Name: Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj oczyszczanie ludzkiej miozyny-7a w systemie MultiBac i jej biofizyczną charakterystykę. Ta metoda pozwala badać mechanizmy słuchu oraz molekularne podstawy głuchoty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Mikroskopowego oraz Ośrodkowi Funkcji Wizualnych i Morfologii Uniwersytetu Zachodniej Wirginii za dyskusję i pomoc w analizie obrazu. Praca ta jest wspierana przez fundusze startowe z West Virginia University School of Medicine do R.L. Prace te są również wspierane przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence (Vs-CoBRE) (P20GM144230) oraz NIGMS West Virginia Network of Biomedical Research Excellence (WV-INBRE) (P20GM103434).

Recombinant Human Myosin-7a Production and Functional Characterization Protocol

<ol><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+superfamily+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The myosin superfamily at a glance.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li>
<li>Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosins%3A+a+diverse+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Myosins: a diverse superfamily.</a> Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).</li>
<li>Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-driven+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin-driven intracellular transport.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972(2018).</li>
<li>Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-muscle+myosin+2+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-muscle myosin 2 at a glance.</a> J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).</li>
<li>Peckham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled+coils+and+SAH+domains+in+cytoskeletal+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors.</a> Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).</li>
<li>Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+understand+muscle+you+must+take+it+apart%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">To understand muscle you must take it apart.</a> Front Physiol. 5, 90(2014).</li>
<li>Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+myosins+and+the+genetics+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Unconventional myosins and the genetics of hearing loss.</a> Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).</li>
<li>Geeves, M. A., Holmes, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of muscle contraction.</a> Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).</li>
<li>Batters, C., Veigel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+activation+of+unconventional+myosins%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Mechanics and activation of unconventional myosins.</a> Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).</li>
<li>Houdusse, A., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+myosin+generates+force+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How myosin generates force on actin filaments.</a> Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).</li>
<li>Odronitz, F., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+the+tree+of+eukaryotic+life+based+on+the+analysis+of+2%2C269+manually+annotated+myosins+from+328+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species.</a> Genome Biol. 8 (9), R196(2007).</li>
<li>Moreland, Z. G., Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+in+sensory+hair+bundle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin motors in sensory hair bundle assembly.</a> Curr Opin Cell Biol. 79, 102132(2022).</li>
<li>Williams, D. S., Lopes, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+different+cellular+functions+of+MYO7A+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">The many different cellular functions of MYO7A in the retina.</a> Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).</li>
<li>Hollo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulatory+mechanism+of+human+myosin-7a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a.</a> J Biol Chem. 299 (10), 105243(2023).</li>
<li>Choi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+EF-hand+protein+CALML4+functions+as+a+critical+myosin+light+chain+within+the+intermicrovillar+adhesion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex.</a> J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nat Commun. 7, 10833(2016).</li>
<li>Whatley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usher+syndrome%3A+Genetics+and+molecular+links+of+hearing+loss+and+directions+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy.</a> Front Genet. 11, 565216(2020).</li>
<li>Ahmed, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USH1H%2C+a+novel+locus+for+type+I+Usher+syndrome%2C+maps+to+chromosome+15q22-23%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23.</a> Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).</li>
<li>Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+myosin+VIIa+causes+defective+melanosome+distribution+in+the+RPE+of+shaker-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice.</a> Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).</li>
<li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa%2C+the+Usher+syndrome+1B+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).</li>
<li>Houdusse, A., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+myosins+in+filopodia%2C+microvilli+and+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia.</a> Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).</li>
<li>Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+series%3A+The+cell+biology+of+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Review series: The cell biology of hearing.</a> J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).</li>
<li>Fitzgerald, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li>
<li>Sari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MultiBac+baculovirus%2Finsect+cell+expression+vector+system+for+producing+complex+protein+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).</li>
<li>Courtney, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin-7+outperforms+synaptotagmin-1+to+promote+the+formation+of+large%2C+stable+fusion+pores+via+robust+membrane+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration.</a> Nat Commun. 14 (1), 7761(2023).</li>
<li>Courtney, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexin+C-terminal+amphipathic+helix+stabilizes+the+fusion+pore+open+state+by+sculpting+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).</li>
<li>Courtney, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+oligomerization+via+the+juxtamembrane+linker+regulates+spontaneous+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118(2021).</li>
<li>Yu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+7+and+its+adaptors+link+cadherins+to+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin.</a> Nat Commun. 8, 15864(2017).</li>
<li>Kron, S. J., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+actin+filaments+move+on+myosin+fixed+to+a+glass+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).</li>
<li>Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+motility+assay+to+study+translocation+of+actin+by+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2(2001).</li>
<li>Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-specific+adaptations+of+in+vitro+fluorescence+microscopy-based+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays.</a> J Vis Exp. (168), e62180(2021).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FERM+domain+autoregulates+Drosophila+myosin+7a+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).</li>
<li>Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+serum-free+and+purified+baculovirus+stocks+under+various+storage+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions.</a> Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+methods+in+cellular+and+molecular+biology%22">Basic methods in cellular and molecular biology</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+ubiquitin-related+modifier+%28SUMO%29-specific+proteases%3A+profiling+the+specificities+and+activities+of+human+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs.</a> J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).</li>
<li>Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensemble+force+changes+that+result+from+human+cardiac+myosin+mutations+and+a+small-molecule+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector.</a> Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).</li>
<li>Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Philament%3A+A+filament+tracking+program+to+quickly+and+accurately+analyze+in+vitro+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays.</a> Biophys Rep. 4 (1), 100147(2024).</li>
<li>Bird, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-enhanced+purification+of+unconventional+myosin+15%2C+a+molecular+motor+specialized+for+stereocilia+protein+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).</li>
<li>Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+full-length+human+nonmuscle+myosin+II+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs.</a> J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).</li>
<li>Billington, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+18A+coassembles+with+nonmuscle+myosin+2+to+form+mixed+bipolar+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments.</a> Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).</li>
<li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+kinesin-1+and+myosin-V+defines+Drosophila+posterior+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination.</a> Elife. 9, 54216(2020).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binding+protein+regulates+myosin-7a+dimerization+and+actin+bundle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly.</a> Nat Commun. 12 (1), 563(2021).</li>
<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chains%3A+Teaching+old+dogs+new+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks.</a> Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).</li>
<li>Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+five+foreign+genes+by+a+single+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus.</a> Gene. 156 (2), 229-233 (1995).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29-induced+rigidity+change+of+the+myosin+VIIa+IQ+motif-single+alpha+helix+lever+arm+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension.</a> Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).</li>
<li>Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+cross-bridge+elasticity+and+post-power-stroke+events+in+fast+skeletal+muscle+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin.</a> Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiono szczegółowy protokół produkcji rekombinowanego ludzkiego białka miozyny-7a z komórek owadów. Chociaż system Sf9 / bakulowirus został wykorzystany do produkcji różnych miozyn 40,41,42,43, dopiero niedawno miozyna-7a ssaków została pomyślnie oczyszczona przy użyciu systemu bakulowirusa MultiBac 14. Stwierdzono, że miozyna-7a u ssaków wiąże się z trzema typami...

