Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

Nasze laboratorium bada wpływ powszechnie stosowanych środków znieczulających na neurony związane ze snem i ich szlaki komunikacyjne. Naszym celem jest lepsze zrozumienie, w jaki sposób środki znieczulające wpływają na endogenne szlaki snu oraz wpływają na sen okołooperacyjny i funkcje poznawcze. Niedawno zidentyfikowaliśmy anatomiczne podłoża dla niektórych zmian snu spowodowanych niektórymi rodzajami znieczulenia ogólnego.

Zrobiliśmy to, używając genetycznie zmodyfikowanych myszy, u których występuje endogenna ekspresja C-fos, markera aktywacji neuronów. Jednak dzięki tej nowej technice będziemy w stanie bezpośrednio zmierzyć pobudliwość komórkową w grupach neuronów w pniu mózgu, które są związane ze snem. Jest to główna zaleta w porównaniu z prostym ilościowym określaniem ekspresji C-fos jako zastępczego markera aktywacji neuronów.

Naszym następnym krokiem będzie zbadanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw zmian snu wywołanych przez niektóre rodzaje znieczuleń ogólnych. Będzie to wymagało pomiaru pobudliwości komórkowej w neuronach pnia mózgu związanych ze snem za pomocą sond neuropikselowych, a także zastosowania podejść przestrzenno-transkryptomicznych w celu ilościowego określenia i mapowania ekspresji genów związanych ze snem w tych obszarach. Aby rozpocząć, wykonaj elektrokortykografię lub zestaw słuchawkowy ECoG, przylutowując drut ze stali nierdzewnej pokryty alkoksylem Furfural do trzypinowego złącza header.

Po zidentyfikowaniu współrzędnych wstawiania na podstawie atlasu stereotaktycznego myszy, umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej. Umieść nos zwierzęcia w stożku nosowym i ustabilizuj głowę za pomocą prętów na głowę. Następnie wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.

Po wykonaniu pięciomilimetrowego nacięcia skóry głowy nad kośćmi ciemieniowymi i potylicznymi, zeskrob opony mózgowe ostrzem skalpela, aby je usunąć. Użyj ostrza skalpela, aby przeciąć przyczepy mięśniowe i odsłonić kości ciemieniowe i potyliczne. Zastosuj nadtlenek wodoru, aby zatamować krwawienie i osuszyć powierzchnię czaszki.

Następnie zidentyfikuj punkty orientacyjne bregma i lambda na czaszce. Następnie dostosuj pozycję stożka nosa, aby wyrównać przednią tylną pozycję czaszki. Aby wyrównać przyśrodkową boczną pozycję czaszki, wybierz dwa przeciwległe punkty między bregmą a lambdą i sprawdź ich poziom.

Teraz zmierz odległość między bregmą a lambdą i porównaj ją z odległością podaną w atlasie stereotaktycznym Franklin Paxino. Użyj różnicy między zmierzonymi i zgłoszonymi odległościami, aby proporcjonalnie przeskalować przednią tylną współrzędną. Zaznacz współrzędne kraniotomii na czaszce wysterylizowanym ołówkiem.

Za pomocą mikromanipulatora stereotaktycznego umieść płytkę głowy bezpośrednio na szwie Lambda. Nałóż cement dentystyczny na płytę głowy i wokół niej, aby przymocować go do czaszki i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Następnie wywierć otwory na zadziory na dwie elektrody korowe i jedną elektrodę referencyjną.

Umieść odizolowane końce powlekanych elektrod z drutu srebrnego w otworach na zadziory i zabezpiecz je żywicą aktywowaną światłem ultrafioletowym. Całkowicie przykryj powlekane druty ze stali nierdzewnej cementem dentystycznym, aby żaden drut nie był odsłonięty. Przykryj spód i boki zestawu słuchawkowego cementem dentystycznym, aby upewnić się, że jest mocno osadzony i pozwól myszy dojść do siebie przez siedem dni.

Umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej. Zidentyfikuj bregmę i lambdę, upewniając się, że różnica wysokości między tymi dwoma punktami orientacyjnymi nie przekracza 100 mikrometrów. Znajdź i zaznacz obliczone współrzędne na czaszce sterylnym ołówkiem.

Wokół współrzędnych utwórz kontur okna kraniotomii o wymiarach dwa milimetry na dwa milimetry. Po sprawdzeniu głębokości znieczulenia użyj wiertła szybkoobrotowego, aby stworzyć okno kraniotomii o wymiarach dwa milimetry na dwa milimetry. Zastosuj 0,5 do jednego mililitra normalnej soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu.

Usunąć oponę twardą za pomocą igły strzykawkowej i drobnych kleszczyków. Następnie użyj wiertła szybkoobrotowego, aby utworzyć oddzielny otwór na elektrodę odniesienia sondy krzemowej, zwykle od jednego do dwóch milimetrów od okna czaszki. Nałóż 0,2 mililitra kleju silikonowego o niskiej toksyczności na czaszkę, aby całkowicie uszczelnić kraniotomię.

Za pomocą płytki głowicy i przymocuj głowę myszy do urządzenia rejestrującego elektrofizjologię. Następnie pokryj trzpień sondy krzemowej barwnikiem fluorescencyjnym, aby trajektorię sondy można było zrekonstruować po eksperymencie. Następnie zamontuj sondę na manipulatorze i ustaw żądany kąt.

Aby opuścić sondę rejestrującą na powierzchnię mózgu w środku okna czaszki, ręcznie włóż sondę na głębokość około 300 mikrometrów. Po włożeniu na tę głębokość powoli automatycznie opuść sondę do 200 mikrometrów na minutę na docelową głębokość, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek. Na koniec nałóż olej mineralny na powierzchnię mózgu w oknie kraniotomii, aby zapobiec wysuszeniu.

Następnie rejestruj dane z sondy krzemowej i ECOG w 30 kilohercach za pomocą kontrolera rejestrującego Intan. Większość zarejestrowanych neuronów zmniejsza swoje wypalanie podczas znieczulenia Sewofluranem. Wystrzeliwanie vlPAG znacznie zmniejszono od wartości wyjściowej do okresu stosowania sewofluranu.

Spadek ten był spójny we wszystkich neuronach vlPAG.