Name: Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania tlenu in vivo w 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego do oceny niedotlenienia guza. Technika ta umożliwia nieinwazyjne monitorowanie poziomów tlenu w tkankach nowotworowych myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy O2M Technology za łaskawe wsparcie techniczne. Uznaje się granty Narodowego Centrum Nauki nr 2020/37/B/NZ4/01313 (obrazownik Jiva-25) oraz NCBiR: ENM3/IV/18/RXnanoBRAIN/2022 (koszty zwierząt). Zakup ultrasonografu VevoF2 został wsparty przez Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii w ramach Programu Strategicznego Inicjatywa Doskonałości Uniwersytetu Jagiellońskiego.

Myszy zostały pozyskane z zatwierdzonego ośrodka hodowli zwierząt, a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi (w naszym przypadku - Zezwolenie nr 165/2023, Pierwsza Lokalna Komisja Etyczna, Kraków, Polska).
1. Zwierzęta i linia nowotworowa
UWAGA: Myszy były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych: Jasne/ciemne: 12 h/12 h, wilgotność: 60%, temperatura: 23 °C. Zapewniono im standardową dietę żywieniową z bezpłatnym dostępem do wody pitnej w klatkach społecznych.
<ol>
	<li>Hodowla linii komórkowej glejaka mysiego wielopostaciowego LN229
	<ol>
		<li>Hodowla komórek LN229 w kolbach do hodowli tkankowych o długości 25cm2 w pożywce DMEM uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną w stężeniach odpowiednio 10 U/ml i 0,1 mg/ml.</li>
		<li>Utrzymuj komórki w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C, pasując co 48 godzin przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i PBS bez jonów magnezu i wapnia (pH 7,4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja guza
	<ol>
		<li>Na tydzień przed inokulacją należy codziennie obchodzić się z myszami, aby zapoznać je z badaczem.</li>
		<li>W dniu zaszczepienia zważyć myszy.</li>
		<li>Zawieś 200 000 komórek LN229 w 50 μl macierzy zewnątrzkomórkowej bez czynników wzrostu. Za pomocą igły 29 G zaszczepić mieszankę komórek podskórnie w śródłopatkowej poduszce tłuszczowej 16-tygodniowych nagich myszy BALB/c (N = 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie dopplerowskie USG
Ogólny harmonogram obrazowania nowotworów jest pokazany w Rysunek 1. Obrazowanie ultrasonograficzne jest używane zarówno do obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą Doppler US, jak i Anatomy US jako odniesienie tuż przed EPROI (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). Obrazowanie anatomiczne w trybie B jest niezbędne do analizy utlenowania guza za pomocą EPR i jest opisane w sekcji 3. Chociaż obrazowanie ultrasonograficzne Doppler (sekcja 2) nie jest obowiązkowe dla pomyślnego przeprowadzenia rejestracji, to jednak dostarcza cennych informacji na temat optymalnego okna czasowego dla badania EPR i pozwala na określenie aktywnego unaczynienia w obszarze guza.
<ol>
	<li>Przygotowanie myszy
	<ol>
		<li>Poczekaj, aż guzy osiągną około 30 mm3. W razie potrzeby należy ogolić myszy ręcznie wokół miejsca guza.</li>
		<li>Wywołaj znieczulenie za pomocą 2% izofrubanu i utrzymuj je za pomocą 1-1,5% izofluranu.</li>
		<li>Przenieść zwierzę z komory anestezjologicznej do poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C podczas przygotowania (w oparciu o sondę temperatury doodbytniczą). Ustabilizuj temperaturę zwierzęcia, aby uzyskać odpowiednią informację zwrotną o parametrach fizjologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usg
	<ol>
		<li>Użyj systemu ultrasonograficznego z głowicą 57-25 MHz do obrazowania przedklinicznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, krok 1).</li>
		<li>Pobieraj pomiary 3D w trybie B do wizualizacji morfologii guza w kierunku strzałkowym. Użyj kroku co 0,1 mm. 
		UWAGA: Nie przesuwaj zwierzęcia ani przetwornika, aby zachować dokładnie te same ustawienia.</li>
		<li>Zastosuj tryb Power Doppler do wizualizacji funkcjonalnego unaczynienia guza o następujących parametrach: Prędkość: 1,5 kHz, Filtr ścienny: niski, Priorytet: 75%, Trwałość: średnia, Rozmiar kroku 0,10 mm.</li>
		<li>Obrócić przetwornik, aby powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3 w kierunku osiowym.</li>
		<li>Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta ultrasonografów. Zaznacz granicę guza, prześlij ją na obraz 3D i oblicz objętość guza oraz procent unaczynienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. EPROI
