Name: Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-16T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Poznaj metodę lędźwiowych wstrzyknięć dooponowych wektorów terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego u myszy i szczurów. Technika ta umożliwia skuteczne dostarczanie leków w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować UT Southwestern AAV Viral Vector Core Facility za wyprodukowanie wektora AAV9 oraz Yuhui Hu, naukowcowi w Gray Lab, za przetworzenie i zabarwienie tkanki przedstawionej na rysunku 2.

Opisane w niniejszym dokumencie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) w University of Texas Southwestern Medical Center. W protokołach z udziałem myszy wykorzystano myszy dzikiego typu C57BL6/J, samce i samice, w wieku od P1 do P28. W protokołach z udziałem szczurów wykorzystano szczury dzikiego typu Sprague-Dawley, samce i samice, w wieku od P1 do P56. Poza operacją przeżywalności opisaną w sekcji 3, wszystkie pozostałe procedury uznaje się za powodujące jedynie chwilowy dyskomfort i nie wymagają one stosowania środków znieczulających lub przeciwbólowych. Osoby przeprowadzające badania powinny monitorować zwierzęta laboratoryjne pod kątem dyskomfortu trwającego dłużej niż chwilowo i konsultować z IACUC oraz personelem weterynaryjnym konieczność podania środków znieczulających i przeciwbólowych. Szczegóły dotyczące wykorzystanych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Podanie domięśniowe w odcinku lędźwiowym u myszy &gt;P21
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory do iniekcji, w tym wektor terapii genowej w pożądanych stężeniu(ach) oraz roztwór kontrolny (zazwyczaj bufor formulacyjny użyty podczas produkcji wektora). Roztwory do iniekcji powinny być sterylne i pozostawać sterylne przez cały czas trwania procedury. 
		UWAGA: Wszystkie roztwory należy przechowywać w lodzie przez cały czas trwania procedury.</li>
		<li>Zebrać i zdezynfekować wszystkie materiały, w tym strzykawkę z igłą, pipetę oraz roztwór do iniekcji. Należy przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących korzystania z komór bezpieczeństwa biologicznego oraz ekspozycji na substancję wstrzykiwaną. Opisane tutaj procedury przeprowadzono w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2.</li>
		<li>Za pomocą pipety mikrolitrowej odmierzyć pożądany objętość roztworu do iniekcji i przenieść go na sterylną folię parafinową. Powszechnie stosowana objętość iniekcji wynosi 5 µL i jest ona traktowana jako objętość docelowa dla dorosłych myszy &gt;P21 (Tabela 1). 
		UWAGA: W razie potrzeby objętość można zwiększyć; należy jednak uważnie monitorować zwierzęta pod kątem reakcji niepożądanych przy większych objętościach iniekcji. Szczegóły dotyczące objętości iniekcji i reakcji niepożądanych znajdują się w sekcji Dyskusja. Roztwór można również przenieść bezpośrednio z końcówki pipety do strzykawki lub można użyć skalibrowanych gazoszczelnych strzykawek mikrolitrowych do bezpośredniego pomiaru objętości roztworu do iniekcji.</li>
		<li>Nabrać roztwór do strzykawki mikrolitrowej z igłą 30 G 0,5", uważając, aby nie nabrać pęcherzyków powietrza. 
		UWAGA: Grubość i długość igły mogą wpływać na penetrację skóry. Dobierając rozmiar strzykawki, należy zadbać, aby objętość iniekcji nie stanowiła mniej niż 10% pojemności strzykawki. W przypadku objętości przekraczających 50% pojemności strzykawki należy upewnić się, że tłok można łatwo wcisnąć palcem wskazującym. Jeśli tłok nie daje się łatwo wcisnąć, należy użyć strzykawki o większej pojemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchamianie
	<ol>
		<li>Używając ręki dominującej, przytrzymać świadomą (nieznieczuloną) mysz za ogon na ręczniku papierowym. Ręcznik papierowy pomoże w unieruchomieniu, uspokojeniu i zapobiegnie gryzieniu przez mysz. Mysz powinna znajdować się w neutralnej pozycji brzusznej, z bokiem ciała skierowanym w stronę operatora. 
		UWAGA: Przed procedurą nie ma potrzeby trenowania ani oswajania myszy z tym sposobem unieruchomienia. Mysze może towarzyszyć walka spowodowana unieruchomieniem, ale nie powinna ona wywoływać specyficznej reakcji bólowej. Jeśli zaobserwowano reakcje bólowe trwające dłużej niż chwilę, konieczne może być podanie leków przeciwbólowych; w takim przypadku należy zasięgnąć porady lekarza weterynarii.</li>
		<li>Ręką niedominującą założyć część ręcznika papierowego na głowę i górną część ciała myszy i mocno uchwycić obręcz miednicy kciukiem i palcem wskazującym ręki niedominującej. Należy upewnić się, że dłoń jest zgięta w łuk i opiera się wokół głowy myszy. Grzebień biodrowy myszy powinien być wyczuwalny i znajdować się w centrum paliczka dalszego każdego palca (Rycina 1A,B). 
		UWAGA: Unieruchomienie dłonią lub ręcznikiem papierowym nie powinno upośledzać oddychania.</li>
		<li>Delikatnie obrócić podstawę ogona, aby zapewnić prawidłowe ustawienie kręgosłupa. Miednica myszy powinna być ustawiona prosto, tak aby wyrostki kręgowe kręgosłupa lędźwiowego były prostopadłe do powierzchni roboczej.</li>
		<li>Przetrzeć grzbietową okolicę lędźwiową myszy gazikiem nasączonym 70% alkoholem.</li>
		<li>Rozsunąć sierść około 2-6 mm kranialnie od grzebienia biodrowego, aby ułatwić wizualizację miejsca iniekcji.</li>
		<li>Zlokalizować dotykowo przestrzeń międzykręgową L4-L5 lub L5-L6, około 2-6 mm kranialnie od grzebienia biodrowego. 
		UWAGA: Dokładna odległość jest zmienna w zależności od wielkości i wieku myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja
	<ol>
		<li>Używając ręki dominującej, trzymać strzykawkę mikrolitrową za środek i ustawić ją prostopadle do kręgosłupa myszy na poziomie przestrzeni międzykręgowej L4-L5 lub L5-L6. Należy upewnić się, że tłok strzykawki można wcisnąć palcem wskazującym bez nadmiernego ruchu ręki. Skierując ścięcie igły w stronę głowy myszy, przebić skórę nad przestrzenią międzykręgową.</li>
		<li>Gdy końcówka igły dotknie krawędzi kości wokół przestrzeni międzykręgowej, zmniejszyć kąt nachylenia strzykawki do 30-45 stopni (Rycina 1A).</li>
		<li>Igła powinna wsunąć się w przestrzeń międzykręgową, co spowoduje nagłe drgnienie ogona; igła powinna zostać ściśle zaciśnięta między kręgami.</li>
		<li>Uważając, aby nie przesunąć strzykawki, jednostajnie wcisnąć tłok, aby podać roztwór w czasie do 10 s.</li>
		<li>Przytrzymać strzykawkę w miejscu przez 15-30 s po całkowitym wciśnięciu tłoka, aby umożliwić rozprzestrzenienie się roztworu i zapobiec jego cofaniu się.</li>
		<li>Płynnie i powoli wycofać strzykawkę z organizmu myszy pod tym samym kątem wejścia 30-45 stopni. Podczas wycofywania igły należy obracać strzykawkę, aby zapobiec cofaniu się roztworu. 
		UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie pchać igły do przodu podczas obracania strzykawki, ponieważ może to spowodować fizyczne uszkodzenie rdzenia kręgowego.</li>
		<li>Zwolnić mysz z unieruchomienia i umieścić ją z powrotem w klatce.</li>
		<li>Po iniekcji monitorować mysz pod kątem nieprawidłowej lokomocji, upośledzenia motorycznego, zaburzeń oddychania oraz koordynacji. Dodatkowe szczegóły dotyczące reakcji niepożądanych znajdują się w sekcji Dyskusja.</li>
		<li>Oczyścić sprzęt zgodnie z zaleceniami producenta. W przypadku wielu iniekcji zaleca się stosowanie różnych strzykawek dla każdego wektora terapii genowej i roztworu kontrolnego. 
		UWAGA: Wymienne igły można czyścić, sterylizować i używać wielokrotnie; nie należy jednak używać tępych igieł, ponieważ mogą one ranić zwierzę i zwiększać prawdopodobieństwo niecelnej iniekcji. Tępa igła nie przebije skóry łatwo i powinna zostać odpowiednio zutylizowana. Jeśli liczba strzykawek jest ograniczona, zaleca się wykonanie wszystkich iniekcji nośnika przed przejściem do wektora terapii genowej oraz wstrzyknięcie najniższej dawki terapii genowej przed podaniem dawek wyższych.</li>
		<li>Postępować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi sterylizacji sprzętu pomiędzy zwierzętami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat iniekcji do rdzenia kręgowego gryzoni przedstawiający podawanie leku i jego dystrybucję w rdzeniu kręgowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat ułożenia palca i strzykawki podczas dostępu dokanałowego w odcinku lędźwiowym u myszy i szczurów. (A) Widok boczny myszy &gt;P21 pokazujący miejsce wprowadzenia igły i zmianę kąta nachylenia strzykawki podczas iniekcji IT do odcinka lędźwiowego. Czerwony przerywany owal wskazuje położenie palca nad grzebieniem biodrowym myszy. Powiększony widok kręgosłupa przedstawia przestrzeń dokanałową (niebieska) z przybliżonym miejscem wprowadzenia igły (zielona strzałka) oraz rdzeń kręgowy (różowy). Widok grzbietowy (B) myszy &gt;P21, (C) myszy &lt;P10 oraz (D) szczura &gt;P21, z punktami odniesienia dla wprowadzenia igły (zielone koło), obręczy miednicznej (żółty przerywany owal) i ułożenia palca (czerwony przerywany owal). W (D) przedstawiono również miejsce nacięcia i haki chirurgiczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Lędźwiowe wstrzyknięcie dokanałowe u myszy i szczurów &lt;P10
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z krokiem 1.1. Jedynym wyjątkiem jest objętość iniekcji w kroku 1.1.3. 
		UWAGA: Zalecane objętości iniekcji dla noworodków myszy (P0-P1) nie powinny przekraczać 3 µL, dla młodych myszy (P5-P7) nie powinny przekraczać 5 µL, a dla młodych myszy (P10) nie powinny przekraczać 10 µL. Zalecane objętości iniekcji dla noworodków szczurów (P0-P1) nie powinny przekraczać 5 µL, dla młodych szczurów (P5-P7) nie powinny przekraczać 10 µL, a dla młodych szczurów (P10) nie powinny przekraczać 30 µL (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie
	<ol>
		<li>Trzymając mysz/szczura ręką dominującą, chwyć go za ogon na ręczniku papierowym. Mysz/szczur powinna znajdować się w neutralnej pozycji brzusznej, z bokiem ciała skierowanym w Twoją stronę. 
		UWAGA: Myszy/szczury mogą szarpać się z powodu unieruchomienia, ale nie powinny wykazywać specyficznej reakcji bólowej. Jeśli zaobserwowane zostaną reakcje bólowe trwające dłużej niż chwilę, konieczne może być podanie leków przeciwbólowych; skonsultuj się z lekarzem weterynarii.</li>
		<li>Delikatnie, ale pewnie chwyć obręcz miednicy kciukiem i palcem wskazującym niedominującej ręki. Grzebień biodrowy powinien być wyczuwalny i znajdować się w centrum paliczka dystalnego każdego z tych palców (Rysunek 1C). 
		UWAGA: W tym wieku nie ma obaw o pogryzienie, więc owijanie myszy/szczura ręcznikiem papierowym nie jest wymagane. W przypadku szczurów w wieku P5-10 może być konieczne użycie ręcznika papierowego, aby utrzymać większe młode w bezruchu.</li>
		<li>Delikatnie obróć nasadę ogona, aby zapewnić prawidłowe ustawienie kręgosłupa. Miednica myszy/szczura powinna być ustawiona prostopadle do powierzchni roboczej, tak aby wyrostki kręgowe kręgosłupa lędźwiowego były do niej prostopadłe.</li>
		<li>Przetrzyj grzbietową okolicę lędźwiową myszy/szczura 70% alkoholowym gazikiem.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, rozdziel sierść na około 1-3 mm kranialnie od grzebienia biodrowego, aby ułatwić wizualizację miejsca iniekcji. Wizualizacja obszaru docelowego jest łatwiejsza u młodszych myszy/szczurów. U bezwłosionych noworodków w przestrzeni międzykręgowej może być widoczne wgłębienie.</li>
		<li>Zlokalizuj dotykowo lub wizualnie przestrzeń międzykręgową L4-L5 lub L5-L6, około 1-3 mm kranialnie od grzebienia biodrowego. 
		​UWAGA: Dokładna odległość jest zmienna w zależności od wielkości i wieku myszy/szczura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja
	<ol>
		<li>Trzymając ręką dominującą środek strzykawki mikrolitrowej, ustaw ją pod kątem 30-45 stopni względem kręgosłupa myszy/szczura. Skieruj ścięcie igły w stronę głowy zwierzęcia i nakłuj skórę około 1-3 mm kaudalnie od przestrzeni międzykręgowej. Ze względu na kąt ustawienia strzykawki, punkt wkłucia w skórę znajduje się nieco kaudalnie w stosunku do przestrzeni międzykręgowej. 
