Name: Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj mechanizmy odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego przy użyciu kultur organotypowych móżdżku myszy. Ta metoda pozwala badać rolę białka ATM w degeneracji móżdżku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w naszym laboratorium jest wspierana przez Fundację Badań Medycznych dr Miriam i Sheldona G. Adelson oraz Izraelskie Stowarzyszenie na rzecz Walki z Chorobą A-T.

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat materiałów, sprzętu i przeciwciał. Procedury na zwierzętach zostały zastosowane zgodnie z wytycznymi etycznymi Komisji Etyki Uniwersytetu w Tel Awiwie po zatwierdzeniu. Zabieg przeprowadza się na 10-dniowych szczeniętach myszy, niezależnie od ich płci. W razie potrzeby genotypowanie wykonuje się poprzedniego dnia przy użyciu biopsji ogona i standardowych metod. Roztwory są sterylne i przechowywane w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej; patrz tabela 1.
1. Przygotowanie kultur
UWAGA: Przeprowadź procedurę w sterylnym środowisku i zdezynfekuj powierzchnię roboczą wcześniej, używając 70% etanolu.
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml BME do każdego dołka na płytkach 6-dołkowych. Za pomocą sterylnych kleszczyków umieścić pojedynczą wkładkę do hodowli komórkowej w każdym dołku i inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez co najmniej 2 godziny przed procedurą preparacji.</li>
	<li>Ustaw obszar preparacyjny w kapturze biologicznym, zawierający rozdrabniacz tkanek, płytki hodowlane 30 mm, mikroskop dwuokularowy i źródło światła.</li>
	<li>Zanurz narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu podczas całego procesu. Użyj kubka na mocz wypełnionego 70% etanolem do zanurzenia i oddzielnego kubka na mocz z 1x PBS, aby zmyć etanol przed użyciem.</li>
	<li>Do każdej sekcji (tj. dla każdego móżdżku) przygotuj dwie 30-milimetrowe płytki hodowlane wypełnione zimnym podłożem preparacyjnym i pozostaw je na lodzie.</li>
	<li>Spryskaj zwierzę 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek szybko odetnij głowę zwierzęciu. Aby odsłonić mózg, wykonaj małe nacięcie nożyczkami z dala od móżdżku. Za pomocą pęsety z zaokrąglonymi końcami delikatnie oderwij czaszkę. Usuń czaszkę na małe kawałki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki móżdżku.</li>
	<li>Natychmiast przenieś mózg do zimnego podłoża preparacyjnego lub bezpośrednio usuń móżdżek z wnętrza czaszki. Aby to zrobić, odsłoń móżdżek i oddziel korę móżdżku od pnia mózgu, odłączając trzy pary szypułek za pomocą cienkiej zakrzywionej szpatułki tęczówki. Aby zidentyfikować szypułki, spójrz od rostralnego do ogonowego: sparowane szypułki móżdżku górnego łączą śródmózgowie z każdą stroną móżdżku; Sparowane środkowe szypułki móżdżku łączą most z każdą stroną móżdżku; a sparowane dolne szypułki móżdżku łączą się z rdzeniem po obu stronach móżdżku. Gdy móżdżek jest widoczny, oddziel go od mózgu za pomocą tej samej szpatułki: wsuń szpatułkę między móżdżek, górny wzgórek i pień mózgu. 
	UWAGA: Nie podejmuj specjalnego wysiłku, aby usunąć opony mózgowe, ponieważ łatwo odklejają się one po przecięciu móżdżku.</li>
	<li>Ustaw rozdrabniacz do tkanek na grubość plastra 350 μm.</li>
	<li>Przed umieszczeniem móżdżku na podstawie siekacza należy usunąć nadmiar buforu preparacyjnego z tkanki. Poprawi to przyczepność tkanki do podstawy siekacza.</li>
	<li>Umieść móżdżek na platformie tnącej w orientacji pionowej i przeprowadź krojenie przystrzałkowe o grubości plastra 350 μm. Delikatnie oddziel plastry za pomocą cienkiej szpatułki do tęczówki i włóż je do zimnego podłoża preparacyjnego.</li>
	<li>Przenieś pokrojoną tkankę z powrotem do świeżego zimnego buforu do preparacji. Użyj końcówki o pojemności 1 000 μl, aby delikatnie wprowadzić plastry tkanki do naczynia zawierającego zimny bufor do preparacji.</li>
	<li>Pod lornetką użyj dwóch zakrzywionych szpatułek tęczówki, aby ostrożnie oddzielić plastry tkanki od siebie. W przypadku kultur należy używać plastrów pochodzących z robaka móżdżku znajdującego się w przyśrodkowej strefie korowo-jądrowej narządu.</li>
	<li>Przenieść każdy wycinek tkanki na wkładkę hodowlaną za pomocą szerokiej szpatułki i przenieść każdą wkładkę z wycinkiem tkanki do dołka w 6-dołkowych płytkach zawierających wstępnie podgrzane podłoże. Pozostaw płytki w inkubatorze.</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę co drugi dzień: odessać zużytą pożywkę za pomocą sterylnej szklanej pipety, a następnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 1 ml świeżej pożywki tak, aby końcówka pipety opierała się o ścianę studzienki. Upewnij się, że nie kierujesz strumienia pożywki na tkankę. 