<ol>
	<li>Przygotowanie sondy
	<ol>
		<li>Rozpuścić proszek OX071 przechowywany w temperaturze -80 °C w wstrzykiwanymH2Odo końcowego stężenia 1 g/10 ml (~70 mM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie myszy
	<ol>
		<li>Znieczulij myszy 1%-3% izofluranem zmieszanym z powietrzem w pomieszczeniu i umieść je na uchwycie na zwierzęta. </li>
		<li>Podawać podskórnie 1 ml soli fizjologicznej w celu utrzymania prawidłowego poziomu nawodnienia.</li>
		<li>Monitoruj częstość oddechów zwierzęcia (80 ± 20 uderzeń na minutę) i temperaturę (37 ± 1 °C) za pomocą czujnika poduszki oddechowej i termometru powierzchniowego przymocowanego do skóry myszy. Monitorować temperaturę w odbycie jako punkt odniesienia (37 °C ± 1 °C).</li>
		<li>Wprowadzić rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica zewnętrzna 0,7 mm) dootrzewnowo w celu podania sondy spinowej. Zabezpiecz kaniulę za pomocą polisiloksanu winylowego (VPS), aby zapobiec jej wypadnięciu z jamy brzusznej.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik moczowy (24 G) w celu zebrania wydalanej sondy wirowej.</li>
		<li>Zabezpiecz mysz w łóżku dla zwierząt za pomocą glinki dentystycznej VPS do unieruchomienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anatomiczne obrazowanie USG do rejestracji
	<ol>
		<li>Włącz stół sterowany w 3D i wypoziomuj łóżko. Ustaw temperaturę platformy na 60 °C, tak aby temperatura zwierzęcia odizolowanego przez plastikowy uchwyt na łóżko była utrzymywana na poziomie 37 °C.</li>
		<li>Umieść legowisko dla zwierząt z unieruchomionym zwierzęciem w uchwycie na łóżko i przenieś je na stół kontrolowany przez 3D w celu obrazowania anatomicznego przed pomiarem EPR (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Upewnij się, że zwierzę jest zabezpieczone w uchwycie łóżka i nie dotyka platformy grzewczej.</li>
		<li>Ustal pozycję uchwytu łóżka w trzech wymiarach, aby zapobiec obracaniu, szczególnie obrotowi XZ (płaszczyzny strzałkowej), co ma kluczowe znaczenie dla dokładnej rejestracji.</li>
		<li>Umieść znacznik pozycji (drut wędkarski na taśmie o średnicy 0,35 mm) na uchwycie łóżka, oznaczając początek rezonatora.</li>
		<li>Obrazowanie w trybie B należy przeprowadzić ręcznie z krokiem 1 mm zarówno w kierunku osiowym, jak i strzałkowym w kierunku osi Y.</li>
		<li>Zobrazuj strukturę guza za pomocą następujących parametrów zależnych od określonej częstotliwości przetwornika; dla przetwornika 18 MHz, głębokość 20 mm, zakres dynamiki 84 dB, moc 8 dB, wzmocnienie 80%; dla przetwornika 40 MHz, głębokość 20 mm, zakres dynamiki 32 dB, wzmocnienie 100%; dla przetwornika 57 MHz, głębokość 13 mm, wzmocnienie 6 dB, moc 100%. Dostosuj ustawienie ostrości przetwornika do konkretnej lokalizacji guza.</li>
		<li>Pod koniec obrazowania anatomicznego zetrzyj nadmiar żelu z myszy i wyjmij unieruchomioną mysz w łóżku dla zwierząt z uchwytu łóżka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie tlenowe EPR
	<ol>
		<li>Wykorzystaj kamerę tlenową do impulsowego EPR, działającą na częstotliwościach radiowych w zakresie od 685 MHz do 735 MHz. Do konfiguracji użyj cewek offsetowych do obrazowania 3D i analizy czasów relaksacji. Użyj rezonatora poziomego o wymiarach 32 mm x 35 m.</li>
		<li>Unieruchomioną mysz w łóżku dla zwierząt należy niezwłocznie przenieść do aparatu do obrazowania EPR po anatomicznym badaniu ultrasonograficznym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Ostrożnie utrzymuj pozycję łóżka zwierzęcia, aby zminimalizować obroty w rezonatorze, podobnie jak w procedurze opisanej w sekcji 3.3.</li>
		<li>Podłącz ponownie sondę temperatury, aby zapewnić ciągłe monitorowanie i utrzymanie temperatury zwierzęcia, korelując ją z temperaturą wewnątrz rezonatora.</li>
		<li>W oprogramowaniu spektrometru EPR wykonaj strojenie rezonatora za pomocą pokrętła strojenia, aby wyśrodkować częstotliwość około 725 MHz (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
		UWAGA: Dobrze dopasowany rezonator powinien mieć spadek 25 dB lub lepszy.</li>
		<li>Zoptymalizuj moc mikrofal, aby uzyskać szczyt przy 60 ns (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B), dostosowując wartość tłumienia od 20 dB do 3 dB.</li>
		<li>Nastroić instrument tak, aby zanik swobodnej indukcji (FID) powierników umieszczonych w łóżku zwierzęcia był wyśrodkowany w polu magnetycznym i fazowany (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
