowymi CD31 (czerwony) i ERG1 (zielony). Paski skali: 150 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pożywka do ekspansji hiPSC</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podłoże podstawowe mTeSR Plus</td>
			<td>400 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement mTeSR Plus</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pożywki do ekspansji hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >pożywka do wysiewu hiPSC</td>
			<td >20 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >pożywka do ekspansji PSC</td>
			<td >20 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Chroman 1 (100 µM)</td>
			<td >10 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Emricasan (1 mM)</td>
			<td >30 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >suplement poliaminowy (1000x)</td>
			<td >20 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td >14 µL</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Skład medium do wysiewu hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pożywka N2B27</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, dodatek GlutaMAX</td>
			<td>48,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka NeuroBasal</td>
			<td>48,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement GlutaMAX (100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór nieessentialnych aminokwasów do MEM (NEAA, 100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-merkaptoetanol (1000x)</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycyna (50 mg/mL)</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement N2 (100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement B27 bez witaminy A (50x)</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparyna, 4 kU/mL</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Skład pożywki N2B27.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pożywka do indukcji mezodermy (MIM)</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka N2B27</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4 (100 ng/µL)</td>
			<td>0.9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Skład pożywki do indukcji mezodermy (MIM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywka do różnicowania naczyniowego 1 (VDM1)</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka N2B27</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forsklin (12 mM)</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA (100 ng/µL)</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Skład medium do różnicowania naczyniowego 1 (VDM1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>mieszanina kolagenu I</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagen I (3,61 g/ml)</td>
			<td>2,77 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka 10x DMEM/F12</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Węglan sodu, 7,5%</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>0,73 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, 1M</td>
			<td>75 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Skład mieszaniny kolagenu I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mieszanina kolagenu I i macierzy błony podstawnej</td>
			<td>6,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina kolagenu typu I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (10 mg/ml)</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 7: Skład mieszaniny kolagenu typu I i macierzy błony podstawnej.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywka do różnicowania naczyniowego 2 (VDM2)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, dodatek GlutaMAX™</td>
			<td>3,67 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór nieessentialnych aminokwasów do MEM (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-merkaptoetanol (1000x)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparyna, 4 kU/ml</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik surowicy KnockOut</td>
			<td>0,75 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytki surowicy wołowej</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA (100 ng/µL)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 (100 ng/µL)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 8: Skład pożywki do różnicowania naczyniowego 2 (VDM2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bufor blokujący</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surowica osła</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór deoksycholanu sodu (1%, m/v)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor fosforanowy w soli fizjologicznej (PBS)</td>
			<td>46,5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 9: Skład buforu blokującego do immunobarwienia.

