Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku
27 grudnia 2024
Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.
Nasza praca koncentruje się na zrozumieniu ludzkiej choroby genetycznej zwanej ataksją-teleangiektazją lub w skrócie A-T. Jest to spowodowane utratą kinazy białkowej ATM. ATM pełni wiele funkcji, a A-T charakteryzuje się wieloma objawami.
Ale głównym objawem A-T jest postępujące zwyrodnienie móżdżku. Obecnie nie jest jasne, która z wielu funkcji białka ATM jest tą, której utrata jest konkretnie odpowiedzialna za ten niszczycielski objaw. Próbujemy zbadać ten główny problem w badaniach nad AT, a w tym celu wykorzystujemy organotypowe kultury móżdżku pochodzące od myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem ATM.
Pozwalają nam skupić się na typie komórek, który jest prawdopodobnie pierwszym, który został utracony w degenerującym się móżdżku pacjentów z A-T, komórkach Purkinjego. Podobnie jak w wielu dziedzinach nauk przyrodniczych, badania w A-T wykorzystują różnorodne zaawansowane techniki i metody. Metody te obejmują modele zwierzęce, nowe typy kultur tkankowych, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, najnowocześniejsze technologie obrazowania, indukowane metody omiczne i częściowe obrazowanie pojedynczych komórek.
Źródłem pogorszenia stanu móżdżku w A-T jest pogorszenie stanu komórek Purkiniego. Komórki te są niezwykle trudne do wyizolowania i nie mogą przetrwać w kulturach bez wsparcia innych typów komórek. Wyjątkowym wyzwaniem eksperymentalnym jest uzyskanie dojrzałych, funkcjonalnych ludzkich komórek Purkinjego przy użyciu technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Ponieważ hodowla izolowanych komórek Purkinjego jest obecnie niemożliwa, komórkowe hodowle organotypowe stanowią cenną okazję do badania tych komórek w naczyniu hodowlanym w ich naturalnym kontekście tkankowym. Wykorzystanie korelacji białek jako odczytu odpowiedzi na uszkodzenie DNA jest bardzo pouczające, szczególnie w odniesieniu do komórek Purkinjego. Główną funkcją kinazy białkowej ATM jest regulacja odpowiedzi na uszkodzenie DNA, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności genomu i homeostazy komórkowej w obliczu trwającego uszkodzenia DNA, które występuje w każdej komórce.
Musimy wskazać krytyczną zmianę DNA, której naprawa jest wadliwa w komórkach Purkinjego z niedoborem ATM, i mamy nadzieję, że uda nam się to zrobić za pomocą tych kultur organotypowych móżdżku. Powinno to pozwolić nam lepiej zrozumieć fizjologiczne i molekularne podstawy najważniejszego i najbardziej niszczycielskiego objawu A-T, jakim jest zwyrodnienie móżdżku. Na początek dodaj jeden mililitr Basal Medium Eagle do każdego dołka sześciodołkowej płytki.
I za pomocą sterylnych kleszczy umieść wkładkę do hodowli jednokomórkowej w każdym dołku. Inkubuj płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Po ustawieniu obszaru sekcji w okapie biologicznym, umyj narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu, a następnie PBS.
Następnie umieść uśpione zwierzę w obszarze sekcji i wykonaj małe nacięcie nożyczkami z dala od móżdżku, aby odsłonić mózg. Za pomocą pęsety z zaokrąglonymi końcami delikatnie oderwij czaszkę i usuń czaszkę na małe kawałki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki móżdżku. Odsłoń tkankę mózgową, aby wyodrębnić móżdżek i odłącz trzy pary szypułek za pomocą drobno zakrzywionej szpatułki tęczówki, aby oddzielić korę móżdżku od pnia mózgu.
Następnie wsuń szpatułkę między móżdżek, górny wzgórek i pień mózgu, aby odzyskać móżdżek. Na początek pobierz móżdżek od 10-dniowego szczeniaka myszy w zimnym buforze preparacyjnym. Po usunięciu nadmiaru bufora umieść móżdżek na platformie tnącej w orientacji pionowej.