		<li>Podać 100 μl OXO71 dootrzewnowo przez wcześniej wprowadzoną kaniulę, a następnie przepłukać 50-100 μl roztworu soli fizjologicznej.</li>
		<li>Korzystając z zaprogramowanej sekwencji kolejki, uzyskaj pomiary z ustawionymi parametrami; typowa sekwencja zawiera T1, czasy relaksacji T2, echo spinowe elektronów 3D (ESE) dla obrazów odniesienia i echo spinowe elektronów z odzysku inwersji 4D (IRESE) dla obrazu zwierzęcego. Zbierz obrazowanie IRESE z gradientem 1,5 G/cm, czasem powtarzania 55 μs, wyzwalaniem wstępnym -250 ns, t90 wynosi 60 ns, a tau 400 ns; Całkowity czas akwizycji ~12 min. Powtórz obrazowanie IRESE co najmniej przez 30-40 minut (3-4 razy) po wstrzyknięciu sondy.</li>
		<li>Po wykonaniu obrazowania przenieś mysz z legowiska dla zwierząt na poduszkę grzewczą. Podawać podskórnie 1 ml soli fizjologicznej w celu utrzymania prawidłowego poziomu nawodnienia. Monitoruj, aż mysz odzyska pionową lokomocję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Analiza rekonstrukcji 4D w "ProcessGUI"
	<ol>
		<li>Przed rekonstrukcją należy zastosować korektę linii bazowej do projekcji, wybierając scenariusz "PulseRecon.scn" i ładując plik parametrów "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par" w celu analizy surowych danych IRESE.</li>
		<li>Przefiltruj każdą projekcję za pomocą filtra Gaussa o szerokości 4 punktów, co jest ustawieniem domyślnym dla wybranego scenariusza.</li>
		<li>Wykonaj podpróbkowanie przefiltrowanych projekcji do 64 punktów (rozmiar matrycy), co jest ustawieniem domyślnym dla wybranego scenariusza.</li>
		<li>Następnie przefiltruj projekcje za pomocą filtra Ram-Lak z apodyzacją na częstotliwości 0,6 razy większej od częstotliwości Nyquista (kliknij parametr Rekonstrukcja | FiltrOdcięcie).</li>
		<li>Rzutuj wstecz przefiltrowane projekcje, aby uzyskać obraz spektralno-przestrzenny 4D.</li>
		<li>Wykorzystaj algorytm dopasowywania, aby wyodrębnić szerokość linii pakietu spinowego z widma w każdym wokselu. Sekcja Ustawienia parametrów dopasowania: Przedłużacz ostatniego punktu - 3, metoda dopasowania - domyślnie.</li>
		<li>Użyj domyślnych ustawień parametrów w procedurze dopasowania, w tym amplitudy widma, fazy, środka widma i szerokości linii pakietu spinu widmowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracja między anatomicznym US a EPROI w "ArbuzGUI" (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) 
	UWAGA: Do przeprowadzenia rejestracji wykorzystano procedurę MATLAB "ArbuzGUI" opracowaną przez Borisa Epela z University of Chicago. Oprogramowanie jest dostępne na stronie EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit. Przybornik rejestracji został wyjaśniony wcześniej w innym miejscu27. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać szczegółowe instrukcje krok po kroku28.
	<ol>
		<li>Wczytuj amerykańskie obrazy 2D jako stos z krokiem 1 mm (krok jest ściśle związany z akwizycją klatek w obrazowaniu w trybie B, punkt 3.3.7), aby utworzyć obrazy 3D US.</li>
		<li>Dodaj zebrane obrazy pO2 (zrekonstruowane w kroku 4.1) jako typ obrazu 3D ustawiony jako dane "PO2_pEPRI". Przechowywanie danych w projekcie.</li>
		<li>Utwórz sekwencję rejestracji i transformację, wybierając pozycję Specjalne | Rejestracja MRI-EPRI.</li>
		<li>Wybierz obraz, który ma zostać dostosowany do danych EPRI (np. US axial 3D), wybierając opcję Sekwencja | dodaj akcję. Użyj etapu 5:T2, aby uzyskać najlepszą wydajność. W rezultacie przed nazwą wybranego obrazu pojawi się symbol plusa.</li>
		<li>Otwórz obraz US w SliceMaskEditPLG. Dostosuj skalę obrazu US na podstawie linijki przedstawionej na obrazach. Zaznacz znacznik pozycji w USA, kontur zwierzęcia i pozycję guza na podstawie wybranych klatek.</li>
		<li>W SliceMaskEditPLG zaznacz kontur mapy pO2 i punkt odniesienia na zrekonstruowanych obrazach 4D pO2.</li>
		<li>Korzystając z przeglądarki figur i przybornika RotateImagePLG, obróć obraz USA zgodnie ze znacznikiem pozycji USA w stosunku do pozycji odniesienia, aby zarejestrować mapę pO2 z konturem USA.</li>
		<li>Przekształć maskę guza z obrazu USA na mapę pO2.</li>
		<li>Wizualizuj maskę guza na mapie pO2 myszy i eksportuj wartości pO2 dla każdego woksela.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Preclinical Imaging of Tumor Oxygen Levels Using EPRI and Ultrasound