		UWAGA: Odległość ta może zmieniać się w zależności od wieku i wielkości myszy/szczura.</li>
		<li>Pozostałe kroki są identyczne z krokami 1.3.3-1.3.10 dla myszy &gt;P21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Lędźwiowe wstrzyknięcie dokanałowe u szczurów &gt;P21
UWAGA: W literaturze opisano wiele procedur wstrzykiwania do przestrzeni intratekalnej (IT), od technik bez znieczulenia po bardziej rozległe podejścia chirurgiczne14,15. Opisano procedurę bezpośredniego wstrzykiwania z wykorzystaniem techniki małoinwazyjnej, przy zastosowaniu lekkiego znieczulenia i niewielkiego nacięcia skóry. Stosowanie znieczulenia, np. gazu izofluranu, może ułatwić unieruchomienie zwierzęcia, rozluźnić mięśnie i zapobiec ruchom podczas wstrzykiwania. Wykonanie niewielkiego nacięcia skóry nad miejscem wstrzyknięcia zwiększa precyzję zabiegu, umożliwiając wizualizację przestrzeni międzykręgowej i eliminując konieczność przebijania się przez grubą skórę. Ze względu na nacięcie konieczne jest zastosowanie środków znieczulających i przeciwbólowych. Dzięki praktyce możliwe jest wykonywanie wstrzyknięć IT do odcinka lędźwiowego u szczurów starszych niż P21 bez znieczulenia lub nacięcia, zależnie od decyzji użytkownika i wymogów instytucjonalnych15. Należy przestrzegać wytycznych i zaleceń instytucjonalnych dotyczących znieczulenia, odpowiednich leków przeciwbólowych oraz chirurgii przeżyciowej zwierząt laboratoryjnych.
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Należy postępować zgodnie z krokiem 1.1. Jedynymi wyjątkami są objętość iniekcji w kroku 1.1.3 oraz rozmiar igły w kroku 1.1.4. Objętości iniekcji dla szczurów mogą się znacznie różnić w zależności od wieku i wielkości ciała. Więcej informacji na temat objętości iniekcji w zależności od wieku znajduje się w sekcji Dyskusja (Tabela 1). 
		UWAGA: Dla dorosłych szczurów zaleca się igłę 27 G x 1", ponieważ igły o mniejszej średnicy mogą się wygiąć, a krótsze igły mogą nie wniknąć w wystarczającym stopniu do przestrzeni intratekalnej. W razie potrzeby można zastosować dłuższą igłę (1,25-1,5").</li>
		<li>Zanurzyć szczura w narkozie, stosując preferowany i zatwierdzony środek anestetyczny (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). 
		UWAGA: W opisanych tutaj procedurach szczury poddano narkozie przy użyciu gazu izofluranowego, a jako miejscowy środek znieczulający zastosowano mieszaninę lidokainy i bupiwakainy w stosunku 1:1. Temperaturę ciała należy utrzymywać za pomocą zatwierdzonego zewnętrznego źródła ciepła przez cały czas trwania procedury oraz podczas wybudzania.</li>
		<li>W przypadku każdego zwierzęcia należy przeprowadzić standardowe aseptyczne przygotowanie miejsca operacyjnego. W skrócie: należy ogolić grzbietową część odcinka lędźwiowego, a następnie przygotować skórę za pomocą szorstkiego mydła chirurgicznego, betadyny i 70% alkoholu izopropylowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura chirurgiczna
	<ol>
		<li>Umieścić szczura w neutralnej pozycji brzusznej, tak aby boczna strona ciała była skierowana w stronę operatora.</li>
		<li>Z palpacji określić położenie obręczy miednicy, identyfikując grzebień biodrowy oraz połączenie lędźwiowo-krzyżowe. U szczurów &gt;P21 wyrostki kręgów są łatwo identyfikowalne.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wykonać nacięcie o długości 1 cm nad przestrzenią międzykręgową L4-L5 lub L5-L6. Nacięcie powinno obejmować tylko skórę i powięź podskórną, pozostawiając mięśnie nienaruszone. 
		UWAGA: Wskazane jest użycie rozieraków do utrzymania nacięcia skóry w pozycji otwartej przez resztę procedury.</li>
		<li>Delikatnie, ale pewnie uchwycić obręcz miednicy kciukiem i palcem wskazującym niedominującej ręki. Grzebień biodrowy powinien być wyczuwalny i znajdować się w centrum dystalnej części palca każdego z tych palców (Rysunek 1D). Użyć kleszczyków typu mosquito do badania wzdłuż linii środkowej grzbietu w celu zlokalizowania przestrzeni międzykręgowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja
	<ol>
		<li>Trzymając w dominującej ręce środek strzykawki mikrolitrowej, ustawić ją prostopadle do kręgosłupa szczura na wysokości przestrzeni międzykręgowej L4-L5 lub L5-L6. Upewnić się, że tłok strzykawki można wcisnąć palcem wskazującym bez nadmiernego ruchu ręki. Skierować ścięcie igły w stronę głowy szczura i przebić mięsień igłą w miejscu przestrzeni międzykręgowej.</li>
		<li>Wprowadzić igłę do przestrzeni międzykręgowej. 
		UWAGA: Podczas przechodzenia między wyrostkami kręgów może wystąpić niewielki opór; w takim przypadku może być konieczna niewielka korekta kąta nachylenia strzykawki, aby przejść przez szczelinę. Strzykawka powinna jednak pozostać pod kątem około 90 stopni, prostopadle do kręgosłupa. W momencie wniknięcia igły do przestrzeni intratekalnej wyczuwalne będzie „puknięcie”. W zależności od parametrów anestezji może wystąpić lub nie zauważalny drgnienie ogona lub nogi. Igła powinna być ściśle zakleszczona między kręgami.</li>
		<li>Uważając, aby nie przesunąć strzykawki, wcisnąć tłok, aby podać roztwór w czasie do 30 s. 
		UWAGA: W przeciwieństwie do iniekcji u myszy, u szczurów &gt;P21 przy zastosowaniu tej metody może nie być możliwe zmniejszenie kąta nachylenia strzykawki. Większe objętości należy wstrzykiwać wolniej, aby zapobiec nadmiernemu wzrostowi ciśnienia.</li>
		<li>Przytrzymać strzykawkę w miejscu przez 30-60 s po całkowitym wciśnięciu tłoka, aby umożliwić rozprzestrzenienie się roztworu i zapobiec jego cofaniu się.</li>
		<li>Płynnie wycofać strzykawkę ze szczura. Podczas wyciągania igły obracać strzykawkę, aby zapobiec cofaniu się płynu. 