Przeprowadzić krojenie przystrzałkowe przy grubości plastra 350 mikrometrów. Delikatnie oddziel plastry drobną szpatułką do tęczówki i umieść je w zimnym podłożu preparacyjnym. Pod lornetką użyj dwóch zakrzywionych szpatułek tęczówki, aby ostrożnie oddzielić od siebie plasterki tkanki.
Do hodowli używaj plastrów pochodzących z robaka móżdżku znajdującego się w przyśrodkowej strefie korowo-jądrowej narządu. Za pomocą szerokiej szpatułki przenieś każdy wycinek tkanki na wkładkę hodowlaną. Przenieść każdą wkładkę zawierającą plasterek tkanki do dołka w sześciodołkowej płytce zawierającej wstępnie podgrzane podłoże.
Podczas inkubacji należy odessać zużytą pożywkę sterylną szklaną pipetą. Używając pięciomililitrowej pipety serologicznej, dodaj jeden mililitr świeżej pożywki Basal Medium Eagle tak, aby końcówka pipety opierała się o ścianę studzienki, nie naruszając tkanki. Na początek posaz posiekaną tkankę móżdżku pobraną od 10-dniowego szczeniaka myszy w Basal Medium Eagle.
Dodaj substancje chemiczne uszkadzające DNA bezpośrednio do pożywki hodowlanej w odpowiednich stężeniach końcowych. Po okresie ekspozycji zastąpić pożywkę świeżo przygotowaną mieszanką zawierającą substancje chemiczne uszkadzające DNA oraz inhibitor glikohydrolazy poliADP-rybozy i inkubować przez 30 minut. Po 30 minutach umyj plastry 0,1-molowym buforem fosforanowym w temperaturze pokojowej i natychmiast utrwal je wstępnie schłodzoną mieszaniną acetonu i metanolu.
Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie usuń roztwór utrwalający i przemyj go 0,4-molowym buforem fosforanowym. Dodaj 100 mikrolitrów 0,1-molowego buforu fosforanowego do każdego dołka 48-dołkowej płytki.
Następnie za pomocą skalpela i deski do krojenia usuń marginesy wkładki, przecinając plasterek tkanki. Umieść plasterek w dołku na płytce 48-dołkowej. Po zassaniu buforu inkubować wkładkę ze 100 mikrolitrami 0,1-molowego buforu fosforanowego zawierającego 1%Triton X-100.
Odessać roztwór i seryjnie inkubować wkładkę w każdym dołku na wytrząsarce z odpowiednią ilością roztworu blokującego, a następnie przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Dodać 20 mikrolitrów końcowego roztworu DAPI do każdego dołka na 20 minut przed końcem dwugodzinnej inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym i kontynuować wytrząsanie przez 20 minut. Do montażu umieść chusteczkę na szkiełku mikroskopowym chusteczką skierowaną do góry.
Dodaj podłoże montażowe i przykryj szkłem nakrywkowym. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Foliacja móżdżku została utrzymana w kulturze.
Komórki Purkinjego wybarwiono na obecność kalbindyny D-28k, a jądra neuronalne wybarwiono na obecność NeuN. Astrocyty w komórkach Purkinjego zostały wybarwione pod kątem GFAP. Barwienie PAR wzrosło w leczonych komórkach Purkinjego po ekspozycji na bromian potasu i parakwat, co wskazuje na uszkodzenie DNA.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje mechanizmy odpowiedzialne za degenerację móżdżku wに合わせて ataksji-teleangiektazji (A-T), zaburzeniu genetycznym wynikającym z utraty kinazy białkowej ATM. Wykorzystując organotypowe hodowle móżdżku myszy typu dzikiego oraz myszy z niedoborem ATM, oceniono dynamikę odpowiedzi komórek Purkinjego na uszkodzenia DNA za pomocą testów korelacji białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Genetyka ataxia-telangiektazji
- Degeneracja móżdżku i mechanizmy leżące u jej podstaw
- Odpowiedź na uszkodzenia DNA w komórkach neuronalnych
Wstęp
- Ataksja-teleangiektazja charakteryzuje się postępującą degeneracją móżdżku.