Miozyny to molekularne białka motoryczne, które oddziałują z aktyną, napędzając liczne procesy komórkowe1,2,3,4. Ludzie posiadają 12 klas i 39 genów miozyny5, które są zaangażowane w szeroki zakres funkcji fizjologicznych, takich jak skurcz mięśni6 i procesy sensoryczne7. Każda cząsteczka miozyny jest multimerycznym kompleksem złożonym z łańcucha ciężkiego i łańcuchów lekkich. Ciężki łańcuch jest podzielony na obszary głowy, szyi i ogona. Głowa zawiera miejsca wiążące aktyny i nukleotydy, które są odpowiedzialne za hydrolizę ATP i generowanie siły na włóknach aktyny2. Szyja jest utworzona przez kilka α-spiralnych motywów IQ, w których związany jest określony zestaw lekkich łańcuchów. Razem działają jako ramię dźwigni, aby wzmocnić zmiany konformacyjne silnika w duże ruchy8,9,10. Ogon zawiera subdomeny specyficzne dla klasy i odgrywa rolę regulacyjną w dostrajaniu aktywności motorycznej miozyny i pośredniczeniu w interakcjach z partnerami wiązania komórkowego2,11.
Ludzka miozyna-7a, członek miozyny klasy 7, jest niezbędna dla procesów słuchowych i wzrokowych12,13. Motywy IQ ludzkiej miozyny-7a są związane z unikalną kombinacją łańcuchów lekkich, w tym regulatorowego łańcucha lekkiego (RLC), kalmoduliny i białka podobnego do kalmoduliny 4 (CALML4)14,15,16. Oprócz stabilizacji ramienia dźwigni, te lekkie łańcuchy regulują właściwości mechaniczne miozyny-7a w odpowiedzi na sygnalizację wapniową, cechę, która wydaje się być unikalna dla ssaków isoform14.
Defekty w genie kodującym ciężki łańcuch miozyny-7a (MYO7A/USH1B) są odpowiedzialne za zespół Ushera typu 1, najcięższą formę połączonego ubytku wzroku i słuchu u ludzi17. Dodatkowo, gen łańcucha lekkiego CALML4 jest jednym z genów kandydujących zmapowanych tak, aby zawierały allel sprawczy dla USH1H, innego wariantu zespołu Ushera typu 115,18. W siatkówce miozyna-7a ulega ekspresji w nabłonku barwnikowym siatkówki i komórkach fotoreceptorowych13. Ma to związek z lokalizacją melanosomów w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE)19 i fagocytozą dysków zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez komórki RPE20. W uchu wewnętrznym miozyna-7a znajduje się przede wszystkim w rzęskach stereocilia, gdzie odgrywa kluczową rolę w tworzeniu wiązek włosów i bramkowaniu procesu transdukcji mechano-elektrycznej12,21,22.
Chociaż znaczenie miozyny-7a w komórkach czuciowych jest dobrze znane, jej mechanizmy funkcjonalne na poziomie molekularnym pozostają słabo poznane. Ta luka w wiedzy wynika częściowo z wyzwań związanych z oczyszczaniem nienaruszonego białka, zwłaszcza izoformy ssaków. Ostatnio poczyniono znaczne postępy przy użyciu systemu MultiBac do rekombinowanej ekspresji kompletnego ludzkiego holoenzymu miozyny-7a14. Postęp ten umożliwił strukturalną i biofizyczną charakterystykę tego białka motorycznego, prowadząc do odkrycia kilku unikalnych właściwości ludzkiej miozyny-7a, które są specjalnie przystosowane do funkcji słuchowych ssaków14,23.
System MultiBac to zaawansowana platforma komórek bakukulowirusa/owadów zaprojektowana specjalnie do ekspresji eukariotycznych kompleksów multimerycznych24,25. Kluczową cechą tego systemu jest jego zdolność do hostowania wielu kaset ekspresji genów, z których każda koduje podjednostkę kompleksu, w obrębie jednego bakulowirusa MultiBac. Składanie kaset ekspresji wielogenowej jest ułatwione dzięki tak zwanemu modułowi namnażania: miejscu endonukleazy samonaprowadzającej (HE) i dopasowanemu zaprojektowanemu miejscu BstXI flankującemu wiele miejsc klonowania (MCS). Moduł ten umożliwia iteracyjny montaż pojedynczej kasety ekspresji poprzez ograniczenie/ligację, wykorzystując fakt, że miejsca restrykcji HE i BstXI są eliminowane po ich ligacji. W tym artykule ludzki łańcuch ciężki miozyny-7a, RLC, kalmodulina i CALML4 są klonowane do modułu namnażania w wektorze pACEBac1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A), które są następnie składane w wielogenową kasetę ekspresyjną w procesie iteracyjnym (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B). Kaseta wielogenowa miozyny-7a jest zintegrowana z genomem bakulowirusa (bakmid) poprzez transpozycję elementu mini-Tn7 z wektora pACEBac1 do miejsca docelowego mini-attTn7 w genomie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Zgodnie z procedurami oczyszczania bakcydu, produkcji bakulowirusa i amplifikacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D, E)), rekombinowany bakulowirus miozyny-7a MultiBac jest przygotowywany i może być stosowany do produkcji białek na dużą skalę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). Dodatkowo, łańcuchy lekkie miozyny-7a mogą być produkowane oddzielnie w E. coli i oczyszczane za pomocą rozszczepialnego znacznika His6-SUMO26,27,28. Oczyszczone łańcuchy lekkie są przydatne do badania ich dynamiki wiązania i regulacji miozyny-7a.
