Name: Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (CAR Tregs) do zastosowań terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych, transplantologii i onkologii. Protokół obejmuje izolację komórek, transdukcję wirusową oraz ocenę funkcjonalności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LMRF jest finansowany przez Human Islet Research Network (HIRN) Emerging Leader in Type 1 Diabetes grant U24DK104162-07, American Cancer Society (ACS) Institutional Research Grant IRG-19-137-20, South Carolina Clinical and Translational Research (SCTR) Pilot Project Discovery Grant 1TL1TR001451-01, Diabetes Research Connection (DRC) Grant IPF 22-1224 oraz Swim Across America Grant 23-1579. RWC jest wspierany przez grant szkoleniowy w zakresie nauk komórkowych, biochemicznych i molekularnych T32GM132055 oraz stypendium Hollings Cancer Center Lowvelo Graduate Fellowship. Badanie to było częściowo wspierane przez Flow Cytometry and Cell Sorting Shared Resource, Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina (P30 CA138313). Specjalne podziękowania dla dr Qizhi Tang z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF) za uprzejme podarowanie zmutowanych plazmidów CAR.

Engineering and Expansion of Human CAR Tregs for Immune Regulation Therapies

<ol><li>Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+in+hematological+malignancies%3A+current+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges.</a> Front Immunol. 13, 927153(2022).</li>
<li>Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcomes+following+CAR+T+cell+therapy%3A+what+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).</li>
<li>Choi, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+CARv3-TEAM-E+T+cells+in+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma.</a> N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+delivery+of+IL-13Ralpha2-targeting+CAR-T+cells+in+recurrent+high-grade+glioma%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).</li>
<li>Bagley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+bivalent+CAR+T+cells+targeting+EGFR+and+IL13Ralpha2+in+recurrent+glioblastoma%3A+phase+1+trial+interim+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results.</a> Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).</li>
<li>Ghobadinezhad, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+regulatory+cell-based+therapy+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease.</a> Front Immunol. 13, 1075813(2022).</li>
<li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li>
<li>Sakaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and human disease.</a> Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).</li>
<li>Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regulatory+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Next-generation regulatory T cell therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+human+autoimmunity%3A+current+practice+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).</li>
<li>Sawitzki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+cell+therapy+in+kidney+transplantation+%28The+ONE+Study%29%3A+a+harmonised+design+and+analysis+of+seven+non-randomised%2C+single-arm%2C+phase+1%2F2A+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials.</a> Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).</li>
<li>Spanier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+with+an+MHC+class+II+peptide-specific+chimeric+antigen+receptor+prevent+autoimmune+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice.</a> J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).</li>
<li>Muller, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+engineering+of+an+anti-HLA-A2+chimeric+antigen+receptor+in+regulatory+T+cells+for+transplant+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance.</a> Front Immunol. 12, 686439(2021).</li>
<li>MacDonald, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen-specific+regulatory+T+cells+generated+with+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).</li>
<li>Boardman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-specific+human+CAR+Tregs+for+immune+regulation+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD.</a> J Autoimmun. 134, 102961(2023).</li>
<li>Schreeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+design%3A+human+leukocyte+antigen+Cclass+I+molecule+A%28%2A%2902-chimeric+antigen+receptor+regulatory+T+cells+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int+Rep%22%5BJournal%5D)">Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation.</a> Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).</li>
<li>Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+human+conventional+and+regulatory+T+cells+using+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors.</a> Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+decrease+of+donor-reactive+T%28regs%29+after+liver+transplantation+limits+T%28reg%29+therapy+for+promoting+allograft+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans.</a> Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).</li>
<li>Bender, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+randomized+trial+with+autologous+polyclonal+expanded+regulatory+T+cells+in+children+with+new-onset+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes.</a> Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).</li>
<li>Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conference+report%3A+Advanced+Therapies+Week+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Conference report: Advanced Therapies Week 2023.</a> Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).</li>
<li>Cochrane, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+test+human+CAR+T+cells+in+solid+tumors%2C+the+next+frontier+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy.</a> Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).</li>
<li>Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+gamma-irradiated+versus+mitomycin+C-treated+feeder+cells+for+the+expansion+of+normal+human+cells+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematother+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures.</a> J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Production+everywhere%3A+a+simple%2C+fast%2C+and+reliable+protocol+for+in-house+AAV+vector+production+based+on+chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction.</a> Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).</li>
<li>Velasco Cardenas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+CD3+diversity+to+optimize+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells.</a> Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).</li>
<li>Boomer, J. S., Green, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enigmatic+tail+of+CD28+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">An enigmatic tail of CD28 signaling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).</li>
<li>Suhoski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).</li>
<li>Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+T+cell+subsets+with+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transduction of human T cell subsets with lentivirus.</a> Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).</li>
<li>Bailey-Bucktrout, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-antigen-driven+activation+induces+instability+of+regulatory+T+cells+during+an+inflammatory+autoimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response.</a> Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+Helios-deficient+Tregs+is+associated+with+conversion+to+a+T-effector+phenotype+and+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).</li>
<li>Dawson, N. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+chimeric+antigen+receptor+co-receptor+signaling+domains+in+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells.</a> Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).</li>
<li>Rana, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-+and+TRuC-redirected+regulatory+T+cells+differ+in+capacity+to+control+adaptive+immunity+to+FVIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII.</a> Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).</li>
<li>Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+human+T+regulatory+cells+with+the+mTOR-inhibitor+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin.</a> Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).</li>
<li>Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+allelic+exclusion%3A+an+update+and+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal.</a> J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Samarasinghe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+alloreactive+T+cells+identifies+CD25+and+CD71+as+optimal+targets+for+a+clinically+applicable+allodepletion+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy.</a> Blood. 115 (2), 396-407 (2010).</li>
<li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP3+protects+conventional+human+T+cells+from+premature+restimulation-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).</li>
<li>Collison, L. W., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Treg+suppression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro Treg suppression assays.</a> Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).</li>
</ol>

