Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

Nasze laboratorium stara się zrozumieć, jak bakterie wyczuwają i reagują na środowisko w ludzkich drogach oddechowych. Charakteryzujemy środowiska dróg oddechowych i wykorzystujemy informacje zdobyte przy projektowaniu nowych modeli do badania fizjologii bakterii podczas infekcji dróg oddechowych oraz do identyfikacji nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Terapie modulatorem CFTR znacznie poprawiły funkcjonowanie płuc i jakość życia u osób z mukowiscydozą.

Ta poprawa może powodować zmiany w ekspresji bakterii oraz czynnikach zaangażowanych zarówno w zjadliwość, jak i oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, co może stanowić wyzwanie w adaptacji obecnych przedklinicznych modeli infekcji. Rozwój solidnych modeli hodowli komórkowych został przyspieszony dzięki zastosowaniu interfejsu powietrze-ciekłe, hodowli komórek nabłonkowych, które były dostępne zarówno w wariantach mukowiscydozy, jak i nie-CF. Jednocześnie wykorzystanie wysokoprzepustowych metod, takich jak transkryptomika, do zrozumienia fizjologii bakterii w stanach związanych z infekcją, pomogło nam zrozumieć, czy modele odtwarzają scenariusze infekcji.

Opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych do leczenia przewlekłych infekcji dróg oddechowych jest wyzwaniem. Większość przedklinicznych procesów przesiewowych leków nie uwzględnia w pełni unikalnych wyzwań związanych z leczeniem infekcji w złożonym i trudno dostępnym środowisku przewlekle zakażonego płuca. Współpracujemy z siecią współpracowników, aby spróbować ustandaryzować przedkliniczne ramy rozwoju nowych środków przeciwdrobnoustrojowych w leczeniu przewlekłych infekcji dróg oddechowych.

Naszym celem jest wykorzystanie opracowanych modeli do przyspieszenia odkrywania leków oraz lepszego zrozumienia patogenezy mikroorganizmów w środowisku dróg oddechowych. Zacznij od ważenia larw galleria mellonella. Aby wysterylizować powierzchnię larw galleria mellonella w partiach po 10 do 20 larw, umieść każdą partię osobno w naczyniu i spryskuj larwy dwukrotnie 70% etanolem.

Używając pęsety, zwijaj larwy, aby zapewnić pełne pokrycie etanolem. Następnie wyjmij larwy z etanolu, umieść je w sterylnej szalce Petriego i zostawij miskę odkrytą, aby mogły wyschnąć. Po dwóch godzinach około 90% larw odzyskuje aktywność, dzieląc je na grupy na podstawie obliczeń mocy opisanych w tej tabeli.

Rozpocznij od przygotowania zapasów zakażenia pseudomonas aerogenosa znanych kolonii tworzących jednostki na mililitr przed infekcją. Aby rozpylić zakażenie, wiruj w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulkę w PBS.

Następnie przygotuj trzy mikrofugowane rurki o jedności mililitra zawierające albo sterylną wodę destylowaną, etanol lub sterylne PBS. Sprawdź sterylną strzykawkę Hamilton o pojemności 100 mikrolitrów, aby upewnić się, że czubek igły jest ostry i nie pojawił się haczyk, który mógłby spowodować poważne uszkodzenie miejsca infekcji. Teraz przemyj strzykawkę sekwencyjnie wodą destylowaną, etanolem i PBS przed zakażeniem, pobierając i wyrzucając maksymalną pojemność.

Następnie zawiruj ponownie zawiesowane inokulum zakażające i pobieraj maksymalnie 100 mikrolitrów do strzykawki Hamiltona, co wystarcza do wstrzyknięcia 10 mikrolitrów na larwę. Następnie wstrzyknij każdej larwie galleria mellonella 10 mikrolitrów inokulum w tylnej prawej nodze pro. Inkubować zakażone larwy w temperaturze od 20 do 42 stopni Celsjusza, co jest odpowiednim zakresem przeżycia galleria mellonella.

Przygotuj szeroki zakres dawek przekraczających oczekiwany zakres terapeutyczny środka przeciwdrobnoustrojowego, kierując się danymi o toksyczności in vitro. Wstrzyknij zdrową, bezpłodną galleria mellonella w odpowiednich grupach z różnymi stężeniami przeciwdrobnoustrojowymi i PBS. Aby zoptymalizować leczenie infekcji bakteryjnej w galleria mellonella, przygotuj odpowiedni zakres dawek środków przeciwdrobnoustrojowych na podstawie wstępnych testów toksyczności.

Zainfekuj grupy larw bakteriami, jak opisano wcześniej. Dwie godziny po zakażeniu lecz larwy przygotowanym środkiem przeciwbakteryjnym lub roztworem kontrolującym pojazd. Monitoruj przeżywalność galleria mellonella co 30 minut lub częściej od momentu, gdy zwykle obserwuje się śmierć.

Usuń martwe larwy i zapisz czas ich śmierci. Aby porównać, jak czas leczenia wpływa na śmiertelność, lecz larwy dwie, cztery, sześć, dziewięć lub dwanaście godzin po zakażeniu i monitoruj ich przeżywalność co 30 minut. Skuteczna dawka tobramycyny, zależała od szczepu, pięć miligramów na kilogram, była optymalna dla PAO1 i PA14,2,5 miligrama na kilogram dla PAK oraz 10 miligramów na kilogram dla IST27-M.

Żadna dawka nie była skuteczna dla LESB58. Leczenie pięcioma miligramami na kilogram tobramycyny w dwóch, czterech i sześciu godzinach po zakażeniu skutkowało ponad 50% przeżywalnością larw Plasmodium aeruginosa zakażonych Galleria mellonella.