	UWAGA: Wycinek tkanki będzie wykazywał wygląd podobny do stanu zapalnego przez pierwsze 5-7 dni w hodowli i będzie gotowy do eksperymentów, gdy tylko zjawisko to zniknie i do 2 tygodni po założeniu hodowli.</li>
</ol>
2. Leczenie czynnikami uszkadzającymi DNA, fiksacja, barwienie i obrazowanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Dodawać substancje chemiczne uszkadzające DNA bezpośrednio do pożywki hodowlanej w odpowiednich stężeniach końcowych, przez określony czas. Po okresie ekspozycji usuń chemikalia, zastępując pożywkę świeżą pożywką hodowlaną.</li>
	<li>Jeżeli odczyt DDR obejmuje barwienie PAR, dodać inhibitor glikohydrolazy poli(ADP-rybozy) (PARG) do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 10 μM, 30 minut przed utrwaleniem. 
	UWAGA: Zabieg ten ma kluczowe znaczenie, ponieważ modyfikacja PAR jest krótkotrwała i stale degradowana przez PARG.</li>
	<li>Bezpośrednio przed utrwaleniem należy odessać pożywkę i zastąpić ją 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego o temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Zimny bufor może spowodować oderwanie się plastrów tkanki od wkładki.</li>
	<li>Natychmiast utrwalić plastry, zastępując bufor wstępnie schłodzoną (-20 °C) mieszanką acetonu i metanolu (1:1) tak, aby plasterek tkanki był zanurzony w tej mieszance i pozostawić na 20 minut w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Możliwe jest zatrzymanie się na tym etapie i późniejsze przystąpienie do barwienia immunologicznego. W tym celu należy przemyć chusteczki 3x 0,1 M buforem fosforanowym wstępnie schłodzonym do 4 °C, upewniając się, że tkanka jest zanurzona w buforze. Tkanki mogą być teraz przechowywane w 0,1 M buforze fosforanowym do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś plasterek tkanki do dołka na 48-dołkowej płytce.</li>
	<li>Użyj skalpela i deski do krojenia, aby usunąć marginesy wkładki, przecinając plasterek tkanki. Umieść każdą kromkę w dołku na 48-dołkowej płytce. Dodać 100 μl 0,1 M buforu fosforanowego.</li>
	<li>W celu przepuszczalności odessać bufor, dodać do studzienki 100 μl 0,1 M buforu fosforanowego zawierającego 1% Triton X-100 i pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór i dodać 100 μl roztworu blokującego (patrz tabela 1) do studzienki. Wstrząsaj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Na etapie blokowania rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe lub odczynnik anty-PAR (1:800) w roztworze blokującym.</li>
	<li>Usuń roztwór blokujący (nie ma potrzeby mycia) i dodaj 100 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Stosować delikatne wstrząsanie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 0,1 M buforze fosforanowym zawierającym 0,2% Triton X-100 (1:500), minimalizując ich ekspozycję na światło.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć plastry 3 x 5 min 0,1 M buforem fosforanowym zawierającym 0,2% Triton X-100, w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Zastąp roztwór płuczący 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:500). Kontynuuj delikatne wstrząsanie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności (przykryj talerze folią aluminiową).</li>
	<li>Aby przygotować roztwór DAPI, rozcieńczyć roztwór podstawowy (2 mg/ml) do 1 μg/ml w 1x PBS.</li>
	<li>Dwadzieścia minut przed końcem 2-godzinnej inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym dodać 20 μl końcowego roztworu DAPI do każdej studzienki i kontynuować wstrząsanie przez 20 minut. Odessać płyn i przemywać roztworem do przemywania przez 3 x 5 minut, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Do montażu umieść chusteczkę na szkiełku mikroskopowym chusteczką skierowaną do góry, dodaj podłoże montażowe i przykryj szkłem nakrywkowym. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia przez noc w ciemności, w temperaturze pokojowej (unikaj używania podłoża montażowego zawierającego DAPI, aby zapobiec rozmyciu).</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w pudełku odpornym na światło.</li>
	<li>Uchwyć obrazy mikroskopowe za pomocą mikroskopu konfokalnego i odpowiednich filtrów.</li>
</ol>

Cerebellar Purkinje Cells: DNA Damage Response in Organotypic Cultures

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Uwagi ogólne Główną zaletą systemu hodowli organotypowej jest to, że ułatwia badania z wykorzystaniem tkanki kory móżdżku, zachowując jej organizację strukturalną przez kilka tygodni w naczyniu hodowlanym. System ten jest przydatny do przeprowadzania dogłębnych analiz morfologicznych komórek Purkinjego (PC), w tym szczegółowych badań kolców dendrytycznych i cech ultrastrukturalnych 52,53,54,55,56,57,58,59. Nasze obserwacje wskazują, że odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) jest szczególnie aktywna w komputerach PC w tych kulturach. Jednak do głównych ograniczeń tego systemu należy ograniczony czas jego stosowania i poleganie na obrazowaniu mikroskopowym w celu monitorowania procesów komórkowych, co podkreśla ciągłą potrzebę opracowywania lub dostosowywania odpowiednich technik obrazowania.