LMRF jest wynalazcą i otrzymał tantiemy z patentów na zmodyfikowane komórki odpornościowe oraz konsultuje się z Guidepoint Global i McKesson. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten zapewnia usprawnioną i kompleksową metodologię generowania i oceny ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (CAR Treg). Sukces technologii CAR w leczeniu nowotworów hematologicznych zainspirował jej zastosowanie w immunosupresyjnym podzbiorze limfocytów T, Treg. W przeciwieństwie do konwencjonalnych limfocytów T, limfocyty Treg hamują odpowiedź immunologiczną, oferując potencjalne metody leczenia stanów wynikających z niepożądanej odporności, takich jak choroba autoimmunologiczna...

Terapie limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CAR) zrewolucjonizowały leczenie nowotworów hematologicznych, osiągając niezwykle wysokie wskaźniki remisji w wcześniej nieuleczalnych nowotworach1,2. Zachęcające wczesne wyniki z wykorzystaniem limfocytów CAR T w leczeniu glejaka3,4,5 podkreślają wszechstronność technologii CAR i jej przyszły potencjał w zakresie zwalczania szerokiego zakresu nowotworów złośliwych. W miarę jak naukowcy badają dalsze zastosowania CAR, limfocyty T regulatorowe (Treg) okazały się obiecującym typem komórek. Tregi odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy immunologicznej i regulacji odpowiedzi immunologicznej poprzez kilka mechanizmów, w tym sekwestrację IL-2, wydzielanie cytokin immunosupresyjnych i modulowanie komórek prezentujących antygen6,7.
Dzięki technologii CAR, Tregi mogą być wykorzystywane do leczenia odrzucenia przeszczepu narządu, chorób autoimmunologicznych i zaburzeń zapalnych, takich jak alergie i astma6,8,9. Przeciwciała Treg CAR mogą prowadzić do znacznej poprawy wyników leczenia i jakości życia pacjentów poprzez ograniczenie stosowania leków immunosupresyjnych, które hamują działanie układu odpornościowego jako całości i wiążą się ze szkodliwymi skutkami ubocznymi10,11. Modele przedkliniczne wykazały obiecujące wyniki w translacji technologii CAR na limfocyty Treg, z udanymi zastosowaniami w chorobach takich jak cukrzyca typu 1, stwardnienie rozsiane, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i nieswoiste zapalenie jelit9,12,13,14,15. W klinice prowadzone są obecnie badania nad limfocytami Treg CAR w celu zapobiegania odrzuceniu przeszczepu narządów litych16.
Ten artykuł przedstawia szczegółową metodologię generowania ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR). Protokół ten polega na izolowaniu limfocytów Treg z ludzkiej krwi obwodowej i genetycznej modyfikacji ich przy użyciu technik takich jak transdukcja lentiwirusowa i precyzyjne wbijanie genów przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 i wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Opisujemy również ocenę stabilności fenotypowej i funkcji supresyjnej tych zmodyfikowanych limfocytów Treg, które są kluczowymi krokami w celu walidacji ich potencjału terapeutycznego17,18,19. Takie podejście usprawnia projektowanie i wczesne testowanie terapii CAR Treg, które mają potencjał do rozszerzenia transformacyjnego wpływu terapii limfocytami T CAR na regulację układu odpornościowego. Dzieląc się naszą metodologią, mamy nadzieję zainspirować do dalszych badań i innowacji w rozwijającej się przestrzeni terapii CAR Treg9,20.

