Name: Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę zakażenia sosen nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus w warunkach in vitro i in vivo oraz izolacji indukowanych substancji lotnych. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi gospodarza na fitopasozyty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez UE w ramach projektu PurPest na podstawie umowy o udzielenie dotacji 101060634, oraz przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), poprzez projekty NemACT, DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002; NemaWAARS, DOI 10.54499/PTDC/ASP-PLA/1108/2021; CESAM UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020; CE3C, DOI 10.54499/UIDB/00329/2020; GREEN-IT, DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 oraz 10.54499/UIDP/04551/2020.

Optimizing Pinewood Nematode Infection in Pinus pinaster

<ol><li>Back, M. A., Bonifácio, L., Inácio, M. L., Mota, M., Boa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+A+global+threat+to+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: A global threat to forestry.</a> Plant Pathol. 73 (5), 1026-1041 (2024).</li>
<li>Mumm, R., Hilker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+chemical+defence+of+pine+against+folivorous+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect chemical defence of pine against folivorous insects.</a> Trend Plant Sci. 11 (7), 351-358 (2006).</li>
<li>Carrasquinho, I., Lisboa, A., Inácio, M. L., Gonçalves, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+susceptibility+to+pine+wilt+disease+of+maritime+pine+%28Pinus+pinaster+Aiton%29+half-sib+families%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Forest+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in susceptibility to pine wilt disease of maritime pine (Pinus pinaster Aiton) half-sib families.</a> Annals Forest Sci. 75 (3), 85(2018).</li>
<li>Gaspar, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+pinewood+nematode+on+naturally-emitted+volatiles+and+scCO2+extracts+from+Pinus+pinaster+branches%3A+a+comparison+with+P.+pinea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Supercritical+Fluids%22%5BJournal%5D)">Impact of the pinewood nematode on naturally-emitted volatiles and scCO2 extracts from Pinus pinaster branches: a comparison with P. pinea.</a> J Supercritical Fluids. 159, 104784(2020).</li>
<li>Rodrigues, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinus+halepensis%2C+Pinus+pinaster%2C+Pinus+pinea+and+Pinus+sylvestris+essential+oils+chemotypes+and+monoterpene+hydrocarbon+enantiomers%2C+before+and+after+inoculation+with+the+pinewood+nematode+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodiver%22%5BJournal%5D)">Pinus halepensis, Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus sylvestris essential oils chemotypes and monoterpene hydrocarbon enantiomers, before and after inoculation with the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus.</a> Chem Biodiver. 14 (1), e1600153(2017).</li>
<li>Faria, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+co-cultures+of+Pinus+pinaster+with+Bursaphelenchus+xylophilus%3A+a+biotechnological+approach+to+study+pine+wilt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease.</a> Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).</li>
<li>Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., García-Lara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+plant+tissue+culture%3A+means+for+production+of+biological+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds.</a> Planta. 248 (1), 1-18 (2018).</li>
<li>Bonga, J. M., von Aderkas, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonga%2C+JM+%22In+Vitro+Culture+of+Trees%22">In Vitro Culture of Trees</a>. , Springer. Netherlands, Dordrecht. (1992).</li>
<li>Faria, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematotoxic+and+phytotoxic+activity+of+Satureja+montana+and+Ruta+graveolens+essential+oils+on+Pinus+pinaster+shoot+cultures+and+P.+pinaster+with+Bursaphelenchus+xylophilus+in+vitro+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Indus+Crops+Prod%22%5BJournal%5D)">Nematotoxic and phytotoxic activity of Satureja montana and Ruta graveolens essential oils on Pinus pinaster shoot cultures and P. pinaster with Bursaphelenchus xylophilus in vitro co-cultures.</a> Indus Crops Prod. 77, 59-65 (2015).</li>
<li>Vallarino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+volatile+compounds+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+%28GC-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Metabol.+Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).</a> Plant Metabol. Meth Mol Biol. , 225-239 (2018).</li>
<li>Kikuchi, T., Aikawa, T., Oeda, Y., Karim, N., Kanzaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+precise+diagnostic+method+for+detecting+the+pinewood+nematode+Bursaphelenchus+xylophilus+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification.</a> Phytopathology. 99 (12), 1365-1369 (2009).</li>
<li>Faria, J. M. S., Barbosa, P., Bennett, R. N., Mota, M., Figueiredo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+against+Bursaphelenchus+xylophilus%3A+Nematotoxics+from+essential+oils%2C+essential+oils+fractions+and+decoction+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactivity against Bursaphelenchus xylophilus: Nematotoxics from essential oils, essential oils fractions and decoction waters.</a> Phytochemistry. 94, 220-228 (2013).</li>
<li>Nickle, W. R., Golden, A. M., Mamiya, Y., Wergin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+taxonomy+and+morphology+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus+%28Steiner+%26Buhrer+1934%29+Nickle+1970%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner &Buhrer 1934) Nickle 1970.</a> J Nematol. 13 (3), 385-392 (1981).</li>
<li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples%3A+baermann+funnel+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">On the methodology of nematode extraction from field samples: baermann funnel modifications.</a> J Nematol. 15 (3), 438-444 (1983).</li>
<li>IPPC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPPC+DP+10%3A+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+protocols%2C+International+standard+for+phytosanitary+measures%22%5BJournal%5D)">IPPC DP 10: Bursaphelenchus xylophilus.</a> Diagnostic protocols, International standard for phytosanitary measures. 27, 1-40 (2016).</li>
<li>Rodrigues, A. M., Carrasquinho, I., António, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+metabolite+adjustments+associated+with+pinewood+nematode+Resistance+in+Pinus+pinaster%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Primary metabolite adjustments associated with pinewood nematode Resistance in Pinus pinaster.</a> Front Plant Sci. 12, 10(2021).</li>
<li>Gonçalves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Monochamus+galloprovincialis+feeding+on+Pinus+pinaster+and+Pinus+pinea%2C+oleoresin+and+insect+volatiles%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Monochamus galloprovincialis feeding on Pinus pinaster and Pinus pinea, oleoresin and insect volatiles.</a> Phytochemistry. 169, September 2019 112159(2020).</li>
<li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+J+Botany%22%5BJournal%5D)">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).</li>
<li>Tereso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+axillary+and+adventitious+bud+regeneration+from+Portuguese+genotypes+of+Pinus+pinaster+AIT%5BTitle%5D)+AND+%22Propag+Ornam+Plants%22%5BJournal%5D)">Improved axillary and adventitious bud regeneration from Portuguese genotypes of Pinus pinaster AIT.</a> Propag Ornam Plants. 6 (1), 24-33 (2006).</li>
<li>Council of Europe European Directorate for the Quality of Medicines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22European+Pharmacopoeia%22">European Pharmacopoeia</a>. , 241(2010).</li>
<li>Likens, S. T., Nickerson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+certain+hop+oil+constituents+in+brewing+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Ann+Meet+-+Am+Soc+Brewing+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of certain hop oil constituents in brewing products.</a> Proc Ann Meet - Am Soc Brewing Chem. 22 (1), 5-13 (1964).</li>
<li>Karimi, A., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+innovative+headspace+collection+technique%3A+volatile+organic+compound+patterns+emitted+by+different+developmental+stages+of+Halyomorpha+halys%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Horti%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an innovative headspace collection technique: volatile organic compound patterns emitted by different developmental stages of Halyomorpha halys.</a> Front Horti. 3, (2024).</li>