		UWAGA: Należy uważać, aby nie pchać igły do przodu podczas obracania strzykawki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie fizyczne rdzenia kręgowego.</li>
		<li>Zamknąć nacięcie skóry za pomocą zatwierdzonej metody, np. szwem lub klipsami chirurgicznymi. W przypadku szczurów użytych w tym protokole skórę zamknięto szwem ciągłym śródskórnym lub pojedynczymi szwami przerywanymi przy użyciu nici 5-0 PDS II.</li>
		<li>Wyprowadzić szczura z narkozy.</li>
		<li>Postępować zgodnie z krokami 1.3.9-1.3.10 oraz wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki pooperacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+neurological+disorders%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects.</a> Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-based+in+vivo+gene+therapy+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).</li>
<li>Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+and+considerations+for+AAV+gene+therapies+targeting+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurodev+Disord%22%5BJournal%5D)">Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system.</a> J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-based+gene+therapy+for+CNS+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases.</a> Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+adeno-associated+virus+gene+therapy+following+cerebrospinal+fluid-directed+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration.</a> Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).</li>
<li>Corning, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+anesthesia+and+local+medication+of+the+cord%5BTitle%5D)+AND+%22NY+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Spinal anesthesia and local medication of the cord.</a> NY Med. J. , 483-485 (1885).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+A+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: A new technique.</a> Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Choi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound-guided+intrathecal+injections+in+a+young+mouse+model%3A+Targeting+the+central+nervous+system+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery.</a> J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).</li>
<li>Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intrathecal+injection+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice.</a> J Vis Exp. 144, e58565(2019).</li>
<li>Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+SiRNA+transfection+and+gene+knockdown+in+spinal+cord+via+rapid+noninvasive+lumbar+intrathecal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice.</a> J Vis Exp. 85, e51229(2014).</li>
<li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31(2010).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).</li>
<li>Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+perform+direct+transcutaneous+intrathecal+injection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).</li>
<li>Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+vector+delivery+in+juvenile+rats+via+lumbar+cistern+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection.</a> J Vis Exp. 205, e66463(2024).</li>
<li>Lu, X., Jiang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+injection+of+newborn+mouse+for+genome+editing+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal injection of newborn mouse for genome editing and drug delivery.</a> J Vis Exp. 205, e65761(2024).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+AAV9%2FAP4M1+gene+therapy+for+hereditary+spastic+paraplegia+50+shows+safety+and+efficacy+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies.</a> J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).</li>
<li>Deschenes, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+correction+of+GM2+ganglioside+accumulation+in+AB-variant+GM2+gangliosidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).</li>
<li>Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcription+factors+Ascl1+and+Lhx6+attenuate+diabetic+neuropathic+pain+by+modulating+spinal+neuroinflammation+and+microglial+activation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice.</a> Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).</li>
<li>Kagiava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+therapy+in+two+Golgi-retained+CMT1X+mutants+before+and+after+the+onset+of+demyelinating+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).</li>
<li>Wong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-dominant+human+FMRP+isoform+rescues+seizures%2C+fear%2C+and+sleep+abnormalities+in+Fmr1-KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice.</a> JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+neurocognitive+deficiency+in+mucopolysaccharidosis+type+ii+mice+by+central+nervous+system-directed%2C+AAV9-mediated+iduronate+sulfatase+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).</li>
<li>Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+selectively+blocks+a+spinal+action+of+N-methyl-D-aspartate+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice.</a> Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).</li>
<li>Bailey, R. M., Armao, D., Nagabhushan Kalburgi, S., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrathecal+AAV9+Gene+therapy+for+giant+axonal+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Development of intrathecal AAV9 Gene therapy for giant axonal neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 9, 160-171 (2018).</li>
<li>Bailey, R. M., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+high-dose+intracisterna+magna+and+lumbar+puncture+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+mice+to+treat+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of high-dose intracisterna magna and lumbar puncture intrathecal delivery of AAV9 in mice to treat neuropathies.</a> Brain Res. 1739, 146832(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9%2FMFSD8+gene+therapy+is+effective+in+preclinical+models+of+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+type+7+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease.</a> J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).</li>
<li>Karumuthil-Melethil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+administration+of+AAV%2FGALC+vectors+in+10-11-day-old+twitcher+mice+improves+survival+and+is+enhanced+by+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant.</a> J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).</li>
<li>Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vector+serotype+9-based+gene+replacement+therapy+for+SURF1-related+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).</li>
<li>Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microRNA-based+regulatory+element+permits+safe+high-dose+miniMECP2+gene+therapy+in+Rett+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice.</a> Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).</li>
<li>Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+and+Intrathecal+Drug+Delivery+in+Rats+and+Mice+for+Experimental+Research%3A+Fundamental+Concepts%2C+Techniques%2C+Precaution%2C+and+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application.</a> Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).</li>
<li>Allen, C. H., Ward, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence-based+approach+to+management+of+increased+intracranial+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure.</a> Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).</li>
<li>Belov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+intrathecal+administrations%3A+Impact+on+CSF+pressure+and+safety+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications.</a> Front Neurosci. 15, 604197(2021).</li>
<li>Moazen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+pressure+changes+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Intracranial pressure changes during mouse development.</a> J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).</li>
<li>Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subarachnoid+distribution+of+drugs+after+lumbar+injection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection.</a> N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF%2C+blood-brain+barrier%2C+and+brain+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).</li>
<li>Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+cerebrospinal+fluid+circulatory+system+of+the+developing+rat%3A+quantitative+volumetric+analysis+and+effect+on+blood-CSF+permeability+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Lumbalna iniekcja do cisterny (IT) jest szybką i małoinwazyjną procedurą, która pozwala na niezawodne dostarczenie wektora terapii genowej do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w celu leczenia chorób ośrodkowego układu nerwowego (CNS)5,6. Procedura ta ma znaczenie translacyjne, a opisany tutaj protokół szczegółowo wyjaśnia, jak przeprowadzić tę drogę podania u myszy i szczurów w każdym wieku, od noworodków po osobniki dorosłe. Zdefiniowanie tego protokołu dla myszy i szczurów w każdym wieku, wraz z udostępnieniem filmów pomocniczych, jest istotne, aby ułatwić badaczom wdrożenie tej metody podawania terapii genowej. Doświadczenia naszego laboratorium wskazują, że protokół ten może być konsekwentnie stosowany przez wielu użytkowników i w wielu badaniach w czasie18,25,26,27,28,29,30.
Występują istotne różnice podczas wykonywania lędźwiowego wstrzyknięcia dokanałowego (IT) u młodszych myszy/szczurów w porównaniu do osobników starszych, przede wszystkim w zakresie kąta wprowadzenia igły do kręgosłupa oraz zalecanej objętości wstrzykiwanego płynu. Raportowane objętości wstrzyknięć IT w odcinku lędźwiowym znacznie różnią się w zależności od badania i gatunku31. Uwzględnienie objętości wstrzykiwania jest kluczowe, aby uniknąć długotrwałego wzrostu ciśnienia wewnątrzczaszkowego (ICP), co może upośledzić przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i krwi mózgowej, spowodować dyskomfort oraz prowadzić do przewlekłych powikłań neurologicznych, w tym wodomózgłowia, niedokrwienia, uszkodzeń komórkowych i śmierci32,33. ICP jest determinowane przez objętość CSF, krwi mózgowej i tkanki OUN, czego nie można bezpośrednio powiązać z masą ciała. Przy prawidłowym funkcjonowaniu ICP jest autoregulowane przez wiele czynników, w tym objętość CSF, objętość krwi mózgowej, oddychanie, pozycję ciała, tempo produkcji CSF oraz tempo drenażu CSF do krwi33,34. Objętości wstrzykiwań IT powinny zatem być ustalane na podstawie właściwości CSF (Tabela 1), a nie masy ciała25,27,28,30. Zalecane objętości do wstrzyknięcia dla każdego wieku u każdego gatunku zostały zaznaczone pogrubioną czcionką.