<table><tbody><tr><td>Wirus związany z adenowirusem&nbsp;( AAV)</td> <td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAR z ekspresją docelową komórek K562</td><td></td><td></td><td>, np. CD19-K562</td></tr><tr><td>promiennik</td><td></td><td></td><td></td>cezu-137</tr><tr><td>Anty-ludzki CD8 PerCP (klon SK1)</td> <td>Biolegend</td><td>344708</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD4 PE / Cy7 (klon SK3)</td> Magnes <td>Biolegend</td><td>344612</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15</td><td>ThermoFisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Ghost BV510 barwnik żywotności&nbsp;</td><td>Komórki TONBO</td><td>13-0870-T100</td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chlorku amonu</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD127 PE (klon hIL-7R-M21)</td><td>BD Biosciences</td><td>557938</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD25 APC (klon BC96)</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>302610</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD4 FITC (klon SK3)</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>344604</tr><tr><td>Anty-ludzki CD71 PE (klon SK1)</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD8 PerCP (klon SK1)</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>344707</tr><tr><td>Anty-ludzki CTLA-4 PerCP-e710</td><td>ThermoFisher</td><td>46-1529-42</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki EGFR APC (klon AY13)</td><td>Biolegend</td><td>352905</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki FOXP3 eFluor 450</td><td>ThermoFisher</td><td>48-4776-42</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki HELIOS PE</td><td>Biolegend</td><td>137216</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ oraz Mg2+ wolne Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek (automatyczny licznik komórek TC20)</td><td></td>Szkiełka do liczenia <td>komórek Bio-Rad</td> 1450102 <td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Zestaw do proliferacji komórek fioletowych</td><td>ThermoFisher</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Probówki DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Easy 50 EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T EasySep CD4+</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania limfocytów T EasySep Human CD8+</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>Magnes EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Zestaw do barwienia czynnikiem transkrypcyjnym Foxp3</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego z zatrzaskiem z sitkiem do komórek, 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2</td></tr><tr><td>Aktywowany fluorescencją sortownik komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACS Sortownik komórek Aria III</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka ekspansja i aktywacja komórek T CD3/28 Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji Invitrogen Neon</td><td>ThermoFisher</td><td>10431915</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji Invitrogen Neon 100 &mu; L Zestaw</td><td>ThermoFisher</td><td>10114334</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych&nbsp;</td><td>Przeciwciało Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Myc Tag A647 (klon 9B11)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>2233S</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicy</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>roztwór penicyny-streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka interleukina-2 (rhIL-2)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 podłoże, bez glutaminy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr spektralny przepływowy</td><td>Cytek</td><td></td><td>Northern</td></tr><tr><td>Lights TRAC gRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>Sequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>ThermoFisher</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1/10 Leukopak</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0092</td><td>1-2 miliardy PBMC</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich limfocytów t regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) zmieniła oblicze leczenia raka, prowadząc do rekordowych wskaźników remisji w wcześniej nieuleczalnych nowotworach hematologicznych. Sukcesy te wzbudziły zainteresowanie adaptacją platformy CAR do niewielkiego, ale kluczowego podzbioru limfocytów T CD4 + odpowiedzialnych głównie za regulację i hamowanie odpowiedzi immunologicznej, limfocytów T regulatorowych (Treg). Zdolność do przekierowania aktywności immunosupresyjnej limfocytów Treg na dowolny cel zewnątrzkomórkowy ma ogromne implikacje dla tworzenia terapii komórkowych w chorobach autoimmunologicznych, odrzucaniu przeszczepów narządów i chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. Tutaj szczegółowo opisujemy metodologie izolacji limfocytów Treg w dobrej wierze z ludzkiej krwi obwodowej, modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów Treg z wykorzystaniem lentiwirusa lub wspomaganego przez CRISPR / Cas9 knock-in przy użyciu dostarczania szablonu homologicznej naprawy ukierunkowanej (HDR) za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem oraz ekspansji ex vivo stabilnych ludzkich Treg CAR. Na koniec opisujemy ocenę stabilności fenotypowej ludzkiego CAR Treg i funkcji supresyjnej in vitro, co zapewnia wgląd w to, jak ludzkie Treg CAR będą się zachowywać w zastosowaniach przedklinicznych i klinicznych.

