Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni
4 października 2024
Glej jelitowy staje się coraz bardziej rozpoznawalny ze względu na swoją rolę w homeostazie jelit i procesach chorobowych, w tym powikłaniach pooperacyjnych. Pacjenci koni powracający do zdrowia po laparotomii zwiadowczej w nagłych wypadkach cierpią na wysokie ryzyko wystąpienia stanów zapalnych pooperacyjnych, co podkreśla znaczenie ustalenia powtarzalnej hodowli pierwotnych komórek glejowych jelit koni do badania.
Konie borykają się z wyniszczającymi stanami zapalnymi pooperacyjnymi po operacji kolki, W badaniach na ludziach komórki glejowe jelitowe zyskują sławę jako kluczowe czujniki środowiska jelitowego, a także czynniki wpływające na stan zapalny. Naszym celem było wyizolowanie komórek glejowych jelitowych z jelita cienkiego koni, aby ocenić ich rolę w zrozumieniu i zapobieganiu powikłaniom pooperacyjnym. Opracowaliśmy powtarzalny protokół izolowania podśluzówkowych komórek glejowych jelitowych z jelita koni.
Udało nam się również zademonstrować jego zastosowanie w zrozumieniu wpływu zapalnego gleju jelitowego na funkcję bariery jelitowej, co może mieć ważne implikacje dla przyszłych badań nad kolkami, powikłaniami pooperacyjnymi i chorobami jelit. Nasze laboratorium będzie nadal koncentrować się na związku gleju jelitowego w zapalnym środowisku jelitowym, a także na tym, w jaki sposób zapobieganie utracie funkcji barierowej przez przeciwzapalne leki biologiczne może być stosowane w celu zapobiegania powikłaniom pooperacyjnym. Na początek pokryj 24-dołkowe płytki roztworem powlekającym i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.
Umyj płytki dwa razy sterylną wodą i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż komórki będą gotowe do posiewu. Teraz weź fragment jelita czczego konia i umieść go w zimnym roztworze Ringera na lodzie. Usuń 10-centymetrową część z jelita czczego i otwórz ją na granicy antykrezkowej, umieszczając obszary nielimfoidalne pośrodku.
Następnie przytnij porcję na odcinek o wymiarach około siedem na siedem centymetrów i dobrze spłucz tkankę w świeżym roztworze Ringera przed preparacją. Teraz przypnij tkankę do płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym w zimnym roztworze Ringera lub PBS śluzówką do góry, rozciągając ją tak bardzo, jak to możliwe. Za pomocą zakrzywionych kleszczy usuń kosmki jelitowe, a następnie usuń warstwę blaszki właściwej z około pięciu na pięć centymetrów obszaru nielimfatycznego.
Następnie za pomocą nożyczek do mikrodysekcji usuń błonę podśluzową w jednym arkuszu, uwalniając ją w jednym rogu. Obserwuj naturalną separację podczas odrywania błony podśluzowej od wewnętrznej warstwy mięśni okrężnych. Następnie zmiel zebraną warstwę podśluzówkową na dwa do pięciu milimetrowych kawałków.
Umieść je w 50-mililitrowej stożkowej tubie zawierającej pięć mililitrów Organo bez FBS, kolagenazy, proteazy i BSA. Inkubuj tkankę przez dwie do trzech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia enzymatycznego. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów Organo o temperaturze pokojowej z FBS, aby zatrzymać działanie enzymu.
Pipetować mieszaninę tkanek w górę iw dół 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby oddzielić komórki od tkanki. Następnie odwirować mieszaninę o stężeniu 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS o temperaturze pokojowej, pipetując roztwór w górę iw dół 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.
Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach Organo o temperaturze pokojowej z FBS, pipetując w górę i w dół 15 razy. Następnie przefiltruj komórki sekwencyjnie przez sitko o wielkości porów 100 mikrometrów, 70 mikrometrów i 40 mikrometrów.
Po odwirowaniu komórek i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze Organo z FBS. Następnie wybarwić komórki błękitem trypanowym, aby zidentyfikować żywe komórki i policzyć je za pomocą hemocytometru. Teraz wysiew około 400 000 komórek w 300 mikrolitrach Organo z FBS w każdym dołku 24-dołkowej płytki.
Dodaj pięć mikrolitrów N2, pięć mikrolitrów G5 i 10 mikrolitrów B27 do każdej studzienki. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić adhezję komórek. Gdy komórki z pierwszego przejścia osiągną 70 do 80% konfluencji, wystaw studzienki na działanie 0, 10 i 25 nanogramów interleukiny-1 beta przez 24 godziny.
W hodowlach zaobserwowano komórki wrzecionowate zgodne z morfologią gleju jelitowego, z pleomorfizmem i minimalnym zanieczyszczeniem innymi typami komórek. Na początek pokryj wkładki Transwell 42 mikrolitrami 0,05% Matrigelu. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby Matrigel stężał.
Zassać dodatkowe podłoże i suszyć Transwells przez 30 minut bez przykrycia. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki DMEM F12 do każdej wkładki i przechowuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu użycia. Umyj paszteciki Matrigel zawierające organoidy PBS.
Wystaw je na 500 mikrolitrów odzyskiwania komórek na lodzie i wielokrotnie pipetuj mieszaninę, aby zapewnić pełne zebranie komórek w 15-mililitrowej probówce. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w docelowej objętości komórek macierzystych nabłonka jelitowego lub pożywki IESC.