<li>Koedam, A., Scheffer, J. J. C., Baerheim Svendsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+isolation+procedures+for+essential+oils+-+II.+Ajowan%2C+Caraway%2C+Coriander+and+Cumin%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Lebensmittel-Untersuchung+und+-Forschung%22%5BJournal%5D)">Comparison of isolation procedures for essential oils - II. Ajowan, Caraway, Coriander and Cumin.</a> Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. 168 (2), 106-111 (1979).</li>
<li>Abdulra'uf, L. B., Hammed, W. A., Tan, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPME+fibers+for+the+analysis+of+pesticide+residues+in+fruits+and+vegetables%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">SPME fibers for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables: A review.</a> Crit Rev Anal Chem. 42 (2), 152-161 (2012).</li>
<li>Gross, J., Gallinger, J., Rid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+identification%2C+and+statistical+analysis+of+volatile+organic+compound+patterns+emitted+by+phytoplasma+infected+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Collection, identification, and statistical analysis of volatile organic compound patterns emitted by phytoplasma infected plants.</a> Methods Mol Biol. 1875, 333-343 (2019).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISO+7609%3A1985+Essential+Oils-Analysis+by+Gas+Chromatography+on+Capillary+Columns-General+Method%5BTitle%5D)+AND+%22ISO%3A+Geneva%2C+Switzerland%22%5BJournal%5D)">ISO 7609:1985 Essential Oils-Analysis by Gas Chromatography on Capillary Columns-General Method.</a> ISO: Geneva, Switzerland. , (1985).</li>
<li>Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+oils+and+volatiles%3A+Sample+preparation+and+analysis.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Flav+Fragr+J%22%5BJournal%5D)">Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review.</a> Flav Fragr J. 25 (5), 282-290 (2010).</li>
<li>Fielding, N. J., Evans, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophilus+%28Steiner+and+Buhrer%29+nickle+%28%3D+B.+lignicolus+Mamiya+and+Kiyohara%29%3A+An+assessment+of+the+current+position%5BTitle%5D)+AND+%22Forestry%22%5BJournal%5D)">The pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) nickle (= B. lignicolus Mamiya and Kiyohara): An assessment of the current position.</a> Forestry. 69 (1), 34-46 (1996).</li>
<li>Faria, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+on+the+synergistic+interaction+between+essential+oils+against+the+pinewood+nematode+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">First report on the synergistic interaction between essential oils against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus.</a> Plants. 12 (13), 2438(2023).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia ulepszoną metodologię analizy lotnych związków w sosnie nadmorskiej zakażonej węgorkiem sosnowcem, w których zmienność środowiskowa i genetyczna jest zmniejszona i nie ma wpływu na wyniki. Wykorzystując czyste linie genotypów sosny morskiej in vitro , wyekstrahowane i wyemitowane substancje lotne mogą być analizowane jako odpowiedź gospodarza na jedno z najbardziej szkodliwych zagrożeń biotycznych dla lasów sosnowych.
Utrzymanie kultur referencyjnych lub wzrost dużych ilości węgorka sosnowca można łatwo przeprowadzić w laboratorium, hodując in vitro B. cinerea (szczep niezarodnikujący) i wykorzystując go jako źródło pożywienia dla nicieni. Ta procedura jest zwykle bardzo dostępna, przy odpowiednich warunkach; jednak podczas pipetowania zawiesiny węgorka sosnowca należy pamiętać o zniszczeniu powierzchni kolonii grzybów. W przeciwnym razie węgorki sosnowce zostaną zatrzymane w kropelkach wody. Gdy się powiedzie, grzybnia grzybów zostanie zużyta, a węgorki sosnowce znacznie się rozmnożą. Sterylizacja nicieni jest krytycznym etapem, ale po uzyskaniu sterylnych węgorków sosnowca kultura może być albo utrzymywana w B. cinerea, będącej wówczas kulturą monokseniczną zanieczyszczoną tylko tym grzybem, albo na pędach sosny in vitro 6,29.
Zastosowanie 2-letnich sadzonek P. pinaster hodowanych w szklarni ma tę zaletę, że symuluje stan bliższy naturalnym infekcjom PWD; Zmienność jest jednak trudniejsza do kontrolowania 3,5. Współhodowle in vitro pędów P. pinaster z węgorkiem sosnowcem są wyrafinowanym systemem roboczym, który jest bardziej odpowiedni do badań wymagających dokładniejszej kontroli zmienności środowiskowej i biologicznej 6,9. Ich zastosowanie ogranicza się jednak do badań na poziomie tkankowym, np. morfologii ultrastrukturalnej lub mechanizmów regulacji biochemicznej w warunkach stresu biotycznego lub abiotycznego. W innych dziedzinach systemy te oferują ogromny potencjał w śledzeniu drobnych zmian w metabolomie gospodarza, proteomie lub transkryptomie indukowanych przez węgorka sosnowca w pierwszych stadiach infekcji.
Przy zakładaniu pędów sosny in vitro sterylizacja powierzchniowa nasion sosny ucieka się do silnego biocydu; Optymalizacje można jednak przeprowadzić z różnymi wariantami czasu ekspozycji lub środka biobójczego. Okrywy z nasion sosny są na ogół mocne i mogą wytrzymać czysty etanol przez dłuższy czas niż słabsze nasiona. Jednak płyn dyfunduje wewnątrz skorupy, dlatego należy uważać, aby etanol nie dotarł do zarodka. In vitro pędy sosny mogą być również wykorzystywane do utrzymania lub mikrorozmnażania określonych genotypów sosny. Chociaż trudniej jest ustalić w nieskażonym środowisku, materiał nienasienny może być również wykorzystany do założenia kultur pędów in vitro . Jednak rozmnażanie i wzrost mogą być wolniejsze.
Procedury hydrodestylacji i destylacji-ekstrakcji są technikami ekstrakcji lotnej. Pierwsza z nich dostarczy czysty ekstrakt z substancji lotnych sosny, zwany olejkiem eterycznym; Drugi ma tę zaletę, że jednocześnie stosuje się rozpuszczalnik, dzięki czemu można potencjalnie zatrzymać lżejsze cząsteczki, które mają skłonność do ucieczki z powodu wysokich temperatur wrzącej wody. Są to ekstrakty i nie zawsze reprezentują lotne mieszaniny, które rośliny emitują do środowiska. Te substancje lotne w przestrzeni nad powierzchnią są dokładniej próbkowane za pomocą procedur mikroekstrakcji do fazy stałej, np. przy użyciu powlekanych włókien lub wypełnionych probówek. Pomimo stosowania wrzącej wody jako środka ekstrakcyjnego, który może indukować tworzenie się artefaktów, procedura hydrodestylacji ma kilka zalet, np. a) brak użycia rozpuszczalników organicznych, co zapewnia czysty ekstrakt, b) umożliwienie określenia plonu, c) uzyskanie ekstraktu wolnego od chlorofilu oraz d) zapewnienie, oprócz olejku eterycznego, dwóch innych ekstraktów, hydrolatu i wody wywarowej, każdy z nich ma swój własny skład i charakterystyczną bioaktywność. Aparat Likensa-Nickersona jest specjalnym urządzeniem destylaccyjno-ekstrakcyjnym, które umożliwia jednoczesną kondensację hydrodestylatu pochodzącego z kolby z materiałem roślinnym oraz rozpuszczalnika organicznego pochodzącego z drugiej kolby. Ponieważ rozpuszczalnik organiczny nie miesza się z wodą i jest od niej lżejszy, jest on widoczny jako supernatant unoszący się nad wodą destylowaną w centralnym syfon separatora w kształcie litery U powyżej zaworu odcinającego aparatu. Fakt, że ramiona powrotne destylatu w pułapce separacyjnej znajdują się na różnych poziomach, pozwala wodzie destylowanej powrócić do kolby z materiałem roślinnym, a ekstrakcyjnemu rozpuszczalnikowi organicznemu na powrót do drugiej kolby. n-Pentan zmienia się z przezroczystego na półprzezroczysty, wskazując na obecność destylatu. Mikroekstrakcja do fazy stałej jest jednym z kilku sposobów zbierania substancji lotnych w przestrzeni nad powierzchnią i może być dostosowana do różnych rodzajów zastosowań i objętości materiału roślinnego w naturze, m.in. w fiolkach, w szklanych eksykatorach i w workach z PTFE17. Wszystkie te procedury ekstrakcji dostarczają uzupełniających się informacji na temat profilu lotnego. Jednak pojedyncze pędy sosny in vitro są małe i mają mniejszą masę, a co za tym idzie mniejszą ilość substancji lotnych w porównaniu z siewkami sosny. W przypadku pędów sosny in vitro destylacja-ekstrakcja jest bardziej odpowiednia do uzyskania wyekstrahowanych substancji lotnych, podczas gdy probówki wypełnione żywicą są bardziej odpowiednie do wychwytywania emitowanych substancji lotnych.