Prof. H. Halpern i B. Epel są współzałożycielami O2M Technologies. Pozostali autorzy: G. Dziurman, A. Bienia, A. Murzyn, B. Płóciennik, J. Kozik, G. Szewczyk, M. Szczygieł, M. Krzykawska-Serda i M. Elas nie mają do stwierdzenia konfliktu interesów.

W opisanym protokole obrazowania znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, aby zarejestrować obrazy anatomiczne z mapami tlenu, rezonans magnetyczny może być lepszym wyborem niż ultradźwięki ze względu na lepszą rozdzielczość i możliwość dostarczania szczegółowych danych 3D19. Ultrasonografia z przetwornikiem wysokiej częstotliwości zapewnia doskonałą rozdzielczość i wystarczającą głębokość obrazowania do badań przedklinicznych. Jednak zarówno rezonans magnetyczny, jak i USG wymagają uży...

Zrozumienie mikrośrodowiska guza (TME), z jego złożonymi przestrzennymi i dynamicznymi interakcjami, przynosi pełniejsze zrozumienie biologii nowotworu. Niedotlenienie, czyli niski poziom tlenu, jest kluczowym składnikiem TME i odgrywa kluczową rolę w rozwoju innych stanów zagrażających życiu, w tym chorób układu krążenia, zaburzeń metabolicznych, takich jak cukrzyca i przewlekła choroba nerek1,2,3. Dotlenienie tkanek jest podstawowym czynnikiem, szczególnie w kontekście nowotworów, gdzie częściowe ciśnienie tlenu w tkankach (pO2) jest skorelowane z opornością na terapię. Poziom pO2 przekraczający 10 mm Hg wiąże się ze wzrostem skuteczności radioterapii o niskim liniowym transferze energii (LET) (efekt wzmocnienia tlenu).
Ostatnie badania z wykorzystaniem obrazowania elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPRI) wykazały, że radioterapia sterowana tlenem może spowodować dwukrotną poprawę wskaźników przeżycia w różnych nowotworach w modelach mysich4,5. Jest to podobne do ludzi, u których pO2 guza mierzono za pomocą wielu pomiarów elektrody Eppendorfa i stwierdzono, że mediana lub średnie wartości pO2 są poniżej 10 torr6. Oprócz radioterapii, niedotlenienie guza jest bezpośrednio skorelowane z agresywnością guza i wynikami innych terapii, takich jak terapia immunologiczna7,8. Związek ten podkreśla znaczenie precyzyjnych pomiarów tlenu w poprawie wyników terapeutycznych i zrozumieniu patofizjologii chorób.
Optymalna pulsoksymetria in vivo wymaga bezpośredniego pomiaru częściowego ciśnienia tlenu w tkankach, niezależnego od takich czynników jak perfuzja tkanek i nasycenie hemoglobiny. Zabieg powinien być nieinwazyjny, z krótkim i precyzyjnym czasem obrazowania, aby uniknąć potencjalnego wpływu na organizm, takiego jak przedłużone znieczulenie, zmiany temperatury tkanek lub znaczące zmiany ciśnienia w tkankach i pH. Oksymetria tkankowa powinna wykazywać się wysoką dokładnością i wiarygodnością, zapewniając spójne pomiary niezależnie od zmian w mikrośrodowisku tkankowym, w tym różnic w pH i stanie redoks. Dla skutecznego planowania terapii kluczowa jest rekonstrukcja danych obrazowych w czasie rzeczywistym i prosta interpretacja. Wiąże się to nie tylko z osiągnięciem rozdzielczości przestrzennej najlepiej mniejszej niż 1 mm, ale także z umożliwieniem szybkiego gromadzenia danych w celu monitorowania dynamicznych zmian stanu tlenu w tkankach, takich jak cykliczne niedotlenienie.
W tym kontekście, opracowano różne techniki pomiaru tlenu cząsteczkowego lub oceny niedotlenienia, z których każda ma unikalne zastosowanie i zalety. Elektroda platynowa, uważana za "złoty standard" w oksymetrii tkanek komórkowych i żywych zwierząt, zapewnia spójne pomiary dzięki precyzyjnemu wprowadzaniu do tkanek. Inne podejścia, takie jak metody optyczne wykorzystujące sondy fluorescencyjne, fotoakustyka, monitorowanie skutków hipoksji poprzez ekspresję genów lub białek lub testy komet, są łatwe w użyciu, ale są pośrednie lub ograniczone przez ścieżkę optyczną w tkankach. Obiecującymi alternatywami do oceny niedotlenienia i/lub natlenienia wydają się być obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)-OE-MRI10 -- lub MOBILE11, pozytonowa tomografia emisyjna (PET) z różnymi sondami wrażliwymi na niedotlenienie12, lub elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR).