Teraz wstępnie pokryj jednomililitrową strzykawkę w podłożu IESC. Odessać zawiesinę komórek przez igłę o rozmiarze 16. Następnie zastąp igłę o rozmiarze 16 igłą o rozmiarze 28 i wyrzuć zawiesinę, aby ułatwić oddzielenie organoidów.
Następnie umieść 200 mikrolitrów powstałej zawiesiny komórek w wierzchołkowej stronie powlekanych Transwells. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki IESC i czynników wzrostu po stronie podstawowej. Użyj dwuelektrodowej komory pomiarowej TEER, aby określić ilościowo TEER w monowarstwach.
Napełnij kubek hodowlany 1.5 mililitra pożywki IESC i upewnij się, że we wkładce Transwell znajduje się dokładnie 200 mikrolitrów pożywki, aby poziomy płynów zgadzały się podczas pomiaru. Wystaw podstawno-boczny aspekt wkładek Transwell na cytokiny zapalne interleukiny-1 beta lub produkty glejowe z kultur narażonych na interleukinę-1 beta. Mierz TEER co 10 do 15 minut przez 45 minut, umieszczając każdy Transwell w kubku hodowlanym.
Podstawno-boczna ekspozycja na pożywki z kultur glejowych traktowanych 10 i 25 nanogramami interleukiny-1 beta znacznie zwiększyła przepuszczalność bariery nabłonkowej. Nie zaobserwowano istotnego wzrostu przepuszczalności nabłonka po ekspozycji na interleukinę-6 koni w różnych stężeniach.
Przegląd
To badanie koncentruje się na izolowaniu komórek glejowych przewodu pokarmowego z jelita cienkiego konia, aby lepiej zrozumieć ich rolę w powikłaniach pooperacyjnych po operacji kolki. Badanie podkreśla znaczenie gleju przewodu pokarmowego w homeostazie jelitowej i jego potencjalny wpływ na stany zapalne.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Gastroenterologia
- Biologia komórki
Tło
- Komórki glejowe przewodu pokarmowego są ważne dla zdrowia jelit.
- Są zaangażowane w reakcje zapalne w jelicie.
- Konie są narażone na wysokie ryzyko stanów zapalnych pooperacyjnych.
- Zrozumienie gleju przewodu pokarmowego może pomóc zmniejszyć te ryzyko.
Cel badania
- Izolować komórki glejowe przewodu pokarmowego z jelit konia.
- Ocenić ich rolę w powikłaniach pooperacyjnych.
- Opracować odtwarzalny protokół izolacji komórek.
Stosowane metody
- Izolowanie komórek glejowych podśluzówkowych przewodu pokarmowego z jelita konia.
- Zastosowanie protokołu izolacji do badania efektów zapalnych.
- Ocena funkcji bariery jelitowej.
- Zastosowanie leków biologicznych o działaniu przeciwzapalnym, aby zapobiec utracie bariery.
Główne wyniki
- Udane izolowaniu komórek glejowych przewodu pokarmowego z jelita cienkiego konia.
- Wykazano wpływ zapalnych komórek glejowych przewodu pokarmowego na funkcję bariery jelitowej.
- Opracowanie protokołu na przyszłe badania nad powikłaniami pooperacyjnymi.
- Zidentyfikowanie potencjalnych podejść terapeutycznych z wykorzystaniem leków biologicznych o działaniu przeciwzapalnym.
Wnioski
- Gleju przewód pokarmowy odgrywa kluczową rolę w zdrowiu jelit i stanach zapalnych.
- Zrozumienie ich funkcji może prowadzić do lepszego zarządzania powikłaniami pooperacyjnymi.
- Przyszłe badania skupią się na związku między gleją przewodu pokarmowego a stanami zapalnymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing primary equine enteric glial cultures enables mechanistic interrogation of neural-epithelial interactions underlying inflammatory barrier dysfunction relevant to equine colic. This platform supports predictive confidence in modeling postoperative inflammatory mechanisms and informs translational strategies for mitigating barrier loss. The approach advances early discovery and target validation for gastrointestinal inflammation in large animal models with direct implications for preclinical research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of inflammatory hypotheses in a disease-relevant equine system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating glial contributions to mucosal barrier modulation.
- Facilitates functional target validation for neural-epithelial signaling pathways in colic.
- Provides a platform for evaluating anti-inflammatory biologics in a controlled setting.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible primary glial cultures for standardized inflammatory challenge assays.
- Enables quantitative measurement of epithelial barrier integrity via TEER readouts.
- Supports assay scalability and cross-study reproducibility for compound evaluation.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of therapeutic candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker exploration in colic.
- Bridges discovery-stage findings to preclinical validation of barrier-protective interventions.
- Enables risk-adjusted advancement of anti-inflammatory strategies targeting enteric glia.
- Provides continuity for mechanistic studies across the discovery-preclinical interface.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical validation, supporting hypothesis-driven research on neural-epithelial interactions in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing of glial-mediated barrier disruption under inflammatory conditions.
- Screening: Provides quantitative TEER outputs for comparing inflammatory and control conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of barrier function changes across experimental groups.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo models of colic and postoperative complications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanistic and therapeutic studies in large animal gastrointestinal research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for gastrointestinal inflammation.
- Operational Value: Standardizes primary cell culture and barrier function assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for anti-inflammatory biologic development in large animal models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates targeting enteric glia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and culture from large animal tissues.
- Demands access to specialized instrumentation for TEER measurement and cell handling.
- Necessitates cross-team standardization of dissection, digestion, and plating protocols.
- May require adaptation for other species or gastrointestinal regions based on research focus.
- Dependent on availability of healthy equine tissue and validated inflammatory stimuli.