Nicień sosnowy (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, to pasożytniczy nicień roślinny, który głównie pasożytuje na gatunkach Pinus. Ten fitopasożyt jest przenoszony przez owady z rodzaju Monochamus na drzewa wrażliwych gatunków sosny podczas żerowania owada. Węgorek sosnowiec zabija drzewo, atakując jego kanały żywiczne i zmniejszając przepływ żywicy oraz uszkadzając jego tkankę naczyniową, powodując przerwy w słupie wody. Brak wody w koronach drzew wywołuje pierwsze widoczne objawy choroby więdnięcia sosny (PWD), tj. igły sosny stają się chlorotyczne po ustaniu fotosyntezy i opadają z powodu wysuszenia. Sosna generalnie reaguje na stres biotyczny i abiotyczny poprzez produkcję żywicy i związków lotnych1. Dlatego zrozumienie mechanizmów obrony sosny jest ważne dla określenia konkretnych skutków ataków węgorka sosnowca i znalezienia alternatywnych metod zwalczania szkodników2.
Obecnie, eksperymentowanie w warunkach polowych zależy od dostępności zainfekowanych sosen, potwierdzenia infekcji PWN i zmiennych warunków środowiskowych. W warunkach szklarniowych parametry te można łatwiej kontrolować; Jednak różnorodność genetyczna gospodarza staje się silnym źródłem zmienności3. Na przykład w badaniu dotyczącym odpowiedzi na oporność Pinus pinaster produkcja terpenu limonenu i kwasów żywicznych była związana z zakażeniem PWN4. Jednak ze względu na małą liczbę próbek i zmienność warunków naturalnych, wykrywalne zmiany zarejestrowano tylko dla połowy próbek. W innym badaniu, w którym wykorzystano sadzonki sosny uprawianej w szklarni, mimo że warunki środowiskowe były łatwiejsze do kontrolowania, naturalna różnorodność genetyczna sosny wywołała dużą zmienność w ekstrahowanych substancjach lotnych5. Ponieważ na substancje lotne sosny wywołane chorobą może mieć duży wpływ zmienność środowiskowa i genetyczna, zastosowanie kultur pędów in vitro jest dobrą alternatywą dla badań nad chemiczną i biochemiczną reakcją tkanki sosny na zakażenie węgorkiem sosnowca5,6. Rozmnażając genotyp rośliny in vitro, można utrzymać jej skład genetyczny i klonować w nieskończoność, co prowadzi do powstania większej liczby genetycznie identycznych osobników na mniejszej przestrzeni i w krótszym czasie niż w warunkach in vivo. Kultury te są prostym systemem roboczym działającym w łatwych do manipulowania warunkach żywieniowych i środowiskowych, dzięki czemu oferują dodatkowe korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi systemami w ocenie produkcji i emisji substancji lotnych7,8. Systemy te są szczególnie korzystne dla badań nad gatunkami drzewiastymi, które w większości przypadków wymagają znacznych zasobów, tj. drzewa docelowe są czasami zlokalizowane w trudno dostępnych miejscach, wymagają drogiego sprzętu, dedykowanej siły roboczej i dłuższych okresów analizy8. In vitro, komulacje sosny z węgorkiem sosnowca umożliwiają ocenę interakcji metabolicznych między nicieniami a rośliną na różnych etapach9. W przypadku analizy substancji lotnych jest to bardzo ważne, ponieważ techniki profilowania stały się bardzo dokładne, a niewielkie różnice w próbkowaniu mogą powodować znaczne zmiany w profilach lotnych. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC-MS) jest potężną techniką analizy substancji lotnych i umożliwia szybkie i sprawne profilowanie substancji lotnych10. Przedstawiony tutaj protokół opisuje techniki infekowania sadzonek sosny in vivo w warunkach szklarniowych oraz kultur pędów in vitro genetycznie identycznych sosen, zoptymalizowanych pod kątem ekstrakcji i profilowania indukowanych substancji lotnych.