EPR ma długą historię w dziedzinie biomedycyny. Samo zjawisko zostało po raz pierwszy opisane w 1944 roku i zostało szeroko przyjęte jako narzędzie do analizy struktur chemicznych, a ostatnio do systemów biologicznych i materiałów z niesparowanymi elektronami13. Spektroskopia EPR została wykorzystana do badania dynamiki i struktury układów biologicznych, takich jak fotosynteza, metaloproteiny, enzymy rodnikowe i błony fosfolipidowe14,15,16. Spektroskopia i tomografia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) stały się kluczowymi nieinwazyjnymi metodami badania natlenienia guza i mikrośrodowiska z rozdzielczością przestrzenną ~1 mm, rozdzielczością czasową 1-10 min i rozdzielczością pO2 1-3 torr5,17,18.
Metody EPR fali ciągłej (CW) są nadal szeroko stosowane w większości zastosowań ze względu na prostotę rejestracji i interpretacji widm. Interakcje tlen-spin sondy działają poprzez ocenę zmian w intensywności sygnału EPR lub kształcie linii, dostarczając wglądu w poziom tlenu w próbce. CW EPR ma zauważalną przewagę pod względem czułości na szerszy zakres pO2 w porównaniu z metodami impulsowymi. Stosując różne sekwencje impulsów, można uzyskać informacje takie jak czasy relaksacji spinu i spinu elektronu, czasy relaksacji spinu i sieci spinowej oraz interakcje z sąsiednimi spinami18,19. Techniki impulsowego EPR, takie jak odzyskiwanie inwersji z odczytem echa spinowego elektronów (IRESE), mierzą szybkość relaksacji sieci spinowej, unikając artefaktu z relaksacji spowodowanej relaksacją sondy spinowej przy niskich stężeniach tlenu19,20. EPR może być stosowany do monitorowania zmian stężenia tlenu z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną; jednak w oksymetrii przy wysokich stężeniach tlenu impulsowy EPR napotyka ograniczenia ze względu na krótkie czasy relaksacji namagnesowania poprzecznego mierzone za pomocą elektronowego echa spinowego (ESE). Ostatecznie CW i impulsowy EPR są komplementarne, a wiarygodne zrozumienie systemu wirowania wymaga zastosowania obu metod.
Techniki pulsoksymetrii EPR opierają się na liniowej zależności między poziomami tlenu a siecią spinową, jak również na szybkościach relaksacji spin-spin w roztworze. Wszystkie sondy pulsoksymetryczne są często podzielone na dwa typy: sondy wirowe rozpuszczalne i cząstek stałych. Wybór właściwej sondy spinowej zależy od konfiguracji eksperymentalnej i potrzebnych informacji21,22,23. Rozpuszczalne sondy spinowe, takie jak nitroksydy lub pochodne trytylu24,25, takie jak OX063 i jego deuterowana forma OX071, rozmieszczone w tkance, dostarczają informacji z całej objętości. Alternatywnie, do pomiarów jednopunktowych oraz do długotrwałych i powtarzających się ocen tlenu, można użyć sond półprzewodnikowych, takich jak LiPc, LiBuO lub pochodne węgla (patrz Tabela 1)22,23,26.
Ultrasonografia Obrazowanie w trybie B jest szeroko stosowane w klinice do obrazowania tkanek miękkich. Rozdzielczość zależy od zastosowanej częstotliwości przetwornika, a w przypadku badań przedklinicznych 18 MHz i więcej zapewnia wystarczającą rozdzielczość w płaszczyźnie i głębi obrazu. Dodatkowym atutem ultrasonografii jest możliwość uzyskania funkcjonalnych obrazów naczyń krwionośnych w trybie Power Doppler. W tym miejscu przedstawiamy obrazowanie tlenem metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPROI) jako metodę generowania 3D map tlenowych nowotworów u żywych myszy. Odpowiednia ultrasonografia umożliwia niezbędne odniesienie anatomiczne do zdefiniowania guza w EPROI. Dla każdego zwierzęcia możliwe są wielokrotne sesje obrazowania. Ostatnim krokiem jest analiza, w tym rekonstrukcja obrazu i rejestracja między modalnościami w celu uzyskania histogramu pO2 z objętości guza.

