Name: Wykorzystanie Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu prątków ograniczonych oznaczeniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę wykorzystania Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu przy ograniczeniu cynku. Protokół ten umożliwia standaryzację badań nad fizjologią prątków i interakcjami z gospodarzem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez National Science Foundation (NSF) CAREER Award 1844854, American Lung Association Innovation Award IA -937538, oraz National Institute of Health (NIH) NIAID R21 AI109293 to S.P. Aktualny adres Allexa D. Burger to Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaje, USA.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

<ol><li>Alloway, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+factors+associated+with+zinc+deficiency+in+crops+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Health%22%5BJournal%5D)">Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans.</a> Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).</li>
<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
<li>Dow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+limitation+triggers+anticipatory+adaptations+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).</li>
<li>Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+does+not+necessarily+induce+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).</li>
<li>Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+specifies+involvement+of+alternative+ribosomal+proteins+in+response+to+zinc+limitation+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis.</a> Front Microbiol. 13, 811774(2022).</li>
<li>Singh, A. K., Reyrat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+Leucine+and+Pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs.</a> Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+a+fluorescent+compound+factor420%2C+from+Methanobacterium+strain+M.o.H%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H.</a> J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Głównym wkładem w lukę w wiedzy na temat mechanistycznych podstaw alt-rybosomów jest trudność w osiągnięciu warunków ograniczających Zn2+ in vitro. Śladowe zanieczyszczenie Zn2+ w warunkach laboratoryjnych jest powszechne; w związku z tym osiągnięcie powtarzalnych warunków wzrostu z ograniczeniem Zn2+ jest wyzwaniem. Zanieczyszczenie Zn2+ może pochodzić z kilku źródeł, chociaż najbardziej znaczącym i powszechnym źródłem zanieczyszczenia i zmienności jest ultraczysta woda używana do płukania sprzętu laboratoryjnego i wytwarzania pożywki. Systemy wody ultraczystej powinny być odpowiednio konserwowane i powinny być płukane przez 1 minutę przed wypłukaniem przyborów laboratoryjnych lub użyciem wody jako mediów. Kolby, które nie są dobrze umyte lub przepłukane ultraczystą wodą, mogą powodować zanieczyszczenie Zn2+ , co będzie widoczne w zwiększonej gęstości komórek w niektórych kolbach, ale nie w innych z tej samej partii ZLM. Zupełnie nowe kolby mogą być używane do oceny, czy źródłem zanieczyszczenia Zn2+ są ponownie użyte kolby lub podłoża. Zanieczyszczenie Zn2+ w ZLM powinno być remediowane poprzez wzmożone płukanie przedmiotów używanych do produkcji pożywek oraz wyznaczonego zestawu materiałów do przygotowania ZLM. Jeżeli żaden z tych środków nie okaże się skuteczny w osiągnięciu oczekiwanych fenotypów bioindykatorów, [Zn2+] w wodzie ultraczystej i ZLM należy określić ilościowo, aby wykluczyć możliwość, że źródło wody jest zanieczyszczone Zn2+. Jak wcześniej informowano, [Zn2+] ZLM wynosi 115 ± 37 nM23, a stężenia poniżej 70 nM i powyżej 150 nM zwykle prowadziły odpowiednio do fenotypów zubożonych w Zn2+ i zanieczyszczonych Zn2+. Jednak dobre przygotowanie pożywki jest tylko jednym z czynników, który wpływa na wynik, a niewystarczające lub nadmierne stężenie Zn2+ może wystąpić z powodu niewłaściwego przygotowania inokulum i/lub hodowli, tj. złego dekantowania pożywki bogatej w Zn2+ podczas etapów mycia. Wszystkie zawarte tu kultury M. smegmatis zostały przygotowane w ten sam sposób - wyniki wzrostu zanieczyszczone Zn2+ (ZLM-C) i zubożone w Zn2+ (ZLM-D) są uwzględnione, aby podkreślić zmienność, która może wystąpić między różnymi partiami pożywek przy użyciu tego samego systemu wody ultraczystej, nawet jeśli eksperymenty są przeprowadzane prawidłowo.