- Zrozumienie roli białka ATM w naprawie uszkodzeń DNA jest kluczowe dla zrozumienia patologii A-T.
- Komórki Purkinjego należą do pierwszych degenerujących się w tym stanie.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie organotypowych kultur móżdżku z modeli mysich.
- Stosowanie chemikaliów uszkadzających DNA w celu oceny odpowiedzi komórkowych.
- Zaawansowane techniki obrazowania i barwienia białek do analizy.
Główne wyniki
- Dowody na upośledzoną odpowiedź na uszkodzenia DNA w komórkach Purkinjego z niedoborem ATM.
- Identyfikacja krytycznych uszkodzeń DNA powiązanych z dysfunkcją komórkową.
- Wgląd w podatność komórek Purkinjego i następującą po niej degenerację w A-T.
Wnioski
- Niniejsze badanie wyjaśnia związek między funkcjami białka ATM a degeneracją móżdżku w przypadku A-T.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia odpowiedzi komórek neuronalnych na uszkodzenia DNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) w komórkach Purkinjego móżdżku jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w neurodegeneracji oraz wyjaśnienia mechanizmów chorobowych w zespołach niestabilności genomu, takich jak ataxia telangiektazy. Wykorzystanie organotypowych kultur móżdżku umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamiki DDR w kontekście fizjologicznie istotnym, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i badaniach mechanistycznych. Podejście to dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania wczesnych decyzji w procesie odkrywania leków oraz priorytetyzacji portfela programów badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków DDR w podtypach neuronów istotnych w kontekście chorób.
- Wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez wyjaśnienie procesów naprawy zależnych od ATM w komórkach Purkinjego.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla portfeli badawczych dotyczących neurodegeneracji.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system ex vivo do ilościowego obrazowania markerów DDR, takich jak łańcuchy PAR.
- Umożliwia powtarzalną ocenę odpowiedzi na stres genotoksyczny w złożonych środowiskach tkankowych.
- Wspiera standaryzację testów dla późniejszego screeningu związków celujących w szlaki DDR.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla danej choroby w zakresie opracowywania translacyjnych biomarkerów neurodegeneracji.
- Zachowuje architekturę tkanki, wspierając ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie podatności komórkowych istotnych dla organizmu człowieka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesny etap odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając prowadzenie opartych na hipotezach badań DDR w natywnym kontekście tkankowym, co wspiera identyfikację wiodących związków oraz walidację mechanistyczną.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji ATM i integralności szlaku DDR w komórkach Purkinjego.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania do analizy markerów DDR.
- Analityka: Zapewnia mierzalne odczyty łańcuchów PAR związanych z białkami do badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z fenotypami istotnymi dla chorób w przebiegu neurodegeneracji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badań nad DDR w kontekście celów terapeutycznych chorób neurodegeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów DDR oraz zapewnia przejrzystość mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy tkankowe w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje późnowalidacyjne ryzyko biologiczne w projektach dotyczących neurodegeneracji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii terapeutycznych modulujących DDR w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu hodowli organotypowych oraz w zaawansowanych technikach obrazowania.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do ilościowej analizy obrazu.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów przygotowania tkanek i barwienia pomiędzy zespołami.
- Można wymagać adaptacji metody dla innych podtypów neuronów lub modeli chorobowych.
- Odczyty oparte na obrazowaniu ograniczają analizę do markerów DDR możliwych do wykrycia za pomocą mikroskopii.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:12
Isolation of Cerebellum from Mouse Pups for Obtaining Organotypic Cultures to Study DNA Damage Response
4:31
Preparation of Cerebellar Organotypic Cultures for Investigating DNA Damage Response in Purkinje Cells
5:50
Treatment of Cerebellar Organotypic Cultures with DNA Damaging Agents for Fluorescent Imaging of PAR Chains to Assess Genotoxic Stress Response