<table><tbody><tr><td>aqua pro injectione</td><td>Polpharma</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1280610-ArbuzGUI&nbsp;</td><td>O2M Technologies</td> <td>–</td> <td>dostępne w repozytorium github</td></tr><tr><td>fosforan disodowy</td><td>POCH S.A.</td><td></td><td></td>799280115-Dulbecco</tr><tr><td>&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - high glucose</td><td>Merck Life Science</td><td>D5648</td><td>4500 mg/L glukozy i L-glutaminy</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>10500064-drut</td></tr> <tr><td>wędkarski</td><td>Good Fish</td><td>A-55A-035</td><td>US znacznik pozycji - 0,35 mm</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu</td></tr><tr><td>ibGUI</td><td>O2M</td> <td>Technologies-dostępne</td> <td>w repozytorium github</td></tr><tr><td>injectio natrii chlorati isotonica</td><td>Polpharma</td><td>Użyto wielu elementów</td><td>9 mg/ml</td></tr><tr><td>igieł insulinowych 29 G&nbsp;</td><td>Użyto wielu elementów</td> <td>Becton, Dickinson and Company</td> <td>-</td></tr> <tr><td>Jiva 25</td><td>O2M Technologies</td> <td>-</td> <td>EPROI</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td> <td>-</td> <td>wersja R2021b</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Merck Life Science</td><td>P4333</td><td>z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny/ml</td></tr><tr><td>chlorku potasu</td><td>POCH S.A.</td><td></td><td></td></tr> 739740114-diwodorofosforan <tr><td>potasu</td><td>POCH S.A.</td><td></td><td></td>742020112-ProcessGUI</tr> <tr><td></td><td>O2M Technologies</td> <td>-</td> <td>dostępne w repozytorium github</td></tr><tr><td>Rurki PTFE&nbsp;</td><td>Cole Palmer Instrument Co</td><td>06412-11-chlorek</td><td></td></tr> <tr><td>sodu</td><td>POCH S.A.</td><td></td><td></td></tr> 794121116-SpecMan4EPR <tr><td></td><td>FEMI Instruments-wersja</td><td></td> <td>3.4 CS 64bit</td></tr><tr><td>Surflash I.V. Cewnik</td><td>Terumo</td><td>SR*FF2419</td><td>rozmiar: 24G x &frac34; "</td></tr><tr><td>taśma</td><td>3M&nbsp;</td><td>użyto wielu elementów</td><td>mikroporowych</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25200072-Ultrasonografia</td><td>Telemed-Anatomical</td><td></td> <td>US</td></tr><tr><td></td><td>żel KONIX</td><td>NUG-0019-Vetflurane</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Virbac</td><td>137317</td><td>1000 mg/g</td></tr><tr><td>Vevo F2</td><td>FujiFilms, Visual Sonics-B-mode</td><td></td> <td>i glina</td></tr><tr><td>dentystyczna Doppler winylowo-polisiloksan&nbsp;</td><td>Użyto wielu elementów</td> <td>3M ESPE</td><td>:</td></tr></tbody></table>

ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3d za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Tumor Hypoxia Assessment: In Vivo 3D Oxygen Imaging Through Electron Paramagnetic Resonance

Precyzyjny pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w czasie rzeczywistym dostarcza cennych informacji w wielu chorobach, w tym w raku. Niskie pO2 guza (tj. niedotlenienie) jest związane z agresywnością guza i słabą odpowiedzią na terapię. Kwantyfikacja pO2 guza pozwala na ocenę skuteczności leczenia. Obrazowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPRI), w szczególności impulsowe EPRI, stało się zaawansowaną trójwymiarową (3D) metodą oceny natlenienia tkanek in vivo. Ta innowacja była możliwa dzięki postępowi technologicznemu w zakresie EPR (elektronowego rezonansu paramagnetycznego) oraz zastosowaniu rozpuszczalnych w wodzie oksymetrycznych sond spinowych z rodziny triarylowych, oferujących szybkie i czułe dane dotyczące natleniania. Czas relaksacji sondy spinowej (T1 i/lub T2) dostarcza dokładnych informacji o pO2 w wybranych wokselach.
Ludzkie guzy glejaka LN229 wyrosły w międzyłopatkowym poduszce nagich myszy BALB/c. Obrazowanie ultrasonograficzne (USG) wykorzystano jako odniesienie do informacji anatomicznych guza. Aby zobrazować tkankę pO2, zwierzęta umieszczono w ustalonej pozycji w łóżku dla zwierząt z odniesieniami, umożliwiającymi rejestrację między metodami obrazowania. Po podaniu środka kontrastowego OX071 wykonano EPRI, a następnie tryb US B. Ze względu na niską toksyczność sondy spinowej, procedurę można powtórzyć podczas wzrostu guza lub leczenia. Po obrazowaniu proces rejestracji został przeprowadzony za pomocą oprogramowania napisanego w MATLAB. Ostatecznie frakcję niedotlenioną można obliczyć dla konkretnego guza, a histogram rozmieszczenia pO2 w tkance można porównać w czasie. EPRI w połączeniu z ultradźwiękami jest doskonałym narzędziem do tlenowego mapowania nowotworów w warunkach przedklinicznych.