Kolejne słowo ostrzeżenia dotyczy części móżdżku, która jest preparowana w celu przygotowania plastrów tkanki. Zaobserwowaliśmy, że różne płaty móżdżku mogą dawać kultury o wyraźnie różnej organizacji wewnętrznej i ogólnej jakości. Dlatego wolimy zakładać kultury z plastrów uzyskanych przez odcinki śródstrzałkowe robaka móżdżku. W tych plasterkach liście kory móżdżku są wygodnie widoczne.
Wskazane jest wykorzystanie wycinków tkanek uzyskanych z robaka móżdżku, które wykazują charakterystyczne foliowanie kory móżdżku. Wycinki te utrzymują swoją strukturę organizacyjną w kulturze przez kilka tygodni. Ponadto zaleca się rozpoczęcie procedur eksperymentalnych z kulturami około 7-12 dni po założeniu. Typowy eksperyment mający na celu ocenę reakcji na uszkodzenie DNA w tych kulturach polega na zainicjowaniu uszkodzenia przez napromieniowanie lub dodanie do pożywki substancji chemicznych uszkadzających DNA. Następnie utrwalanie i barwienie tkanek odbywa się w różnych odstępach czasu. Aby ocenić regenerację po uszkodzeniach spowodowanych przez chemikalia, uwzględnia się okres inkubacji w świeżej pożywce. Wskazane jest jak najszybsze rozpoczęcie długoterminowych eksperymentów, najlepiej około 7 dni po założeniu hodowli.
Kultury organotypowe móżdżku są utrzymywane w pożywce pozbawionej antybiotyków; Dlatego konieczne jest utrzymanie sterylnego środowiska podczas ich zakładania. Wiek szczeniąt, z których zbiera się móżdżek, jest krytyczny, z zalecanym zakresem 9-12 dni. Ten przedział wiekowy jest optymalny, ponieważ kora móżdżku jest wystarczająco rozwinięta do sekcji. Warto zauważyć, że u starszych zwierząt tkanki mają tendencję do przylegania do ostrza. Bardzo ważne jest, aby móżdżek był zanurzony w zimnym roztworze preparacyjnym do czasu wypreparowania.
W ciągu pierwszych 5-7 dni w hodowli wycinki tkanki mogą wykazywać objawy przypominające stan zapalny, charakteryzujące się obrzękiem i mlecznymi przebarwieniami. Atrybuty te mogą potencjalnie wpływać na pomiar parametrów fizjologicznych i skuteczność technik barwienia immunologicznego.
Zdecydowanie zaleca się, aby nie kroić móżdżku cieńszego niż 350 μm, aby uniknąć niespójności grubości podczas krojenia. Należy pamiętać, że tkanka o grubości 350 μm staje się znacznie cieńsza po 7 dniach w hodowli do około 90 μm (na podstawie pomiaru stosu Z).
Tutaj wprowadzamy barwienie PAR 7,50 do zestawu narzędzi używanych do badania DDR w komputerach PC. Odczyt ten jest szybki, czuły i oddaje dynamiczną naturę DDR, co okazuje się szczególnie przydatne w naszej analizie DDR w komputerach typu dzikiego i z niedoborem ATM. Przedstawione tutaj protokoły powinny być szczególnie korzystne dla naukowców badających zespoły niestabilności genomowej, które wpływają na móżdżek.