<table><tbody><tr><td>Sito testowe o oczkach 38</td><td>Retsch</td><td>60.131.000038</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzyloaminopuryna (6-BAP)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>B0904</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowane węglem drzewnym</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1302</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Clevengera</td><td>WINZER Laborglastechnik</td><td>25-000-02</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku</td><td>wodoru Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kwas indolo-3-masłowy (IBA)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>I0902</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Likensa-Nickersona</td><td>VitriLab LDA.</td><td>c/IN29/32</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki okrągłe Microbox</td><td>Sac O2</td><td>O118/80+OD118</td><td></td></tr><tr><td>n-Pentane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00882</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca PARAFILM M</td><td>MARKA</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Fitoagar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Agar ziemniaczany dekstroza</td><td>BD DIFCO</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 24</td><td>Romed Holland</td><td>BLADE24</td><td></td></tr><tr><td>Schenk & Hildebrandt Sól bazalna medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0225</td><td></td></tr><tr><td>Schenk & Mieszanka witamin Hildebrandt</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0411</td><td></td></tr><tr><td>Zespół włókien SPME Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Supelco</td><td>57300-U</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na włókna SPME</td><td>Supelco</td><td>57330-U</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Tenax TA- rurki ze stali nierdzewnej kondycjonowane + zaślepione</td><td>Markes International</td><td>C1-AAXX-5003</td><td></td></tr></tbody></table>

zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

Nicień sosnowy (PWN) to fitopasożyt, który powoduje chorobę więdnięcia sosny (PWD) u gatunków iglastych. Ten pasożytniczy nicień roślinny w dużym stopniu przyczynił się do wylesiania sosny w krajach azjatyckich, np. w Japonii, Chinach i Korei. W ciągu ostatnich dwóch dekad w Europie bardzo ucierpiały Portugalia i Hiszpania. Badania nad mechanizmami zakażenia węgorkiem sosnowca i/lub progresją PWD u wrażliwych gatunków żywicieli opierają się na kontrolowanym zakażeniu siewek sosny w warunkach szklarniowych. Technika ta jest pracochłonna i angażuje znaczne zasoby ekonomiczne i ludzkie. Dodatkowo może być podatny na zmienność, która wynika z różnorodności genetycznej związanej z niektórymi gatunkami sosny, ale także z ingerencji czynników zewnętrznych. Alternatywnie, kohodowle in vitro sosny z węgorkiem sosnowca oferują korzystniejszy system do badania zmian biochemicznych, ponieważ a) pozwalają kontrolować pojedyncze zmienne środowiskowe lub odżywcze, b) zajmują mniej miejsca, c) wymagają mniej czasu na uzyskanie oraz d) są wolne od zanieczyszczeń lub zmienności genetycznej gospodarza. Poniższy protokół szczegółowo opisuje standardowe zakażenie in vivo węgorkiem sosnowca Pinus pinaster, sosny nadmorskiej, oraz ustanowienie nowych kokultur in vitro pędów sosny z węgorkiem sosnowcem jako ulepszonej metodologii badania wpływu fitopasożytów na substancje lotne sosny. Substancje lotne indukowane węgorkiem sosnowca są ekstrahowane z sosny zakażonych in vivo i in vitro za pomocą hydrodestylacji i destylacji-ekstrakcji, a wyemitowane substancje lotne są wychwytywane przez mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME) przy użyciu technik włókien lub kolumn z upakowaniem.

