Name: Oznaczanie stabilności ludzkiego enzymu deaminazy adenozyny 1 w surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Poznaj metody oceny stabilności enzymów w surowicy dla inżynierii białek i terapii przeciwnowotworowej. Badanie pokazuje, jak zwiększona stabilność poprawia skuteczność leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health [1DP2CA280622-01] i finansowana przez Biolocity. Dziękujemy dr Marii Jennings i Andrei Fox za dostarczenie wektorów ekspresji HsADA1 i HsKYNazy.

1. Inkubacja surowicy
<ol>
	<li>Przygotować 10-krotny roztwór zapasowy HsADA1 w 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) o stężeniu końcowym 10 µM. Odmrozić 15 mL alikwot połączonego surowicy ludzkiej i podgrzać do 37 °C. Podgrzać 50 mL alikwot 1x PBS do 37 °C.</li>
	<li>Przygotować mieszaniny do inkubacji enzymu z surowicą, dodając 100 µL 10-krotnego roztworu zapasowego HsADA1 do 900 µL połączonej surowicy ludzkiej w probówce do mikrowirówki o niskim wiązaniu (low-bind), określanej jako mieszanina enzym + surowica. W osobnej probówce low-bind dodać 100 µL 10-krotnego roztworu zapasowego HsADA1 do 900 µL 1x PBS w celu porównania z kontrolą bezsurowiczą, określaną jako mieszanina enzym + 1x PBS. Stężenie końcowe HsADA1 w każdej mieszaninie wyniesie 1 µM.</li>
	<li>Przygotować dodatkową kontrolę w probówce low-bind, składającą się ze 100 µL 1x PBS zmieszanego z 900 µL połączonej surowicy ludzkiej. Będzie ona służyć jako kontrola bezenzymowa dla mieszaniny enzym + surowica. Dodatkowo przygotować kontrolę składającą się z 1 mL 1x PBS, która będzie służyć jako kontrola bezenzymowa dla mieszaniny enzym + 1x PBS.</li>
	<li>Odmierzyć 100 µL każdej mieszaniny z kroku 1.2 do osobnych probówek low-bind i rozcieńczyć w stosunku 1:1 za pomocą 100 µL 30% (v/v) glicerolu w 1x PBS. Zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki te będą stanowić punkt czasowy Dzień 0, a stężenie HsADA1 w nich wyniesie 500 nM. Powtórzyć ten krok dla mieszanin kontrolnych bezenzymowych z punktu 1.3. Uszczelnić wszystkie mieszaniny enzymów i kontroli przezroczystą folią i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 h pobrać 100 µL każdej inkubowanej próbki i rozcieńczyć 1:1 za pomocą 100 µL 30% (v/v) glicerolu w 1x PBS. Zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki te będą stanowić punkt czasowy Dzień 1. Wrócić wszystkie mieszaniny enzymów i kontroli do inkubatora w temperaturze 37 °C. Powtórzyć ten krok w 72 h i 120 h. 
	UWAGA: Pobrane alikwoty próbek nie muszą być koniecznie mrożone błyskawicznie. Alternatywnie użytkownik może wykonać analizę na mikropłytce natychmiast po pobraniu każdej próbki, przy czym przy każdym badaniu próbki należy przygotować świeże krzywe wzorcowe i zapasy substratu adenozyny.</li>
</ol>
2. Analiza w płytkach mikrotitracyjnych
<ol>
	<li>Przygotować czytnik mikropłytek, konfigurując protokół pomiaru kinetycznego (Rycina 2) do pomiaru absorbancji przy 260 nm z najkrótszym odstępem czasu pomiaru przez 30 min i rozgrzać czytnik do temperatury zadanej 37 °C.</li>
	<li>Odmrozić wszystkie zebrane próbki na lodzie. Rozcieńczyć każdą rozmrożoną próbkę w stosunku 1:10, używając 1x PBS wstępnie ogrzanego do 37 °C jako rozcieńczalnika, w probówkach do mikrocentryfugi typu low-bind. Nowe stężenie HsADA1 w tych próbkach wyniesie 50 nM.</li>
	<li>Przygotować również 10-krotne rozcieńczenie w 1x PBS z kontrolnej próbki surowicy bez enzymu. Dodatkowo przygotować roztwór zapasowy adenozyny 5 mM, dodając 66,8 mg adenozyny do 50 mL 1x PBS. Przygotować rozcieńczenie adenozyny 250 µM, dodając 400 µL roztworu zapasowego adenozyny do 7 600 µL 1x PBS i wstępnie ogrzać go do 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Do kompatybilnej z UV mikropłytki 96-dołkowej dodać 160 µL rozcieńczenia adenozyny 250 µM oraz 40 µL każdej rozcieńczonej próbki białka w trzech powtórzeniach, aby uzyskać całkowitą objętość 200 µL. Pozwoli to uzyskać końcowe stężenie adenozyny 200 µM i końcowe stężenie enzymu 10 nM.</li>
	<li>Powtórzyć rozcieńczanie dla próbek kontrolnych, dodając 40 µL rozcieńczonej surowicy lub kontroli 1x PBS oraz 160 µL rozcieńczenia adenozyny 250 µM w trzech powtórzeniach. Pozwoli to również uzyskać końcowe stężenie adenozyny 200 µM, ale bez enzymu. 
	UWAGA: W celu skrócenia całkowitego czasu napełniania może być korzystne najpierw dodać wszystkie rozcieńczone próbki enzymu i kontroli indywidualnie do mikropłytki, a następnie dodać substrat adenozyny za pomocą mikropipety 12-kanałowej. Dodatkowo w tym kroku należy używać płytek przezroczystych dla UV, aby zapobiec zakłócaniu mierzonego sygnału absorbancji przez samą płytkę.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdego dołka przy 260 nm przez 30 min w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Analiza danych z czytnika mikropłytek
<ol>
	<li>Wyznacz nachylenie odcinka liniowego danych absorbancji w funkcji czasu dla pierwszych kilku minut pomiarów na płytce mikrotitracyjnej. Dla próbek rozcieńczonych w surowicy odpowiadało to pierwszym ~120 s. Dla próbek rozcieńczonych w 1x PBS odpowiadało to pierwszym ~270 s. Nachylenie to, opisujące spadek wartości absorbancji, będzie miało ujemną wartość liczbową i będzie wyrażone w jednostkach zmiany absorbancji na sekundę (ΔA260/s).</li>
	<li>Od nachylenia uzyskanego dla danych enzym + surowica odejmij nachylenie kontroli negatywnej składającej się z puli surowicy ludzkiej. Wykonaj tę samą operację dla mieszanin enzym + 1x PBS, odejmując nachylenie kontroli 1x PBS.</li>
	<li>Znormalizuj wszystkie skorygowane nachylenia względem początkowego nachylenia w czasie t=0 h, aby obliczyć frakcję pozostałej aktywności za pomocą równania 1. 
	<img alt="Równanie frakcji aktywności; Stosunek zmian absorbancji w analizie spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">    Równanie 1</li>
	<li>Przedstaw na wykresie zależność frakcji pozostałej aktywności od czasu.</li>
</ol>