Aby zapewnić, że komórki hodowlane w ZLM dają powtarzalne fenotypy bioindykacyjne ograniczające Zn2+, ważne jest, aby jednoznacznie oznaczyć kolby, zawsze używać ich do tego samego stanu (tj. za pomocą ZLM lub ZRM), śledzić kolby przez wiele zastosowań i usuwać kolby, które są pod koniec swojego cyklu życia lub które nadal dają fenotypy bioindykacyjne zanieczyszczone Zn2+ za pomocą ZLM. Właściwe przygotowanie inokulum jest bardzo ważne, aby osiągnąć wzrost ograniczający Zn2+, ponieważ Zn2+ przenoszony z nieodpowiednio umytych komórek nasiennych jest częstym źródłem zanieczyszczenia Zn2+, które może być trudne do przeanalizowania z ZLM zanieczyszczonego Zn2+. Kultury M. smegmatis należy oznaczyć i zebrać po 72 godzinach wzrostu w ZLM (i ZRM uprawianym równolegle). Fenotypy morfogenezy i biowskaźnika są wyraźne od 48 do 72 godzin; w związku z tym zbyt wczesna (lub zbyt późna) ocena lub zbiór kultur pod kątem ograniczenia Zn2+ może nie dać pełnego fenotypu bioindykatora. Kultury, które są zubożone w Zn2+ , będą wykazywać długości komórek podobne do tych, które są zanieczyszczone Zn2+; w związku z tym do rozróżnienia należy użyć fluorescencji F420 i OD600 . Podobnie, kultury zanieczyszczone Zn2 + mogą nie zawsze rosnąć lepiej niż bakterie z ograniczoną liczbą Zn2 +, ale fluorescencja F420 i długość komórek typu dzikiego i mutant ΔaltRP powinny ujawnić, czy osiągnięty jest warunek ograniczony Zn2+.
To samo dotyczy M. tuberculosis, ponieważ utrata fenotypu bioindykatora F420 w kulturach z ograniczoną liczbą Zn2+ jest wyraźna między 8-10 dniem wzrostu w ZLM. Chociaż M. tuberculosis nie wykazuje silnego fenotypu bioindykatora ograniczonego Zn2 +, takiego jak M. smegmatis, przedstawiona tutaj metoda wzrostu została wykorzystana do powiązania utraty fenotypu bioindykatora F420 ze wzrostem ograniczonym przez Zn2 + przy użyciu testów funkcjonalnych i transkryptomiki zarówno w zjadliwych, jak i atenuowanych szczepach M. tuberculosis (odnośnik23i dane niepublikowane). Dlatego podążanie za fluorescencją F420 jest dostępnym sposobem monitorowania i weryfikacji biologicznych warunków ograniczających Zn2+ u M. tuberculosis. Ważne jest, aby zauważyć, że mechanizm prowadzący do zmniejszonej fluorescencji F420 w warunkach ograniczających Zn2+ pozostaje nierozwiązany, podobnie jak rozróżnienie, czy zmniejszona fluorescencja jest spowodowana zmniejszoną obfitością puli koenzymów jako całości, czy zmianą jej stanu redoks, ponieważ tylko utleniona forma emituje fluorescencję29.
Jak wykazano tutaj, przygotowanie pożywek ograniczających Zn2+ jest zniuansowane i istnieje wiele czynników, które mogą wpływać na efektywne stężenie jonów Zn2+ w pożywce, nawet przy zachowaniu tego samego protokołu i użyciu tych samych odczynników. Ślady Zn2+ w ZLM pozwalają na wystarczający wzrost i ekspresję fenotypu ograniczającego Zn2+. Ten stopniowy spadek Zn2+ w celu osiągnięcia ograniczenia jest podobny do modelu niedotlenienia Wayne'a, w którym tlen jest stopniowo zużywany przez bakterie hodowane w zamkniętej kolbie30. Ponieważ zarówno hipoksja, jak i fenotypy ograniczone Zn2 + zależą od wzrostu bakterii, jeśli nie ma wystarczającej ilości tlenu lub w tym modelu Zn2+ w inokulum lub pożywce, bakterie przestaną rosnąć, zanim będą w stanie przejść odpowiedni program morfogenny. W związku z tym, podczas gdy zanieczyszczenie Zn2 + jest bardziej oczywistym problemem, gdy chce się osiągnąć ograniczenie Zn2 + , wyczerpanie Zn2 + może również stanowić problem ze względu na upośledzenie wzrostu i pominięty wyzwalacz zależny od Zn2 + podczas aktywnego wzrostu. Ponadto użycie monochromatorowych lub filtrowych czytników płytkowych z trybami odczytu od góry lub od dołu dla intensywności fluorescencji nieznacznie wpływa na obliczoną wartość procentową F375/420 . W związku z tym wartości z każdego laboratorium mogą nie być bezpośrednio porównywalne z tymi przedstawionymi tutaj, ale powinny być podobne i podążać za tymi samymi trendami. W związku z tym metody i procedury wytwarzania ZLM, który daje wzrost ograniczający Zn2+, powinny być zoptymalizowane dla każdego laboratorium i systemu wody ultraczystej, a przedstawione tutaj fenotypy bioindykacyjne powinny być stosowane jako standard do określania warunków ograniczających Zn2+.
Ze względu na trudności w standaryzacji i odtwarzaniu warunków wzrostu ograniczonych przez Zn2+, dostępnym podejściem do obejścia zanieczyszczenia Zn2+ jest dodanie czynnika chelatującego do pożywki przygotowanej bez dodatkuZn 2+. Jednak takie podejście zaburza prawdziwą biologiczną odpowiedź na ograniczenie Zn2+, często tworząc środowisko głodne Zn2+ i innych mikroelementów. Wykazano, że nawet czynniki chelatujące specyficzne dla Zn2 + zwiększają reakcję na głód żelaza, oprócz zależnej od Zn2 + odpowiedzi transkrypcyjnej w M. tuberculosis23. Ponadto stosowanie czynników chelatujących wymaga starannego miareczkowania i czasu, aby uniknąć środowiska z poważnym niedoborem Zn2+, które nie odzwierciedla odpowiedzi biologicznej podczas przejścia z warunków pełnych Zn2+ naZn 2+ o ograniczonej dostępności lub długotrwałego wzrostu w środowiskach o ograniczonej dostępności wolnego Zn2+. Wreszcie, dodawanie czynników chelatujących może nie być kompatybilne z dalszymi zastosowaniami (np. makrofagami lub infekcjami zwierząt). Zasadniczo wyciągnięto różne wnioski na temat formy i funkcji rybosomów alt otrzymanych za pomocą czynników chelatujących w porównaniu ze stopniowym wytracaniem Zn2+ w aktywnie rosnących kulturach17,24. Podkreślono tutaj różne fenotypy wynikające ze stosunkowo niewielkich różnic w czystości wody w różnych partiach pożywek, nawet jeśli procedura jest wykonana prawidłowo. Przedstawiony tutaj wymierny, powtarzalny i biologicznie istotny system generowania alt-rybosomów, tj. w kulturach typu dzikiego z ograniczoną liczbą Zn2+ bez dodawania chelatorów, oferuje ustandaryzowaną metodę, która będzie miała zasadnicze znaczenie dla ujednolicenia wkładu w całej dziedzinie w kierunku lepszego zrozumienia alternatywnej biologii rybosomów.

Jon (Zn2+) jest niezbędnym mikroelementem i standardowym składnikiem pożywek mikrobiologicznych. Jednak wiele bakterii wytrzymuje ograniczenie Zn2+ w środowisku, ponieważ warunki ograniczające Zn2 + są szeroko rozpowszechnione; soil1, marine2, a nisze w obrębie host3 są często ograniczone do Zn2+. W związku z tym większość bakterii wyewoluowała mechanizmy przezwyciężające ograniczenie Zn2+ i zachowujące funkcje komórkowe4. Systemy zaangażowane w utrzymanie homeostazy Zn2+ są pod ścisłą kontrolą transkrypcji5 i są zaangażowane w wymiatanie Zn2+ przy użyciu systemów importu Zn2+ o wysokim powinowactwie, mobilizację rezerw komórkowych Zn2+ i zastępowanie niektórych białek wiążących Zn2+ alternatywnymi paralogami niezależnymi od Zn2+6. Przykładem tego ostatniego są paralogi białka rybosomalnego (RPs) niezależnego od Zn2+, które są wspólną cechą regulatorów reagujących na Zn2+ u bakterii4. Te wysoce rozbieżne, niezależne od Zn2+ RP różnią się od ich paralogów wiążących Zn2+ przez zakłócenie wiązania Zn2+ CXXC motif7. Ponad połowa zsekwencjonowanych genomów prokariotycznych zawiera co najmniej jedną parę zduplikowanych RP, gdzie w wielu z nich jeden RP wiąże Zn2+, podczas gdy jego paralog nie8. Podczas gdy notacja C+/C- (wskazująca na obecność/brak bogatego w cysteinę motywu wiążącego Zn2+) jest powszechnie używana w odniesieniu do tych paralogicznych par RP7, RP niezależne od Zn2+ zostały również opisane jako alternatywne (Alt) wersje pierwotnych (Prim), wiążących Zn2+ paralogów RP, ponieważ AltRP służą jako alternatywne RP dla biogenezy rybosomów w Zn2+-ograniczony stan u niektórych bakterii i jest to słowo kluczowe o lepszej wyszukiwalności9,10,11.