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="5" >Objętość iniekcji do IT</td>
			<td colspan="4" >Wartości płynu mózgowo-rdzeniowego u osobników dorosłych</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td >
			<td >P0-1 (µL)</td>
			<td >P5-7 (µL)</td>
			<td >P10 (µL)</td>
			<td >&gt;P21 (µL)</td>
			<td >Objętość całkowita (µL)</td>
			<td >Szybkość produkcji (µL/min)</td>
			<td >Wymiana (h)</td>
			<td >Ciśnienie wewnątrzczaszkowe (mm Hg)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Myszy</td>
			<td >3</td >
			<td >5</td >
			<td >5-10</td>
			<td >5-20</td>
			<td >30-4025,30</td >
			<td >0.32-0.3525,30</td >
			<td >1.7-225,30</td >
			<td >5.0 +/- 0.528</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Szczury</td>
			<td >5</td >
			<td >5-10</td >
			<td >10-30</td >
			<td >10-200 (20-75)</td >
			<td >15025</td >
			<td >1.7-2.825</td >
			<td >2-2.6625</td >
			<td >8.6 +/- 1.7,27</td >
		</tr>
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Podsumowanie objętości wewnątrzotrzewkowych (IT) w odcinku lędźwiowym dla myszy i szczurów w różnym wieku. Wartości pogrubione są zalecane i zostały podane bezpiecznie. Maksymalne możliwe objętości nie zostały formalnie ocenione. Dodatkowe informacje na temat znanych parametrów płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) — objętości całkowitej, tempa produkcji, wymiany i ciśnienia wewnątrzczaszkowego — u myszy i szczurów zostały zamieszczone w celach referencyjnych.
W całej dziedzinie brakuje wiedzy na temat górnego progu objętości jednorazowych iniekcji bolusowych do przestrzeni intratekalnej (IT). U dorosłych ludzi, szczurów i myszy, w przypadku których objętość płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) jest znana, wzrost całkowitej objętości CSF o 30% nie wydaje się powodować chronicznych obrażeń ani schorzeń31,33,35,36. Brak znanych objętości CSF u myszy młodocianych lub noworodków sprawia, że podobna ekstrapolacja jest niemożliwa. Niektóre grupy badawcze zaczynają analizować objętość i produkcję CSF u młodszych zwierząt37. Dopóki dodatkowe badania w tych obszarach nie zostaną potwierdzone, objętość iniekcji będzie nadal zależeć od wartości raportowanych przez badaczy.
Myszy i szczury, zwłaszcza gdy są poddawane zabiegom w młodym wieku lub przy zastosowaniu dużych objętości iniekcji, mogą wykazywać napinanie mięśni, wyprost kończyn, przyspieszony oddech lub tymczasowy paraliż kończyn tylnych, który powinien ustąpić samoistnie w ciągu kilku minut. W ekstremalnych przypadkach gwałtowne wzrosty ICP mogą powodować zaburzenia układu sercowo-naczyniowego i oddechowego, co może być śmiertelne32,33. Jeśli jakiekolwiek nieprawidłowości pozabiegowe utrzymują się po 24 h, myszy/szczury należy wycofać z badania i humanitarnie uśpić. Trwały paraliż kończyn tylnych może wystąpić, jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, uszkadzając rdzeń kręgowy. Może to być wynikiem częstego błędu podczas wykonywania iniekcji IT do odcinka lędźwiowego: przesunięcia strzykawki po odruchu cofnięcia ogona podczas naciskania tłoka. Należy unikać poruszania strzykawką i igłą. Jeśli podczas pierwszej punkcji nie uda się uzyskać prawidłowej pozycji, można podjąć drugą próbę w tym samym miejscu. Jeśli druga próba również okaże się nieudana, należy spróbować zmienić położenie igły, aby celować w kolejną przestrzeń międzykręgową. Należy pamiętać, że wielokrotne nakłucia mogą prowadzić do wycieku treści podczas późniejszej, udanej iniekcji.
Osiągnięcie biegłości w wykonywaniu lędźwiowych iniekcji dokanałowych (IT) może wymagać czasu. Aby ćwiczyć iniekcje jako procedurę końcową, należy postępować zgodnie z powyższym protokołem, używając zatwierdzonego roztworu barwnika, takiego jak błękit Evansa lub zielony barwnik McCormick filtrowany przez filtr 0,2 mikrona (Rycina 3) lub stosując środki farmakologiczne omówione w sekcji Reprezentatywne wyniki. Zaleca się stosowanie barwnika w celu rozwiązywania problemów i opanowania techniki iniekcji, ponieważ w ciągu 1 min można łatwo stwierdzić, czy iniekcja zakończyła się sukcesem, czy niepowodzeniem. Ćwiczenia z barwnikiem są przeznaczone wyłącznie do procedur nieprzeżywalnych, ponieważ zwierzęta mogą wystąpić reakcję na barwnik przy bezpośrednim podaniu do OUN. Reakcja ta może wystąpić w ciągu minuty od udanej iniekcji i charakteryzuje się gwałtownym swędzeniem i ruchami wirowania. Po zaobserwowaniu tej reakcji zwierzęta należy natychmiast poddać eutanazji, aby zminimalizować dyskomfort. Po udanej ćwiczeniowej iniekcji z barwnikiem, barwnik pozostanie zlokalizowany w kręgosłupie (brak barwnika w pobliskich tkankach obwodowych) i będzie przemieszczać się w górę kolumny kręgosłupa do móżdżku, mózgu i opuszki węchowej. W dniu P1 skóra jest na tyle przezroczysta, że można zauważyć przemieszczanie się barwnika w dół kolumny kręgosłupa w ogonie. Jeśli barwnik nie dotrze do mózgu w ciągu kilku minut, iniekcja jest nieudana.
<img alt="Analiza morfologii mózgu, anatomia porównawcza, okazy mózgu barwione na zielono, badanie laboratoryjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Barwnik McCormick green w mózgu po udanych ćwiczeniach z iniekcji IT w odcinek lędźwiowy. Wszystkie mózgi pochodzą od myszy P21, którym wstrzyknięto 5 µL barwnika; przedstawiono je w widoku brzusznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Dodatkowe informacje na temat istotnych parametrów powiązanych z projektowaniem badań przedklinicznych, takich jak miano wirusa i dawki, znajdują się w wcześniej opublikowanych przeglądach3,6,31.