Evaluating Serum Stability of HsADA1: A Microplate-Based Approach

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

JB i MRJ są wynalazcami patentów lub zgłoszeń patentowych związanych z deaminazą adenozynową i/lub enzymami kynureninazy. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Protokół ten wykorzystuje zmianę absorbancji, gdy substrat jest przekształcany w produkt w celu zmierzenia aktywności enzymu. W związku z tym podłoże i produkt muszą mieć odrębne profile spektralne. Tak jest w przypadku adenozyny i inozyny, które mają różne profile widmowe i współczynniki ekstynkcji w zakresie 260-265 nm 6,8,12,13. Ten test jest inspirowany kilkoma wcześniejszymi pracami. Kalackar, na przykład, wykorzystał zmianę absorbancji przy 265 nm jako bezpośredni korelat aktywności deaminazy adenozyny14. Gracia i wsp. oraz Lu i wsp. zastosowali podejście zakorzenione w prawie Beera-Lamberta, które wiąże prędkość początkową z różnicą współczynników ekstynkcji między adenozyną a inozyną 8,13. W podobnym duchu, OH-Kyn i OH-AA mają również różne profile widmowe, ponieważ OH-Kyn silnie absorbuje przy 379 nm, podczas gdy OH-AAnie 9,10. Spektrum absorbancji metabolitów można łatwo sprawdzić za pomocą skanowania pełnego spektrum na wielu czytnikach mikropłytek, które z kolei informowałyby użytkownika, czy możliwe jest śledzenie postępu reakcji enzymatycznej. Jak wspomniano wcześniej, Lu i in. wcześniej analizowali natywną stabilność HsADA1 w różnych płynach ustrojowych, a Jennings i in. zastosowali bardzo podobną metodę do oceny stabilności surowicy rekombinowanego HsADA1 i zmutowanego enzymu 6,8. Ta metoda, podobnie jak metoda Jenningsa i wsp., jest wyjątkowa, ponieważ możemy używać enzymów o ekspresji rekombinowanej, w przeciwieństwie do enzymów pochodzących natywnie. W ten sposób metodę tę można ekstrapolować na zmutowane białka, które nie występują natywnie w organizmach żywych.
W przypadku kombinacji produkt/substrat, których nie można zmierzyć za pomocą testu absorbancji na płytce, protokół ten można zmodyfikować w celu uwzględnienia kilku innych alternatywnych metod analitycznych, które śledzą degradację substratu lub tworzenie produktu do testów kinetycznych, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), która na przykład była wcześniej stosowana do oceny kinetyki zarówno deaminazy adenozyny, jak i kinureninazy15, Rozdział 16,17. Tylko metoda oznaczania pozostałego substratu lub wytworzonego produktu po pewnym czasie (jeśli nie jest określana w sposób ciągły) powinna się różnić. Wybór testu będzie oczywiście zależał od reakcji katalizowanej przez interesujący nas enzym, a kluczowym czynnikiem przy tym wyborze będzie również kompatybilność danej metody analitycznej z rozcieńczoną surowicą ludzką. Równie ważny może być również całkowity czas potrzebny do analizy wszystkich interesujących nas próbek, a kluczową korzyścią płynącą z zastosowania testu mikropłytek jest możliwość łatwej analizy szybkości degradacji w maksymalnie 96 próbkach jednocześnie.
Parametry testu, takie jak stężenie enzymu na płytce i substratu, będą musiały zostać dostrojone do poszczególnych enzymów będących przedmiotem zainteresowania. Dla wszystkich przeprowadzonych tu testów wybrano stężenie substratu powyżej Km o rząd wielkości większe (1,15-1,26 OOM). Wildtype HsADA1 ma Km ~ 14 μM dla adenozyny, a końcowe stężenie adenozyny zastosowane na płytce wyniosło 200 μM3. Podobnie, testowany zmodyfikowany wariant HsKYNazy ma Km ~ 22 μM dla OH-Kyn, a końcowe stężenie OH-Kyn zastosowane na płytce wynosiło 400 μM7. Jednym z ważnych wymagań dotyczących stężeń substratu będących przedmiotem zainteresowania dla testu mikropłytek jest to, że substrat jest zgodny z prawem Beera-Lamberta w danym zakresie, tak że spadek absorbancji może być liniowo skorelowany z degradacją substratu (rysunek uzupełniający 1 i rysunek uzupełniający 2). Ta korelacja liniowa eliminuje konieczność przekształcania zmiany absorbancji na stężenie substratu, ponieważ przeprowadzenie tej konwersji nie zmieniłoby pozostałej frakcji aktywności.
Jeśli chodzi o stężenie enzymu, głównym kryterium, które należy wziąć pod uwagę, jest wystarczająca degradacja substratu w stosunku do tła. Zarówno w przypadku HsADA1, jak i zmodyfikowanej HsKYNazy, wykorzystaliśmy wcześniej opublikowane wartości literaturowe, aby wygenerować reprezentatywne wyniki 6,7. Jak wykazaliśmy tutaj, stosowanie krótszych czasów z wyższymi stężeniami enzymów może być wykonalne, podobnie jak stosowanie dłuższych czasów i niższych stężeń enzymów. Ogólnie rzecz biorąc, dłuższy okres czasu/niższe stężenie enzymu może dać bardziej powtarzalne wyniki, chyba że sam substrat jest podatny na degradację. W tym duchu zarówno kinurenina, jak i jej pochodne, w tym OH-Kyn, ulegają stosunkowo szybkiej degradacji w temperaturze pokojowej, co powoduje zauważalne żółknięcie mieszaniny substratów18. W przypadku innych enzymów można przeprowadzić prosty eksperyment eskalacji stężeń w celu zidentyfikowania stężeń z najbardziej optymalnymi krzywymi reakcji i separacją tła. Przeprowadzenie tej eskalacji stężenia na HsADA1 pokazuje, że w zakresie 1-10 nM osiąga się największą separację tła (rysunek uzupełniający 3). Przeprowadzenie tego samego eksperymentu eskalacji stężenia z zaprojektowaną HsKYNazą pokazuje podobny trend z największą separacją tła przy 2 μM (rysunek uzupełniający 4). Jednak oba testy (HsADA1 kontra HsKYNaza) nie mają takiej samej czułości. W przypadku HsADA1 stężenie enzymu na płytce wynoszące jedną dziesiątą stężenia użytego w protokole jest nadal możliwe do odróżnienia od tła na statystycznie istotnych poziomach (rysunek uzupełniający 3). To samo nie dotyczy HsKYNazy, co oznacza, że może być trudniej ilościowo ocenić, ile aktywności HsKYNaza zachowuje po utracie ponad 90% swojej aktywności. Stanowi to potencjalne ograniczenie metody czytnika mikropłytek.
Dodatkowo, jedną z obserwacji, które poczyniliśmy dla HsKYNazy, było to, że po załadowaniu płytki nastąpiła natychmiastowa przerwa między odczytami absorbancji między próbkami enzymu + 1x PBS a kontrolą 1x PBS (Figura 5B, D). Ta luka była obecna we wszystkich punktach czasowych. Ponieważ zaobserwowaliśmy to zjawisko również podczas testowania enzymu dezaktywowanego termicznie (podgrzewanego w temperaturze 95 °C przez 10 minut), doszliśmy do wniosku, że nie jest to wynik degradacji substratu za pośrednictwem enzymu (rysunek uzupełniający 5). Podczas gdy kontynuowaliśmy pierwotne kontrolne wartości absorbancji, przyszłe badania mogą wykorzystywać dezaktywowane kontrole enzymatyczne w celu wyeliminowania tej rozbieżności. Należy jednak wziąć pod uwagę koszt zakupu lub wyprodukowania enzymu będącego przedmiotem zainteresowania. Zarówno w przypadku HsKYNazy, jak i HsADA1 wystąpiła pewna zmienność w początkowych wartościach absorbancji badanych próbek, przy czym niektóre z nich zaczynały się od niższej wartości absorbancji niż powiązane z nimi kontrole (ryc. 3 i ryc. 5). Można to częściowo przypisać opóźnionemu czasowi dodawania substratu do wszystkich próbek białka, a następnie ładowaniu do czytnika płytek. Ponieważ jednak zastosowane stężenie substratu jest znacznie wyższe niż wartości Km zastosowanych enzymów, nie oczekuje się, że doprowadzi to do efektów zależnych od stężenia substratu na obserwowanych zboczach.
W sekcji dotyczącej protokołu i reprezentatywnych wyników próbki są podawane we wskazanych punktach czasowych, przy czym czas pobierania próbek różni się w zależności od profilu aktywności enzymu. Ten harmonogram pobierania próbek będzie zależał od profilu aktywności enzymu będącego przedmiotem zainteresowania w surowicy. Jeśli enzym szybko traci aktywność, pożądany będzie krótszy odstęp między próbkami, tak jak w przypadku testowanego mutanta HsKYNase_66-W102H-T333N, a odwrotnie jest w przypadku enzymów o większej stabilności surowicy. W związku z tym prawdopodobnie korzystne jest przeprowadzenie próby tego protokołu, w której podwielokrotności są pobierane zarówno w małych odstępach czasu (1 godzina, 2 godziny itd.), jak i w dużych (24 godziny, 48 godzin itd.), aby zbadać, jak wygląda profil stabilności surowicy dla nowego enzymu będącego przedmiotem zainteresowania. Oczywiście, w miarę jak staje się ona bardziej stabilna, stabilność surowicy staje się mniej istotna w porównaniu z klirensem nerkowym lub innymi mechanizmami klirensu białek in vivo .
Ponieważ kynureninazy różnią się od HsADA1, zmodyfikowaliśmy kilka parametrów testu, a mianowicie stężenie enzymu podczas inkubacji w surowicy lub 1x PBS, interwał pobierania próbek, stężenie enzymu w teście mikropłytkowym, stężenie substratu w teście mikropłytkowym i, oczywiście, sam substrat. Zmiany są następujące: 10x zapas enzymu miał stężenie 100 μM, co po rozcieńczeniu surowicą/1x PBS dało stężenie 10 μM. Interwał pobierania próbek w metodzie inkubacji surowicy został dostosowany, ponieważ HsKYNaza traci aktywność szybciej w surowicy niż w HsADA1. W związku z tym metoda obejmowała pobieranie próbek w punktach czasowych 0,5, 3 h i 24 h. Ponadto próbki HsKYNazy nie zostały błyskawicznie zamrożone, zamiast tego zostały natychmiast przeanalizowane za pomocą testu mikropłytki. Czytnik płytek został skonfigurowany do odczytu przy długości fali 379 nm w celu monitorowania postępu reakcji enzymatycznej. Kolejną ważną różnicą w teście opartym na mikropłytkach podczas badania enzymu HsKYNazy jest przygotowanie substratu. Zapas 2 mM OH-Kyn został sporządzony przez rozpuszczenie 4,5 mg OH-Kyn w 10 ml 1x PBS. W tym samym czasie 6 mg fosforanu pirydoksalu (PLP), kofaktora HsKYNazy, rozpuszczono w 1 ml 1x PBS, aby uzyskać 100-krotny zapas PLP. Rozcieńczenie OH-Kyn o wielkości 500 μM przygotowano przez dodanie 2,5 ml materiału wyjściowego OH-Kyn do 7,5 ml 1x PBS, a także 100 μL 100 μL materiału PLP. Aby przeprowadzić test mikropłytki, 80 μl rozcieńczenia 500 μM OH-Kyn i 20 μl próbek białka lub kontroli ujemnych dodano w trzech egzemplarzach do 96-dołkowej mikropłytki zgodnej z promieniowaniem UV. W ten sposób uzyskano końcowe stężenie OH-Kyn wynoszące 400 μM i końcowe stężenie enzymu 2 μM, po czym mierzono absorbancję przy 379 nm przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W przeciwieństwie do HsADA1, który został rozcieńczony przed analizą na czytniku płytkowym, HsKYNaza nie była rozcieńczana.
Chociaż protokół ten jest stosunkowo prosty, potencjalnym wyzwaniem może być przygotowanie oryginalnych zapasów enzymów. Wszystkie enzymy użyte w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników wyrażono w E. coli i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu, a następnie chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). Kilka innych źródeł fachowo opisało alternatywy dla naszej metody oczyszczania, obejmujące organizmy gospodarzy i dalsze przetwarzanie19,20. Test ten zasadniczo próbuje określić zdolność enzymu do zachowania swojej aktywności w połączonej surowicy ludzkiej. Jednym z założeń naszej metodologii jest to, że utrata aktywności enzymu jest trwała, tj. usunięcie dezaktywowanego enzymu z surowicy nie przywróci jego aktywności. Jest to istotne, ponieważ w tym protokole dodatkowo rozcieńczamy mieszaniny enzymów glicerolem i 1x PBS przed błyskawicznym zamrożeniem i po rozmrożeniu. Jeśli ta utrata aktywności jest odwracalna po usunięciu surowicy, te dodatkowe rozcieńczenia uniemożliwią uchwycenie tego zjawiska w teście. Jeśli jest to niepokojące dla użytkownika, to 1.) Zbiorcza surowica ludzka może być stosowana jako rozcieńczalnik zamiast 1x PBS w przygotowaniu wszystkich roztworów substratów i próbek testowych oraz 2.) Błyskawiczne zamrażanie i dodawanie glicerolu można pominąć, a próbki można natychmiast przetworzyć w celu utrzymania enzymu w jego pierwotnym środowisku. Wreszcie, chociaż test ten może być wykorzystany do zbadania specyficznego wpływu surowicy na aktywność enzymu, nie można wyciągnąć żadnych wniosków dotyczących konkretnego mechanizmu stojącego za takimi efektami. To, czy ta utrata aktywności jest spowodowana rozwijaniem enzymów, agregacją, utratą kofaktora, czy też rozszczepieniem przez proteazy surowicy, wymagałoby dalszych badań. Podobne kwalifikacje można powiedzieć o inkubowanym enzymie 1x PBS, ponieważ nie można wyciągnąć wniosków mechanistycznych z tego testu.
W kontekście opracowywania białkowych leków biologicznych jako środków terapeutycznych, zdolność do utrzymania aktywności w surowicy jest ważnym wskaźnikiem21. Enzym terapeutyczny, który bardzo szybko traci swoją aktywność, musiałby być dawkowany wielokrotnie, aby uzyskać korzyść kliniczną. Praca ta zapewnia użytkownikom test in vitro do ilościowego badania przesiewowego enzymów w celu zwiększenia stabilności surowicy. W połączeniu z ukierunkowanymi wysiłkami ewolucyjnymi, enzymy o doskonałej stabilności surowicy mogą być badane przesiewowo i selekcjonowane, co daje większy potencjał translacji. Ponadto przewidujemy, że protokół ten może również współpracować z bardziej zaawansowanymi systemami, na przykład do pomiaru stabilności surowicy w miejscu, w którym enzym jest zamknięty. Das i in. zastosowali test dla kilku różnych enzymów upakowanych w cząstkach wirusopodobnych i przetestowali ich stabilność w różnych warunkach denaturacji, takich jak rozpuszczalniki organiczne22.

Poniższa metoda pozwala użytkownikowi ilościowo ocenić zdolność enzymu do zachowania swojej aktywności po wystawieniu na warunki, które naśladują to, co napotka po wstrzyknięciu dożylnym. Metoda in vitro naśladuje takie warunki in vivo i polega na inkubacji enzymu w zbiorczej surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C oraz analizach zachowania aktywności enzymu w czasie. Zdolność enzymu do utrzymania aktywności w tych warunkach nazywamy jego stabilnością w surowicy, a metoda analizy aktywności enzymu wykorzystuje różnice w absorbancji między substratem enzymu a otrzymanym produktem. Koncepcja stabilności surowicy nie jest specyficzna tylko dla enzymu i została zastosowana również do kilku innych metod leczenia. Na przykład stabilność surowicy aptamerów RNA ukierunkowanych na białka kolców COVID została wcześniej oceniona poprzez monitorowanie ich degradacji po inkubacji za pomocą płodu cielęcego surowica1. Peptydy przeciwbakteryjne zostały również ocenione pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu bakterii po inkubacji z pulą surowicy ludzkiej2.
HsADA1 to enzym, który katalizuje przemianę adenozyny lub 2-deoksyadenozyny odpowiednio w inozynę lub 2-deoksyinozynę3. Adenozyna ma pik absorpcji 260 nm, podczas gdy inozyna wchłania się najsilniej przy 250 nm4. To przesunięcie pików absorpcji można wykryć na czytniku mikropłytek poprzez zmniejszenie intensywności absorpcji przy 260 nm, gdy HsADA1 jest dodawany do adenozyny. Enzym HsADA1 ma ważne implikacje w organizmie człowieka, a jego niedobór powoduje ciężki złożony niedobór odporności (ADA-SCID)5. Bydlęcy homolog HsADA1, BtADA1, może być wykorzystany jako enzymatyczny środek zastępczy w leczeniu ADA-SCID, a wcześniej wykazaliśmy, że HsADA1 typu dzikiego traci swoją aktywność, gdy jest inkubowany z połączoną surowicą ludzką, potencjalnie utrudniając jego stosowanie jako terapeutycznej klasy <sup="xref">6. Dlatego wybraliśmy enzym HsADA1 typu dzikiego, aby zademonstrować procedurę określania stabilności enzymu w surowicy. Szczegółowa metoda oczyszczania HsADA1 została opisana wcześniej6.
W poniższym protokole (opisanym w Rysunek 1), pokazujemy, jak współinkubować HsADA1 typu dzikiego w zbiorczej surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C. W tym czasie próbki testowe są pobierane w określonych punktach czasowych i zamrażane w celu przyszłej analizy. Po pobraniu wszystkich próbek przeprowadza się test mikropłytki, w którym każda próbka jest łączona z substratem, przy czym wynikający spadek absorbancji jest korelacją dla zachowanej aktywności enzymu. Przedstawiono reprezentatywne wyniki ilustrujące stabilność HsADA1 w surowicy, a ponieważ wskaźnik ten może być istotny dla określenia potencjalnej wartości terapeutycznej innych enzymów, omawiamy również rozważania dotyczące dostosowania tego protokołu do zmodyfikowanego enzymu kynureninazy Homo sapiens (HsKYNazy) i wszelkich enzymów bardziej ogólnie. HsKYNaza jest enzymem biorącym udział w metabolizmie tryptofanu i jest zdolna do rozkładu produktów ubocznych tryptofanu kinureniny i hydroksy-kinureniny (OH-Kyn) odpowiednio do kwasu antranilowego i kwasu hydroksy-antranilowego (OH-AA). Modulacja metabolizmu tryptofanu za pośrednictwem enzymów może mieć znaczenie terapeutyczne7.

<table><tbody><tr><td>Adenozyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr>Czytnik <td></td><td></td><td></td><td>mikropłytek BioTek Synergy HT</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf LoBind: Białko&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>glicerolu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>Własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>serum ludzkie, zbiorcze</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>hydroksy-kinureniny</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inozyna&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7,4+/- 0,1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>5-fosforan pirydoksalu jednowodny, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR MICROPLATE, 96 DOŁKÓW, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Ludzka deaminaza adenozynowa typu dzikiego 1</td><td>we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie stabilności ludzkiego enzymu deaminazy adenozyny 1 w surowicy

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

Pojęcie stabilności enzymu jest zazwyczaj używane w odniesieniu do termostabilności enzymu - jego zdolności do zachowywania struktury i aktywności wraz ze wzrostem temperatury. W przypadku enzymu terapeutycznego kluczowe mogą być również inne miary stabilności, w szczególności jego zdolność do zachowania funkcji w ludzkiej surowicy w temperaturze 37 °C, którą nazywamy stabilnością surowicy. W tym miejscu opisujemy test in vitro w celu oceny stabilności surowicy enzymu deaminazy adenozynowej I (HsADA1) typu dzikiego przy użyciu procedury mikropłytki opartej na absorbancji. W szczególności manuskrypt ten opisuje przygotowanie i odczynników, metodę organizowania komonetyzacji HsADA1 w surowicy, metodę analizy próbek testowych za pomocą czytnika mikropłytek oraz towarzyszącą analizę w celu określenia frakcji aktywności, którą enzym HsADA1 zachowuje w surowicy w funkcji czasu. Dalej omawiamy rozważania dotyczące dostosowania tego protokołu do innych enzymów, na przykładzie enzymu kynureninazy Homo sapiens, aby pomóc w adaptacji protokołu do innych enzymów, w przypadku których stabilność surowicy jest interesująca.

Rysunki przedstawiają wyniki testu przeprowadzonego z wykorzystaniem HsADA1 typu dzikiego. Rysunek 3A,B ilustruje krzywe spadku absorbancji przy 260 nm próbek pochodzących z mieszanin 1x PBS/surowica-enzym dla HsADA1 typu dzikiego po dodaniu adenozyny. Dane dotyczące tego spadku absorbancji w funkcji czasu są tym, czego użytkownik może oczekiwać po pomyślnym przeprowadzeniu testu na mikropłytce i są podobne do danych absorbancji, które pojawiłyby się po dodaniu odpowiedniej ilości funkcjonalnego HsADA1 do adenozyny. Rysunek 3C,D ilustruje krzywe absorbancji przetestowanych kontroli negatywnych, które nie zawierają enzymu po dodaniu adenozyny. W porównaniu z rzeczywistymi próbkami enzymu, zmiana absorbancji tych kontrol negatywnych jest niemal niezauważalna. Z Rysunku 3 wynika, że nachylenie krzywych enzymatycznych zmienia się w funkcji czasu inkubacji. Na przykład nachylenie dla punktu czasowego Dzień 0 jest znacznie większe niż dla punktu czasowego Dzień 5.
Rysunek 4 przedstawia frakcję aktywności zachowanej przez HsADA1 typu dzikiego w funkcji czasu podczas inkubacji w 1x PBS lub połączonym surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C. W szczególności, nachylenia wszystkich krzywych spadku absorbancji na Rysunku 3A,B zostały znormalizowane do nachyleń z dnia 0 dla ich odpowiednich grup. Jak widać na Rysunku 4, występuje rozbieżność w aktywności zachowanej dla HsADA1 typu dzikiego w 1x PBS w porównaniu do połączonej surowicy ludzkiej. Konkretnie, enzym traci aktywność szybciej w połączonej surowicy ludzkiej, zachowując około 10% swojej pierwotnej aktywności w 5. dniu. Utrata aktywności jest nadal wykrywalna, gdy HsADA1 jest inkubowany w 1x PBS, choć enzym zachowuje około 75% swojej aktywności. Jest to zgodne z wynikami Jenningsa i wsp., którzy również zgłosili spadek aktywności po inkubacji z surowicą w temperaturze 37 °C o prawie 40% po 48 h6. Lu i wsp. wykazali również, że aktywność HsADA1 spada w płynie opłucnej, otrzewnej i mózgowo-rdzeniowej w temperaturze otoczenia (25 °C)8.
Aby zademonstrować elastyczność tego protokołu, wykorzystano go do przetestowania stabilności w surowicy innego enzymu pochodzenia ludzkiego – zmodyfikowanego wariantu ludzkiej kynureninazy, wcześniej nazwanego HsKYNase66-W102H-T333N7. HsKYNase66_W102H-T333N efektywnie katalizuje konwersję OH-Kyn do OH-AA, podobnie jak enzym HsKYNase typu dzikiego, choć w rzeczywistości jest on mutantem z rewersją dwóch aminokwasów zmodyfikowanego wariantu ludzkiej kynureninazy o zmiżonej specyficzności substratowej, tj. takiego, który efektywnie degraduje kynureninę do kwasu antranilowego7. OH-Kyn wykazuje silną absorpcję przy 379 nm, podczas gdy OH-AA nie, co skutkuje mierzalnym spadkiem absorbancji po dodaniu naszego zmodyfikowanego wariantu HsKYNase do OH-kyn9,10. Rysunek 5A,B przedstawia krzywe spadku absorbancji przy 379 nm dla próbek pochodzących z mieszanin 1x PBS/surowica-enzym dla HsKYNase po dodaniu OH-Kyn. Rysunek 5C,D przedstawia krzywe absorbancji przetestowanych kontroli niezawierających enzymów. Podobnie jak w przypadku HsADA1, widoczna jest wyraźna różnica w nachyleniu krzywych absorbancji pomiędzy próbkami. Jest to szczególnie widoczne na Rysunku 5A, gdzie nachylenie w punkcie czasowym 0 h jest znacznie większe niż w punktach czasowych 3 h i 24 h. Rysunek 6 przedstawia odpowiadający temu ułamek zachowanej aktywności dla badanego HsKYNase w funkcji czasu. Podobnie jak HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N traci aktywność w surowicy szybciej niż w PBS (~85% utraty aktywności w porównaniu do ~40% w ciągu 24 h). Choć stabilność w surowicy tego wariantu enzymu nie była wcześniej badana, podąża on za ogólnym trendem innych wariantów HsKYNase, które również utraciły większość swojej aktywności w ciągu 24 h w surowicy w temperaturze 37 °C7. 
Ogólnie rzecz biorąc, enzymy mogą z czasem tracić aktywność z powodu szeregu czynników, w tym pH, stężenia soli, temperatury i innych11. W związku z tym wynik, który nie wykazuje tej tendencji, można uznać za nieprawidłowy. Na przykład, jeśli aktywność enzymatyczna drastycznie wzrasta w czasie, może to wskazywać na nieważność wyników. Zakłada się tutaj, że warunki działania enzymu nie uległy zmianie i odnosimy się ściśle do aspektu czasowego.
<img alt="Proces inkubacji HsADA1; schemat blokowy; rozcieńczanie enzymu, przygotowanie adenozyny, absorbancja UV w płytce 96-dołkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy szczegółowo przedstawiający kroki protokołu dla HsADA1. Rycina przedstawia kroki realizowane w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do analizy kinetycznej na płytce 96-dołkowej; interfejs oprogramowania do kontroli temperatury i odstępów między odczytami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ustawienia odczytu kinetycznego w czytniku mikropłytek. Utworzono protokół odczytu kinetycznego w celu pomiaru absorbancji przy 260 nm przez 30 min w temperaturze 37 °C z minimalnym odstępem czasu. Na rysunku przedstawiono wybrane ustawienia służące do skonfigurowania tego protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy analizy stabilności HsADA1 typu dzikiego; kontrole w surowicy i PBS; absorbancja A260 w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Krzywe zależności absorbancji od czasu dla HsADA1 po dodaniu 200 µM adenozyny. (A) Krzywe zależności absorbancji od czasu dla HsADA1 inkubowanego w surowicy po dodaniu 200 µM adenozyny. (B) HsADA1 inkubowany w 1x PBS. (C) Negatywna kontrola surowicy. (D) Negatywna kontrola 1x PBS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres aktywności HsADA1 w czasie, przedstawiający ułamek aktywności w 1x PBS w porównaniu z pulą surowicy ludzkiej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Utrzymanie aktywności HsADA1. Aktywność oceniono w 1x PBS w porównaniu z pulą surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C. Określono ułamek zachowanej aktywności pierwotnej dla HsADA1 inkubowanego w 1x PBS w porównaniu z pulą surowicy ludzkiej w ciągu 5 dni (słupki = średnia ± SD, n=3). Zastosowano dwustronny nieparzysty test t: *p&lt;0,05, **p &lt; 0,01 oraz ***p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy stabilności kynazy przy A379, surowica/PBS pH 7.4; absorpcja w czasie 0-24h, cztery warunki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Krzywe zależności absorbancji od czasu dla HsKYNase66-W102H-T333N po dodaniu 400 µM OH-Kyn. (A) Krzywe zależności absorbancji od czasu dla HsKYNase inkubowanej w surowicy po dodaniu 400 µM OH-Kyn. (B) HsKYNase inkubowana w 1x PBS. (C) Negatywna kontrola surowicy. (D) Negatywna kontrola 1x PBS (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres aktywności enzymatycznej wariantu HsKynase_66 w 1x PBS w porównaniu z ludzką surowicą w czasie, przedstawiający wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zachowanie aktywności HsKYNase66-W102H-T333N. Aktywność oceniono w 1x PBS w porównaniu z pulą ludzkiej surowicy w temperaturze 37 °C. Wyznaczono frakcję zachowanej aktywności pierwotnej dla HsKYNase66-W102H-T333N inkubowanego w 1x PBS w porównaniu z pulą ludzkiej surowicy w ciągu 24 h (słupki = średnia ± SD, n=3). Zastosowano dwustronny nieparzysty test t; ***p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Krzywa wzorcowa dla adenozyny ikinozyny. Wykres sporządzono dla zakresu 0-200 µM. Adenozynę lubkinozynę dodano do 1x PBS w zaznaczonych stężeniach, a następnie zmierzono absorbancję przy 260 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Krzywa wzorcowa OH-Kyn. Wykres sporządzono dla zakresu 0-400 µM. OH-Kyn dodano do 1x PBS w zaznaczonych stężeniach, a następnie zmierzono absorbancję przy 379 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 3: Krzywe absorbancji w funkcji czasu przy 260 nm dla zwiększających się stężeń HsADA1 po dodaniu 200 µM adenozyny. (A) Krzywe reakcji dla różnych stężeń HsADA1. (B) Krotność zmiany nachylenia liniowego odcinka krzywych absorbancji w stosunku do kontroli 1x PBS (słupki = średnia ± SD, n=3). Zastosowano dwustronny nieparzysty test t **p &lt; 0,01 i ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 4: Krzywe absorbancji w funkcji czasu przy 379 nm dla zwiększających się stężeń zmodyfikowanej HsKYNase po dodaniu 400 µM OH-Kyn. (A) Krzywe reakcji dla różnych stężeń zmodyfikowanej HsKYNase. (B) Krotność zmiany nachylenia obszaru liniowego krzywych absorbancji w stosunku do kontroli 1x PBS (słupki = średnia ± SD, n=3). Zastosowano dwustronny nieparzysty test t ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 5: Krzywe absorbancji w funkcji czasu przy 379 nm z użyciem enzymu dezaktywowanego termicznie w 400 µM OH-Kyn. Do 400 µM OH-Kyn w 1x PBS dodano enzym HsKYNase dezaktywowany termicznie, a następnie zmierzono absorbancję przy 379 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