Oczyszczone białko miozyny-7a może być poddane badaniom strukturalnym, biochemicznym i biofizycznym, aby uzyskać wgląd w strukturalno-funkcjonalną regulację tego białka motorycznego. Dodatkowo, jego interakcje z siecią aktynową i innymi białkami wiążącymi29 mogą być badane przy użyciu różnych podejść do rekonstytucji in vitro. Wyniki tych analiz poinformują o właściwościach biofizycznych tej miozyny, prowadząc do mechanistycznego zrozumienia, w jaki sposób miozyna-7a napędza zmiany cytoszkieletu i ostatecznie kształtuje unikalną morfologię i funkcję komórek czuciowych. W tym artykule szczegółowo opisujemy przebieg pracy w teście ślizgania się włókien aktynowych, który został specjalnie dostosowany do miozyny 7a ssaków. Test ślizgania włókien aktynowych to solidny test ruchliwości in vitro, który ilościowo bada ruch fluorescencyjnych włókien aktyny napędzanych przez dużą liczbę silników miozyny unieruchomionych na powierzchni szkiełka nakrywkowego30,31,32. Zaletami tego testu są prostota konfiguracji, minimalne wymagania sprzętowe (szerokokątny mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kamerę cyfrową) oraz wysoka odtwarzalność. Dodatkowo, ponieważ ruch włókien aktynowych jest napędzany przez klaster unieruchomionych silników miozyny, test ten jest szczególnie przydatny do badania ruchliwości miozyn monomerycznych, takich jak miozyna-7a14,33. Protokoły obejmują kilka modyfikacji, od procedur eksperymentalnych po analizę obrazową, specjalnie dostosowanych do unikalnych właściwości ruchliwych miozyny-7a u ssaków. Dzięki dostępności nienaruszonego białka miozyny-7a i przedstawionemu tutaj protokołowi charakterystyki funkcjonalnej, praca ta kładzie podwaliny pod dalsze badania nad molekularnymi rolami miozyny-7a zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>1X FLAG Peptide</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>Niestandardowa synteza peptydów</td></tr><tr><td>22x22mm Szkiełka nakrywkowe nr 1,5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Stożkowe probówki</td> wirówkowe <td>Nunc</td><td>376814</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Wentylowana kolba wytrząsarska Erlenmyer</td><td>IntelixBio</td><td>DBJ-SF250VP</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>VWR</td><td>M131</td><td></td></tr><tr><td>75x25x1 mm Szkiełka mikroskopowe Vistavision</td><td>VWR</td><td>16004-42</td><td></td></tr><tr><td>Białko aktynowe (>99% czyste)</td><td>Cytoszkielet</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4</td><td>Millipore Sigma UFC801024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Spin Jednorazowa kolumna chromatograficzna</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6008</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-Gal</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>15519028</tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Millipore Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>BstXI Enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0113S</td><td></td></tr><tr><td>Kalmodulina</td><td>Milipore Sigma</td><td>208694</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza Millipore</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET-SUMO System ekspresji</td><td>Thermo Fisher</td><td>K30001</td><td></td></tr><tr><td>cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche Diagnostics</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>DO632</td><td></td>DL-Dithiothreitol</tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>DO632</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-610-304</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td> Office <td>Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, Klasa biologii molekularnej</td><td>Millipore Sigma</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, Biologia molekularna</td> klasy <td>Millipore Sigma</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji ExpiFectamine Sf</td><td>Gibco</td><td>A38915</td><td></td></tr><tr><td>Program FAST</td><td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Model 505 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór odczynnika gentamycyny</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>10 mg / ml w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Glikoza Millipore Sigma</td><td>G5767</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Żywica</td> <td>kobaltowa HisPurThermo Fisher</td><td>89966</td><td></td></tr><tr><td>CeuI Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td> Wtyczka stabilizatora <td></td></tr><tr><td>obrazu</td><td>https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion Snap Assembly Master Mix</td><td>TaKaRa</td><td>638948</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451SK</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ67354AD</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z dużym otworem</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-134</td><td>1-200uL</td></tr><tr><td>LB Agar, gotowy proszek</td><td>Thermo Fisher</td><td>J75851-A1</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy leupeptyny</td><td>Thermo Fisher</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Thermo Fisher</td><td>J61014.=E</td><td>1M</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Thermo Fisher</td><td>J61014.=E</td><td>1M</td></tr><tr><td>Max Wydajność DH10Bac Kompetentne komórki</td><td>Gibco</td><td>10361012</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,7 ml</td><td>Mikroskop VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Model firmy Nikon</td><td>: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem</td><td></td>100X TIRF</tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>ORCA-Fusion BT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka laserowa</td><td>mikroskopu iXon Ultra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miller' s LB Bulion</td><td>Corning</td><td>46-050-CM</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One/OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One/OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Kompetentny E.coli (wysoka wydajność)</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6003S</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>LADD Research Industries</td><td>53152</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pACEBac1 Vector</td><td>Geneva Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNaza A (20 mg / ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Zestaw do ekstrakcji żelu (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Szybki</td><td>New England Biolabs</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Proteaza</td><td></td> Invitrogen 15544034 <td></td></tr><tr><td>SENP2</td><td>PMID:17591783</td><td>Oczyszczony w laboratorium</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Sf9</td><td>Thermo Fisher</td><td>11496015</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM (1X) - Complete Serum Free Media</td><td>Gibco</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G3, 10K MWCO, 3 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>A52971</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td> Chlorek sodu Millipore Sigma S7653 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release Jednorazowy system filtracji napędzany próżnią</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU01RE</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>29148721</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA</td><td>T4 New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza - 10X z 10mM ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>Millipore Sigma</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Amerykański bioanalityczny</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie oparte na systemie multibac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

