Name: Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj izolację glejów jelitowych koni w celu badania mechanizmów zapalnych pooperacyjnych. Ta metoda pozwala zrozumieć rolę komórek glejowych w homeostazie jelit i zapobieganiu powikłaniom po kolce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Morris Animal za finansowanie tego projektu.

Pierwotne kultury glejowe jelitowe koni uzyskano od trzech koni, które zostały humanitarnie poddane eutanazji przez przedawkowanie barbituranu z powodów niezwiązanych z tym badaniem. Konie wybrane do badań kulturowych były końmi dorosłymi, bez aktualnej historii chorób przewodu pokarmowego.
1. Podśluzówkowa hodowla pierwotna przędowa jelitowa koni
<ol>
	<li>Wyhoduj monowarstwy nabłonka koni z krypt jelita czczego uzyskanych od trzech oddzielnych dorosłych koni konnych.
	<ol>
		<li>Płytki 24-dołkowe pokryć roztworem powlekającym przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze pokojowej, umyć je 2x sterylną wodą i przechowywać w temperaturze pokojowej, aż komórki będą gotowe do posiewu.</li>
		<li>Po humanitarnej eutanazji, w ciągu 60 minut, usuń fragment jelita czczego i umieść go w zimnym roztworze Ringera na lodzie.</li>
		<li>Usuń 10-centymetrową część z jelita czczego i otwórz ją na granicy antykrezkowej, aby utrzymać obszary nielimfatyczne w środku tkanki. Przytnij porcję do odcinka o wymiarach około 7 cm x 7 cm. Przed sekcją dobrze wypłucz tkankę w świeżym roztworze Ringera.</li>
		<li>Przypnij tkankę do płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym w zimnym roztworze Ringera lub PBS śluzówką do góry, rozciągając tkankę tak bardzo, jak to możliwe (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Usuń kosmki jelitowe za pomocą zakrzywionych kleszczyków (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B), a następnie warstwę blaszki właściwej z obszaru nielimfoidalnego o wymiarach około 5 cm x 5 cm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: Warstwy te łatwo oddzielają się od błony podśluzowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Usuń błonę podśluzową w jednym arkuszu, uwalniając ją nożyczkami do mikrodysekcji w jednym rogu i obserwuj naturalną separację, jednocześnie odrywając błonę podśluzową od wewnętrznej okrągłej warstwy mięśni jelita czczego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
		<li>Zmielić zebraną warstwę podśluzówkową na 2-5 mm kawałki i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml "Organo-FBS" (Tabela 1), 0,825 mg kolagenazy, 5 mg proteazy i 20 mg albuminy surowicy bydlęcej. Inkubować tkankę przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C w celu trawienia enzymatycznego.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 10 ml roztworu "Organo + FBS" o temperaturze pokojowej, aby zatrzymać działanie enzymu. Pipetować mieszaninę tkanek w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu dysocjacji komórek od tkanki, a następnie odwirować w temperaturze 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 10 ml PBS o temperaturze pokojowej, pipetując ponownie około 15 razy w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu oddzielenia komórek od tkanki.</li>
		<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml roztworu "Organo + FBS" o temperaturze pokojowej, pipetując w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu oddzielenia komórek od tkanki.</li>
		<li>Przefiltruj komórki szeregowo przez sitko o wielkości porów 100 μm, 70 μm, a następnie 40 μm.</li>
		<li>Odwirować przefiltrowane komórki i pożywki o masie 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml "Organo + FBS".</li>
		<li>Wybarwić błękitem trypanowym, aby zidentyfikować żywe komórki i policzyć je za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Wysiewaj około 400 000 komórek w 300 μl "Organo + FBS" w każdym dołku 24-dołkowej płytki i dodaj czynniki wzrostu do każdej studzienki: N2 5 μl / dołek, G5 5 μl / dołek i B27 10 μl / dołek. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić przyleganie komórek. Dwadzieścia cztery godziny później zmień pożywkę na "pożywkę glejową" (Tabela 1) z powyższymi czynnikami wzrostu i zmieniaj co 48 godzin (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Cytologia immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Wyhoduj komórki glejowe jelitowe z hodowli pierwotnej (P0) (krok 2.1.14) do 70-80% zbiegu i przeprowadź je raz (P1).</li>
