Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych
13 grudnia 2024
Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Badanie to wprowadza zmodyfikowaną metodę skalowalnej produkcji jednorodnych organoidów naczyniowych z ludzkich iPSC przy użyciu nowych inhibitorów ROCK i uwięzienia mikrostudzienek. Podejście to zwiększa odtwarzalność i minimalizuje różnice między partiami, dzięki czemu nadaje się do dalszych analiz morfologicznych i zastosowań związanych z modelowaniem chorób. Technologie sekwencjonowania pojedynczych komórek są szeroko wykorzystywane w badaniach organoidowych w celu rozwikłania niejednorodności genomicznej, epigenomicznej i transkryptomicznej oraz dynamiki w populacjach komórkowych.
Technologie obrazowania 3D, takie jak oczyszczanie tkanek i mikroskopia świetlna, ułatwiają szybkie obrazowanie morfologii komórek i architektury tkanek w wysokiej rozdzielczości w trójwymiarowym kontekście. Przepustowość i standaryzacja są kluczowymi wyzwaniami w badaniach nad organoidami. Ręczna obsługa jest pracochłonna i ogranicza przepustowość, co sprawia, że automatyzacja robotów jest obiecującym rozwiązaniem.
Standaryzacja hodowli organoidów, w tym kontrola jakości iPSC i optymalizacja protokołu różnicowania, może znacznie zwiększyć odtwarzalność i zminimalizować różnice między partiami i liniami komórkowymi. Na początek umieść 50-mililitrową tubkę na lodzie i kolejno dodawaj roztwór kolagenu 1 wraz z innymi składnikami. Wstrząśnij tubką, aby dokładnie wymieszać.
Za pomocą pipety P10 dodawać kroplami 1 molowy roztwór wodorotlenku sodu, potrząsając zmieszanym roztworem, aby dostosować pH do 7,3. Dodaj 1,25 mililitra macierzy błony podstawnej do pięciomililitrowej mieszaniny Collagen 1 i delikatnie wymieszaj roztwór. Następnie umieść 12-dołkową płytkę na lodzie na dwie minuty.
Używając końcówek o szerokim otworze, powoli dodawaj mieszaninę macierzy błony podstawnej Collagen 1 do płytki 12-dołkowej. Umieść 12-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, aby zestalić pierwszą warstwę hydrożelu. Pozostałą mieszaninę macierzy błony podstawnej Collagen 1 należy przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania.
Następnie przenieś około 60 agregatów komórek do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i schładzaj probówkę na lodzie przez pięć minut. Za pomocą końcówki do pipety P200 ostrożnie usuń medium z probówki. Dodaj kroplami 1,5 mililitra mieszaniny membrany podstawnej Collagen 1 do agregatów komórkowych i delikatnie wymieszaj je za pomocą końcówki do pipety P200 o szerokim otworze w celu ponownego zawieszenia.
Przenieść płytkę z pierwszą warstwą hydrożelu z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj 1,5 mililitra zawiesiny kruszywa na utwardzoną warstwę hydrożelu i delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić kruszywa. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwie godziny.
Wstępnie podgrzej pożywkę do różnicowania naczyń krwionośnych 2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj dwa mililitry pożywki do każdej studzienki i hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmieniaj pożywkę co trzy dni na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę do różnicowania naczyń krwionośnych 2.
Organoidy wykazywały ekspresję CD31, ERG1 i PDGFR-beta, co wskazuje na obecność komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i pasożytów. Sieci naczyniowe uwidoczniono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej typu full-mount po oczyszczeniu tkanek. Dojrzałe organoidy wybarwione w 17 dniu wykazały sieci naczyniowe otaczające sferoidy w bloku żelu.
Organoidy pobrane w 28 dniu miały sieci naczyniowe owijające się wokół sferoidów, zamiast rozszerzać się promieniście.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zmodyfikowaną metodę skalowalnej produkcji jednorodnych organoidów naczyniowych z ludzkich iPSC przy użyciu nowych inhibitorów ROCK oraz ograniczenia w mikrosyzywach. Podejście to zwiększa powtarzalność i minimalizuje różnice między partiami, co czyni je odpowiednim do późniejszych analiz morfologicznych oraz zastosowań w modelowaniu chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad organoidami
Wstęp
- Organoidy naczyniowe są istotne dla badania biologii naczyń krwionośnych.