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

Badanie to wprowadza zmodyfikowaną metodę skalowalnej produkcji jednorodnych organoidów naczyniowych z ludzkich iPSC przy użyciu nowych inhibitorów ROCK i uwięzienia mikrostudzienek. Podejście to zwiększa odtwarzalność i minimalizuje różnice między partiami, dzięki czemu nadaje się do dalszych analiz morfologicznych i zastosowań związanych z modelowaniem chorób. Technologie sekwencjonowania pojedynczych komórek są szeroko wykorzystywane w badaniach organoidowych w celu rozwikłania niejednorodności genomicznej, epigenomicznej i transkryptomicznej oraz dynamiki w populacjach komórkowych.Technologie obrazowania 3D, takie jak oczyszczanie tkanek i mikroskopia świetlna, ułatwiają szybkie obrazowanie morfologii komórek i architektury tkanek w wysokiej rozdzielczości w trójwymiarowym kontekście. Przepustowość i standaryzacja są kluczowymi wyzwaniami w badaniach nad organoidami. Ręczna obsługa jest pracochłonna i ogranicza przepustowość, co sprawia, że automatyzacja robotów jest obiecującym rozwiązaniem.Standaryzacja hodowli organoidów, w tym kontrola jakości iPSC i optymalizacja protokołu różnicowania, może znacznie zwiększyć odtwarzalność i zminimalizować różnice między partiami i liniami komórkowymi. Na początek umieść 50-mililitrową tubkę na lodzie i kolejno dodawaj roztwór kolagenu 1 wraz z innymi składnikami. Wstrząśnij tubką, aby dokładnie wymieszać.Za pomocą pipety P10 dodawać kroplami 1 molowy roztwór wodorotlenku sodu, potrząsając zmieszanym roztworem, aby dostosować pH do 7,3. Dodaj 1,25 mililitra macierzy błony podstawnej do pięciomililitrowej mieszaniny Collagen 1 i delikatnie wymieszaj roztwór. Następnie umieść 12-dołkową płytkę na lodzie na dwie minuty.Używając końcówek o szerokim otworze, powoli dodawaj mieszaninę macierzy błony podstawnej Collagen 1 do płytki 12-dołkowej. Umieść 12-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, aby zestalić pierwszą warstwę hydrożelu. Pozostałą mieszaninę macierzy błony podstawnej Collagen 1 należy przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania.Następnie przenieś około 60 agregatów komórek do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i schładzaj probówkę na lodzie przez pięć minut. Za pomocą końcówki do pipety P200 ostrożnie usuń medium z probówki. Dodaj kroplami 1,5 mililitra mieszaniny membrany podstawnej Collagen 1 do agregatów komórkowych i delikatnie wymieszaj je za pomocą końcówki do pipety P200 o szerokim otworze w celu ponownego zawieszenia.Przenieść płytkę z pierwszą warstwą hydrożelu z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj 1,5 mililitra zawiesiny kruszywa na utwardzoną warstwę hydrożelu i delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić kruszywa. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwie godziny.Wstępnie podgrzej pożywkę do różnicowania naczyń krwionośnych 2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj dwa mililitry pożywki do każdej studzienki i hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmieniaj pożywkę co trzy dni na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę do różnicowania naczyń krwionośnych 2.Organoidy wykazywały ekspresję CD31, ERG1 i PDGFR-beta, co wskazuje na obecność komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i pasożytów. Sieci naczyniowe uwidoczniono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej typu full-mount po oczyszczeniu tkanek. Dojrzałe organoidy wybarwione w 17 dniu wykazały sieci naczyniowe otaczające sferoidy w bloku żelu.Organoidy pobrane w 28 dniu miały sieci naczyniowe owijające się wokół sferoidów, zamiast rozszerzać się promieniście.

vascular-organoid-generation-from-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Film demonstruje metodę generowania organoidów ludzkiego mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pokazuje, w jaki sposób neurosfera tworzy warstwę neuroektodermalną, która hamuje tworzenie się innych listków zarodkowych. Neurosfery są osadzone w matrycy żelowej 3D i tworzą zawiązki neuronabłonkowe. Podczas inkubacji z pożywkami organoidowymi te pąki neuroepitelialne różnicują się w określone obszary mózgu, co powoduje tworzenie dojrzałych organoidów mózgowych.

Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu

Ten film przedstawia tworzenie organoidów typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), demonstrując postęp od agregatów komórek macierzystych do złożonych struktur, które naśladują korę mózgu i różnicują się w różne typy neuronów.

Generowanie organoidów mózgowych typu przodomózgowia z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje tworzenie samoorganizujących się naczyń krwionośnych z ludzkich pluripotencjalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te sieci naczyń krwionośnych wykazują rozległą i połączoną sieć śródbłonka otoczoną perycytami, aktyną mięśni gładkich i ciągłą błoną podstawną.

Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Poznaj skalowalną metodę wytwarzania jednorodnych organoidów naczyniowych z ludzkich komórek iPSC przy użyciu inhibitorów ROCK i mikropłytek. To podejście zwiększa powtarzalność i umożliwia modelowanie chorób.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów