Name: Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj optymalizację modeli zakażenia Galleria mellonella do przesiewowych ocen przeciwdrobnoustrojów. Standaryzowane protokoły poprawiają niezawodność badań przedklinicznych i przyspieszają odkrywanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TB, AK, JF i DN otrzymały wsparcie grantowe dla Strategic Research Centre (SRC) "Oparte na dowodach ramy przedkliniczne dla rozwoju terapii przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie" (PIPE-CF; Projekt nr SRC 022) od UK Cystic Fibrosis Trust oraz US Cystic Fibrosis Foundation. LD i JF potwierdzają finansowanie od Kidney Research North West (Projekt nr 49/19).

W tym badaniu wybrano larwy Galleria mellonella (większy woskowej) jako model do testów podatności na antybiotyki oraz badań ostrej toksyczności. Nie jest wymagana etyczna zgoda na eksperymentalne stosowanie Galleria mellonella. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Projektowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Określ odpowiednie wielkości grup larw Galleria mellonella na podstawie proporcjonalnej zmiany przeżywalności larwalnej, którą ma uchwycić badanie. Tabela 1 szczegółowo opisuje rozmiary grup potrzebne do wykrycia określonych procentowych zmian przeżycia przy użyciu modelu zakażenia szczepem PAO1 szczepem Pseudomonas . UWAGA: Przy użyciu nowego patogenu najpierw określ zmienność między testami w proporcjonalnej przeżywalności zakażonych, ale nieleczonych larw, ponieważ wpłynie to na określenie wielkości próbki.<ol>
		<li>Uwzględnić dwie grupy środków kontrolnych PBS: jedną wstrzykniętą przed resztą infekcji, aby upewnić się, że strzykawka jest ostra i odpowiednia do użycia, oraz drugą wstrzykniętą podczas lub po infekcjach bakteryjnych, aby zapewnić prawidłową sterylizację między grupami infekcji. Jeśli optymalizuje się z nowym patogenem, należy uwzględnić kontrolę termiczną, aby upewnić się, że śmierć nie jest wynikiem odpowiedzi immunologicznej na obce cząstki. UWAGA: Do zastrzyków można stosować strzykawki insulinowe, co zmniejsza ryzyko stępienia i zanieczyszczenia. Jednak eksperymenty mogą rutynowo wykorzystywać setki G. mellonella, co czyni użycie strzykawek insulinowych kosztownym i marnotrawnym.</li>
		<li>W badaniach optymalizujących leczenie antybakteryjne uwzględnić dwie dodatkowe grupy kontrolne: grupę zakażoną bakteriami, która następnie poddana zabieg "sham" w ramach pojazdu, oraz grupę dwukrotnie wstrzykniętą tym pojazdem, raz w momencie infekcji w innych schorzeniach i raz podczas leczenia. UWAGA: Pierwsza jest kontrolą nieleczoną, natomiast druga kontroluje wszelkie urazy spowodowane zastrzykami. Takie urazy są bardziej prawdopodobne, gdy stosuje się igły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamów G. mellonella u dostawcy żywej przynęty lub utrzymuj kolonię G. mellonella zgodnie z wcześniejszymi fragmentami 5,6,7. Dla dostawcy wymienionego w Tabeli Materiałów należy zamówić 1,8 razy więcej larw niż planowana, ponieważ około 33% zostanie wykluczonych ze względu na rozmiar, a kolejne 10% może umrzeć po sterylizacji skórek.<ol>
		<li>Określ zmienność wagową G. mellonella przed zastosowaniem eksperymentalnym i upewnij się, że zakres wagowy nie przekracza jednego odchylenia standardowego od średniej. UWAGA: Dla dostawców niewymienionych w Tabeli Materiałów należy zorganizować dostarczenie nowego zapasu przez dostawcę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po otrzymaniu przechowuj G. mellonella w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć ryzyko powstania kokonu, które następuje po inkubacji w temperaturze 37 °C. UWAGA: Nie wszystkie larwy od komercyjnych dostawców tworzą kokony, które wcześniej były używane jako wskaźnik zdrowia larw16.</li>
	<li>Larwy używaj w ciągu tygodnia od otrzymania, wtedy nie wymagają karmienia. UWAGA: Chociaż stadium życia larw różni się między grupami, większość larw jest dostarczana podczas ostatniego stadium przed poczwarką. Na tym etapie naturalne karmienie maleje w porównaniu do wcześniejszych etapów17.</li>
</ol>
2. Sterylizacja i selekcja larw G. mellonella
<ol>
	<li>Zważ larwy Galleria mellonella i odrzuć te, które wykraczają poza zakres od 224 mg ± 49,2 mg, co jest średnią wagą larw plus minus jedno odchylenie standardowe. Skutkuje to wykluczeniem około 33% larw. UWAGA: Różnice wagi mogą się różnić w zależności od dostawców. Dla dostawców niewymienionych w tym protokole należy obliczyć odpowiedni zakres masy.</li>
	<li>Wykonaj następujące kroki w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Spryskaj 70% etanolem do szalki Petriego, upewniając się, że dno naczynia jest wystarczająco duże.</li>
	<li>Sterylizuj powierzchnię G. mellonella w partiach po 10-20 larw.<ol>
		<li>Każdą partię włóż osobno do misy i spryskaj larwy dwukrotnie 70% etanolem.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby zwinąć larwy, zapewniając pełne pokrycie.</li>
		<li>Usuń larwy z etanolu i umieść je w sterylnej szalce Petriego. Zostaw naczynie odkryte, aby larwy mogły wyschnąć. UWAGA: Pozostawienie G. mellonella w etanolu dłużej niż 15 sekund spowoduje wysoką śmiertelność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy około 90% larw odzyska aktywność po 2 godzinach, rozdziel odzyskane larwy na grupy o rozmiarze umożliwiającym wystarczającą wykrywalność zmian przeżywalności zgodnie z obliczeniami mocy opisanymi w Tabeli 1.</li>
	<li>Użyj G. mellonella w ciągu 6 godzin od sterylizacji.</li>
</ol>
3. Optymalizacja gęstości bakteryjnej inokulum
<ol>
	<li>Przygotuj zapas zakażenia bakteryjnego znanego CFU/mL przed zakażeniem. Metody generowania zasobów będą się różnić w zależności od organizmu. Tutaj Pseudomonas aeruginosa była hodowana do fazy średniej logarii w bulionie odżywczym, alicytatowana i zamrożona w gęstości 6 x 107 CFU/mL.</li>
	<li>Rozpylaj zakażenie, wirując w temperaturze 10 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesij w PBS. Seryjnie rozcieńczaj bakterie dziesięciokrotnie, aby uzyskać zakres dawek inokulum na poziomie 101-10 7 CFU na larwę, biorąc pod uwagę, że każda larwa jest wstrzykiwana 10 μL inokulum. UWAGA: Zakres dawki w inokulum specyficzny będzie się różnił w zależności od zjadliwości bakterii, ale proponowany zakres powinien być odpowiedni dla większości gatunków patogennych. Określenie tempa wzrostu in vitro może pomóc w wyborze odpowiedniego zakresu dawek, ponieważ specyficzne dla szczepu tempo wzrostu w hodowli ciekłej koreluje ze śmiertelnością larw.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem infekcji należy wyliczyć inokulum za pomocą rozcieńczenia seryjnego Milesa i Misry, aby dokładnie określić gęstość inokulum18.</li>
	<li>Przygotuj trzy mikrofugeurki po 1 mL zawierające sterylnedH2O, 70% etanolu lub sterylny PBS. Będą one używane stale do sterylizacji strzykawki użytej do wstrzyknięcia larw.</li>
	<li>Sprawdź sterylną strzykawkę Hamiltona o pojemności 100 μL, upewniając się, że czubek igły jest ostry i nie pojawił się haczyk, co spowoduje poważne uszkodzenie miejsca infekcji. UWAGA: Końcówka igły strzykawki Hamilton zacznie się wyginać po około 300 infekcjach. Jeśli końcówka igły jest wykrzywiona, trzeba ją wymienić.</li>
	<li>Przed infekcją przemyj strzykawkę kolejnodH2O, etanolem i PBS, pobierając i wyrzucając maksymalną pojemność strzykawki.</li>
	<li>Vortex ponownie zawiesuje inokulum infekcji i pobiera maksymalnie 100 μL do strzykawki Hamiltona, co wystarcza do wstrzyknięcia 10 μL na larwę.</li>
	<li>Każdej larwie należy podać 10 μL inokulum w tylnej prawej części nogi. Upewnij się, że igła przenika około 2 mm w głąb korpusu. UWAGA: Można stosować różne metody zakażenia. Należą do nich trzymanie larwy nad końcówką pipety, aby odsłonić przednogi, statyczne zabezpieczenie strzykawki i ręczne ustawienie G. mellonella lub wstrzyknięcie ręką.</li>
	<li>Między każdym zestawem infekcji sterylizuj strzykawkę zgodnie z krokiem 2.5, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez resztki komórek skórnych.</li>
	<li>Inkubować zakażone larwy w temperaturze wystarczającej do wzrostu mikroorganizmów, między 20 °C a 42 °C, co jest odpowiednim zakresem przeżycia G. mellonella 5.</li>
	<li>Monitoruj przeżywalność G. mellonella w regularnych odstępach czasu od momentu, gdy zwykle po raz pierwszy obserwuje się śmiertelność, aby dokładnie zmierzyć czas śmierci. Należy to ocenić podczas wstępnego przesiewu. Usuń martwe larwy i zapisz czas ich śmierci.</li>
	<li>Wybierz optymalną dawkę zakażenia do badania terapeutycznego na podstawie dawki, która daje 50% śmiertelności do 18 godzin i ponad 80% do 72 godzin. Pozwala to na szybkie jednodniowe badanie przesiewowe, jednocześnie zapewniając odpowiednią zjadliwość i odpowiednie okno terapeutyczne.</li>
</ol>
4. Testy toksyczności nowych środków przeciwdrobnoustrojowych u niezakażonych larw
<ol>
	<li>Oceń toksyczność nowych środków przeciwdrobnoustrojowych i wybranych środków w Galleria mellonella przed ich zastosowaniem u larw eksperymentalnie zakażonych. Przygotuj szeroki zakres dawek przekraczających oczekiwany zakres terapeutyczny środka przeciwdrobnoustrojowego, kierując się danymi in vitro (np. linii komórkowej), jeśli są dostępne.<ol>
		<li>Należy zauważyć, że larwy zostaną wstrzyknięte 10 μL środka terapeutycznego. Przygotuj kontrolę wyłącznie z pojazdem w stężeniach odpowiadających tym, w których podawany jest zabieg.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknij zdrową, sterylną G. mellonella w odpowiednich grupach z różnymi stężeniami antybakteryjnymi i nośnikami PBS, zgodnie z krokami 3.2-3.10. W niniejszym badaniu stosowanym środkiem przeciwdrobnoustrojowym była tobramycyna. UWAGA: W przypadku środka wymagającego DMSO jako rozpuszczalnika należy wstrzyknąć igłę o grubości 26 s, zamiast standardowej igły 22, ponieważ uraz spowodowany większymi igłami zwiększa śmiertelność przy użyciu DMSO.</li>
	<li>Bezpieczną dawkę zdefiniuj jako taką, która nie powoduje istotnej różnicy w śmiertelności w porównaniu z larwami poddanymi wyłącznie PBS.</li>
</ol>
5. Optymalizacja leczenia zakażenia bakteryjnym G. mellonella za pomocą środka przeciwdrobnoustrojowego
<ol>
	<li>Przygotuj różne dawki środka przeciwbakteryjnego, biorąc pod uwagę, że zakażone larwy są leczone dawką 10 μL. Stosuj różne dawki o minimalnej toksyczności, jak oceniano w kroku 4.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami 1 i 2 tego protokołu, aby przygotować i zainfekować Galleria mellonella w odpowiednich grupach przy wcześniej zoptymalizowanej dawce zakażenia.</li>
	<li>Po 2 godzinach od infekcji lecz larwy przygotowanym środkiem przeciwbakteryjnym lub roztworem kontrolującym pojazd. Postępuj zgodnie z krokami 3.2-3.8, wstrzykując w przeciwległą część nogi niż ta, która została wstrzyknięta podczas infekcji. Wysterylizuj igłę między grupami. UWAGA: Do tej optymalizacji wybrano leczenie po 2 godzinach, aby uzyskać silne dane dawka-odpowiedź, z których następnie określono optymalizację czasu leczenia19.</li>
	<li>Monitorowanie przeżywalności G. mellonella w odstępach 30 minut lub częściej od momentu, gdy zwykle po raz pierwszy zaobserwowana jest śmiertelność. Usuń martwe larwy i zapisz czas ich śmierci.</li>
	<li>Oblicz zmianę w proporcjach przeżycia między grupami leczonymi. Wykorzystaj analizę przeżycia Kaplana-Meiera, aby określić, czy leczenie prowadzi do istotnej zmiany śmiertelności larw. Uwzględnić odpowiednią korektę po domyśle parowej wielokrotności w analizach wielogrupowych.</li>
</ol>
6. Optymalizacja czasu leczenia zakażonego G. mellonella
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami 1 i 2, aby przygotować Galleria mellonella w odpowiednich grupach przy wcześniej zoptymalizowanej dawce infekcji.</li>
	<li>Przygotuj środek przeciwdrobnoustrojowy w dawce wcześniej zoptymalizowanej w kroku 4.</li>
	<li>Po 2, 4 godzinach, 6, 9 lub 12 godzinach po zakażeniu lecz zakażone larwy zgodnie z krokami 3.2-3.8, aby porównać, jak czas leczenia wpływa na śmiertelność.</li>
	<li>Monitorowanie przeżywalności G. mellonella w odstępach 30 minut lub częściej od momentu, gdy zwykle po raz pierwszy zaobserwowana jest śmiertelność. Usuń martwe larwy i zapisz czas ich śmierci. Optymalne tempo to takie, które utrzymuje przeżywalność obserwowaną po początkowej optymalizacji dawki leczenia. UWAGA: Podczas testowania skuteczności przeciwdrobnoustrojowej w G. mellonella optymalizuj dawkę leczenia i czas leczenia osobno, wykorzystując pierwszą do określenia dawki leczenia w drugiej.</li>
</ol>

Standardized Galleria mellonella Models for Preclinical Antimicrobial Testing

<ol><li>Menard, G., Rouillon, A., Cattoir, V., Donnio, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+as+a+suitable+model+of+bacterial+infection%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella as a suitable model of bacterial infection: Past, present and future.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 782733(2021).</li>
<li>Piatek, M., Sheehan, G., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella%3A+The+versatile+host+for+drug+discovery%2C+in+vivo+toxicity+testing+and+characterizing+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella: The versatile host for drug discovery, in vivo toxicity testing and characterizing host-pathogen interactions.</a> Antibiotics. 10 (12), 1545(2021).</li>
<li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Chem%22%5BJournal%5D)">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nat Rev Chem. 5 (10), 726-749 (2021).</li>
<li>Seyhan, A. A. Lost in translation: The valley of death across preclinical and clinical divide - identification of problems and overcoming obstacles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeyhan%2C+AA+%22Transl+Med+Commun%22">Transl Med Commun</a>. 4 (1), (2019).</li>
<li>Firacative, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+and+maintenance+of+Galleria+mellonella+and+its+application+to+study+fungal+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fungus%22%5BJournal%5D)">Rearing and maintenance of Galleria mellonella and its application to study fungal virulence.</a> J Fungus. 6 (3), 130(2020).</li>
<li>Pereira, M. F., Rossi, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+rearing+and+testing+conditions+and+a+guide+for+optimizing+Galleria+mellonella+breeding+and+use+in+the+laboratory+for+scientific+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Overview of rearing and testing conditions and a guide for optimizing Galleria mellonella breeding and use in the laboratory for scientific purposes.</a> APMIS. 128 (12), 607-620 (2020).</li>
<li>Jorjão, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+moths+to+caterpillars%3A+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li>
<li>Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li>
<li>Gallorini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+hemocytes+from+infected+Galleria+mellonella+larvae+as+an+innovative+tool+for+immune+profiling%2C+infection+studies+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of hemocytes from infected Galleria mellonella larvae as an innovative tool for immune profiling, infection studies and drug screening.</a> Sci Rep. 14, 759(2024).</li>
<li>Smith, F. Q., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+immunity+and+pathogenesis+in+mammals+versus+the+invertebrate+model+organism+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal immunity and pathogenesis in mammals versus the invertebrate model organism Galleria mellonella.</a> Pathog Dis. 79 (3), ftab013(2021).</li>
<li>Sugumaran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biochemistry+of+eumelanogenesis+and+the+protective+roles+of+phenoloxidase+and+melanin+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative biochemistry of eumelanogenesis and the protective roles of phenoloxidase and melanin in insects.</a> Pigment Cell Res. 15 (1), 2-9 (2002).</li>
<li>Sheehan, G., Garvey, A., Croke, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+humoral+immune+defences+in+mammals+and+insects%3A+The+same%2C+with+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Innate humoral immune defences in mammals and insects: The same, with differences.</a> Virulence. 9, 1625-1639 (2018).</li>
<li>Wright, C. L., Kavanagh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+as+a+novel+in+vivo+model+to+screen+natural+product-derived+modulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Sci%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella as a novel in vivo model to screen natural product-derived modulators of innate immunity.</a> Appl Sci. 12 (13), 6587(2022).</li>
<li>Newton, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+invertebrate+Galleria+mellonella+as+an+infection+model+to+study+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of the invertebrate Galleria mellonella as an infection model to study the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> J Vis Exp. (148), e59703(2019).</li>
<li>Frankel, G., Collins, J. W., Schroeder, G. N., Harding, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Galleria+mellonella+as+a+model+organism+to+study+Legionella+pneumophila+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection.</a> J Vis Exp. (81), e50964(2013).</li>
<li>Romera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galleria+mellonella+infection+model+as+a+system+to+investigate+the+virulence+of+Candida+auris+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">The Galleria mellonella infection model as a system to investigate the virulence of Candida auris strains.</a> Pathog Dis. 78 (9), ftaa067(2020).</li>
<li>Kwadha, C. A., Ong'amo, G. O., Ndegwa, P. N., Raina, S. K., Fombong, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+control+of+the+greater+wax+moth%2C+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">The biology and control of the greater wax moth, Galleria mellonella.</a> Insects. 8 (2), 61(2017).</li>
<li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg%22%5BJournal%5D)">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> J Hyg. 38, 732-749 (1938).</li>
<li>Ignasiak, K., Maxwell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+%28greater+wax+moth%29+larvae+as+a+model+for+antibiotic+susceptibility+testing+and+acute+toxicity+trials%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella (greater wax moth) larvae as a model for antibiotic susceptibility testing and acute toxicity trials.</a> BMC Res Notes. 10 (1), 428(2017).</li>
<li>Hesketh-Best, P. J., Mouritzen, M. V., Shandley-Edwards, K., Billington, R. A., Upton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+larvae+exhibit+a+weight-dependent+lethal+median+dose+when+infected+with+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella larvae exhibit a weight-dependent lethal median dose when infected with methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Pathog Dis. 79 (2), ftab003(2021).</li>
<li>Mahenthiralingam, E., Weiser, R., Floto, R. A., Davies, J. C., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+relevant+bacterial+strains+for+novel+therapeutic+testing%3A+a+Guidance+document+for+priority+cystic+fibrosis+lung+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+MicrobiolRep%22%5BJournal%5D)">Selection of relevant bacterial strains for novel therapeutic testing: a Guidance document for priority cystic fibrosis lung pathogens.</a> Curr Clin MicrobiolRep. 9 (4), 33-45 (2022).</li>
<li>Carter, M. E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J Infect Dis. 202 (6), 935-942 (2010).</li>
<li>Herrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colistin-tobramycin+combinations+are+superior+to+monotherapy+concerning+the+killing+of+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Colistin-tobramycin combinations are superior to monotherapy concerning the killing of biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J Infect Dis. 202 (10), 1585-1592 (2010).</li>
<li>Hennig, S., Standing, J. F., Staatz, C. E., Thomson, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+pharmacokinetics+of+tobramycin+in+patients+with+and+without+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Population pharmacokinetics of tobramycin in patients with and without cystic fibrosis.</a> Clin Pharmacokinet. 52 (4), 289-301 (2013).</li>
<li>Reyhanoglu, G., Reddivari, A. K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReyhanoglu%2C+G+%22Tobramycin%22">Tobramycin</a>. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK551695/ (2023).</li>
<li>Crass, R. L., Rutter, W. C., Burgess, D. R., Martin, C. A., Burgess, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrotoxicity+in+patients+with+or+without+cystic+fibrosis+treated+with+polymyxin+b+compared+to+colistin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Nephrotoxicity in patients with or without cystic fibrosis treated with polymyxin b compared to colistin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (4), e02329-e02416 (2017).</li>
<li>Deacon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+efficacy+of+tobramycin+polymeric+nanoparticles+for+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+cystic+fibrosis%3A+Formulation%2C+characterization+and+functionalization+with+dornase+alfa+%28DNase%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial efficacy of tobramycin polymeric nanoparticles for Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis: Formulation, characterization and functionalization with dornase alfa (DNase).</a> J Control Release. 198, 55-61 (2015).</li>
<li>Tamma, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Diseases+Society+of+America+2022+guidance+on+the+treatment+of+extended-spectrum+%CE%B2-lactamase+producing+enterobacterales+%28ESBL-E%29%2C+carbapenem-resistant+enterobacterales+%28CRE%29%2C+and+Pseudomonas+aeruginosa+with+difficult-to-treat+resistance+%28DTR-P.+aeruginosa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious Diseases Society of America 2022 guidance on the treatment of extended-spectrum β-lactamase producing enterobacterales (ESBL-E), carbapenem-resistant enterobacterales (CRE), and Pseudomonas aeruginosa with difficult-to-treat resistance (DTR-P. aeruginosa).</a> Clin Infect Dis. 75 (2), 187-212 (2022).</li>
<li>Charan, J., Kantharia, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+calculate+sample+size+in+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+PharmacolPharmacother%22%5BJournal%5D)">How to calculate sample size in animal studies.</a> J PharmacolPharmacother. 4 (4), 303-306 (2022).</li>
<li>Murray, C. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+in+2019%3A+A+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis.</a> Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).</li>
<li>de Kraker, M. E. A., Stewardson, A. J., Harbarth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+10+million+people+die+a+year+due+to+antimicrobial+resistance+by+2050%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Will 10 million people die a year due to antimicrobial resistance by 2050.</a> PLoS Med. 13 (11), e1002184(2016).</li>
<li>Prasad, N. K., Seiple, I. B., Cirz, R. T., Rosenberg, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaks+in+the+pipeline%3A+A+failure+analysis+of+gram-negative+antibiotic+development+from+2010+to+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Leaks in the pipeline: A failure analysis of gram-negative antibiotic development from 2010 to 2020.</a> Antimicrob Agents Chemother. 66 (5), e0005422(2022).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Galleria+mellonella+experimental+model+for+zoonotic+pathogen+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">A novel Galleria mellonella experimental model for zoonotic pathogen Brucella.</a> Virulence. 14 (1), 2268496(2023).</li>
<li>Senior, N. J., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+Galleria+mellonella+hemocytes+for+infection+studies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of Galleria mellonella hemocytes for infection studies.</a> F1000Res. 9, 1932(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obciążenie opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stale rośnie. W 2019 roku szacuje się, że na świecie z AMR związano 4,95 miliona zgonów –30. Do 2050 roku szacuje się, że śmiertelność spowodowana AMR osiągnie 10 milionów31. Aby przeciwdziałać temu ryzyku, należy opracować i przetestować nowe leki przeciwdrobnoustrojowe efektywnie i efektywnie kosztowo, co wymaga zastosowania modeli przedklinicznych, które dokładnie przewidują skuteczność antybakteryjną. Wysoki wskaźnik zaniku zaobserwowany podczas translacji do badań klinicznych jest głównym czynnikiem ograniczającym. Jedno badanie opisywało 13 kandydatów na antybiotyki, którzy nie przeszli w badaniach klinicznych, a 11 nie przeszło do fazy II32.
Niniejsze badanie przedstawia ramy do optymalizacji przedklinicznych badań przesiewowych G. mellonella oraz metodę oceny skuteczności przeciwdrobnoustrojowej. Larwy G. mellonella mają znaczną użyteczność w ocenie toksyczności leków, wyznaczaniu MIC oraz testach na zjadliwość, a także przyczyniają się do redukcji liczby ssaków wykorzystywanych w rozwoju przedklinicznym. Larwy Galleria mellonella mają stosunkowo wysoką przepustowość, są istotne biologicznie i dobrze przekładają się na bardziej złożone modele ssaków. Tymczasem dzikie laboratoryjne myszy kosztowały od £8 do £30 za sztukę, przy ~7£ tygodniowej konserwacji na mysz, natomiast G. mellonella kosztowała ~£2 za 50 larw. Przetestowanie 10 związków w modelu G. mellonella kosztowałoby więc ~60 funtów, w porównaniu do ponad 4000 funtów za to samo badanie na myszach. Ponadto wcześniejsze badania porównywały toksyczność i skuteczność nowych związków oraz wskazywały korelację między ostrą toksycznością u G. mellonella i myszy 8,19,33. Dlatego zaleca się wdrożenie przesiewu G. mellonella w celu priorytetyzacji związków do dalszego testowania w modelach myszy.
Pomimo oczywistej użyteczności modelu, istnieje kilka kwestii, które należy do rozważenia zapewnić skuteczne zastosowanie. Brak larw jałowych o jakości badawczej komplikuje ich przygotowania do zastosowań eksperymentalnych, ponieważ wymagana jest sterylizacja etanolem lub naukowcy muszą utrzymywać własną kolonię G. mellonella, co zmniejsza ryzyko skażenia i poprawia ogólną jakość eksperymentów 5,6. Niewłaściwa sterylizacja może prowadzić do znacznej śmiertelności, a całkowita sterylizacja organizmu jest trudna, ponieważ dłuższy czas ekspozycji na etanol prowadzi do śmierci. Alternatywne metody sterylizacji obejmują wymazywanie z pro-nogi każdej larwy 70% etanolem przed infekcją, co zmniejsza śmiertelność podczas sterylizacji, ale jest bardziej pracochłonną. Można było również stosować inne środki antyseptyczne, choć w tym badaniu nie oceniano alternatyw, ponieważ sterylizacja etanolem dawała <10% zgonu po optymalizacji. Ponadto często nie jest jasne, czy dostawcy traktują G. mellonella antybiotykami, ponieważ mogą pozyskiwać larwy od innych dostawców, zamiast samodzielnie prowadzić kolonie.
Biologia G. mellonella znacznie różni się od biologii ssaków, co ogranicza ich użyteczność. Ich układ odpornościowy nie posiada żadnej odporności adaptacyjnej, choć obecne są kluczowe rozpuszczalne i komórkowe aspekty odporności wrodzonej. Hemocyty są główną wrodzoną obroną odpornościową G. mellonella i wykazują właściwości przypominające fagocyty. Opisano różne podzbiory tych komórek, w tym granulocyty i plazmatocyty, między innymi34. G. mellonella nie potrafi również odtworzyć odpowiednich miejsc infekcji, takich jak infekcje dróg oddechowych czy pęcherza. Jednak w przedklinicznym potoku G. mellonella służyłaby jako pre-screeningowy dla modeli myszy, zapewniając, że tylko najbardziej obiecujące związki przejdą do złożonego systemu ssaków, który bardziej przypomina środowiska zakażenia człowieka. Wreszcie, model skorzystałby na dalszej charakteryzacji genomowej G. mellonella w celu określenia jego przydatności do oceny zmian klinicznie istotnych biomarkerów. W szczególności wymaga to poprawy naszej wiedzy o odporności na G. mellonella.
Ogólnie rzecz biorąc, model zakażenia Galleria mellonella jest cennym narzędziem do przedklinicznej oceny nowych związków przeciwdrobnoustrojowych przed ich oceną w modelach ssaków. Choć ich zastosowanie jest skomplikowane z powodu braku standaryzacji dostaw, ich zastosowanie jest wysokoprzepustowe, proste i może być szeroko stosowane w całym krajobrazie rozwoju środków przeciwdrobnoustrojowych. W przyszłości integracja tego modelu w ustandaryzowanym przedklinicznym procesie może przyspieszyć rozwój nowych związków przeciwdrobnoustrojowych, aby zwiększyć odsetek kandydatów przechodzących od oceny przedklinicznej do badań klinicznych.

Larwy Galleria mellonella (większej woskowej) są szeroko wykorzystywane w naukach biologicznych jako modele infekcji gatunków drobnoustrojów oraz do testów toksyczności nowych związków lekowych 1,2. Mają one potencjał znacznej użyteczności w przedklinicznym procesie badań antydrobnoustrojowych, ponieważ są wysokoprzepustowe, odtwarzają integralne cechy zakażeń ludzkich in vivo oraz zmniejszają uzależnienie od modeli ssaków, zgodnie z zasadami redukcji, udoskonalania i zastępowania, które regulują etyczne wykorzystanie gatunków ssaków w badaniach.
Opracowanie nowych antybiotyków wymaga szeroko zakrojonych badań przedklinicznych in vitro oraz in vivo przed walidacją kliniczną3. Tylko nieliczni nowatorscy agenci z obiecującymi pakietami danych przedklinicznych przekładają się do kliniki, a jednym z czynników tej wysokiej odejścia jest brak badań przedklinicznych w uchwyceniu złożoności środowisk infekcji4. Problemy te przyczyniają się nie tylko do niskiego wskaźnika translacji środków przeciwdrobnoustrojowych do kliniki, ale także do zwiększonego użycia eksperymentalnych kręgowców podczas późnych badań przedklinicznych. Aby poprawić przedkliniczną ocenę nowych środków przeciwdrobnoustrojowych oraz ograniczyć stosowanie kosztownych, czasochłonnych, złożonych i etycznie problematycznych modeli in vivo na myszy, potrzebne są lepsze narzędzia do badania leków na wczesnym etapie, które ograniczą liczbę nieobiecujących związków przechodzących do testów w systemach kręgowców.
G. mellonella ma krótki cykl życia trwający 8 tygodni, składający się z czterech etapów życia: jaja, larwy, poczwarki i dorosłych, z których forma larwalna jest wykorzystywana w tym protokole1. G. mellonella jest łatwa w utrzymaniu przez cały eksperyment, bez potrzeby specjalistycznego sprzętu czy dedykowanego ośrodka badawczego na zwierzętach. Nie ma wymogu ubiegania się o etyczną zgodę na ich użycie, a naukowcy mogą hodować organizm we własnej praktyce, aby poprawić jakość eksperymentalną 2,5,6,7. Układ odpornościowy G. mellonella bardzo przypomina układ odpornościowy ssaków, zdolny do reagowania na bodźce "ja" i "nie-ja"8. Hemocyty odpowiadają za molekularne rozpoznawanie wzorców związanych z patogenami oraz późniejszą fagocytozę, pełniąc funkcjonalnie analogiczną rolę neutrofilów u ludzi9. G. mellonella koduje trzy typy receptorów przypominających toll, które zostały zidentyfikowane przez homologię sekwencji u człowieka, i produkują białka przypominające dopełnienie, które rozpoznają materiały niebędące własnymi i tworzą lokalne kompleksy melanizacyjne po aktywacji i polimeryzacji fenotlenazy do melaniny10. Może to służyć jako wizualny odczyt zdrowia larw podczas eksperymentów z infekcją, ponieważ skórka jest ciemniejąca przez melanizację. Należy jednak zauważyć, że oś melanizacji u owadów, obejmująca fenooksydazę, znacznie różni się od osi tyrozynaza-melanina u ssaków11,12. Dodatkowo G. mellonella produkuje 18 indukowalnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych, w tym lizozym i13 homologów defensiny. To podobieństwo, a także proste procedury utrzymania larw i wysoka przepustowość modelu, sprawiły, że G. mellonella stał się szeroko wykorzystywanym organizmem w ocenie nowych leków. W przedklinicznym opracowywaniu antybiotyków G. mellonella wykazuje się większą użytecznością w porównaniu z modelami in vitro, ponieważ potrafią dokładniej modelować interakcje gospodarz-patogen-lek w złożonym środowisku z aktywną odpornością.
Obecnie w Europie nie ma standaryzowanego dostawcy G. mellonella o jakości badawczej. Badacze muszą zamiast tego kupować larwy G. mellonella w sklepach z przynętami lub prowadzić własną kolonię. Chociaż opisano metody utrzymania kolonii G. mellonella w miejscu, które mogą zwiększyć spójność eksperymentalną 5,6,7, ta opcja prawdopodobnie będzie atrakcyjna tylko dla tych, którzy często korzystają z larw. W związku z tym protokół ten koncentruje się na eksperymentalnym przygotowaniu po zakupie larw od dostawcy żywej przynęty. Choć jest bardziej dostępna, ta metoda zwiększa złożoność eksperymentu i może wprowadzać dodatkową zmienność w testach z powodu niespójności w stanie zdrowia larw w momencie ich otrzymania od dostawców. Aby środowisko naukowe, przemysł i regulatorzy mogli zaakceptować i wdrożyć testy G. mellonella jako część przedklinicznego procesu rozwoju leków przeciwdrobnoustrojowych, niezbędny jest ustandaryzowany system optymalizacji i oceny skuteczności antydrobnoustrojów.
Badanie to optymalizuje eksperymentalny projekt modelu zakażenia G. mellonella do opracowania antybiotyków. Chociaż opisano modele zakażenia G. mellonella 14,15, niniejsza metodologia dokumentuje dodatkowe kroki mające na celu złagodzenie dodatkowej złożoności spowodowanej niespójnością podaży oraz dostarcza ram do oceny nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Jako przypadek testowy G. mellonella została zakażona patogenem pierwszego priorytetu WHO – Pseudomonas aeruginosa, a leczenie aminoglikozydami (tobramycyną) zostało zoptymalizowane. Ten schemat, zilustrowany na Rysunku 1, stanowi podstawę dla przyszłych przedklinicznych badań przesiewowych przeciwdrobnoustrojowych z użyciem nowych leków.

<table><tbody><tr><td>22 s, mała igła RN z małym piastem, 2 cale, typ grotowy 2</td><td>Hamilton</td><td>7758-03</td><td>Zamiennik strzykawki Hamilton.</td></tr><tr><td>Zapasy infekcji bakteryjnych</td><td></td><td></td><td>Zapasy bakterii o znanej gęstości (CFU/mL) zamrożone w fazie średniej wykładniczej wzrostu.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10610813</td><td>Mogą być używane także inne producenty.</td></tr><tr><td>Larwy G. mellonella</td><td>Livefoods</td><td>5.06045E+12</td><td>Dla tego dostawcy zamówienia są oznaczane jako " Nowy zapas do użytku laboratoryjnego". Na kwiecień 2024 nowy zapas jest dostarczany dostawcy w poniedziałki. Wtedy należy składać zamówienia na dostawę w środy.</td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton</td><td>80630</td><td>Strzykawka 80630 ma 100 & micro; Pojemność. Istnieją także inne woluminy, takie jak 80430, 80530 czy 80730.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>12674785</td><td>Mogą być używane także inne producenty.</td></tr></tbody></table>

galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

Galleria mellonella as an Antimicrobial Screening Model

Aby przeciwdziałać narastającemu globalnemu problemowi oporności na antybiotyki, niezbędne jest przyspieszenie opracowania nowych antybiotyków. Obecny rozwój przedklinicznych leków przeciwdrobnoustrojowych daje znaczną liczbę leadów, które okazują się nieodpowiednie zarówno przed, jak i podczas badań klinicznych. Aby zwiększyć efektywność rozwoju przedklinicznego, należy opracować odpowiednie, standaryzowane, dostępne i opłacalne modele. Larwy Galleria mellonella (woskowej wielkiej) są szeroko wykorzystywane jako model infekcji do oceny zjadliwości mikroorganizmów, przeprowadzania testów toksyczności leków oraz jako wstępny sposób oceny skuteczności in vivo nowych związków przeciwdrobnoustrojowych. Te modele infekcji mają większe znaczenie biologiczne niż wiele badań in vitro o porównywalnej przepustowości i zmniejszają uzależnienie od modeli ssaków, gdy są używane jako wstępne badania antybakteryjne. Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodologię optymalizacji modeli zakażeń G. mellonella , którą można stosować do gatunków bakterii oraz wybranych terapii przeciwdrobnoustrojowych. Korzystając z priorytetowego patogenu WHO Pseudomonas aeruginosa jako wzoru, przedstawiamy kroki, które można podjąć, aby opracować powtarzalny model zakażeń i testów terapeutycznych. Obejmuje to zalecenia dotyczące konfiguracji eksperymentów, przygotowania próbek oraz protokołów infekcji i leczenia. Integracja tego modelu w przedklinicznych procesach rozwoju leków przeciwdrobnoustrojowych zmniejszyłaby zależność od modeli ssaków, zmniejszyłaby liczbę nieskutecznych związków trafiających do badań klinicznych oraz ostatecznie zwiększyłaby efektywność przedklinicznego rozwoju leków przeciwdrobnoustrojowych.

Ocena zmienności masy G. mellonella z partii Potencjalnym źródłem niepożądanych zmienności w eksperymentach zakażeń są różnice wielkości między poszczególnymi jednostkami eksperymentalnymi (czyli larwami) oraz między partiami. Efekty tej zmienności można złagodzić albo poprzez dostosowanie dawek leczenia lub infekcji na podstawie masy ciała, albo przez wybór tylko tych larw mieszczących się w określonym zakresie wagowym do eksperymentów. Ta druga korekta jest bardziej pragmatyczna i nie podlega błędom ludzkim, które mogą pojawić się podczas przygotowywania dawki. Dodatkową zaletą ważenia larw jest możliwość konwersji dawek leczniczych z tych podawanych larwam na ich ludzkie odpowiedniki mg/kg. Aby ilościowo określić zmienność w obrębie i pomiędzy partiami, zważono trzy partie po 50 larw, zamówionych w różnych okresach. Średnia masa masy w każdej grupie wynosiła 225,5 mg, 230,54 mg i 215,86 mg, z odchyleniami standardowymi odpowiednio 49,1 mg, 53,7 mg i 44,3 mg (Rysunek 2A). Pomiędzy partiami nie było istotnej różnicy w masie. W różnych partiach masa wahała się od 107,5 mg do 341,0 mg, ze średnią 224,0 mg ± 49,2 mg.
Aby uzyskać powtarzalne wyniki, larwy były ważone przed eksperymentami i wybierane, jeśli ich waga wynosiła 224 mg ± 49,2 mg, zmniejszając zakres masy z 233,5 mg do 98,4 mg i eliminując 33% larw. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami, które wykazały istotne zróżnicowanie przeżywalności larw zakażonych MRSA z pasami wagowymi powyżej 100 mg14,20. Porównaliśmy również wagę G. mellonella w momencie porodu z wagą tygodnia po porodzie, ponieważ każda istotna zmiana masy może wpłynąć na wyniki eksperymentalne, gdy larwy nie są używane natychmiast po przybyciu. Średnia masa G. mellonella wynosiła 230,54 mg ± 53,7 mg. Tydzień po porodzie średnia masa wynosiła 221,8 mg ± 45,7 mg odchylenia standardowego (Rysunek 2B). Nie stwierdzono istotnej różnicy między wagą przy przybyciu a wagą po tygodniu, z czego wnioskujemy, że larwy mogą być wykorzystywane do celów eksperymentalnych w dowolnym momencie w pierwszym tygodniu od porodu. Warto zauważyć, że wyniki te są reprezentatywne tylko dla G. mellonella kupowanego u jednego dostawcy, a waga może się znacząco różnić między dostawcami lub gdy larwy są zamawiane w różnych terminach.
Optymalizacja gęstości inokulum P. aeruginosa PAO1 Oceniono zjadliwość pięciu izolatów P. aeruginosa o czterech gęstościach szczepionkowych, w tym trzech powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych: PAO1, PA14 i PAK, oraz dwóch klinicznych izolatów z przewlekłej infekcji dróg oddechowych, LESB58 i IST27-M. Zostały one wykorzystane jako część panelu szczepów istotnych dla CF, opracowanego przez Mahenthiralingama i in.21 i reprezentują globalną filogenezę gatunku. Wstępne dane wzrostu w bulionie odżywczym wykazały niższe tempo wzrostu izolatów z przewlekłej infekcji (Rysunek 3). Biorąc to pod uwagę, G. mellonella była zakażona w grupach po 10 larw dawkami 10 00000 CFU/larwa w 10 μl PBS dla PAO1, PA14 i PAK oraz dawkami 10 2, 103, 10 4 lub 105 CFU/larwa dla LESB58 i IST27-M. Dwie grupy po 10 larw również zostały wstrzyknięte wyłącznie PBS, jedna grupa przed i jedna po zakażeniu. Zastrzyki PBS przed zakażeniami kontrolują zanieczyszczone PBS lub zanieczyszczenie igieł mikroorganizmami z kustyki Galleria, natomiast zastrzyki PBS po kontroli infekcji w przypadku skażenia igieł bakteriami wykorzystywanymi w procesie infekcji. Optymalne dawki dla PAO1, PA14 i PAK wynosiły 10 CFU/larwę, ponieważ wyższe gęstości powodowały > 50% zgonów do 18 godzin (Rysunek 4). 10 CFU było najniższą dawką, którą można było wiarygodnie i powtarzalnie przygotować na zakażenie. Do osiągnięcia pożądanej kinetyki przeżywalności wymagane były wyższe dawki LESB58 i IST27-M, co odzwierciedla wolniejszy wzrost i niższą nośność tych izolatów w warunkach in vitro (Rysunek 4). Optymalna dawka dla obu to 10 z4 CFU/larwy. LESB58 i IST27-M są klinicznymi izolatami od osób z przewlekłymi infekcjami, a LESB58 wcześniej wykazywał niższą zjadliwość w modelach gryzoni niż PAO122.
Testy toksyczności tobramycyny i kolistyny w Galleria mellonella Przed oceną skuteczności nowych związków przeciwdrobnoustrojowych należy ocenić ich toksyczność poprzez wstrzykiwanie szerokiego zakresu dawek istotnych klinicznie. Pozwala to na usunięcie związków o wysokiej toksyczności z testów na wczesnym etapie przedklinicznego procesu. Tobramycyna i kolistyna były oceniane pod kątem niezakażonych larw G. mellonella, ponieważ są powszechnie podawane w leczeniu zakażenia P. aeruginosa u osób z mukowiscydozą (pwCF)23. Kliniczne stosowanie tobramycyny waha się od 3 mg/kg dziennie u ciężko chorych osób bez mukowiscydozy do 11 mg/kg co 24 godziny dla osób z mukowiscydozą24,25. Wartości te były wykorzystywane jako wskazówka do dawkowania w Galleria mellonella, z wybranymi dawkami 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg tobramycyny do testów toksyczności. Nie zaobserwowano żadnych zgonów w żadnym skupisku. Biorąc pod uwagę brak toksyczności tobramycyny w wysokich stężeniach, oceniono toksyczność kolyny, ponieważ wcześniej była ona powiązana z nefrotoksycznością lub neurotoksycznością w 29,8% pwCF, z dawką obciążającą 2,9 (±1,5) mg/kg i ogólną dawką dzienną 4,1 (±1,1) mg/kg26. Czyniło to go cennym kandydatem do testów toksyczności, choć specyficzne dla narządów działanie u ludzi sugerowało, że toksyczność może nie przekładać się na G. mellonella. Rzeczywiście, gdy podano dawki 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg oraz 250 mg/kg kolistyny, nie zaobserwowano śmierci larw powyżej 72 godzin. W związku z tym kolistyna została ostatecznie podana w najwyższej rozpuszczalności w H2000mg/kg. Śmierć wszystkich larw zaobserwowano w ciągu 12 godzin, co potwierdza, że toksyczność leków można ocenić w G. mellonella, ale należy zachować ostrożność przy próbie przewidywania toksyczności do człowieka.
Optymalizacja dawki leczenia tobramycyną przeciwko zakażeniu P. aeruginosa PAO1 Larwam zakażonym P. aeruginosa podano szereg klinicznie istotnych dawek tobramycyny, aby zoptymalizować dawkę leczenia. W przypadku nowych środków przeciwdrobnoustrojowych dawkę można początkowo dobrać na podstawie klinicznego zastosowania podobnych istniejących antybiotyków lub danych przedklinicznych dotyczących nowego środka, takich jak minimalne stężenia hamujące w bulionie. Aby ocenić skuteczność tobramycyny przeciwko P. aeruginosa PAO1, larwy G. mellonella zostały zakażone 10 CFU P. aeruginosa PAO1, zgodnie z wcześniej zoptymalizowaną, i wstrzyknięto 1 mg/kg, 2,5 mg/kg lub 5 mg/kg tobramycyny 2 godziny po zakażeniu. Dawki te zostały wybrane na podstawie wcześniejszych badań G. mellonella z tobramycyną i są zgodne z aktualnymi dawkami klinicznymi tobramycyny u osób bez mukowiscydozy 24,27,28.
Próg początkowego sukcesu to 50% wzrost przeżycia G. mellonella w porównaniu z nieleczonymi grupami kontrolnymi. Leczenie PAO1 dawką 1 mg/kg tobramycyny miało niewielki wpływ na śmiertelność G. mellonella – 90% zgonów było 28 godzin po zakażeniu (Rysunek 5). Leczenie 2,5 mg/kg tobramycyny opóźniło śmiertelność, ale dało 80% śmiertelności ogólnej przy dawce 5 mg/kg tobramycyny, co dało optymalne 90% przeżycia. Skuteczna dawka PA14 wynosiła 5 mg/kg, natomiast PAK 2,5 mg/kg. Skuteczna dawka IST27-M była wyższa i wynosiła 10 mg/kg, podczas gdy żadne testowane stężenie tobramycyny nie było wystarczające, aby uratować larwy przed infekcją LESB58. Ten trend koreluje z minimalnym stężeniem hamującym (MIC) tobramycyny w bulionie Mueller Hinton, skorygowanym kationowo, gdzie 1 μg/mL wystarczało do zahamowania 90% wzrostu we wszystkich szczepach z wyjątkiem LESB58, który miał MIC 8 μg/mL. W związku z tym początkowe testy MIC mogą być używane do wskazania względnej oporności między szczepami, choć nie powinny być stosowane do określania zakresów dawki G. mellonella, które powinny być optymalizowane osobno.
Optymalizacja czasu leczenia tobramycyną przeciwko zakażeniu P. aeruginosa PAO1 Kliniczne stosowanie antybiotyków zazwyczaj nie następuje w ciągu kilku godzin od zakażenia, lecz w dniach lub tygodniach po zakażeniu. Testowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych w ten sposób jest niemożliwe w przypadku G. mellonella, ponieważ wysoka śmiertelność obserwuje się w ciągu 24 godzin od zakażenia P. aeruginosa PAO1. Aby zwiększyć znaczenie modelu infekcji, nowe leki przeciwdrobnoustrojowe powinny być podawane jak najpóźniej podczas zakażenia. Aby zoptymalizować czas leczenia, podano 5 mg/kg tobramycyny larwam zakażonym PAO1 G. mellonella w ciągu 2 godzin, 4 godzin, 6 godzin, 9 godzin i 12 godzin po zakażeniu. Sukces eksperymentalny zdefiniowano jako leczenie antybiotykiem, które przyniosło >50% wzrost przeżywalności w porównaniu z zakażeniem PAO1. Leczenie w 9 i 12 godzinach opóźniło śmiertelność, choć nie udało się wyleczyć infekcji (Rysunek 6). Leczenie trwające 2, 4 godziny i 6 godzin dało przeżywalność przekraczającą 50%.
Optymalizacja wielkości grupy G. mellonella Wielkość grupy eksperymentalnej obliczono na podstawie zmienności obserwowanej w przeżyciu G. mellonella po zakażeniu 10 CFU / larwami P. aeruginosa PAO1. Wielkość grupy może się różnić w zależności od oczekiwanej procentowej zmiany między grupą kontrolną nieleczoną a leczoną w dowolnym badaniu (Tabela 1). Obliczenia poprowadzono według opisu Charana i in. 29. Poniżej opisano równanie użyte do użytego wzoru.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67210/67210eq01.jpg" style="margin: auto;" />
Gdzie:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67210/67210eq02.jpg" style="margin: auto;" /> = 1,96 przy błędzie typu 1 wynoszącym 5%.
Zβ = 0,842 to wartość zapewniająca 80% mocy statystycznej.
p1 = Proporcja zdarzeń w grupie testowej, obliczana jako p2 + oczekiwana procentowa zmiana
p2 = Udział zdarzeń w grupie kontrolnej (nieleczona infekcja), obliczony na podstawie zmienności przeżycia P. aeruginosa PAO1 przy .<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67210/67210eq03.jpg" style="margin: auto;" />
P = Zbiorcza częstość, zdefiniowana jako (p1 + p2)/2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67210/67210fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat badania zakażenia G. mellonella . Ogólny protokół obejmuje przygotowanie larw G. mellonella przed zakażeniem, zakażenie inokulum 10 μL, opcjonalne leczenie po kilku godzinach po zakażeniu oraz ciągłe monitorowanie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67210/67210fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67210/67210fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Różnice w wadze larw Galleria mellonella zależne od partii i czasu. (A) Waga trzech partii po 50 larw Galleria mellonella ważone natychmiast po dostawie. Każda partia była zamawiana w innym czasie. Nie stwierdzono istotnej różnicy w masie między partiami obliczanej przez jednokierunkową ANOVA (P > 0,05). (B) Waga 50 larw ważonych przy odbiorze w porównaniu do tej samej partii ważonej tydzień później. Nie stwierdzono istotnej różnicy w wadze obliczanej przez test t-ucznia (P > 0,05). ns: Nieistotnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67210/67210fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67210/67210fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Krzywe wzrostu szczepów P. aeruginosa PAO1, PA14, PAK, LESB58 i IST27-M. Każdy szczep był hodowany w LB od początkowego OD600 0,08-0,13, a OD600 był następnie mierzony co 15 minut podczas 24-godzinnego wzrostu statycznego w 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67210/67210fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67210/67210fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Optymalizacja gęstości inokulum szczepów Pseudomonas aeruginosa pod kątem infekcji larwami Galleria mellonella . Przeżywalność larw Galleria mellonella po wstrzyknięciu różnych gęstości jednostek tworzących kolonie (CFU) na larwę. Testowane gęstości inokulum wynosiły 10, 10², 10³ lub 104 CFU na larwę dla (A) PAO1, (B) PA14 lub (C) PAK oraz 10², 10³, 104 lub 105 CFU na larwę dla (D) LESB58 i (E) IST27-M. Na grupę użyto dziesięciu larw, z których każda wstrzykiwana była 10 μL inokulum w prawej tylnej nodze. Przeżywalność monitorowano co 30 minut, zaczynając 16 godzin po zakażeniu, a czas śmierci był rejestrowany. Wszystkie szczepy wykazywały zależność od dawki wirulencję określoną przez test Log-rank (Mantel-Cox) pod kątem istotności. P < 0,05 dla wszystkich porównań dawek wewnątrzszczepowych, z wyjątkiem PAK 101 vs. PAK 102, PAK 103 kontra PAK 104, LESB58 104 kontra LESB58 105 oraz IST27-M 103 vs. IST27-M 104, które nie były znaczące. Ta liczba reprezentuje trzy biologiczne replikacje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67210/67210fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67210/67210fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Przeżycie larw Galleria mellonella po wstrzyknięciu szczepów panelowych P. aeruginosa i leczeniu siarczanem tobramycyny 2 godziny po zakażeniu. 10 larw G. mellonella na grupę eksperymentalną zostało zakażonych albo 10 CFU (A) PAO1, (B) PA14, lub (C) PAK lub 103 CFU (D) LESB58 lub (E) IST27-M na larwę w 10 μL PBS. Infekcje podawano w tylnej lewej części przednogi. 2 godziny po zakażeniu PAO1, PA14 i PAK zostały podany wstrzykniętym 10 μL PBS jako kontrolny środek bez leczenia, 1 mg/kg, 2,5 mg/kg lub 5 mg/kg tobramycyny, natomiast LESB58 i IST27-M leczono 10 μL PBS, 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg lub 40 mg/kg tobramycyny. jak wskazano na rysunku. Tobramycynę rozcieńczono w wodzie destylowanej i podano w tylnej prawej nodze. Przeżywalność była nieustannie monitorowana, a czas śmierci rejestrowany. Test rangi logaritycznej (Mantel-Cox) dla istotności vs. kontrola PBS dla każdego szczepu. ns: Nieistotne, *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,0005 ****P < 0,0001. Ta liczba reprezentuje trzy biologiczne replikacje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67210/67210fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67210/67210fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Przeżywalność larw Galleria mellonella po zakażeniu Pseudomonas aeruginosa PAO1 i późniejszym leczeniu tobramycyną w różnych momentach po zakażeniu. 10 larw G. mellonella w grupie eksperymentalnej zostało zakażonych 10 CFU PAO1 w 10 μL PBS, wstrzykniętych do tylnej prawej nogi. Larwy były następnie wstrzykiwane w ciągu 2 godzin, 4 godzin, 6 godzin, 9 godzin lub 12 godzin po zakażeniu 5 mg/kg siarczanu tobramycyny w 10 μL wody destylowanej w tylnej lewej części przednogi. Przeżywalność była nieustannie monitorowana, a czas śmierci rejestrowany. Test rangi logaritycznej (Mantel-Cox) dla istotności vs. Nieleczona kontrola. P < 0,0005, ****P < 0,0001. Ta liczba reprezentuje trzy biologiczne replikacje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67210/67210fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oczekiwana zmiana przeżycia (%)</td>
			<td>Wielkość grupy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wielkość grup w eksperymentach przetrwania G. mellonella , w których larwy G. mellonella są zakażone 10 CFU/larwami P. aeruginosa PAO1, a następnie podawano środek.

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowane ramy optymalizacji modeli zakażenia G. mellonella do zastosowań w przedklinicznej ocenie antybakteryjnej. Zastosowanie modelu G. mellonella w ramach przedklinicznego procesu rozwoju środków przeciwdrobnoustrojowych może zmniejszyć liczbę nieskutecznych związków przechodzących do badań klinicznych.

Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

To combat the rising global issue of antibiotic resistance, the accelerated development of novel antibiotics is essential. Current preclinical ...

Nasze laboratorium stara się zrozumieć, jak bakterie wyczuwają i reagują na środowisko w ludzkich drogach oddechowych. Charakteryzujemy środowiska dróg oddechowych i wykorzystujemy informacje zdobyte przy projektowaniu nowych modeli do badania fizjologii bakterii podczas infekcji dróg oddechowych oraz do identyfikacji nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Terapie modulatorem CFTR znacznie poprawiły funkcjonowanie płuc i jakość życia u osób z mukowiscydozą.Ta poprawa może powodować zmiany w ekspresji bakterii oraz czynnikach zaangażowanych zarówno w zjadliwość, jak i oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, co może stanowić wyzwanie w adaptacji obecnych przedklinicznych modeli infekcji. Rozwój solidnych modeli hodowli komórkowych został przyspieszony dzięki zastosowaniu interfejsu powietrze-ciekłe, hodowli komórek nabłonkowych, które były dostępne zarówno w wariantach mukowiscydozy, jak i nie-CF. Jednocześnie wykorzystanie wysokoprzepustowych metod, takich jak transkryptomika, do zrozumienia fizjologii bakterii w stanach związanych z infekcją, pomogło nam zrozumieć, czy modele odtwarzają scenariusze infekcji.Opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych do leczenia przewlekłych infekcji dróg oddechowych jest wyzwaniem. Większość przedklinicznych procesów przesiewowych leków nie uwzględnia w pełni unikalnych wyzwań związanych z leczeniem infekcji w złożonym i trudno dostępnym środowisku przewlekle zakażonego płuca. Współpracujemy z siecią współpracowników, aby spróbować ustandaryzować przedkliniczne ramy rozwoju nowych środków przeciwdrobnoustrojowych w leczeniu przewlekłych infekcji dróg oddechowych.Naszym celem jest wykorzystanie opracowanych modeli do przyspieszenia odkrywania leków oraz lepszego zrozumienia patogenezy mikroorganizmów w środowisku dróg oddechowych. Zacznij od ważenia larw galleria mellonella. Aby wysterylizować powierzchnię larw galleria mellonella w partiach po 10 do 20 larw, umieść każdą partię osobno w naczyniu i spryskuj larwy dwukrotnie 70% etanolem.Używając pęsety, zwijaj larwy, aby zapewnić pełne pokrycie etanolem. Następnie wyjmij larwy z etanolu, umieść je w sterylnej szalce Petriego i zostawij miskę odkrytą, aby mogły wyschnąć. Po dwóch godzinach około 90% larw odzyskuje aktywność, dzieląc je na grupy na podstawie obliczeń mocy opisanych w tej tabeli.Rozpocznij od przygotowania zapasów zakażenia pseudomonas aerogenosa znanych kolonii tworzących jednostki na mililitr przed infekcją. Aby rozpylić zakażenie, wiruj w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulkę w PBS.Następnie przygotuj trzy mikrofugowane rurki o jedności mililitra zawierające albo sterylną wodę destylowaną, etanol lub sterylne PBS. Sprawdź sterylną strzykawkę Hamilton o pojemności 100 mikrolitrów, aby upewnić się, że czubek igły jest ostry i nie pojawił się haczyk, który mógłby spowodować poważne uszkodzenie miejsca infekcji. Teraz przemyj strzykawkę sekwencyjnie wodą destylowaną, etanolem i PBS przed zakażeniem, pobierając i wyrzucając maksymalną pojemność.Następnie zawiruj ponownie zawiesowane inokulum zakażające i pobieraj maksymalnie 100 mikrolitrów do strzykawki Hamiltona, co wystarcza do wstrzyknięcia 10 mikrolitrów na larwę. Następnie wstrzyknij każdej larwie galleria mellonella 10 mikrolitrów inokulum w tylnej prawej nodze pro. Inkubować zakażone larwy w temperaturze od 20 do 42 stopni Celsjusza, co jest odpowiednim zakresem przeżycia galleria mellonella.Przygotuj szeroki zakres dawek przekraczających oczekiwany zakres terapeutyczny środka przeciwdrobnoustrojowego, kierując się danymi o toksyczności in vitro. Wstrzyknij zdrową, bezpłodną galleria mellonella w odpowiednich grupach z różnymi stężeniami przeciwdrobnoustrojowymi i PBS. Aby zoptymalizować leczenie infekcji bakteryjnej w galleria mellonella, przygotuj odpowiedni zakres dawek środków przeciwdrobnoustrojowych na podstawie wstępnych testów toksyczności.Zainfekuj grupy larw bakteriami, jak opisano wcześniej. Dwie godziny po zakażeniu lecz larwy przygotowanym środkiem przeciwbakteryjnym lub roztworem kontrolującym pojazd. Monitoruj przeżywalność galleria mellonella co 30 minut lub częściej od momentu, gdy zwykle obserwuje się śmierć.Usuń martwe larwy i zapisz czas ich śmierci. Aby porównać, jak czas leczenia wpływa na śmiertelność, lecz larwy dwie, cztery, sześć, dziewięć lub dwanaście godzin po zakażeniu i monitoruj ich przeżywalność co 30 minut. Skuteczna dawka tobramycyny, zależała od szczepu, pięć miligramów na kilogram, była optymalna dla PAO1 i PA14,2,5 miligrama na kilogram dla PAK oraz 10 miligramów na kilogram dla IST27-M.Żadna dawka nie była skuteczna dla LESB58. Leczenie pięcioma miligramami na kilogram tobramycyny w dwóch, czterech i sześciu godzinach po zakażeniu skutkowało ponad 50% przeżywalnością larw Plasmodium aeruginosa zakażonych Galleria mellonella.

galleria-mellonella-as-an-antimicrobial-screening-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Larwa woskowej Galleria mellonella została niedawno ustanowiona jako model in vivo do badania infekcji Legionella pneumophila. W tym miejscu demonstrujemy podstawowe techniki charakteryzujące patogenezę Legionelli w larwach, w tym inokulację, pomiar zjadliwości i replikacji bakterii, a także ekstrakcję i analizę zakażonych hemocytów.

Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

Galleria mellonella została niedawno uznana za powtarzalny, tani i etycznie akceptowalny model infekcji dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kroki podjęte w celu ustalenia skutecznego zakażenia G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Niniejszy film wyjaśnia mechanizmy odporności rośliny żywicielskiej na roślinożerność oraz demonstruje test bez wyboru (no-choice test), który pozwala oszacować względny wkład antybiozy i tolerancji w odporność gatunków Brachiaria na spittlebugi.

Charakterystyka mechanizmów odporności na roślinożerców: przykład pluskwiaków piankowych na gatunkach Brachiaria

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

W tym artykule opisano wysoce czuły test oparty na rybozymie, mający zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych ukierunkowanych na unikalny proces edycji RNA w patogenach trypanosomatidów. Inhibitory mogą być wykorzystywane jako narzędzia do opartej na hipotezach analizy procesu edycji RNA, a ostatecznie jako terapie.

Katalizator RNA jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji RNA w trypanosomach

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Poznaj optymalizację modeli zakażenia Galleria mellonella do przesiewowych ocen przeciwdrobnoustrojów. Standaryzowane protokoły poprawiają niezawodność badań przedklinicznych i przyspieszają odkrywanie leków.

Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

Przeglądaj więcej filmów