- Ludzkie iPSC stanowią wszechstronną platformę do generowania organoidów.
- Standaryzacja i przepustowość są kluczowymi wyzwaniami w badaniach nad organoidami.
- Automatyzacja robotyczna może zwiększyć wydajność w obchodzeniu się z organoidami.
Cel badania
- Opracowanie skalowalnej metody produkcji organoidów naczyniowych.
- Zwiększenie powtarzalności w badaniach nad organoidami.
- Ułatwienie późniejszych zastosowań w modelowaniu chorób.
Zastosowane metody
- Zastosowanie nowych inhibitorów ROCK w celu poprawy tworzenia organoidów.
- Ograniczenie w mikrootworach w celu zwiększenia jednorodności rozmiaru organoidów.
- Technologie sekwencjonowania pojedynczych komórek do analizy heterogeniczności komórkowej.
- Techniki obrazowania 3D do wysokorozdzielczej analizy morfologicznej.
Główne wyniki
- Zmodyfikowana metoda pozwala na otrzymanie jednorodnych organoidów naczyniowych.
- Powtarzalność wyników między partiami została znacząco poprawiona.
- Umożliwia szczegółową analizę morfologiczną organoidów.
- Wspiera zastosowania w badaniach i modelowaniu chorób.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę generowania organoidów naczyniowych.
- Osiągnięto poprawę powtarzalności oraz skalowalności procesu.
- Podejście to rokuje zastosowania w przyszłych badaniach nad organoidami.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Skalowalna generacja homogenicznych organoidów naczyniowych z hiPSC rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w przedklinicznym modelowaniu chorób naczyniowych i przesiewaniu leków. Zwiększona powtarzalność i standaryzacja umożliwiają niezawodne analizy pochodne, zwiększając pewność predykcyjną w ocenie terapeutycznej na wczesnym etapie. Zdolność ta wzmacnia ciągłość translacyjną oraz proces podejmowania decyzji w ramach portfela programów ukierunkowanych na naczynia krwionośne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wspiera badanie biologii naczyń krwionośnych i mechanizmów chorobowych w kontrolowanym ludzkim systemie 3D.
- Umożliwia funkcjonalną walidację celów naczyniowych poprzez powtarzalne fenotypy organoidów.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie złożonych architektur naczyniowych in vitro.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, skalowalne platformy organoidowe do ilościowego przesiewania leków.
- Poprawia powtarzalność i porównywalność testów pomiędzy partiami oraz liniami komórkowymi.
- Umożliwia wysokotreściowe odczyty morfologiczne i molekularne w celu oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele naczyniowe in vitro do biologii człowieka w kontekście konkretnych schorzeń na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez minimalizację zmienności między partiami.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzeń na późnych etapach badań dzięki ulepszowanemu modelowaniu predykcyjnemu reakcji naczyniowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, zapewniając powtarzalną i skalowalną platformę do badań nad biologią naczyniową oraz przesiewu leków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w kontekście naczyń krwionośnych człowieka.
- Przesiewanie: Dostarcza organoidów gotowych do analiz, charakteryzujących się spójną morfologią i ekspresją markerów.
- Analityka: Wspiera obrazowanie ilościowe oraz sekwencjonowanie jednokomórkowe w celu uzyskania wiarygodnych wyników danych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z modelami przedklinicznymi o zwiększonej wierności biologicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany schemat postępowania, który można dostosować do różnych programów badań naczyniowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność produkcji organoidów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywny kapitałowo rozwój portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów celowanych w układ naczyniowy z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli, różnicowania hiPSC oraz pracy z trójwymiarowymi organoidami.
- Niezbędny jest dostęp do platform mikropoziomowych, systemów obrazowania oraz narzędzi do analizy molekularnej.
- Wymagana jest rygorystyczna kontrola jakości i standaryzacja protokołu pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych linii hiPSC lub modeli chorobowych.
- Przepustowość może być ograniczona przez manualne operacje, chyba że zostanie wdrożona automatyzacja.