Wyzwanie w leczeniu chorób neurologicznych, które wymagają globalnego dostarczania ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ale poza tym są dobrymi kandydatami do terapii genowej, zostało w dużej mierze przypisane nieefektywnemu celowaniu w OUN i odpowiednie typy komórek1. Prowadzona jest znaczna liczba badań mających na celu optymalizację globalnego ukierunkowania na komórki i tkanki OUN za pomocą inżynieryjnych pojazdów dostawczych1,2. Jednak dość powszechne dostarczanie wektorów może być nadal osiągnięte przy użyciu obecnej technologii wektorów terapii genowej, przy użyciu pewnych kombinacji wektorów wirusowych i dróg podawania3,4. Obecnie złotym standardem w uzyskiwaniu powszechnego dostarczania do OUN z jednorazowego leczenia jest stosowanie wirusa związanego z adenowirusem serotypu 9 (AAV9) wraz z bezpośrednim wstrzyknięciem do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
Istnieją trzy typowe drogi podania dla bezpośrednich iniekcji płynu mózgowo-rdzeniowego: dokanałowa lędźwiowa (IT), domózgowo-komorowa (ICV) i dożerczo-piersiowa (ICM)5. Każda z tych dróg podania powoduje różne wzorce biodystrybucji w OUN i tkankach obwodowych, ale wszystkie mają tę zaletę, że omijają barierę krew-mózg (BBB), aby dotrzeć do komórek w OUN, które przyczyniają się do patologii i fenotypów chorób neurologicznych6. Wstrzyknięcie IT w odcinku lędźwiowym jest standardem w klinicznym podawaniu leków u ludzi, ponieważ procedura kliniczna jest rutynowa i prosta, z mniejszą inwazyjnością w porównaniu z iniekcjami ICV i ICM.
Zastrzyk IT w odcinku lędźwiowym jest powszechnie stosowaną techniką w dziedzinie środków znieczulających i przeciwbólowych, z pierwszą pracą opublikowaną w 1885 roku7. Pierwszy protokół zastrzyków IT w odcinku lędźwiowym u dorosłych myszy został opublikowany w 1980 roku8 i od tego czasu został szeroko przyjęty i zrecenzowany9. Wprowadzono drobne poprawki lub ulepszenia do tych protokołów10,11,12, w tym technikę oszczędzania produktu13. Protokoły dotyczące iniekcji IT w odcinku lędźwiowym u dorosłych szczurów zostały również po raz pierwszy opublikowane w 1976 roku, z cewnikowaniem do przewlekłego podawania14 i bezpośrednim wstrzyknięciem do jednorazowych zabiegów15. Niedawno grupy opublikowały protokoły dotyczące iniekcji IT w odcinku lędźwiowym u noworodków lub młodych myszy i szczurów16,17.
Szerokie zastosowanie i walidacja tej techniki omijania bariery krew-mózg i komórek docelowych w OUN doprowadziła do wielu udanych badań przedklinicznych i klinicznych nad terapią genową w leczeniu chorób neurologicznych. Pozytywne dane dotyczące skuteczności i bezpieczeństwa u myszy, szczurów i naczelnych modelujących choroby neurologiczne wzbudziły zainteresowanie i ekscytację wokół potencjalnych korzyści klinicznych dla tych chorób18,19,20,21,22,23. Kilka z tych badań jest obecnie w fazie badań klinicznych (na przykład identyfikatory clinicaltrials.gov NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 i NCT05518188)3,6. W tym artykule opisano prosty protokół wstrzykiwań IT w odcinku lędźwiowym u myszy i szczurów w różnym wieku, bez usuwania płynu mózgowo-rdzeniowego, który można zastosować w projektach translacyjnej terapii genowej. Ten protokół jest podobny do już dostępnych protokołów, które są powszechnie stosowane; Warto jednak przytoczyć te odpowiednie protokoły w jednym miejscu, aby uzyskać łatwy dostęp i odniesienie, wraz z towarzyszącymi wizualizacjami wideo. Protokół ten wyjaśnia wstrzyknięcie dla nowonarodzonych myszy i szczurów w dniu pourodzeniowym (P) 0-1 oraz młodych myszy i szczurów <P10, a także dla myszy i szczurów >P21, z reprezentatywnymi wynikami udanego i nieudanego wstrzyknięcia IT w odcinku lędźwiowym w P1 u myszy. W dyskusji omówiono typowe błędy i konkretne szczegóły, które wymagają szczególnej uwagi podczas wykonywania tej procedury, a także zalecenia dotyczące sposobu ćwiczenia tych zastrzyków przed rozpoczęciem badania przedklinicznego.

<table><tbody><tr><td>Filtr 0,2 mikrona</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>67005</td><td>Służy do filtrowania roztworu barwnika</td></tr><tr><td>od 0,5 do 10 i mikro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690026</td><td>Służy do odmierzania roztworu do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>1,5 ml Microtube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>Służy do przechowywania roztworów iniekcyjnych</td></tr><tr><td>10 &mikro; L Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>Objętość wstrzyknięcia nie powinna być mniejsza niż 10% pojemności strzykawki</td></tr><tr><td>od 10 do 100 &mikro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690029</td><td>Służy do odmierzania roztworu iniekcyjnego</td></tr><tr><td>10&micro; l Końcówki do pipet</td><td>USA Scientific Inc</td><td>11203810</td><td>Służy do odmierzania roztworu do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>100 i mikro; L Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td>Tylko dla szczurów >21. Objętość wstrzyknięcia nie powinna być mniejsza niż 10% pojemności strzykawki</td></tr><tr><td>100 &mikro; L Końcówki do pipet</td><td>USA Scientific Inc</td><td>11231840</td><td>Służy do odmierzania roztworu do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>25 i mikro; L Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>Idealna dla 5-10 i mikro; L-zastrzyki. Objętość wstrzyknięcia nie powinna być mniejsza niż 10% pojemności strzykawki</td></tr><tr><td>27 Igła(y)</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>Tylko dla szczurów >21. Rozmiar 27, Igła RN z małą piastą, 1 cal, styl punktowy 4 przy 12&deg;,</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze</td> 6/PK <td>30Hamilton</td><td>7803-17</td><td>o rozmiarze 30, Mała igła RN z piastą, 0,5 cala, styl punktowy 4 przy 12&deg;, 6/PK</td></tr><tr><td>50 &mikro; L Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>Tylko dla szczurów >21. Objętość wstrzyknięcia nie powinna być mniejsza niż 10% pojemności strzykawki</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000140</td><td>Służy do dezynfekcji miejsca pracy i sprzętu</td></tr><tr><td>70% Podkładki przygotowawcze z alkoholem izopropylowym</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td>Służy do przygotowania miejsca</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> wstrzyknięcia <td>Tylko dla szczurów >21.</td></tr><tr><td>Środek znieczulający (izofluran)</td> <td>Piramal Critical Care</td><td>66794001725</td><td>Tylko dla szczurów >21.