W tym artykule szczegółowo opisujemy metody charakteryzujące zdolność enzymu do zachowania funkcji podczas inkubacji w temperaturze 37 °C w ludzkiej surowicy, co jest farmakologiczną właściwością określaną jako stabilność jego surowicy. Zdolność ta może być kluczowym czynnikiem w przewidywaniu profilu farmakokinetycznego enzymu i jego przydatności do zastosowania terapeutycznego.

Oznaczanie stabilności ludzkiego enzymu deaminazy adenozyny 1 w surowicy

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

Dlatego nasze laboratorium działa na styku immunologii, inżynierii i metabolizmu, aby poprawić zdrowie ludzi. Wykorzystujemy naszą wiedzę w zakresie inżynierii białkowej i komórkowej, aby tworzyć nowe terapie i kontrolować funkcje biologiczne. Jeśli naukowcy pragną wydłużyć okres półtrwania krążących leków biologicznych białek, protokół ten może pomóc w informowaniu użytkowników, czy stabilność surowicy jest krokiem ograniczającym szybkość.Zrozumienie tego kluczowego punktu pomogłoby w ukierunkowaniu przyszłych wysiłków w zakresie inżynierii białek na obszar potrzeb. Jednym z pytań, które będziemy badać, jest to, czy białka o zwiększonej stabilności surowicy skutkują większą skutecznością terapeutyczną w kontekście leczenia raka niż ich niemodyfikowane odpowiedniki. Będziemy dalej badać, czy skuteczność terapeutyczną można osiągnąć przy użyciu mniejszej dawki ze względu na tę zwiększoną stabilność.

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

W niniejszym artykule opisano procedurę syntezy hydrofobowo modyfikowanej membrany Nafion do unieruchamiania enzymów, sposób unieruchamiania białek i/lub enzymów wewnątrz membrany oraz metodę testowania ich aktywności specyficznej.

Hydrofobowy Nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów

Ten film wyjaśnia ilościową metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu adenozyny i powiązanych puryn generowanych przez konsumpcję AMP w środowisku zewnątrzkomórkowym komórek raka białaczkowego. Protokół opisuje czuły, specyficzny, wiarygodny i powtarzalny test RP-HPLC opracowany i zwalidowany do oznaczania ilościowego zewnątrzkomórkowych nukleotydów purynowych i nukleozydów wytwarzanych przez oczyszczone komórki przewlekłej białaczki...

Zewnątrzkomórkowy metabolizm puryn: test oparty na HPLC do pomiaru wytwarzania i metabolizmu adenozyny w komórkach białaczkowych

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

PAD4 to enzym odpowiedzialny za konwersję peptydylo-argininy do peptydylo-cytruliny. Rozregulowanie PAD4 jest związane z wieloma chorobami u ludzi. Opisano łatwy i wysokoprzepustowy, kompatybilny test PAD4 oparty na fluorescencji.

Monitorowanie aktywności PAD4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Protokół ten opisuje metodę kolorymetryczną umożliwiającą wiarygodną ocenę wpływu chemikaliów na aktywność dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandell-Kolthoffa. Zawiera ona z góry określone kryteria akceptacji oraz statystyczne wskaźniki wydajności oraz wspiera dalsze działania na rzecz włączenia wytycznych testowych OECD.

Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa

Poznaj metody oceny stabilności enzymów w surowicy dla inżynierii białek i terapii przeciwnowotworowej. Badanie pokazuje, jak zwiększona stabilność poprawia skuteczność leczenia.

Oznaczanie stabilności ludzkiego enzymu deaminazy adenozyny 1 w surowicy

Przeglądaj więcej filmów