Opisany tutaj protokół zapewnia usprawnioną i zestandaryzowaną procedurę oceny nowych konstruktów chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) w ludzkich limfocytach T regulatorowych (Tregs), w celu stworzenia żywych terapii chorób autoimmunologicznych, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucania przeszczepów narządowych oraz alergii. Rysunek 1 przedstawia sposób uzyskiwania wysokiej czystości ludzkich Tregs z krwi obwodowej za pomocą FACS (Rysunek 1A), c...

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

Nasze laboratorium projektuje sztuczne receptory odpornościowe, takie jak chimeryczne receptory antygenowe, i bada, jak wpływają one na biologię regulatorowych limfocytów T. Wymyślając nowe sekwencje DNA i wykorzystując humanizowane mysie modele chorób, dążymy do stworzenia zmodyfikowanych terapii komórkami odpornościowymi w chorobach autoimmunologicznych, odrzuceniu przeszczepu, raku i starzeniu się. Projektując chimeryczne receptory antygenowe dla regulatorowych limfocytów T, należy wziąć pod uwagę ich siłę.Tregi CAR o wysokim powinowactwie zachowują się bardziej jak efektorowe limfocyty T, wytwarzając zwiększone cytokiny zapalne i wykazując większą aktywność zabijającą. Nasze trwające badania wskazują, że zmniejszenie powinowactwa do CAR prowadzi do poprawy profilu cytokin i funkcji w CAR Treg. Pole CAR Treg dopiero raczkuje i brakuje mu standaryzacji.Nasz protokół wprowadza solidne, uniwersalne podejście do generowania i testowania limfocytów Treg CAR. Zwiększa to powtarzalność i przyspiesza innowacje, a jednocześnie stanowi wytyczne dla laboratoriów, które dopiero zaczynają badania nad CAR Treg, zwłaszcza biorąc pod uwagę wyzwania związane z niedoborem Treg i specjalistycznymi wymaganiami. Badamy mechanizmy wykorzystywane przez limfocyty T regulatorowe do utrzymania równowagi immunologicznej i wspomagania gojenia się tkanek.Nasze badania obejmują zrozumienie sygnalizacji i funkcji CAR Treg, a także badanie nowych kontekstów chorobowych, w których terapia CAR Treg może przynieść wyjątkowe korzyści w porównaniu z obecnymi strategiami. Na początek przenieś zawartość leukopaku do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodać równą objętość DPBS z 2% płodową surowicą bydlęcą i delikatnie wymieszać pipetą.Wiruj probówkę z prędkością 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu supernatantu należy rozpuścić osad komórkowy w dwóch mililitrach DPBS z 2% płodową surowicą bydlęcą. Następnie dodaj osiem mililitrów roztworu chlorku amonu do zawiesiny komórek i wymieszaj przez delikatne odwrócenie.Po odłamaniu odwiruj umyte komórki w masie 150 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 30 mililitrach DPBS z 2% płodową surowicą bydlęcą. Następnie wiruj w dół od 10 do mocy od ośmiu do 10 do mocy dziewięciu PBMC przy 500 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.I ponownie zawiesić w buforze do separacji komórek w stężeniu pięć razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr. W celu wspomaganego fluorescencją sortowania komórek regulatorowych limfocytów T, należy obracać komórki CD4-dodatnie przy 500 g przez pięć minut. Następnie rozpuść komórki w 200 mikrolitrach DPBS.Na każdy milion komórek dodaj jeden mikrolitr anty-ludzkiego CD4 FITC, jeden mikrolitr anty-ludzkiego CD25 APC i jeden mikrolitr anty-ludzkiego CD127 PE. Po delikatnym zawirowaniu rurki umieść ją w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Po umyciu komórek 10 mililitrami DPBS z 2% płodową surowicą bydlęcą, wiruj je w 500 g przez pięć minut i delikatnie ponownie zawieś wybarwione komórki w ilości 1,5 razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr w DPBS z 2% płodową surowicą bydlęcą. Następnie przepuść wybarwioną zawiesinę komórek przez 40-mikrometrową nasadkę filtrującą do probówek do sortowania komórek wspomaganych fluorescencją.Przygotuj 15-mililitrowe probówki zbiorcze zawierające trzy mililitry pożywki RPMI10 i umieść je na lodzie. Na koniec posortuj CD4 dodatnie, CD25 wysokie, CD127 ujemne regulatorowe limfocyty T i CD4 dodatnie, CD25 niskie, CD127 dodatnie konwencjonalne limfocyty T za pomocą sortowania komórek wspomaganych fluorescencją. Na początek weź regulatorowe limfocyty T wyizolowane z ludzkiej krwi 48 godzin po aktywacji i ponownie je zamieść.Po policzeniu komórek wiruj z prędkością 500 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić regulatorowe limfocyty T w RPMI10 przy 1,25 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr z 1 000 jednostek międzynarodowych na mililitr interleukiny-2. Teraz dodaj każdą podwielokrotność lentiwirusa do 2,5 razy 10 do mocy pięciu regulatorowych limfocytów T w 200 mikrolitrach w probówce do mikrowirówki.Spinokulować w ilości 1 000 g przez godzinę w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Przenieś każdą reakcję o pojemności 200 mikrolitrów na płytkę 24-dołkową. Inkubować płytkę z transdukowanymi regulatorowymi limfocytami T w inkubatorze do hodowli tkankowych przez noc.Uzupełnij każdą studzienkę do dwóch mililitrów pożywką RPMI10, przy czym końcowe stężenie interleukiny-2 wynosi 1 000 jednostek międzynarodowych na mililitr. Oceń skuteczność modyfikacji genów za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano tutaj. Na początek weź zawieszone regulatorowe limfocyty T z kulkami anty-CD3, CD28 w 15-mililitrowej stożkowej probówce 48 godzin po aktywacji.Inkubuj zawiesinę komórkową w magnesie przez trzy minuty. Będąc w magnesie, przenieś komórki w pożywce za pomocą pipety do nowej probówki. Po usunięciu kulek pozwól zdekoraplikowanym limfocytom T regulatorowym odpoczywać w RPMI10 przez dwie godziny.Następnie wiruj limfocyty T regulatorowe przy 500 g przez pięć minut. Po zdekantacji supernatantu ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym zredukowanym podłożu surowicy w ilości cztery razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Podwielokrotne komórki w 100 mikrolitrach w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych o niskiej zawartości białka.Dodać wirusa związanego z adenoreceptorem chimerycznego receptora antygenowego przy wielokrotności infekcji 20 000 do każdej próbki i ponownie zawiesić. Następnie inkubować probówki reakcyjne w inkubatorze do hodowli tkankowych przez godzinę. Podczas inkubacji przygotuj kompleksy rybonukleoproteinowe CRISPR-Cas9, dodając 8,3 mikrolitra białka Cas9 do 2,5 mikrolitra pojedynczego przewodnika RNA, celując w locus genu torowego.Po dokładnym wymieszaniu składników inkubować mieszaninę rybonukleoprotein przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie napełnij świeżą probówkę do elektroporacji trzema mililitrami buforu do elektroporacji o wysokiej osmolarności. Włóż napełnioną rurkę do elektroporacji do stacji pipetowej systemu elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie.Ustaw warunki elektroporacji na 2 200 woltów, 20 milisekund, jeden impuls w systemie elektroporacji. Po zakończeniu godzinnej inkubacji z wirusem związanym z adenowirusem, należy obracać komórki z wirusem w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach buforu do ponownego zawieszania komórek dostarczanego przez system elektroporacji na próbkę.Następnie dodaj 10,8 mikrolitra kompleksu rybonukleoproteinowego na próbkę i dobrze wymieszaj pipetą, nie tworząc pęcherzyków. Teraz włóż końcówkę do elektroporacji o pojemności 100 mikrolitrów, dociskając pipetę do drugiego oporu, aby otworzyć zacisk. Umieść górną głowicę pipety w końcówce elektroporacji, aż zacisk bezpiecznie zatrzaśnie się z trzpieniem mocującym tłoka.Stopniowo zwalniaj przycisk, utrzymując nacisk na pipetę skierowany w dół, aby upewnić się, że końcówka jest dobrze dopasowana bez żadnych szczelin. Następnie dociśnij pipetę do pierwszego oporu i zanurz końcówkę elektroporacji w mieszaninie rybonukleoprotein komórek. Delikatnie wciągnąć próbkę do pipety bez pęcherzyków powietrza.Włóż pipetę z zamontowaną końcówką do elektroporacji zawierającą próbkę pionowo do rurki E, aż usłyszysz dźwięk kliknięcia. Po potwierdzeniu optymalnych ustawień dla ludzkich regulatorowych limfocytów T, naciśnij Start na ekranie dotykowym, aby elektroporować ogniwa. Poczekaj, aż ekran dotykowy zostanie wyświetlony po zakończeniu wyświetlania.Delikatnie wyjąć pipetę i natychmiast przenieść próbkę do przygotowanej sześciodołkowej płytki zawierającej 2,5 mililitra wstępnie podgrzanej, wolnej od antybiotyków pożywki RPMI10 z interleukiną-2 na dołek. Po delikatnym kołysaniu płytki ruchami liniowymi umieść ją w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnego dnia, 16 do 18 godzin później, zastąp pożywkę pożywką zawierającą antybiotyki.Policz elektroporowane regulatorowe limfocyty T i hodowlę w ilości 10 do potęgi sześciu komórek na mililitr z 1 000 jednostek międzynarodowych na mililitr interleukiny-2.