Integralność komórkowego DNA jest stale zagrożona przez czynniki uszkadzające DNA, głównie produkty uboczne przemiany materii, takie jak reaktywne formy tlenu, które powodują dziesiątki tysięcy uszkodzeń DNA na komórkę dziennie1. Stałe utrzymanie stabilności genomu jest niezbędne dla homeostazy komórkowej2,3. Kamieniem węgielnym tego utrzymania jest odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) - skomplikowana, warstwowa sieć sygnalizacyjna, która inicjuje określone szlaki naprawy DNA, jednocześnie starannie dostosowując wiele innych procesów komórkowych4,5. Deficyty w DDR są często objawiane jako "zespoły niestabilności genomu", charakteryzujące się niestabilnością chromosomalną, postępującym niszczeniem tkanek, upośledzonym wzrostem lub rozwojem, predyspozycją do raka i zwiększoną wrażliwością na określone czynniki uszkadzające DNA6,7,8,9. Warto zauważyć, że neurodegeneracja, która często obejmuje atrofię móżdżku, jest charakterystyczną cechą wielu zespołów niestabilności genomu7,10,11,12.
Autosomalne zaburzenie recesywne, ataksja-teleangiektazja (A-T), jest dobrze udokumentowanym przykładem zaburzenia niestabilności genomu13,14,15. Ten stan wynika z mutacji zerowych w genie ATM (A-T, zmutowanym), odpowiedzialnym za kodowanie kluczowej kinazy białkowej, ATM, która jest znana przede wszystkim jako mobilizator DDR w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB)16,17. A-T objawia się jako zaburzenie wieloukładowe, charakteryzujące się głównie postępującym zwyrodnieniem móżdżku, prowadzącym do ostrych zaburzeń motorycznych, niedoboru odporności, atrofii gonad, predyspozycji do raka i ekstremalnej wrażliwości na promieniowanie jonizujące. Hodowane komórki od osób z A-T wykazują niestabilność chromosomalną i zwiększoną wrażliwość na czynniki genotoksyczne, zwłaszcza te powodujące DSBs15,18,19. Co ważne, ATM odgrywa również rolę w naprawie innych uszkodzeń DNA, co podkreśla jego szerokie znaczenie w utrzymaniu stabilności genomu20,21,22.
Pomimo wnikliwych badań nad licznymi rolami ATM, specyficzny mechanizm prowadzący do zwyrodnienia móżdżku w A-T pozostaje tematem aktywnej dyskusji, z różnymi modelami proponowanymi w celu wyjaśnienia tego procesu23,24,25,26,27,28,29,30. Nasz model28 sugeruje, że zwyrodnienie móżdżku u pacjentów z A-T zaczyna się od dysfunkcji i ostatecznej utraty komórek Purkinjego (PC). Biorąc pod uwagę kluczową rolę ATM w zachowaniu stabilności genomu w obliczu trwających uszkodzeń DNA, komputery PC są szczególnie podatne na brak ATM. Przypisujemy tę podatność połączeniu ich wysokiej aktywności metabolicznej, charakterystycznej struktury chromatyny i rozległej aktywności transkrypcyjnej. Ostatecznie sugeruje się, że utrata funkcji PC, a co za tym idzie, ich degeneracja, jest spowodowana stochastyczną, funkcjonalną inaktywacją genów, konsekwencją wytwarzania wadliwych transkryptów28.
Badanie biologii PC w laboratorium jest utrudnione przez wyzwania związane z hodowlą izolowanych PC, ponieważ te komórki w dużym stopniu polegają na swoim naturalnym środowisku i sąsiednich komórkach do przetrwania i funkcjonowania, co czyni je niekompatybilnymi z dysocjacyjnym wzrostem kultur. Niemniej jednak PC mogą pozostać żywotne przez dłuższy czas w kulturach warstwowych tkanek. Hodowle organotypowe móżdżku, które są wycinkami tkanek zwykle pochodzącymi z móżdżki gryzonia, utrzymują organizację strukturalną tkanki i wspierają różne manipulacje eksperymentalne analogiczne do tych, które są możliwe w przypadku hodowanych komórek. Dlatego te kultury pozwalają na badania móżdżku w kontrolowanym otoczeniu31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, 41,42,43. W szczególności, w kontekście A-T, organotypowe hodowle móżdżku myszy okazały się pomocne w badaniu DDR u komputerów PC z niedoborem Atm40,41,42,43. Podczas gdy myszy z niedoborem Atm wykazują tylko subtelny fenotyp móżdżku44,45,46,47, prawdopodobnie z powodu różnic między fizjologią móżdżku człowieka i myszy, zakłada się, że role ATM są w dużej mierze zachowane u tych gatunków. Pogląd ten jest wspierany przez nasze obserwacje, że niedostateczna odpowiedź na DSB DNA w mysich komputerach PC Atm-/- jest zgodna z tą obserwowaną u innych typów komórek z niedoborem ATM i ATM oraz ludzkich40,41,42,43.
Ograniczeniem w analizowaniu reakcji PC na różne bodźce lub stresy w kulturach organotypowych jest konieczność polegania na obrazowaniu mikroskopowym przy odczytach. DDR jest zwykle badany przy użyciu masowych odczytów biochemicznych, chociaż wykorzystuje się również powszechne markery immunofluorescencyjne, takie jak śledzenie dynamiki powstawania i rozdzielczości ognisk jądrowych fosforylowanego histonu H2AX (γH2AX) i białka 53BP1, które są uważane za wskaźniki DSBs48,49. Szerszą miarą jest obrazowanie fluorescencyjne tworzenia łańcuchów poli(ADP-rybozy) (PAR) na białkach, szybka i silna wczesna reakcja na uszkodzenie DNA, szczególnie na pęknięcia nici7,50. Zmodyfikowaliśmy protokół Komulainen et al.51 do barwienia PAR w kulturach organotypowych móżdżku. Zaobserwowaliśmy wyraźną odpowiedź PAR w dużych jądrach PC. Przedstawiono tutaj nasz wyrafinowany protokół tworzenia mysich kultur organotypowych móżdżku i wizualizacji odpowiedzi PAR w stresie genotoksycznym.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>szalka Petriego 150 x 30 cm</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 35 x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne szkiełka mikroskopowe</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Ostrza do rozdrabniacza</td><td>TED PELLA</td><td>Model TC752-1</td><td>&nbsp; Stylowe żyletki</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>Brak L-Glut</td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa wprowadza</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Biological Indo.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>No Ca+,No Mg+</td></tr><tr><td>HBSS z czerwienią fenolową</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td><td>inaktywowane termicznie</td></tr><tr><td>kleszczyki do tęczówki</td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td><td>130mm tępo ząbkowana</td></tr><tr><td>szpatułka do tęczówki</td><td>FST</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe bez</td><td>GRIGENE. Ltd, Izrael</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Dichlorek parakwatu (Viologen metylowy)</td></tr><tr><td>PARG-Poli(ADP-rybozy) Inhibitor glikohydrolazy</td><td>Tocris Bioscience, Wielka Brytania</td><td>PDD 00017273</td><td>światłoczuły&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy</td><td>Biologiczny Indo.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek</td><td></td><td></td><td></td>skórnych</tr><tr><td>Płytki sześciodołkowe</td><td>Corning CLS3516</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zapasowe krążki do krojenia&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>Model 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek</td><td>McIlwain</td><td>Model TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Pęseta, spiczasta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miseczki moczowe</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><silne>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 osioł anty królik IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; wtórne AB; Wtórny bufor rozcieńczający; &nbsp; Inkubacja przez 2 godziny w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Antyglejowy fibrylarny kwaśny protien</td><td>Milifor</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; pierwotny ab; blokowanie; Host:mysz</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; pierwotny ab; blokowanie; gospodarz: królik&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-kalbindyna-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38A</td><td>1:2000; pierwotny AB; Blokowanie&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik anty-pan-ADP-rybozy</td><td>Milifor</td><td>MABE1016</td><td>1:800; pierwotny ab; blokowanie; inkubacja przez 2 godziny w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2'-fenylindolu)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4084</td><td>1:1000; wtórny bufor rozcieńczający; inkubacja przez 20 min w temperaturze pokojowej</td></tr></tbody></table>

wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia dna w komórkach purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) wykazują unikalne połączenie wysokiego tempa metabolizmu, specyficznej architektury chromatyny i rozległej aktywności transkrypcyjnej, co czyni je szczególnie podatnymi na uszkodzenia DNA. Wymaga to skutecznej odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR), aby zapobiec zwyrodnieniu móżdżku, często inicjowanym przez dysfunkcję lub utratę komputera. Godnym uwagi przykładem jest zespół niestabilności genomu, ataksja-teleangiektazja (A-T), charakteryzujący się postępującym wyczerpaniem PC i pogorszeniem stanu móżdżku. Badanie mechanizmów DDR w komputerach PC ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia szlaków prowadzących do ich degeneracji w takich zaburzeniach. Jednak złożoność izolowania i hodowli PC in vitro od dawna utrudnia wysiłki badawcze. Mysie hodowle organotypowe (plasterkowe) móżdżku stanowią realną alternatywę, ściśle naśladującą środowisko tkankowe in vivo. Jednak model ten jest ograniczony do wskaźników DDR podatnych na obrazowanie mikroskopowe. Udoskonaliliśmy protokół hodowli organotypowej, wykazując, że obrazowanie fluorescencyjne łańcuchów poli(ADP-rybozy) (PAR) związanych z białkami, szybki i wczesny wskaźnik DDR, skutecznie ujawnia dynamikę DDR w PC w tych kulturach w odpowiedzi na stres genotoksyczny.

Rysunek 1 przedstawia ogólny wygląd organotypowych kultur móżdżku. Górny rząd na Rysunku 1A pokazuje listkowanie móżdżku, które zostaje zachowane w kulturze, natomiast dolny rząd przedstawia komórki Purkinjego (PCs) wybarwione kalbindyną D-28k (kolor zielony) oraz jądra neuronów wybarwione NeuN (kolor czerwony). Na Rysunku 1B astrocyty w warstwie komórek Purkinjego (kolor czerwony) zostały wybarwione GFAP (kolor zielony), białkiem filamentów pośrednich typu III. Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają wybarwienie PAR zaobserwowane po potraktowaniu tych kultur dwoma czynnikami uszkadzającymi DNA, z których oba są silnymi utleniaczami: bromianem potasu (stężenie końcowe 10 mM przez 12 h) oraz parakwatem. Odpowiedź PAR była wyraźna w potraktowanych komórkach Purkinjego w listku móżdżku w porównaniu z grupą kontrolną.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki mózgowej; barwienia DAPI, Calbindin, NeuN, GFAP; obrazy z nałożeniem kanałów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd organotypowych kultur móżdżku mysiego. (A) Górny rząd ilustruje listkowanie móżdżku, które zostaje zachowane w kulturze. Dolny rząd skupia się na warstwie PC. Komórki PC są zaznaczone za pomocą Calbindin D-28k (zielony). Barwienie NeuN (czerwony) identyfikuje jądra neuronów we wszystkich warstwach. (B) Powiększenie komórek PC (czerwony). GFAP (zielony), białko filamentów pośrednich typu III, które zaznacza astrocyty. Paski skali = 968.8 µm (A, górny rząd), 42.1 µm (A, drugi rząd), 72.7 µm (B, górny rząd), 18.2 µm (B, drugi rząd). Skróty: PC = komórki Purkinje; GFAP = kwaśne białko włókienkowe gleju; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, DAPI, kalbindyna D-28k, barwienie PAR, analiza tkanki niepoddanej działaniu czynnika i poddanej działaniu KBrO3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Barwienie PAR w skrawku móżdżku poddanym działaniu bromianu potasu.Skrawka móżdżku inkubowano z bromianem potasu (KBrO3), silnym utleniaczem, w stężeniu końcowym 10 mM przez 12 h. Paski skali = 775 µm. Skróty: PAR = poli(ADP-ryboza); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; ekspozycja na paraquat w komórkach neuronalnych, DAPI, kalbindyna D-28k, markery PAR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Odpowiedź PAR w skrawkach móżdżku eksponowanych na paraquat, silny generator anionów ponadtlenkowych. (A) Ogólny widok listka móżdżku. Zauważalna jest silna odpowiedź PAR, szczególnie w PC w porównaniu z kontrolą. (B) Powiększenie obrazu ukazuje odpowiedź PAR w PC oraz innych typach komórek. Paski skali = 193.8 µm (A), 18.2 µm (B). Skróty: PAR = poli(ADP-ryboza); DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Roztwory i bufory</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Roztwór  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Składniki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Medium do sekcji</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) zawierający 0,5% D-glukozy. Do 50 ml HBSS bez Mg należy dodać 0,5 ml 50% roztworu D-glukozy.2+ oraz Ca2+. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">pożywka hodowlana BME</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Wymieszać 100 ml podstawowej pożywki Eagle'a (BME) zawierającej czerwień fenolową, ale bez L-glutaminy i HEPES-u, z 50 ml HBSS z czerwienią fenolową, 50 ml inaktywowanego ciepłem surowicy konia, 2 ml 50% D-glukozy oraz 1 ml 200 mM L-glutaminy. Wymieszać i przefiltrować przez 0.22 μm przefiltrować w warunkach sterylnych. Przechowywać w 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Roztwór blokujący do immunobarwienia</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">w 0,1 M buforze fosforanowym: dodać 0,5% Triton X-100, 10% surowicy koziej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Bufor do rozcieńczania przeciwciał wtórnych </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">bufor fosforanowy 0,1 M, 0,2% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Bufor piorący</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">bufor fosforanowy 0,1 M, 0,2% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Roztwór utrwalający</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">aceton:metanol (1:1 v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Roztwór permeabilizujący</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">bufor fosforanowy 0,1 M, 1% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">roztwór DAPI</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Roztwór zapasowy (2 mg/mL) rozcieńczony do 1 µg/mL w 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Bufor fosforanowy</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Przygotować dwa roztwory A i B (patrz poniżej). Wymieszać roztwory zgodnie z podanymi niżej proporcjami, aby otrzymać 0,2 M bufor fosforanowy. Następnie rozcieńczyć roztwór 0,2 M wodą DDW (1:1), aby otrzymać 0,1 M bufor fosforanowy (roztwór roboczy).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">roztwór A (dla 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g bezwodnego fosforanu sodu(I) (Na2HPO4 FW 141,96) 
			 500 ml podwójnie destylowanej wody (DDW)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Roztwór B (dla 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14,2 g bezwodnego fosforanu sodu dwuzasadowego (Na2HPO4 FW 141,96) 
			500 ml podwójnie destylowanej wody (DDW)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid">Zmieszano roztwory, aby otrzymać stężenie 0,2 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Przygotuj 1 l: 230 ml roztworu A i 770 ml roztworu B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td fo:border="1.5pt solid"> bufor fosforanowy 0,1 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"> Rozcieńczyć zmieszany roztwór wodą destylowaną DDW (1:1)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Roztwory i ich skład.

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

Nasza praca koncentruje się na zrozumieniu ludzkiej choroby genetycznej zwanej ataksją-teleangiektazją lub w skrócie A-T. Jest to spowodowane utratą kinazy białkowej ATM. ATM pełni wiele funkcji, a A-T charakteryzuje się wieloma objawami.Ale głównym objawem A-T jest postępujące zwyrodnienie móżdżku. Obecnie nie jest jasne, która z wielu funkcji białka ATM jest tą, której utrata jest konkretnie odpowiedzialna za ten niszczycielski objaw. Próbujemy zbadać ten główny problem w badaniach nad AT, a w tym celu wykorzystujemy organotypowe kultury móżdżku pochodzące od myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem ATM.Pozwalają nam skupić się na typie komórek, który jest prawdopodobnie pierwszym, który został utracony w degenerującym się móżdżku pacjentów z A-T, komórkach Purkinjego. Podobnie jak w wielu dziedzinach nauk przyrodniczych, badania w A-T wykorzystują różnorodne zaawansowane techniki i metody. Metody te obejmują modele zwierzęce, nowe typy kultur tkankowych, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, najnowocześniejsze technologie obrazowania, indukowane metody omiczne i częściowe obrazowanie pojedynczych komórek.Źródłem pogorszenia stanu móżdżku w A-T jest pogorszenie stanu komórek Purkiniego. Komórki te są niezwykle trudne do wyizolowania i nie mogą przetrwać w kulturach bez wsparcia innych typów komórek. Wyjątkowym wyzwaniem eksperymentalnym jest uzyskanie dojrzałych, funkcjonalnych ludzkich komórek Purkinjego przy użyciu technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.Ponieważ hodowla izolowanych komórek Purkinjego jest obecnie niemożliwa, komórkowe hodowle organotypowe stanowią cenną okazję do badania tych komórek w naczyniu hodowlanym w ich naturalnym kontekście tkankowym. Wykorzystanie korelacji białek jako odczytu odpowiedzi na uszkodzenie DNA jest bardzo pouczające, szczególnie w odniesieniu do komórek Purkinjego. Główną funkcją kinazy białkowej ATM jest regulacja odpowiedzi na uszkodzenie DNA, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności genomu i homeostazy komórkowej w obliczu trwającego uszkodzenia DNA, które występuje w każdej komórce.Musimy wskazać krytyczną zmianę DNA, której naprawa jest wadliwa w komórkach Purkinjego z niedoborem ATM, i mamy nadzieję, że uda nam się to zrobić za pomocą tych kultur organotypowych móżdżku. Powinno to pozwolić nam lepiej zrozumieć fizjologiczne i molekularne podstawy najważniejszego i najbardziej niszczycielskiego objawu A-T, jakim jest zwyrodnienie móżdżku. Na początek dodaj jeden mililitr Basal Medium Eagle do każdego dołka sześciodołkowej płytki.I za pomocą sterylnych kleszczy umieść wkładkę do hodowli jednokomórkowej w każdym dołku. Inkubuj płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Po ustawieniu obszaru sekcji w okapie biologicznym, umyj narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu, a następnie PBS.Następnie umieść uśpione zwierzę w obszarze sekcji i wykonaj małe nacięcie nożyczkami z dala od móżdżku, aby odsłonić mózg. Za pomocą pęsety z zaokrąglonymi końcami delikatnie oderwij czaszkę i usuń czaszkę na małe kawałki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki móżdżku. Odsłoń tkankę mózgową, aby wyodrębnić móżdżek i odłącz trzy pary szypułek za pomocą drobno zakrzywionej szpatułki tęczówki, aby oddzielić korę móżdżku od pnia mózgu.Następnie wsuń szpatułkę między móżdżek, górny wzgórek i pień mózgu, aby odzyskać móżdżek. Na początek pobierz móżdżek od 10-dniowego szczeniaka myszy w zimnym buforze preparacyjnym. Po usunięciu nadmiaru bufora umieść móżdżek na platformie tnącej w orientacji pionowej.Przeprowadzić krojenie przystrzałkowe przy grubości plastra 350 mikrometrów. Delikatnie oddziel plastry drobną szpatułką do tęczówki i umieść