Reprezentatywny przekrój poprzeczny z obrazu ultrasonograficznego guza LN229 rosnącego w podłopatkowej tkance tłuszczowej, wraz z układem naczyniowym, przedstawiono na Rysunku 5. Część naczyń krwionośnych widoczna jest poza granicami guza. Co nieoczekiwane, procentowa objętość unaczynienia guza nie uległa zmniejszeniu i pozostała stabilna wraz ze wzrostem nowotworu.
Zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2, krok 2 polega na unieruchomien...

Ilościowe mapy tlenowe 3D mysich guzów zostały zobrazowane nieinwazyjnie za pomocą pulsacyjnego rezonansu paramagnetycznego. Ultrasonografia B-mode i Power Doppler zostały wykorzystane do anatomii i struktury naczyniowej. Obrazy z obu modalności nałożono na siebie, umożliwiając wieloparametryczną analizę guza.

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 ...

Badamy mikrośrodowisko guza i rolę niedotlenienia w rozwoju guza w odpowiedzi na terapię. Niedotlenienie ma kluczowe znaczenie nie tylko w chorobach nowotworowych, ale także w wielu innych patologiach, takich jak zaburzenia serca czy neurologiczne. Naszym celem jest ilościowe określenie poziomu tlenu w tkankach żywych zwierząt w kontekście różnych terapii przeciwnowotworowych i kilku przedklinicznych modeli nowotworów.W pulsoksymetrii stosuje się kilka technik APR, w tym falę ciągłą, impuls lub szybkie skanowanie. Jednak przedkliniczne obrazowanie impulsów, JIVA-25, umożliwia precyzyjne i wysokiej rozdzielczości przestrzennej i tlenowej mapowanie 3D tlenu w całym ciele. Obrazy są pozyskiwane w ciągu kilku minut i mogą być pozyskiwane przez kilka dni, co odpowiada fizjologicznym zmianom w tkance, PO2, a także umożliwia śledzenie zmian w czasie.Jednym z największych wyzwań obrazowania elektronowego rezonansu paramagnetycznego jest brak odniesienia anatomicznego. W wielu laboratoriach do uzyskania kluczowych cech anatomicznych stosuje się rezonans magnetyczny lub tomografię komputerową. Wadą jest jednak wysoki koszt i konieczność przemieszczenia zwierzęcia.Aby rozwiązać te problemy, proponujemy użycie ultradźwięków jako łatwych w użyciu, przenośnych i opłacalnych metod. Nasze wyniki wskazują na wykonalność fuzji obrazów ultrasonograficznych i EPR, co otwiera możliwość porównywania obrazów funkcjonalnych i atomowych w różnych punktach czasowych. Na przykład mapy tlenu EPR mogą być rejestrowane w anatomii tkanek USA, sieci naczyniowej lub perfuzji tkanek przy użyciu mikropęcherzyków jako środka kontrastowego.Technologia ta pomaga nam odkrywać obszary niedotlenienia w obrębie guzów i projektować malowanie dawek w radioterapii. Pozwala również na ocenę skuteczności zabiegów przeciwhipoksyjnych, takich jak mikropęcherzyki tlenu. Mapowanie tlenu może być również wykorzystywane jako marker skuteczności terapii na wczesnym etapie leczenia i odpowiedniej klasyfikacji pacjenta do leczenia.Na początek zabezpiecz znieczuloną mysz zaszczepioną guzem na łóżku dla zwierząt. Podawaj myszu jeden mililitr soli fizjologicznej podskórnie, aby utrzymać nawodnienie. Użyj czujnika poduszki oddechowej i termometru powierzchniowego z glinką dentystyczną z polisiloksanu winylu, aby monitorować tętno i temperaturę zwierzęcia.Wprowadzić rurkę z politetrafluoroetylenu dootrzewnowo w celu podania sondy spinowej i zabezpieczyć kaniulę za pomocą glinki dentystycznej z polisiloksanu winylu, aby zapobiec jej przemieszczaniu się z jamy brzusznej. Następnie należy wprowadzić cewnik moczowy, aby zebrać wydalaną sondę wirową. W celu anatomicznego obrazowania ultrasonograficznego obróć mysz wewnątrz legowiska dla zwierząt i zabezpiecz jej pozycję za pomocą winylowej glinki dentystycznej z polisiloksanu.Przenieś zwierzę na stół kontrolowany przez 3D przed pomiarem elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Upewnij się, że zwierzę jest zabezpieczone i nie ma kontaktu z platformą grzewczą. Ustal pozycję uchwytu łóżka w trzech wymiarach, aby zapobiec obracaniu się, szczególnie w płaszczyźnie XZ lub strzałkowej, co jest niezbędne do dokładnej rejestracji.Następnie, używając drutu wędkarskiego o średnicy 0,35 milimetra na taśmie, umieść znacznik pozycji na uchwycie łóżka, aby zaznaczyć początek rezonatora. Obrazowanie w trybie B należy przeprowadzić ręcznie z krokiem o jeden milimetr zarówno w kierunku osiowym, jak i strzałkowym w kierunku osi Y. Zobrazuj strukturę guza za pomocą parametrów specyficznych dla częstotliwości przetwornika.Po anatomicznym obrazowaniu ultrasonograficznym należy niezwłocznie przenieść unieruchomioną mysz w łóżku zwierzęcia do obrazowania elektronowego rezonansu paramagnetycznego lub EPR. Ostrożnie utrzymuj pozycję łóżka zwierzęcia, aby zminimalizować obroty w rezonatorze. Podłącz ponownie sondę temperatury, aby zapewnić ciągłe monitorowanie temperatury zwierzęcia, dostosowując ją do wewnętrznej temperatury rezonatora.W oprogramowaniu spektrometru EPR wyreguluj rezonator za pomocą pokrętła strojenia, aby wyśrodkować częstotliwość wokół 725 megaherców. Aby zoptymalizować moc mikrofal, dostosuj tłumienie od 20 do trzech decybeli, aż do osiągnięcia szczytu po 60 nanosekundach. Dostrój instrument tak, aby wyśrodkował swobodny zanik indukcji powierników umieszczonych w łóżku zwierzęcia w polu magnetycznym i odpowiednio go fazuj.Następnie podać dootrzewnowo 100 mikrolitrów OXO 71 przez wcześniej wprowadzoną kaniulę, a następnie przepłukać 50 do 100 mikrolitrami roztworu soli fizjologicznej. Użyj zaprogramowanej sekwencji Q, aby uzyskać pomiary o określonych parametrach, w tym czasach relaksacji T1 i T2, echa spinowym elektronów 3D do obrazowania referencyjnego oraz echa spinowego elektronów z odzysku inwersji 4D do obrazowania zwierzęcia. Po zobrazowaniu przeprowadź analizę danych i zwizualizuj maskę guza na mapie ciśnienia parcjalnego tlenu myszy i wyeksportuj wartości dla każdego woksela.Przekrój ultrasonograficzny wykazał wzrost guza LN 229 w poduszce tłuszczowej wewnątrz łopatki z unaczynieniem zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz granicy guza. Obrazy ultrasonograficzne guza w trybie B dostarczyły anatomicznego odniesienia, pokazując powierzchnię guza i markery do wyrównania z EPR-OI. Obrazy przekrojowe 3D mapy ciśnienia parcjalnego tlenu wykazały zauważalną niejednorodność poziomu tlenu, z większą liczbą niedotlenionych obszarów w guzie i wysoce niedotlenionym markerem odniesienia na dole obrazu.Obrazy guzów o różnych rozmiarach wykazały, że większe guzy zawierały więcej wokseli, podczas gdy najmniejszy guz wykazywał nieoptymalną mapę ciśnienia parcjalnego tlenu z powodu niewystarczającego stężenia sondy spinowej.