generation-of-human-chimeric-antigen-receptor-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania limfocytów T z chemerycznym receptorem antygenu (CAR) specyficznym dla antygenu poprzez transdukcję retrowirusową. Aktywowane mysie limfocyty T CD8 + dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej rekombinowanymi fragmentami fibronektyny. Następnie wprowadza się wektory retrowirusowe zawierające transgeniczne RNA kodujące specyficzny dla antygenu chimeryczny receptor antygenowy (CAR), a płytkę odwirowuje się w celu ułatwienia transdukcji. Po inkubacji...

Technika wytwarzania limfocytów CAR T specyficznych dla antygenu

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Ten protokół opisuje proces transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą interesującego genu, zapewniając zgodność ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP).

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Tutaj prezentujemy protokół generowania i funkcjonalnej weryfikacji wrażliwych na niedotlenienie komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T. Protokół ten przedstawia generację wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T opartą na lentiwirusie i ich charakterystykę, w tym walidację zależnej od hipoksji ekspresji CAR i selektywnej cytotoksyczności.

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Poznaj metodę wytwarzania ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (CAR Tregs) do zastosowań terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych, transplantologii i onkologii. Protokół obejmuje izolację komórek, transdukcję wirusową oraz ocenę funkcjonalności.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Przeglądaj więcej filmów