	<li>Utrwalić komórki kultury pierwotnej (P0) w studzienkach za pomocą 4% paraformaldehydu przez 5 minut przed zastosowaniem 0,1% azydku PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór nasycający składający się z azydku PBS, 4% surowicy osła i 0,5% Triton-X. Dodać 300 μl roztworu nasyconego do studzienek, aby przepuszczalność komórek przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać pierwszorzędowe przeciwciało dla markera glejowego, kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i pierwszorzędowe przeciwciało dla markera fibroblastów, aktyny alfa mięśni gładkich, w rozcieńczeniach 1:1,000 w roztworze nasycającym do inkubacji przez noc w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Przemyć 3x PBS przed dodaniem drugorzędowego przeciwciała przeciwko królikowi IgG Alexa Fluor 594 i koziej anty-mysiej IgG Alexa Flour 488 w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze nasycającym przez 2-3 godziny.</li>
	<li>Wybarwić jądra 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Po trzech przemyciach PBS przechowuj komórki w 0,1% azydku PBS.</li>
</ol>
3. Podśluzówkowa ekspozycja na pierwotną hodowlę IL-1β koniowatych
<ol>
	<li>Gdy komórki z pierwszego pasażu (P1) osiągną 70-80% konfluencji, należy przeprowadzić eksperyment ekspozycji na IL-1β. Wystawić studzienki na działanie 0 ng, 10 ng i 25 ng IL-1β przez 24 godziny. Po upływie 24 godzin należy przechowywać pożywki z każdej studzienki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Hodowla organoidów koni do produkcji monowarstw enterocytów
UWAGA: Zgodnie z protokołem Stewart et al. opublikowanym w 2018 roku, bankowane krypty jelitowe koni i pąki, które zostały poddane kriobankowaniu, zostały rozszerzone do badań enteroidów 2D10.
<ol>
	<li>Użyj około 700-1,000 pąków/fragmentów krypty (40 000-50 000 komórek po dysocjacji na pojedyncze komórki) na wkładkę transwell. Pokryj wkładki transwell 42 μl 0,05% Matrigel przed dodaniem enterocytów. Pozostawić Matrigel do utrwalenia na wkładce poprzez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37 oC. Odessać dodatkowe podłoże i pozostawić transwelle do wyschnięcia przez 30 minut bez przykrycia. Dodać 200 μl pożywki DMEM-F12 do każdej wkładki transwell i przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Umyj paszteciki Matrigel zawierające organoidy PBS, a następnie wystawij je na działanie 500 μl Cell Recovery na lodzie. Odpipetuj je wielokrotnie, aby zapewnić pełne pobranie komórek do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w docelowej objętości pożywki z komórek macierzystych nabłonka jelitowego (IESC). Oblicz objętość docelową, mnożąc żądaną liczbę monowarstw przez 200 μl podłoża. (Tabela 1).</li>
	<li>Wstępnie pokryć strzykawkę o pojemności 1 ml w pożywce IESC i odessać zawiesinę komórek przez igłę 16 G. Zastąp igłę 16 G igłą 28 G i wyrzuć przez nią zawiesinę komórek, aby ułatwić rozdzielenie organoidów.</li>
	<li>Umieść 200 μl powstałej zawiesiny komórek po stronie wierzchołkowej powlekanych transwelli i 500 μl IESC, jak również wcześniej opisane czynniki wzrostu po podstawowej stronie wkładki transwell10. Zmieniaj pożywkę i czynniki wzrostu co 24-48 godzin, aż do osiągnięcia konfluencji. Zdefiniuj konfluencję jako gęstość komórek odpowiadającą TEER wynoszącemu 1 000 omówxcm2,11. Aby zapoznać się z pomiarem, patrz krok 5.1.</li>
</ol>
5. Przepuszczalność monowarstwy enterocytów koni po ekspozycji na cytokiny zapalne i produkty glejowe jelitowe koni
<ol>
	<li>Użyj dwuelektrodowej komory pomiarowej TEER, aby określić ilościowo TEER na monowarstwach i ustalić odczyt bazowy na każdej przepuszczalnej membranie transwell. Upewnij się, że media IESC i transwell mają 15 minut na osiągnięcie temperatury pokojowej przed wykonaniem pomiarów. Napełnij kubek hodowlany 1.5 ml pożywki IESC i upewnij się, że we wkładzie transwell znajduje się dokładnie 200 μl pożywki, tak aby przewody płynu pasowały do siebie w momencie pomiaru.</li>
	<li>Wystawić podstawno-boczny aspekt wkładek transwell na działanie cytokin zapalnych 25 ng IL-1β, 10 ng i 25 ng interleukiny 6 (IL-6) na studzienkę lub produktów glejowych kultur wystawionych na działanie 10 ng lub 25 ng IL-1β. Wystawić podstawno-boczny aspekt kontrolnych wkładek transwell na działanie pożywki glejowej i pożywki glejowej z kultur nienarażonych na IL-1β.</li>
	<li>Mierz TEER przez 45 minut w odstępach 10-15 minut, umieszczając każdy transwell w kubku hodowlanym.</li>
</ol>
6. Statystyki
<ol>
	<li>Oblicz zmianę fałdu TEER każdej transwella dla punktów czasowych: 0, 10, 20, 30 i 45 min.</li>
	<li>Korzystając z wybranego oprogramowania (patrz tabela materiałów), porównaj korelacje między zmniejszonym TEER a bazolateralną ekspozycją na IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng i 100 ng) oraz pożywkę glejową (wystawioną na 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β i 25 ng IL-1β) w celu kontrolowania pożywek za pomocą niesparowanego jednostronnego testu t.</li>
</ol>

Studying Enteric Glial-Epithelial Interactions in Colic-Related Inflammation

<ol><li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>Morton, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+and+postoperative+factors+influencing+short-term+survival+of+horses+following+small+intestinal+resection%3A+92+cases+%281994-2001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001).</a> Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).</li>
<li>French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+surgical+colic%3A+risk+factors+for+postoperative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications.</a> Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).</li>
<li>Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+the+local+inflammatory+response+in+the+intestinal+mucosa+and+muscularis+of+horses+undergoing+small+intestinal+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection.</a> Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).</li>
<li>Sheats, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+equine+SIRS%2C+sepsis%2C+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils.</a> Front Vet Sci. 6, 69(2019).</li>
<li>Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+and+postoperative+gastrointestinal+tract+dysfunction%3A+pathogenic+mechanisms+and+novel+treatment+strategies+beyond+colorectal+enhanced+recovery+after+surgery+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharm%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols.</a> Front Pharm. 11, 583422(2020).</li>
<li>Stoffels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+involves+interleukin-1+receptor+signaling+in+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia.</a> Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li>
<li>Savidge, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+regulate+intestinal+barrier+function+and+inflammation+via+release+of+S-nitrosoglutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Hellman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+equine+enteroids+and+enteroid-derived+2D+monolayers+that+are+responsive+to+microbial+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics.</a> Vet Res. 52 (1), 108(2021).</li>
<li>Al-Sadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+permeability+is+mediated+by+JNK+pathway+activation+of+claudin-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene.</a> PLoS One. 9 (3), e85345(2014).</li>
<li>Ochoa-Cortes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells%3A+A+new+frontier+in+neurogastroenterology+and+clinical+target+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases.</a> Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).</li>
<li>Ziegler, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cell+network+function+is+required+for+epithelial+barrier+restitution+following+intestinal+ischemic+injury+in+the+early+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).</li>
<li>Grubišić, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia%3A+the+most+alimentary+of+all+glia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Celem pracy było opracowanie powtarzalnej metody hodowli pierwotnej podśluzówkowego gleju jelitowego koni i wykazanie jej zastosowania do modelowania interakcji nabłonkowo-glejowych w czasie kolki. Izolacja i hodowla gleju jelitowego, która jest nowością u koni, okazała się korzystna w zrozumieniu szlaków chorób jelitowych w modelach świń i gryzoni oraz u ludzi 6,7,13,14. Badanie tej populacji komórek jest potencjalnie ważne ze względu na ich rolę jako podnabłonkowych czujników środowiska jelitowego, a także ich zdolność do interakcji i komunikowania się z otaczającymi komórkami w ścianie jelita. Dzięki ich wyostrzonej zdolności wyczuwania nietrudno wyobrazić sobie potencjalnie krytyczną rolę gleju w kolce koni, gdzie tkanka jelitowa jest obciążona wzdęciami, niedokrwieniem i potencjalnie chirurgiczną manipulacją6.
Wcześniejsze prace Lisowskiego i wsp. wykazały podwyższony stan zapalny tkanki jelitowej koni w czasie operacji kolki. Znaczenie łagodzenia tego środowiska zapalnego podkreślają hodowle gleju jelitowego gryzoni, które okazały się zdolne do syntezy produktów ze zdolnością do zakłócania funkcji bariery jelitowej 7,12. Wyciek treści świetlnej jelita do ściany jelita doprowadziłby nie tylko do reakcji zapalnej, ale także do potencjalnej infiltracji do krążenia, co mogłoby następnie wywołać wstrząs endotoksemiczny/posocznicę. Pacjenci z kolką końską po operacji są niestety nękani licznymi powikłaniami pooperacyjnymi o podłożu zapalnym, w tym sepsą i pooperacyjną niedrożnością jelit, które nie tylko zmniejszają przeżycie i komfort pacjenta, ale także zwiększają koszty klienta i stres emocjonalny3. Ustalenie modelu interakcji nabłonkowo-glejowych w czasie kolki może wyjaśnić potencjalną ścieżkę przepuszczalności bariery jelitowej koni w kolce i możliwe zapobieganie.
Hodowla podśluzówkowego gleju jelitowego koni wiąże się z adaptacjami i ograniczeniami wynikającymi z cech gatunku. Co najważniejsze, czas potrzebny do skutecznego trawienia enzymatycznego wymagał miareczkowania. Autorzy stwierdzili, że inkubacja z enzymami przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C była niezbędna do pomyślnej izolacji gleju jelitowego koni. Ponadto umożliwienie hodowlom jelitowym koni osiągnięcia ponad 80% zbieżności przed pasażowaniem wydaje się być szkodliwe dla żywotności hodowli. Głównym ograniczeniem tej metody w tym dniu jest wielkość próby. Badanie to obejmowało tylko tkanki/komórki, które zostały pozyskane od koni poddawanych operacji kolki lub eutanazji z powodów niezwiązanych z badaniem. Kontynuacja hodowli gleju jelitowego koni od dodatkowych uczestników, a także opracowanie protokołu zamrażania i przechowywania gleju jelitowego koni znacznie zwiększy moc tego badania.
Badanie to przedstawia nową użyteczność podśluzówkowej hodowli gleju jelitowego koni i pierwotnej hodowli enterocytów koni jako potencjalnych metodologii pomagających zrozumieć kolkę koni i choroby przewodu pokarmowego. Ponadto, podczas gdy monowarstwy nabłonka koni wyhodowane z izolowanych krypt jelitowych i organoidów były dobrze znane w przeszłości, badanie to nie tylko nadal prezentowało ich przydatność jako modelu, ale także zachęcało do dodatkowych badań oceniających interakcję z enterocytami jelitowymi koni i innymi typami komórek znajdującymi się w ścianie jelita.
Zaobserwowane interakcje między tymi typami komórek mają potencjalne zastosowanie zarówno w przypadku kolki, jak i innych zapalnych zaburzeń żołądkowo-jelitowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD) i zapalenie jelita grubego. Ponadto ciągłe doskonalenie metod hodowli gleju jelitowego i enterocytów pozwoli w przyszłości na rozpoczęcie badań nad współkulturą. Ponadto, podczas gdy obecne badanie koncentruje się na podśluzówkowej populacji glejów jelitowych ze względu na jej bliskość do monowarstwy nabłonka i skupienie się na funkcji bariery jelitowej, można wykonać dodatkowe prace w celu hodowli i oceny funkcji gleju jelitowego koni ze splotu mięśniowo-jelitowego ściany jelita, co może pomóc w określeniu wpływu zapalnego gleju jelitowego koni na ruchliwość15.