MultiBac System-Based Purification and Biophysical Characterization of Human Myosin-7a

Miozyna-7a to białko motoryczne na bazie aktyny, niezbędne dla procesów słuchowych i wzrokowych. Mutacje w miozynie-7a prowadzą do zespołu Ushera typu 1, najczęstszej i najcięższej postaci głuchoślepoty u ludzi. Przypuszcza się, że miozyna-7a tworzy transbłonowy kompleks adhezyjny z innymi białkami Ushera, niezbędny dla strukturalno-funkcjonalnej integralności fotoreceptorów i komórek rzęsatych ślimaka. Jednak ze względu na wyzwania związane z uzyskaniem czystego, nienaruszonego białka, dokładne mechanizmy funkcjonalne ludzkiej miozyny-7a pozostają nieuchwytne, a dostępne badania strukturalne i biomechaniczne są ograniczone. Ostatnie badania wykazały, że miozyna-7a ssaków jest multimerycznym kompleksem motorycznym składającym się z łańcucha ciężkiego i trzech typów łańcuchów lekkich: regulatorowego łańcucha lekkiego (RLC), kalmoduliny i białka podobnego do kalmoduliny 4 (CALML4). W przeciwieństwie do kalmoduliny, CALML4 nie wiąże się z jonami wapnia. Zarówno wrażliwe, jak i niewrażliwe kalmoduliny są krytyczne dla miozyny 7a u ssaków dla prawidłowego dostrojenia jej właściwości mechanicznych. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodę wytwarzania rekombinowanego ludzkiego holoenzymu miozyny-7a przy użyciu systemu ekspresji białka MultiBac Baculovirus. W ten sposób uzyskuje się miligramowe ilości białka o pełnej długości o wysokiej czystości, co pozwala na jego charakterystykę biochemiczną i biofizyczną. Ponadto przedstawiamy protokół oceny jego właściwości mechanicznych i ruchliwych za pomocą dostosowanych testów ruchliwości in vitro i mikroskopii fluorescencyjnej. Dostępność nienaruszonego ludzkiego białka miozyny-7a, wraz ze szczegółowym protokołem charakterystyki funkcjonalnej opisanym tutaj, toruje drogę do dalszych badań nad molekularnymi aspektami miozyny-7a w widzeniu i słuchu.