</td></tr><tr>Produkty <td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>6906606</td><td>Tylko dla szczurów >21. Używany do przygotowania skóry</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>kontrolny Roztwór do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Roztwór barwnika (zielony)</td><td>McCormick</td><td></td><td>Do ćwiczeń, tylko niezwiązane z przetrwaniem</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>Kimberly-Clark</td><td>19-149-863B</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Wiadro na lód z lodem</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-395-150</td><td>Utrzymuj roztwór wektora wirusowego na lodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcze do komarów (zakrzywione lub proste)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>Tylko dla szczurów >21. Służy do badania palpacyjnego przestrzeni międzykręgowej.</td></tr><tr><td>Uchwyty do igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>Tylko dla szczurów >21. Służy do zamykania skóry za pomocą szwu</td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>Berkshire</td><td>18-998-123</td><td>Służy do krępowania dorosłych myszy podczas wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>StatLab</td><td>PM996</td><td>Służy do pobierania roztworu do strzykawki</td></tr><tr><td>Retraktory</td><td>Stoelting</td><td>52124P</td><td>Tylko dla szczurów >21. Służy do przytrzymywania otwartego nacięcia skóry</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td>Tylko dla szczurów >21. Służy do nacinania</td></tr><tr><td>Rękojeść ostrza skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Tylko dla szczurów >21. Używany do nacięcia</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td>Służy do filtrowania roztworu barwnika</td></tr><tr><td>Peeling chirurgiczny (przygotowanie skóry)</td><td>Medline Industries Inc.</td><td>MDS098720</td><td>Tylko dla szczurów >21. Służy do przygotowania skóry</td></tr><tr><td>Klipsy do szwów lub ran</td><td>Stoelting</td><td>50483</td><td>Tylko dla szczurów >21. Służy do zamykania skóry.</td></tr><tr><td>Roztwór do czyszczenia strzykawek / igieł</td><td>Hamilton</td><td>18311</td><td>Można użyć alternatywnego roztworu czyszczącego</td></tr><tr><td>Kleszcze do kciuków</td><td>Fine Science Tools</td><td>11019-12</td><td>Tylko dla szczurów >21. Stosowany podczas całego dostępu chirurgicznego i zamykania</td></tr><tr><td>Vector Solution</td><td></td><td></td><td>Roztwór do wstrzykiwań</td></tr></tbody></table>

lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Lumbar Intrathecal Injection of Gene Therapy Vectors for Central Nervous System Targeting in Mice and Rats

Jedną z metod leczenia chorób neurologicznych jest wykorzystanie dokanałowej drogi podawania w odcinku lędźwiowym. Takie podejście omija barierę krew-mózg, aby uzyskać bezpośredni dostęp do płynu mózgowo-rdzeniowego i preferencyjnie celować w komórki w ośrodkowym układzie nerwowym. Wiele opublikowanych badań przedklinicznych wykorzystujących lędźwiową drogę iniekcji dooponowej przyczyniło się do opracowania badań klinicznych terapii genowej; Jednak opisane protokoły są zmienne i rozproszone w wielu zasobach. W tym miejscu przedstawiono kompleksowy zestaw protokołów dokanałowych wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów do przedklinicznych badań terapii genowej. Przy odpowiednim przeszkoleniu ta technika iniekcji może być wykonana szybko i niezawodnie. Oprócz szczegółowego omówienia protokołu iniekcji na każdym etapie rozwoju, omówiono powiązane parametry, takie jak objętość wstrzyknięcia, które mogą mieć wpływ na wyniki badania. Aby zademonstrować zastosowanie dokanałowych wstrzyknięć lędźwiowych do ośrodkowego układu nerwowego, przedstawiono ekspresję serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w mózgu, rdzeniu kręgowym i tkankach obwodowych po udanym lub nieudanym wstrzyknięciu.

Chociaż na transdukcję wektora w terapii genowej może wpływać wiele czynników, barwienie histologiczne tkanek pozostaje najdokładniejszą metodą określania sukcesu doksytrakalnych (IT) iniekcji lędźwiowych. Szeroki i równomierny rozkład wektora terapii genowej w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) po iniekcji świadczy o powodzeniu procedury. Rycina 2C przedstawia udaną iniekcję samouzupełniającej terapii genowej opartej na AAV9, sterującej słabą, powszechną ekspresją transgenu pod promotorem JeT w dawce 1.3 × 1011 vg/mysz u noworodkowych myszy (P1), 4 miesiące po iniekcji. Analiza RNAscope z wykorzystaniem sondy skierowanej przeciwko transgenowi dostarczonemu w ramach terapii genowej wykazuje szeroki rozkład w lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego, szyjnym odcinku rdzenia kręgowego oraz w mózgu. Do analizy włączono przekrój wątroby i serca, aby podkreślić, że nawet przy bezpośredniej iniekcji do płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR), wektor terapii genowej może nadal rozpowszechniać się w tkankach obwodowych.
<img alt="Przekroje histologiczne mózgu myszy, oznaczone A-C, wykazujące różnice strukturalne; analiza schematyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Barwione 5-mikronowe przekroje tkankowe OUN i tkanek obwodowych myszy 4 miesiące po wstrzyknięciu w dniu P1. Czerwone barwienie wskazuje ekspresję transgenu metodą RNAscope, a niebieskie przeciwbarwienie jąder wykonano hematoksyliną. (A) Wstrzyknięcie kontrolnego buforu formulacyjnego. (B) Nieudane wstrzyknięcie doparenchymalne z wektorem AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Udane wstrzyknięcie dokanałowe (IT) w odcinku lędźwiowym z wektorem AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). Wektor terapii genowej użyty w (B) i (C) podano w dawce istotnej translacyjnie wynoszącej 1.3E11 vg/mysz. Pasek skali: górny panel (5 mm); dolny panel (1 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Skupiona ekspresja w lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego przy jednoczesnym braku ekspresji w mózgu, co pokazano na Rysunku 2B, może wskazywać na wstrzyknięcie śródmiąższowe do rdzenia kręgowego i powinno być uznane za nieudany zabieg. Dzieje się tak, gdy igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko do kanału kręgowego, poza przestrzeń intratekalną, bezpośrednio do rdzenia kręgowego. Ponadto, bardzo niska lub brak ekspresji w rdzeniu kręgowym i mózgu (nie pokazano) również powinny być uznane za nieudane wstrzyknięcie poza cel, przy założeniu zastosowania wektora i dawki, przy których oczekiwana jest szeroka dystrybucja w OUN. Może to wynikać z niewystarczającego wprowadzenia igły lub z umiejscowienia jej bocznie względem linii środkowej.
Wzorce ekspresji obserwowane po udanych iniekcjach mogą się różnić w zależności od następujących ośmiu przykładowych czynników: (1) wieku w momencie iniekcji, (2) istniejącej odporności, (3) szybkości infuzji, (4) wektora terapii genowej, (5) dawki terapii genowej, (6) białek powierzchniowych komórek, (7) tropizmu oraz (8) w razie potrzeby, odpowiedniego wyboru promotora sterującego ekspresją transgenu6. Mimo że wzorce ekspresji mogą się różnić, szeroka, równomierna i rozległa dystrybucja będzie uniwersalna, pod warunkiem zastosowania wystarczająco wysokiej dawki skutecznego wektora, takiego jak AAV9.