PWN szybko rozmnażają się w optymalnych warunkach, a czas generacji może wynosić zaledwie 4 dni, przy czym każda samica składa w ciągu swojego życia około 80 jaj28. Stosując opisaną powyżej metodologię, można uzyskać duże ilości PWN, w zależności od wzrostu grzyba. W ciągu 8-dniowego okresu wzrostu liczebność populacji PWN może wzrosnąć 100-krotnie (Rysunek 1). Aby zwiększyć powtarzalność ilości otrzymywanych PWN, należy używać sterylizowanych PWN, ponieważ zanieczyszczenie nieznanymi bakteriami lub grzybami negatywnie wpłynie na populację PWN.
Pomyślna infekcja siewek sosny PWN doprowadzi do wystąpienia objawów PWD około 20 dni po zakażeniu (Ryc. 2). Jednak wiadomo, że P. pinaster wykazuje wysoką zmienność genetyczną w zakresie podatności na PWD, a różnice w czasie pojawienia się objawów są bardzo częste3.
In vitro pędy sosny nie wykazują takiej zmienności genetycznej, a warunki środowiskowe i odżywcze są kontrolowane i dostosowane do potrzeb użytkownika. Kultury pędów sosny nadmorskiej in vitro dobrze rosną na podłożu do elongacji SH, wykazując tempo wzrostu wynoszące około 0,9 mm na tydzień6. Idealnie sterylne PWN można dodawać do pędów o długości co najmniej 5 cm (od podstawy do najwyższej igły). Ponieważ pędy sosny in vitro są mniejsze i obszar infekcji PWN jest ograniczony, wzrost populacji nicieni jest mniej wyraźny, a czas podwojenia może wynosić od 6 do 7 dni6. Niemniej jednak w ciągu miesiąca współhodowli można zaobserwować chlorotyczne igły (Rysunek 3). W porównaniu do sosen uprawianych w szklarni, kultury pędów sosny in vitro pozwalają na synchronizację objawów PWD, kontrolę temperatury i fotoperiodu, kontrolę stanu odżywienia oraz uniknięcie kontaminacji.
Dwuletnie siewki P. pinaster charakteryzują się wydajnością olejku eterycznego na poziomie około 0,2% ± 0,1% (v/masa świeża) oraz profilem substancji lotnych bogatym w α-pinen, β-pinen lub δ-3-karen, wykazując regularną zmienność chemiczną. Obecnie zidentyfikowano dwa główne chemotypy: jeden, w którym dominują α-pinen i β-pinen, oraz drugi, w którym α-pinen i β-pinen dzielą dominację z δ-3-karenem5. Pędy sosny nadmorskiej in vitro mogą być hodowane zgodnie z pożądanym chemotypem, którego substancje lotne są w pełni profilowane za pomocą GC-MS. Choć profile substancji lotnych uzyskanych poprzez ekstrakcję z destylacją mogą różnić się od profili olejków eterycznych, w przypadku P. pinaster są one zbliżone (Rysunek 5A). Techniki ekstrakcji substancji lotnych są odpowiednie do oceny indukowanych zmian w profilach lotnych metabolitów sosny. Techniki pułapkowania substancji lotnych dostarczają informacji o związkach emitowanych przez sosny. Profile chemiczne uzyskane technikami SPME mogą być odmienne, jednak różnice te zazwyczaj zależą od ilości materiału roślinnego i uwięzionych substancji lotnych (Rysunek 5B,C).
<img alt="Wzrost grzyba w zlewkach A i B, ustawienie eksperymentalne dla badań mykologicznych, tworzenie kolonii pleśni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wzrost nicienia sosnowego in vitro. (A) Nie-sporulujący szczep Botrytis cinerea hodowany na sterylizowanych, nawodnionych nasionach jęczmienia oraz (B) hodowla nicienia sosnowego in vitro po żerowaniu na grzybni grzyba. Pasek skali = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie zdrowego i zwiędłego drzewa; wyniki eksperymentu wzrostu roślin, pokazujące wpływ warunków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Próby szklarniowe z sadzonkami sosny. (A) 2-letnie sadzonki Pinus pinaster bez objawów (B) i z objawami choroby więdnięcia sosny. Pasek skali = 10 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu roślin; schemat zdrowia siewek; eksperyment z zaobserwowanym efektem inhibitora wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Eksperymenty in vitro z mikypędami sosny. Pinus pinaster in vitro kultury pędów (A) przed i (B) po infekcji nicieniom sosnowym. Chlorozę będącą wynikiem infekcji nicieniami można zaobserwować w igłach mikypędów (strzałki). Pasek skali = 1.5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układy destylacji frakcyjnej A-C z chłodnicami; D przedstawia stację eksperymentalną do analizy gazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Układy różnych systemów izolacji substancji lotnych. Izolacja (A) olejków eterycznych metodą hydrodestylacji (aparat Clevengera), (B) substancji lotnych metodą destylacji-ekstrakcji (aparat Likensa-Nickersona) oraz substancji lotnych z przestrzeni nadpróbkowej metodą mikroekstrakcji w fazie stałej (SPME) za pomocą (C) włókien lub (D) rurek z wypełnieniem. Skala = 10 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny analizy terpenów wykazujący α-Pinene, β-Pinene, Limonene; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne chromatogramy substancji lotnych z pędów Pinus pinaster. (A) olejek eteryczny, (B) substancje lotne zebrane za pomocą włókna do ekstrakcji w fazie stałej (SPME) oraz (C) substancje lotne emitowane do wypełnionych probówek. Identyfikacja przeprowadzona przy użyciu biblioteki referencyjnej stworzonej w laboratorium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół opisuje infekcję in vivo i in vitro nicieniami sosnówki Pinus pinaster oraz ich analizę lotną za pomocą chromatografii gazowej (GC) i GC sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS).

Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily ...

Ustaliliśmy system kohodowli in vitro pędów sosny z nicieniem sosnówki, aby zaznaczyć badane zmiany w lotnej odpowiedzi żywiciela na te fitopasożyty. Testy biologiczne szklarni pozwalają na kontrolę zmienności środowiska. Jednak różnorodność genetyczna sadzonek sosny nadal wpływa na wynikające z tego profile lotne.Pędy sosny in vitro porażone nicieniami sosnówki pozwalają na pobieranie próbek łatwo dostępnych klonów roślin, co ogranicza wpływ zmienności wynikającej z różnorodności genetycznej sosny. Roślinne substancje lotne są izolowane przez hydrodestylację i ekstrakcję destylacyjną, ale techniki headspace pozwalają na profilowanie substancji lotnych emitowanych przez roślinę. Kolumny wypełnione żywicą zostaną wykorzystane jako nieinwazyjna technika profilowania substancji lotnych emitowanych przez sosnę mieloną in vitro zakażoną nicieniem sosnówką w celu bezpośredniej analizy wzajemnych oddziaływań chemicznych między żywicielem a fitopasożytem.Na początek przenieś korek hodowlany Botrytis cinerea z najbardziej zewnętrznej granicy kolonii na sterylną płytkę agarową z dekstrozą ziemniaczaną. Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 7 do 10 dni lub do momentu, gdy kolonia grzybów dotrze do krawędzi płytki. Hodowla B.Cinerea w sterylizowanych parą wodną, uwodnionych, certyfikowanych organicznych ziarnach jęczmienia przez 7 do 10 dni lub do momentu, gdy powierzchnia zboża zostanie w pełni skolonizowana.Następnie zaszczepij kulturę B.cinerea zawiesiną nicieni sosnowych. Inkubować kolbę w ciemności przez 7 do 10 dni lub do momentu, gdy kolonia grzybów zostanie całkowicie zużyta, a nicienie wdrapią się na ścianki kolby. Aby wyizolować nicienie sosnowe, należy przepłukać ścianki kolby wodą z kranu, a następnie wylać zawartość na ręcznik papierowy umieszczony w lejku lub tacy Baermann i zanurzyć nicienie w wodzie.Po 24 do 48 godzinach odzyskaj nicienie za pomocą sita o oczkach 38 mikrometrów. Umyj nagromadzone nicienie w pojemniku z wodą z kranu. Stosując tę metodologię, populacja nicieni sosnowych wzrosła 100-krotnie w ciągu ośmiodniowego okresu wzrostu.Na początek ustaw zawiesiny nicieni sosnowych w mieszanym stadium życiowym na 1 000 nicieni na mililitr. Policz nicienie na wklęsłym szkiełku pod mikroskopem lornetkowym z powiększeniem do 40x. Przed zaszczepieniem nicieni ręcznie usuń igły z odcinka poniżej górnych pięciu centymetrów łodygi sosny i wykonaj powierzchowne podłużne nacięcie za pomocą wysterylizowanego skalpela.W strefie zranienia umieść kawałek wysterylizowanej bawełny, aby pomieścić 0,5 mililitra zawiesiny nicieni sosnowych i przymocuj go przezroczystym paskiem, aby utrzymać wilgotność. Utrzymuj szklarnię w wilgotnych warunkach i często podlewaj. Regularnie śledź postęp choroby więdnięcia sosny i oceniaj symptomatologię, określając ilościowo procent przebarwionych i zwiędłych igieł.Po 20 dniach od inokulacji odetnij sadzonki u podstawy łodygi w celu ekstrakcji substancji lotnych. Umieść sadzonki w brązowych papierowych torebkach i zamroź w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Udane zakażenie sadzonek sosny nicieniem sosnowym spowodowało objawy choroby więdnięcia sosny po około 20 dniach od zakażenia.Na początek umyj certyfikowane nasiona Pinus pinaster pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć większe zanieczyszczenia. Następnie umyj drobniejsze zanieczyszczenia za pomocą zwykłego roztworu detergentu, energicznie mieszając. W okapie przepływowym dodaj dostępny w handlu roztwór wybielacza, aż nasiona zostaną pokryte i energicznie mieszaj przez 15 minut.Po wyrzuceniu roztworu wybielacza spłucz nasiona trzykrotnie wysterylizowaną wodą z kranu. Teraz zanurz nasiona w 80% etanolu na 15 minut, energicznie mieszając. Po wyrzuceniu etanolu umyj nasiona trzykrotnie wysterylizowaną ultraczystą wodą.W celu kiełkowania sosny rozbij wysterylizowane okrywy nasienne sterylną tokarką mechaniczną. Odizoluj orzeszki piniowe i umieść je w zamkniętym pojemniku ze wysterylizowaną mokrą bibułą filtracyjną do nawodnienia przez noc. Następnego dnia rozwarstwiaj uwodnione orzeszki piniowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem dni, aby przerwać spoczynek i zsynchronizować kiełkowanie.Następnie trzymaj orzeszki piniowe w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza do wykiełkowania. Przenieś aseptyczne kiełkujące sosny do kontrolowanych warunków środowiskowych na dwa tygodnie lub do momentu, gdy główna łodyga zacznie się rozwijać. Po dwóch tygodniach odetnij nadziemną część sadzonki powyżej korzenia skalpelem i przenieś ją do wysterylizowanej pożywki hodowlanej Schenk i Hildebrandt.Utrzymuj kulturę w kontrolowanych warunkach środowiskowych, jak opisano wcześniej. Subkulturuj okresowo, przecinając zrogowaciałą tkankę u podstawy pędu sterylnym skalpelem. Przenieś kępek pędów za pomocą sterylnej pęsety na świeżą pożywkę do rozmnażania.Następnie zaszczepij mikropędy w pożywce hodowlanej Schenka i Hildebrandta, zawierającej trzy gramy na litr węgla aktywnego w celu wydłużenia mikrołodygi. Teraz umieść wydłużone pędy w pożywce hodowlanej Schenka i Hildebrandta bez fitohormonów i węgla aktywnego. Dodaj 100 do 150 wysterylizowanych nicieni sosnowych w mieszanym stadium życia na dnie mikropędu.Utrzymuj kulturę w kontrolowanych warunkach środowiskowych, jak opisano wcześniej, założenie i zakażenie pędów sosny in vitro wykazało pojawienie się igieł chlorotycznych w ciągu miesiąca od wspólnej hodowli z nicieniami sosnówki. Na początek przygotuj zestaw do wychwytywania substancji lotnych w przestrzeni nad głową za pomocą zapakowanych pułapek ze stali nierdzewnej. Umieść materiał sosnowy osadzony w zakrytym szkle lub w workach PET, aby zgromadzić lotne substancje lotne w przestrzeni nad głową.W przypadku systemu z zamkniętą pętlą należy podłączyć wylot pompy do rurki PTFE. Następnie podłącz rurkę PTFE do filtrów powietrza z węglem aktywnym. Podłącz filtry powietrza do dodatkowych przewodów prowadzących do naczyń szklanych lub worków PET z materiałem sosnowym.Następnie przymocuj zapakowaną rurkę do wylotu szkła lub worka PET i podłącz dodatkowe rurki PTFE z wylotu rurki ze stali nierdzewnej do wlotu pompy przepływu masowego. Za pomocą pompy o przepływie masowym przepompuj 100 litrów przefiltrowanego powietrza przez system sosnowy z prędkością 0,6 litra na minutę, aby zebrać substancje lotne. Po zebraniu substancji lotnych zamknij zapakowane tuby na obu końcach hermetycznym nasadkami do przechowywania.Na koniec wypłucz wszystkie rurki PTFE i naczynia szklane 70% etanolem i podgrzewaj w piekarniku w temperaturze 230 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Profile lotne pędów sosny nadmorskiej uzyskanych metodą hydrodestylacji lub ekstrakcji destylacyjnej były podobne w obrębie analizowanego chemotypu. Profile chemiczne uzyskane za pomocą technik mikroekstrakcji do fazy stałej wykazywały różnice w zależności od ilości uwięzionego materiału roślinnego i substancji lotnych.