Oczyszczony kompleks miozyny-7a oraz białka łańcuchów lekkich można ocenić za pomocą elektroforezy żelowej SDS-PAGE, co przedstawiono na Rysunku 3. Prążek powyżej markera 200 kDa odpowiada ciężkiemu łańcuchowi miozyny-7a (255 kDa). Trzy prążki migrujące między markerami 22 a 14 kDa, licząc od góry do dołu, to odpowiednio RLC (20 kDa), kalmodulina oraz CALML4. Choć kalmodulina i CALML4 mają podobną masę cząsteczkową wynoszącą około 17 kDa, dwa te białka można rozdzielić przy użyciu żelu Tris-...

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Myosin-7a is an actin-based motor protein vital for auditory and visual processes. Mutations in myosin-7a lead to Usher syndrome type 1, the most common ...

Próbujemy odpowiedzieć na pytanie, dlaczego mutacje w silnikach miozyny powodują choroby u ludzi i jaką rolę odgrywają te białka w procesie słyszenia. Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów molekularnych miozyny-7a i tego, jak współpracuje ona z białkami Ushera w celu złożenia i utrzymania maszynerii komórkowej niezbędnej do słyszenia. Zrozumienie mechanizmów strukturalnych i funkcjonalnych miozyny-7a wymaga wysokiej jakości nienaruszonego białka, co od dawna stanowi wyzwanie w tej dziedzinie.Ostatnio poczyniliśmy znaczne postępy i udało nam się oczyścić pusty enzym miozyny-7a o pełnej długości, co pozwoliło na dalsze badania tego ważnego białka. Dzięki temu białku, które jest obecnie dostępne, możemy zbadać kluczowe cechy tego silnika, w tym jego strukturę, wytwarzanie siły i ruchliwość. Te spostrzeżenia mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów miozyny-7a w słuchu i defektów molekularnych, które prowadzą do głuchoty u ludzi.W przyszłości nasze laboratorium wykorzysta naszą wiedzę specjalistyczną w zakresie systemu multi vac do rekombinacyjnego wytwarzania dużych kompleksów biomolekularnych, na przykład kompleksu Usher 1, który ma kluczowe znaczenie dla

multibac-system-based-purification-biophysical-characterization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

W miocytach serca struktury błony kanalikowej tworzą sieci wewnątrzkomórkowe. Opisujemy zoptymalizowane protokoły i) izolacji miocytów z serca myszy, w tym kontroli jakości, ii) barwienia żywych komórek do najnowocześniejszej mikroskopii fluorescencyjnej oraz iii) bezpośredniej analizy obrazu w celu ilościowego określenia złożoności składników i plastyczności sieci błon wewnątrzkomórkowych.

Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

Bacillus anthracis jest obowiązkowym patogenem śmiertelnego wąglika wziewnego, więc badania nad jego genami i białkami są ściśle regulowane. Alternatywnym podejściem jest badanie genów ortologicznych. Opisujemy badania biofizykochemiczne ortologa B. anthracis w B. cereus, bc1531, wymagające minimalnego sprzętu doświadczalnego i pozbawione poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa.

Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Poznaj oczyszczanie ludzkiej miozyny-7a w systemie MultiBac i jej biofizyczną charakterystykę. Ta metoda pozwala badać mechanizmy słuchu oraz molekularne podstawy głuchoty.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Przeglądaj więcej filmów