Głównymi ograniczeniami wykorzystania analizy histologicznej do potwierdzenia sukcesu wstrzyknięcia dopochyłkowego (IT) w odcinku lędźwiowym są długie czasy oczekiwania – aż do zakończenia badania, wykonania nekropsji i pobrania tkanek – oraz znaczne zasoby potrzebne do przetworzenia tkanek od wszystkich myszy w dużym badaniu nad terapią genową. Niestety, nasze doświadczenie pokazuje, że bezpośrednie i natychmiastowe wskaźniki prawidłowego lub nieprawidłowego wstrzyknięcia mogą być niewiarygodne; jednakże odruch cofania ogona w momencie wniknięcia igły do przestrzeni dopochyłkowej jest dobrym wskaźnikiem prawidłowego rozmieszczenia igły w czasie rzeczywistym i prawdopodobnie świadczy o udanym wstrzyknięciu. Nie należy mylić drgnięcia podczas przebijania skóry u nieznieczulonej myszy lub szczura z reakcją cofania ogona w odpowiedzi na wniknięcie igły do przestrzeni dopochyłkowej. Doniesiono, że stosowanie środków farmakologicznych, takich jak NMDA, substancja P i lidokaina, zarówno w celach szkoleniowych, jak i w mieszance z eksperymentalnym roztworem do wstrzyknięcia, pozwala na szybsze potwierdzenie sukcesu procedury9,11,24. W przypadku rozważania stosowania tych środków ważne jest ocenienie ich kompatybilności z wektorem terapii genowej.

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

One method to target the central nervous system for treating neurological diseases involves utilizing the lumbar intrathecal route of administration. This ...

Nasze laboratorium opracowuje terapie genowe dla rzadkich chorób neurologicznych u dzieci, wykorzystując platformę dostarczania genów pożywki przedsionkowo-jelitowej w połączeniu z bezpośrednim wstrzyknięciem płynu mózgowo-rdzeniowego. Oceniamy potencjał terapeutyczny w modelach przedklinicznych, aby awansować obiecujących kandydatów do badań klinicznych. W badaniach przedklinicznych dotyczących rzadkich schorzeń neurologicznych, w tym paraplegii spastycznej 50 i gigantycznej neuropatii aksonalnej i zespołu RET, wykazaliśmy, że dokanałowe dostarczanie genów jest bezpieczne i skuteczne w łagodzeniu fenotypów choroby u myszy. Terapie te są obecnie w fazie 1, 2 badań klinicznych. Nasze laboratorium będzie nadal współpracować z grupami wsparcia pacjentów w celu opracowania skutecznych metod leczenia dzieci z rzadkimi zaburzeniami genetycznymi. Równolegle pracujemy nad nowymi kapsydami AAV, które, mamy nadzieję, zwiększą skuteczność tych terapii.[Narrator] Na początek zbierz wymagane sterylne materiały, w tym strzykawkę i igłę, pipetę i roztwór do wstrzykiwań. Za pomocą pipety o pojemności mikrolitrów odmierz żądaną objętość roztworu do wstrzykiwań i przenieś ją na sterylną folię parafinową. Pobrać roztwór do mikrolitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 i średnicy 0,5 cala. Teraz, używając dominującej ręki, przytrzymaj przytomną mysz za ogon na ręczniku papierowym. Ręką niedominującą złóż część ręcznika papierowego na głowie i górnej części ciała myszy i mocno chwyć obręcz miedniczną między kciukiem a palcem wskazującym. Delikatnie obróć podstawę ogona, aby prawidłowo wyrównać kręgosłup myszy i rozdzielić włosy około dwóch do sześciu milimetrów czaszki do grzebienia biodrowego, aby uwidocznić miejsce wstrzyknięcia. Zbadaj palpacyjnie obszar, w którym należy wyczuć przestrzeń międzykręgową L4, L5 lub L5, L6, znajdującą się około dwóch do sześciu milimetrów czaszki do grzebienia biodrowego. Przytrzymaj środek strzykawki mikrolitrowej dominującą ręką i ustaw ją prostopadle do kręgosłupa myszy w przestrzeni międzykręgowej L4, L5 lub L5, L6. Ze skosem igły skierowanym w stronę głowy myszy nakłuj skórę nad przestrzenią międzykręgową. Gdy igła dotknie krawędzi kostnych przestrzeni międzykręgowej, zmniejsz kąt strzykawki do 30 do 45 stopni. Po całkowitym wciśnięciu tłoka należy przytrzymać strzykawkę na miejscu przez 15 do 30 sekund, aby roztwór rozproszył się i zapobiec cofaniu się. Następnie płynnie i powoli wyjmować strzykawkę pod tym samym kątem wejścia od 30 do 45 stopni. Na koniec uwolnij mysz z uwięzi i umieść ją z powrotem w klatce domowej. Przygotuj się do zabiegu, jak pokazano wcześniej. Używając dominującej ręki, przytrzymaj młodocianą mysz za ogon na ręczniku papierowym. Delikatnie, ale stanowczo chwyć obręcz miedniczną między niedominującym kciukiem a palcem wskazującym i obróć podstawę ogona, aby zapewnić prawidłowe ułożenie kręgosłupa. Przetrzyj grzbietowy odcinek lędźwiowy zwierzęcia wacikiem nasączonym 70% alkoholem, aby zdezynfekować ten obszar. W razie potrzeby rozchyl włosy na około jeden do trzech milimetrów czaszki od grzebienia biodrowego. aby pomóc w wizualizacji miejsca wstrzyknięcia. Poczuj lub wizualizuj przestrzeń międzykręgową L4, L5 lub L5, L6 około jednego do trzech milimetrów czaszki od grzebienia biodrowego. Używając dominującej ręki, przytrzymaj środek strzykawki mikrolitrowej i ustaw ją pod kątem od 30 do 45 stopni do grzbietu myszy. Ze skosem igły skierowanym do góry, nakłuj skórę około jednego do trzech milimetrów od rozpieszczenia do przestrzeni międzykręgowej. Wstrzyknąć roztwór i zakończyć procedurę, jak pokazano wcześniej, Szeroki i równomierny rozkład wektora terapii genowej w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym w mózgu, szyjnym rdzeniu kręgowym i lędźwiowym rdzeniu kręgowym zaobserwowano w udanych wstrzyknięciach cztery miesiące po wstrzyknięciu. Skoncentrowana ekspresja w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego z brakiem ekspresji w mózgu wskazywała na nieudane wstrzyknięcie z powodu intraparenchymalnego celowania w rdzeń kręgowy. Mózgi myszy, którym wstrzyknięto barwnik dla praktyki, wykazywały widoczne zielone zabarwienie, wskazujące na pomyślne dostarczenie wstrzykniętego roztworu do ośrodkowego układu nerwowego.

lumbar-intrathecal-injection-gene-therapy-vectors-for-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Chen, Y., et al. Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje dostarczanie badanego związku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez cewnik wszczepiony w odcinek lędźwiowy kręgosłupa modelu szczurzego. Związek krąży wzdłuż płynu mózgowo-rdzeniowego do mózgu i rdzenia kręgowego, wnika do neuronów i oferuje potencjał terapeutyczny.

Dokanałowe podawanie badanego związku do ośrodkowego układu nerwowego szczura

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Poznaj metodę lędźwiowych wstrzyknięć dooponowych wektorów terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego u myszy i szczurów. Technika ta umożliwia skuteczne dostarczanie leków w badaniach przedklinicznych.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Przeglądaj więcej filmów