infection-vivo-vitro-pines-with-pinewood-nematode-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono protokół badania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Cechy behawioralne B. xylophilus są opisane w procesie krycia.

Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania dyspersji młodocianych osobników trzeciego stadium (młodocianych osobników sprzed dauer, JIII.) Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez osmotyczną regulację jonów chlorku potasu (KCl). Metoda ta może stanowić wsparcie techniczne dla badań nad mechanizmami odporności B . xylophilus na stres.

Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Endocytoza zależna od klatryny opiera się na białkach adaptorowych, które koordynują selekcję ładunku i montaż otoczki klatrynowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury służące do badania fizycznych oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną oraz metody obrazowania żywych komórek, wykorzystując jako model drożdżowe białko adaptorowe endocytozy Sla1p.

Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Opisano metodę push-pull służącą do zbierania lotnych substancji roślinnych. Metoda ta umożliwia porównanie substancji lotnych indukowanych przez żerowanie roślinożerców, egzogenny jasmonian metylu oraz uszkodzenia mechaniczne. Technika ta jest również wykorzystywana do badania odpowiedzi lotnej nieuszkodzonych gałązek na ekspozycję na substancje lotne z gałązek uszkodzonych przez roślinożerców w obrębie roślin borówki.

Lotne związki borówki indukowane przez roślinożerców i sygnalizacja wewnątrzroślinna

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Poznaj metodę zakażenia sosen nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus w warunkach in vitro i in vivo oraz izolacji indukowanych substancji lotnych. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi gospodarza na fitopasozyty.

Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

Przeglądaj więcej filmów