je w zimnym podłożu preparacyjnym. Pod lornetką użyj dwóch zakrzywionych szpatułek tęczówki, aby ostrożnie oddzielić od siebie plasterki tkanki.Do hodowli używaj plastrów pochodzących z robaka móżdżku znajdującego się w przyśrodkowej strefie korowo-jądrowej narządu. Za pomocą szerokiej szpatułki przenieś każdy wycinek tkanki na wkładkę hodowlaną. Przenieść każdą wkładkę zawierającą plasterek tkanki do dołka w sześciodołkowej płytce zawierającej wstępnie podgrzane podłoże.Podczas inkubacji należy odessać zużytą pożywkę sterylną szklaną pipetą. Używając pięciomililitrowej pipety serologicznej, dodaj jeden mililitr świeżej pożywki Basal Medium Eagle tak, aby końcówka pipety opierała się o ścianę studzienki, nie naruszając tkanki. Na początek posaz posiekaną tkankę móżdżku pobraną od 10-dniowego szczeniaka myszy w Basal Medium Eagle.Dodaj substancje chemiczne uszkadzające DNA bezpośrednio do pożywki hodowlanej w odpowiednich stężeniach końcowych. Po okresie ekspozycji zastąpić pożywkę świeżo przygotowaną mieszanką zawierającą substancje chemiczne uszkadzające DNA oraz inhibitor glikohydrolazy poliADP-rybozy i inkubować przez 30 minut. Po 30 minutach umyj plastry 0,1-molowym buforem fosforanowym w temperaturze pokojowej i natychmiast utrwal je wstępnie schłodzoną mieszaniną acetonu i metanolu.Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie usuń roztwór utrwalający i przemyj go 0,4-molowym buforem fosforanowym. Dodaj 100 mikrolitrów 0,1-molowego buforu fosforanowego do każdego dołka 48-dołkowej płytki.Następnie za pomocą skalpela i deski do krojenia usuń marginesy wkładki, przecinając plasterek tkanki. Umieść plasterek w dołku na płytce 48-dołkowej. Po zassaniu buforu inkubować wkładkę ze 100 mikrolitrami 0,1-molowego buforu fosforanowego zawierającego 1%Triton X-100.Odessać roztwór i seryjnie inkubować wkładkę w każdym dołku na wytrząsarce z odpowiednią ilością roztworu blokującego, a następnie przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Dodać 20 mikrolitrów końcowego roztworu DAPI do każdego dołka na 20 minut przed końcem dwugodzinnej inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym i kontynuować wytrząsanie przez 20 minut. Do montażu umieść chusteczkę na szkiełku mikroskopowym chusteczką skierowaną do góry.Dodaj podłoże montażowe i przykryj szkłem nakrywkowym. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Foliacja móżdżku została utrzymana w kulturze.Komórki Purkinjego wybarwiono na obecność kalbindyny D-28k, a jądra neuronalne wybarwiono na obecność NeuN. Astrocyty w komórkach Purkinjego zostały wybarwione pod kątem GFAP. Barwienie PAR wzrosło w leczonych komórkach Purkinjego po ekspozycji na bromian potasu i parakwat, co wskazuje na uszkodzenie DNA.

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Ten film ilustruje technikę uzyskiwania organotypowych wycinków móżdżku z mózgu szczeniaka myszy i hodowania tych wycinków w pożywkach uzupełnionych składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu, aby naśladować rozwój móżdżku in vitro. Dodatkowo określone wycinki móżdżku są traktowane badanym związkiem, a zdolność neuroprotekcyjna związku jest analizowana przy użyciu techniki barwienia immunofluorescencyjnego.

Analiza przeżywalności komórek Purkiniego w organotypowych kulturach warstwowych móżdżku

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisano szczegółowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksów naprawy DNA w komórkach Bacillus subtilis.

Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis

Poznaj mechanizmy odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego przy użyciu kultur organotypowych móżdżku myszy. Ta metoda pozwala badać rolę białka ATM w degeneracji móżdżku.

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Przeglądaj więcej filmów