tumor-hypoxia-assessment-vivo-3d-oxygen-imaging-through-electron

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

W niniejszej pracy opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy in vivo. Metoda ta opiera się na jednoczesnym obrazowaniu dwufotonowym nikotynamidowo-adeniny-dinukleotydu (NADH) oraz mikrokrążenia korowego. Metoda ta jest przydatna do wysokorozdzielczej analizy zaopatrzenia tkanki w tlen.

Wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji NADH

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Rezonans paramagnetyczny elektronów o niskim polu (pasmo L, 1,2 GHz) przy użyciu rozpuszczalnych sond nitroksylowych i trytylowych jest demonstrowany do oceny fizjologicznie ważnych parametrów w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi.

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia ortotopowych ksenoprzeszczepów raka wątrobowokomórkowego z podwiązaniem tętnicy wątrobowej i bez niej oraz wykonywania nieinwazyjnego obrazowania hipoksji guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu [18F]Fluoromisonidazolu ([18F]FMISO) i [18F]Fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG).

Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego

Przedstawiamy tutaj protokół do wykonywania Oxygen Sensitive – Dynamic Contrast Enhanced Optoacoustic Imaging (OS-DCE OAI) w celu oceny przedklinicznych modeli raka i gojenia się ran. OS OAI może obrazować oksysyhemoglobinę i oksyhemoglobinę, mapując natlenowanie tkanek. DCE-OAI może obrazować farmakokinetykę egzogenicznego środka kontrastowego, mapując tym samym perfuzję naczyniową.

Oceny tlenowania i perfuzji naczyniowej w przedklinicznych modelach nowotworów i gojenia ran z wykorzystaniem OS-DCE OAI

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Poznaj metodę obrazowania tlenu in vivo w 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego do oceny niedotlenienia guza. Technika ta umożliwia nieinwazyjne monitorowanie poziomów tlenu w tkankach nowotworowych myszy.

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Przeglądaj więcej filmów