Kolka u koni jest najczęstszą dolegliwością medyczną wymagającą konsultacji w nagłych wypadkach1. Biorąc pod uwagę, że nawet 17% tych koni wymaga korekcji chirurgicznej, wysiłki na rzecz poprawy wyników pooperacyjnych powinny być w czołówce badań medycznych koni 2. Obecnie pacjenci z kolką pooperacyjną doświadczają wysokiego ryzyka wystąpienia kilku zagrażających życiu zaburzeń, w tym sepsy/wstrząsu endotoksemicznego (12,3% pacjentów) i pooperacyjnej niedrożności jelit (13,7% pacjentów)3. Pomimo postępów w leczeniu powikłań pooperacyjnych, nadal istnieje zapotrzebowanie na zaawansowane metody leczenia w celu zapobiegania lub leczenia tych schorzeń.
Ostatnie badania wykazały miejscowy i ogólnoustrojowy stan zapalny pacjentów z kolką4. Na przykład wykazano, że białka prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworów (TNF) alfa, interleukina 1β (IL-1β), interleukina 6 (IL-6) i białko chemoatraktantu monocytów-1, wykazują znacznie zwiększoną ekspresję w błonie śluzowej jelita kolki w porównaniu z normalną tkanką jelitową4. Z ogólnoustrojowego punktu widzenia wykazano, że zwiększony poziom TNF alfa w tkance jelitowej jest skorelowany ze zwiększonym ryzykiem pooperacyjnego refluksu nosowo-żołądkowego większego niż 2 l, co jest ogólnym pomiarem dysmotoryki pooperacyjnej4. Wiadomo również, że podawanie interleukiny IL-1β i TNF alfa jest w stanie wywołać kliniczne objawy wstrząsu septycznego5.
Potencjalnym wyjaśnieniem stanu zapalnego tkanki jelitowej kolki i jej związku z powikłaniami pooperacyjnymi jest bariera nabłonkowa jelit. W zdrowiu kompleksy połączeń ścisłych łączące pojedynczą warstwę nabłonka walcowatego, który wyściela przewód pokarmowy, stanowią funkcjonalną barierę ograniczającą zawartość światła i jej składniki bakteryjne przed przedostaniem się do przestrzeni podśluzówkowej i krwiobiegu. Jednak wzdęcia i uszkodzenia spowodowane niedrożnością jelit związaną z kolką i manipulacją jelit podczas operacji mogą zakłócić tę funkcję bariery jelitowej.
Jeśli chodzi o funkcjonalne składniki ściany jelita jako całości, wykazano, że podśluzówkowa sieć glejowa jelitowa w obrębie jelitowego układu nerwowego jest kluczowa w patofizjologicznym rozwoju powikłań pooperacyjnych związanych ze szlakami zapalnymi i może stanowić konkretny cel terapeutyczny6,7,8,9. Glej jelitowy jest nie tylko obecny w całym przewodzie pokarmowym, ale działa jako czujniki środowiska jelitowego, wpływa na sygnalizację za pomocą wielu typów komórek ściany jelita i bezpośrednio reguluje barierę jelitową6. W związku z tym uzasadnione jest założenie, że te silne czujniki jelita zostałyby aktywowane przez uraz i stan zapalny i mogłyby wywołać ostrą reakcję, taką jak zmiany w przepuszczalności bariery.
To badanie jest pierwszym, które opisuje hodowlę gleju jelitowego koni, a dokładniej rolę zapalnego gleju jelitowego koni na funkcję bariery jelitowej. W tym artykule przedstawiono metody hodowli pierwotnej podśluzówkowego gleju jelitowego koni i ich odpowiedzi na ekspozycję na zapalną IL-1β, ocenę wpływu produktów glejowych jelitowych po ekspozycji na IL-1β na przepuszczalność monowarstw enterocytów koni oraz możliwą blokadę poprzez zastosowanie surowicy koni.

<table><tbody><tr><td>1 M bufor HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>2 mM GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>25050-061</td><td></td></tr><tr><td>4' 6-Diaminidino-2-Phenylindol</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Alfa przeciwciało aktynowe mięśni gładkich</td><td>Abcam</td><td>7817</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>AA9529</td><td>4,4 g / ml podwielokrotności podstawowe, stężenie końcowe 1,1 i mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Anty-Anti-Micotic 1x</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>AA3311</td><td></td></tr><tr><td>BSA 50 mg/ml roztwór podstawowy</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>ACROS Organiics</td><td>206791000</td><td>Składnik obrączkarza koni ' s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>9891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 media</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anty-królik IgG Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>21207</td><td></td></tr><tr><td>EVOM EndOhm dwuelektrodowa komora pomiarowa TEER</td> World <td>Precision Instruments</td><td>EVM-EL-03-01</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Instrukcja dla TEER Measurement</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>G5</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór gentamycyny</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td>Stężenie końcowe 20 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP</td><td>Abcam</td><td>4674</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysie IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>28175</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta; ELISA</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESIL1B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>P330-500</td><td>Składnik Ringera dla koni" s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Corning</td><td>25-00-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33-500</td><td>Składnik Ringera dla koni s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP332-1</td><td>Składnik Ringera dla koni s Bulion 2: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra miarowego i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 1, aby wykonać kompletne " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td>Składnik Ringera dla koni" s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP329-500</td><td>Składnik Ringera dla koni" s Bulion 2: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra miarowego i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 1, aby wykonać kompletne " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>S637-212</td><td>Składnik Ringera dla koni" s Bulion 2: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra miarowego i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2, Połącz z Equine Ringer' s Zapas 1, aby wykonać kompletne " Dzwonek' Rozwiązanie".</td></tr><tr><td>Roztwór pióra/paciorkowca</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>0,5 mg / ml w 1x bufor boranowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaza</td><td>Sigma</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td>7,5% roztwór podstawowy</td></tr></tbody></table>

posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

Zapalne stany pooperacyjne kolki koni (ostry brzuch) nie tylko przyczyniają się do zwiększenia kosztów klienta, dyskomfortu pacjenta i czasu hospitalizacji, ale w wielu przypadkach okazują się zagrażać życiu. Unikalna populacja komórek jelitowych, glej jelitowy, jest coraz częściej uznawana za swoją rolę w wyczuwaniu środowiska żołądkowo-jelitowego i komunikowaniu się z otaczającymi typami komórek. Interakcje między glejem jelitowym a nabłonkiem jelitowym mogą okazać się kluczowe w ustaleniu, w jaki sposób glej jelitowy koni może zmieniać barierę śluzówkową w celu modulowania stanu zapalnego w zdrowiu i kolce.
Aby zbadać tę interakcję, przedstawiamy metodę tworzenia pierwotnych kultur gleju jelitowego koni z jelita czczego koni i wystawiania tych kultur na stany zapalne, o których wiadomo, że są obecne w kolce. Pierwotne posiewy gleju jelitowego uzyskano od dorosłych koni poddanych eutanazji z przyczyn niezwiązanych z kolką. Kosmki jelitowe i blaszkę właściwą poddano mikropreparowaniu w celu odsłonięcia błony podśluzowej. Wyizolowaną błonę podśluzową poddano trawieniu enzymatycznemu kolagenazą, proteazą i albuminą surowicy bydlęcej przez 2-3 godziny. Następnie, mechaniczna mineralizacja obejmująca wirowanie, pipetowanie i sitka komórkowe (40-100 μm), dała osad używany do posiewu na studzienkach pokrytych poli-L-lizyną o stężeniu 0,05 mg/ml poli-lizyny o stężeniu ~400 000 komórek/300 μl pożywki.
Po konfluencji i pierwszym pasażu, komórki glejowe jelita były następnie wystawione na działanie rekombinowanego IL-1β (0, 10, 25 ng) przez 24 godziny. Aby modelować interakcje nabłonkowo-glejowe w czasie kolki, pożywkę kondycjonowaną przez kontrolny lub leczony glej jelitowy dodano bezpośrednio do zlewających się monowarstw jelita czczego koni podczas pomiaru transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) przy użyciu dwuelektrodowej komory EndOhm. Dane te pokazują tylko jedno z wielu potencjalnych zastosowań gleju jelitowego koni.

Mikrosekcja jelita czczego konia do warstwy podśluzówkowej (Rycina 1) z następującym trawieniem enzymatycznym i mechanicznym pozwoliła na uzyskanie żywych kultur komórek glei jelitowej konia. Komórki wykazywały pleomorfizm z przewagą komórek wrzecionowatych, co jest zgodne z obrazem glei jelitowej u innych gatunków (Rycina 2A). Kultury były pozytywne pod kątem selektywnego markera glejowego, białka kwaśnego włókienstwa glejowego (GFAP), przy niskim stopniu zanieczyszczenia fibroblastami (alpha SMA, Rycina 2B). W niektórych przypadkach mikrosekcja warstw podśluzówkowych nie była wystarczająco precyzyjna, a kultury były zanieczyszczone wysokim odsetkiem fibroblastów, co zaobserwowano w immunofluorescencji markera fibroblastów – aktyny mięśni gładkich (Rycina 3).
Następnie, jako przykład użyteczności hodowli glejowych komórek jelitowych koni, oceniono wpływ gleju jelitowego eksponowanego na IL-1β na funkcję bariery nabłonkowej jelit. Basolateralna ekspozycja na pożywkę z hodowli gleju podśluzówkowego koni eksponowanego na 10 ng i 25 ng IL-1β przez 24 h znacząco zwiększyła przepuszczalność (odpowiednio p = 0,05 i 0,04, średnia dla pożywki kontrolnej = 0,9, średnia dla grupy glejowej 10 ng IL-1β = 0,8, przedział ufności 95% = -0,2 do 0,02, średnia dla grupy glejowej 25 ng IL-1β = 0,8, przedział ufności 95% = -0,1995 do 0,01060, n = 3-4) (Rysunek 4A). Jednakże ekspozycja monowarstw nabłonkowych koni na basolateralne 10-25 ng IL-6 koni – cytokiny zapalnej, o której wykazano, że jest produkowana przez glej jelitowy eksponowany na IL-1β i indukuje zwiększoną przepuszczalność enterocytów w modelach gryzoni12 – nie zwiększyła znacząco przepuszczalności monowarstwy enterocytów koni (Rysunek 4B)
<img alt="Proces sekcji tkanki; analiza obrazu mikroskopowego; zestaw obejmuje szalkę Petriego, pęsetę, tkankę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Izolacja glejowi enteric z jelita czczo konia za pomocą mikrodysekcji oraz trawienia enzymatycznego i mechanicznego. (A) Jelito czczo zostało rozcięte wzdłuż brzegu antymezentealnego i przypięte stroną błony śluzowej do góry. (B) Kosmki jelitowe zostały zobrazowane pod mikroskopem i usunięte poprzez delikatne skrobanie, aż do momentu uwidocznienia włóknistej blaszki właściwej. (C) Następnie usunięto warstwę błony właściwej, aż do momentu, gdy włókna mięśni gładkich stały się widoczne przez półprzezroczystą błonę podśluzową. (D) Błonę podśluzową uniesiono i oddzielono od warstwy mięśniowej, przecinając w razie potrzeby włókniste fragmenty. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu sekcyjnego 10x (B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa komórek; kontrast fazowy, immunofluorescence; jądra DAPI, GFAP, aktyna mięśni gładkich." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazowanie hodowli glei jelitowej z podśluzówki konia. (A) Morfologia gwiaździsta (strzałki), wrzecionowata (otwarta grot strzałki) i zrazowa (zamknięta grot strzałki) konnej glei jelitowej została oceniona za pomocą mikroskopii kontrastowej. (B) Czystość hodowli oceniono poprzez barwienie na GFAP oraz na marker fibroblastów, aktynę mięśni gładkich. Paski skali = 100 mm (A), 400 mm (B). Skróty: GFAP = kwaśne białko włókienstwie glejowego; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej hodowli komórkowych z zaznaczonym wyrażaniem białek i markerami molekularnymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazowanie nieudanych hodowli glejowych splotu podśluzówkowego konia. Czystość hodowli oceniono poprzez barwienie na GFAP (czerwony) oraz na marker fibroblastów, aktynę mięśni gładkich (zielony), co wykazało duży procent zanieczyszczenia fibroblastami. Żółta grot grota wskazuje GFAP, a biała grot grota aktynę mięśni gładkich. Pasek skali = 400 mm. Skrót: GFAP = kwaśne białko włókienstwa glejowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres przedstawiający zmianę krotności w czasie; wpływ IL-1β/IL6 na pożywkę; analiza odpowiedzi biologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: TEER monowarstwy nabłonka konia po ekspozycji na cytokiny zapalne i zapalne produkty gleju. (A) Basolateralna ekspozycja na pożywkę z hodowli gleju entericznego podśluzówkowego konia, wystawionego na 10 ng i 25 ng IL-1β przez 24 h, znacząco zwiększyła przepuszczalność (*p = 0,05 i 0,04 odpowiednio, n = 3-4). (B) Ostra ekspozycja basolateralna monowarstwy enterocytów konia na 25 ng IL-1β oraz 10-25 ng konnego IL-6 nie zwiększyła znacząco przepuszczalności monowarstwy nabłonka konia (n = 2-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Odczynniki do izolacji i hodowli. Poniższe odczynniki zostały wykorzystane do sporządzenia pożywek do izolacji glii jelitowej koni, hodowli glii jelitowej oraz hodowli komórek macierzystych nabłonka jelitowego koni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Glej jelitowy staje się coraz bardziej rozpoznawalny ze względu na swoją rolę w homeostazie jelit i procesach chorobowych, w tym powikłaniach pooperacyjnych. Pacjenci koni powracający do zdrowia po laparotomii zwiadowczej w nagłych wypadkach cierpią na wysokie ryzyko wystąpienia stanów zapalnych pooperacyjnych, co podkreśla znaczenie ustalenia powtarzalnej hodowli pierwotnych komórek glejowych jelit koni do badania.

Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni

Inflammatory postoperative conditions of equine colic (acute abdomen) contribute not only to increased client cost, patient discomfort, and ...

Konie borykają się z wyniszczającymi stanami zapalnymi pooperacyjnymi po operacji kolki, W badaniach na ludziach komórki glejowe jelitowe zyskują sławę jako kluczowe czujniki środowiska jelitowego, a także czynniki wpływające na stan zapalny. Naszym celem było wyizolowanie komórek glejowych jelitowych z jelita cienkiego koni, aby ocenić ich rolę w zrozumieniu i zapobieganiu powikłaniom pooperacyjnym. Opracowaliśmy powtarzalny protokół izolowania podśluzówkowych komórek glejowych jelitowych z jelita koni.Udało nam się również zademonstrować jego zastosowanie w zrozumieniu wpływu zapalnego gleju jelitowego na funkcję bariery jelitowej, co może mieć ważne implikacje dla przyszłych badań nad kolkami, powikłaniami pooperacyjnymi i chorobami jelit. Nasze laboratorium będzie nadal koncentrować się na związku gleju jelitowego w zapalnym środowisku jelitowym, a także na tym, w jaki sposób zapobieganie utracie funkcji barierowej przez przeciwzapalne leki biologiczne może być stosowane w celu zapobiegania powikłaniom pooperacyjnym. Na początek pokryj 24-dołkowe płytki roztworem powlekającym i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.Umyj płytki dwa razy sterylną wodą i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż komórki będą gotowe do posiewu. Teraz weź fragment jelita czczego konia i umieść go w zimnym roztworze Ringera na lodzie. Usuń 10-centymetrową część z jelita czczego i otwórz ją na granicy antykrezkowej, umieszczając obszary nielimfoidalne pośrodku.Następnie przytnij porcję na odcinek o wymiarach około siedem na siedem centymetrów i dobrze spłucz tkankę w świeżym roztworze Ringera przed preparacją. Teraz przypnij tkankę do płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym w zimnym roztworze Ringera lub PBS śluzówką do góry, rozciągając ją tak bardzo, jak to możliwe. Za pomocą zakrzywionych kleszczy usuń kosmki jelitowe, a następnie usuń warstwę blaszki właściwej z około pięciu na pięć centymetrów obszaru nielimfatycznego.Następnie za pomocą nożyczek do mikrodysekcji usuń błonę podśluzową w jednym arkuszu, uwalniając ją w jednym rogu. Obserwuj naturalną separację podczas odrywania błony podśluzowej od wewnętrznej warstwy mięśni okrężnych. Następnie zmiel zebraną warstwę podśluzówkową na dwa do pięciu milimetrowych kawałków.Umieść je w 50-mililitrowej stożkowej tubie zawierającej pięć mililitrów Organo bez FBS, kolagenazy, proteazy i BSA. Inkubuj tkankę przez dwie do trzech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia enzymatycznego. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów Organo o temperaturze pokojowej z FBS, aby zatrzymać działanie enzymu.Pipetować mieszaninę tkanek w górę iw dół 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby oddzielić komórki od tkanki. Następnie odwirować mieszaninę o stężeniu 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS o temperaturze pokojowej, pipetując roztwór w górę iw dół 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach Organo o temperaturze pokojowej z FBS, pipetując w górę i w dół 15 razy. Następnie przefiltruj komórki sekwencyjnie przez sitko o wielkości porów 100 mikrometrów, 70 mikrometrów i 40 mikrometrów.Po odwirowaniu komórek i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze Organo z FBS. Następnie wybarwić komórki błękitem trypanowym, aby zidentyfikować żywe komórki i policzyć je za pomocą hemocytometru. Teraz wysiew około 400 000 komórek w 300 mikrolitrach Organo z FBS w każdym dołku 24-dołkowej płytki.Dodaj pięć mikrolitrów N2, pięć mikrolitrów G5 i 10 mikrolitrów B27 do każdej studzienki. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić adhezję komórek. Gdy komórki z pierwszego przejścia osiągną 70 do 80% konfluencji, wystaw studzienki na działanie 0, 10 i 25 nanogramów interleukiny-1 beta przez 24 godziny.W hodowlach zaobserwowano komórki wrzecionowate zgodne z morfologią gleju jelitowego, z pleomorfizmem i minimalnym zanieczyszczeniem innymi typami komórek. Na początek pokryj wkładki Transwell 42 mikrolitrami 0,05% Matrigelu. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby Matrigel stężał.Zassać dodatkowe podłoże i suszyć Transwells przez 30 minut bez przykrycia. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki DMEM F12 do każdej wkładki i przechowuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu użycia. Umyj paszteciki Matrigel zawierające organoidy PBS.Wystaw je na 500 mikrolitrów odzyskiwania komórek na lodzie i wielokrotnie pipetuj mieszaninę, aby zapewnić pełne zebranie komórek w 15-mililitrowej probówce. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w docelowej objętości komórek macierzystych nabłonka jelitowego lub pożywki IESC.Teraz wstępnie pokryj jednomililitrową strzykawkę w podłożu IESC. Odessać zawiesinę komórek przez igłę o rozmiarze 16. Następnie zastąp igłę o rozmiarze 16 igłą o rozmiarze 28 i wyrzuć zawiesinę, aby ułatwić oddzielenie organoidów.Następnie umieść 200 mikrolitrów powstałej zawiesiny komórek w wierzchołkowej stronie powlekanych Transwells. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki IESC i czynników wzrostu po stronie podstawowej. Użyj dwuelektrodowej komory pomiarowej TEER, aby określić ilościowo TEER w monowarstwach.Napełnij kubek hodowlany 1.5 mililitra pożywki IESC i upewnij się, że we wkładce Transwell znajduje się dokładnie 200 mikrolitrów pożywki, aby poziomy płynów zgadzały się podczas pomiaru. Wystaw podstawno-boczny aspekt wkładek Transwell na cytokiny zapalne interleukiny-1 beta lub produkty glejowe z kultur narażonych na interleukinę-1 beta. Mierz TEER co 10 do 15 minut przez 45 minut, umieszczając każdy Transwell w kubku hodowlanym.Podstawno-boczna ekspozycja na pożywki z kultur glejowych traktowanych 10 i 25 nanogramami interleukiny-1 beta znacznie zwiększyła przepuszczalność bariery nabłonkowej. Nie zaobserwowano istotnego wzrostu przepuszczalności nabłonka po ekspozycji na interleukinę-6 koni w różnych stężeniach.

equine-enteric-glial-culture-application-to-study-neural-inflammatory

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy nowatorską metodę utrzymywania ludzkiej błony śluzowej jelita w kulturze oraz monitorowania odpowiedzi na różne rodzaje bodźców przez co najmniej 24 hrs. Dzięki zastosowaniu naszej metody zachowana zostaje polarność tkanki, co umożliwia fizjologiczną stymulację drogą apikalną.

Nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek glejowych jelit od błony podśluzowej i blaszki właściwej jelita myszy. Przedstawiono w nim etapy ekstrakcji tkanki podśluzówkowej i blaszki właściwej, izolowania z nich komórek glejowych jelitowych i hodowli komórek na powlekanej płytce studzienkowej w celu ustanowienia hodowli komórek glejowych jelitowych.

Izolowanie komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej myszy

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Plastyczność neuronalna jest coraz bardziej rozpoznawaną, ale niedostatecznie poznaną cechą przewodu pokarmowego (GI). Tutaj, na przykładzie zaburzeń trzustki u człowieka, przedstawiamy test neuroplastyczności in vitro do badania plastyczności neuronalnej w przewodzie pokarmowym zarówno na poziomie morfologicznym, jak i funkcjonalnym.

Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

Nieprawidłowa funkcja czuciowa leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit. Przedstawiono protokół elektrofizjologicznego zapisu nerwów doprowadzających okrężnicy w preparacie ex vivo jelita grubego szczura.

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Poznaj izolację glejów jelitowych koni w celu badania mechanizmów zapalnych pooperacyjnych. Ta metoda pozwala zrozumieć rolę komórek glejowych w homeostazie jelit i zapobieganiu powikłaniom po kolce.

Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni

Przeglądaj więcej filmów