Ponieważ ekspresja AltRP jest ściśle regulowana przez Zn2+, logiczne jest założenie, że ekspresja AltRP oferuje funkcjonalną redundancję dla białek rybosomalnych zależnych od Zn2+ w obliczu ograniczenia Zn2+. Rzeczywiście, ta cecha AltRP została zademonstrowana dla modelowej bakterii glebowej Bacillus subtilis, w której wzrost jest ratowany podczas ograniczenia Zn2+ poprzez uwolnienie powierzchni PrimRP L31 i zastąpienie przez AltRP L3112,13. Jednak niektóre AltRP są paralogiczne do rdzeniowych PrimRP, np. S14, co oznacza, że ich włączenie jest wymagane podczas biogenezy rybosomów12,13. Odbudowa rybosomu za pomocą AltRP jest zaangażowanym, energochłonnym programem. Podczas gdy te rdzeniowe AltRP mogą służyć do uwalniania Zn2+ z rybosomu, możliwe jest również, że niektóre AltRP wyewoluowały dodatkową funkcję w środowisku ograniczonym przez Zn2+. Potwierdza to obserwacja, że AltRP różnią się od swoich paralogicznych PrimRP; homologia sekwencji genów AltRP jest często wyższa wśród homologów różnych gatunków niż w przypadku sekwencji genu PrimRP wiążącej Zn2+ w obrębie tego samego gatunku7,10. Ponieważ geny kodujące wysoce rozbieżne AltRP znajdują się pod kontrolą transkrypcyjną zależną odZn 2+, są one usuwane z selektywnego nacisku wywieranego na ściśle regulowane i wysoce konserwatywne superoperony rybosomalne14. Rozłączona presja selekcyjna na informację genetyczną kodującą maszynerię rybosomalną i AltRP naraża te RP na inne trajektorie ewolucyjne niż homologiczne PrimRP i może pozwolić na specyficzną dla linii ewolucję tego samego AltRP u różnych bakterii10,15. Powszechne istnienie AltRP w bakteriach i rozłączna regulacja genetyczna tych unikalnych RP rodzi interesujące pytanie, czy włączenie AltRP do rybosomów bakteryjnych nadaje specjalną właściwość rybosomom zawierającym AltRP (rybosomom Alt).
Prątki to idealna grupa bakterii do badania mechanistycznych właściwości alt-rybosomów. Po pierwsze, prątki posiadają wysoce konserwatywny operon altRP zawierający cztery geny kodujące AltRP: S14-2, S18-2, L28-2 i L33-28,9. Mykobakteryjne AltRP znacznie różnią się od ich paralogów PrimRP; we wszystkich czterech parach PrimRP/AltRP dany gen AltRP jest bardziej podobny u wszystkich gatunków prątków niż do genu PrimRP u tego samego gatunku10. Specyficzna dla linii ewolucja AltRP jest również widoczna w obrębie prątków, o czym świadczą AltRP S18-2 i L28-2 w Mycobacterium tuberculosis i M. bovis, które zawierają unikalne sekwencje na C-końcu, które nie są obecne u innych prątków10. Po drugie, ta grupa wysoce spokrewnionych bakterii zawiera niepatogennych i chorobotwórczych członków, którzy żyją w różnych środowiskach, od gleby (np. M. smegmatis) po niezliczonych żywicieli: ludzi (np. M. tuberculosis), bydła (np. M. bovis), wodnych (np. M. marinum) i ptaków (np. M. avium), żeby wymienić tylko kilka. Wysoce konserwatywny charakter operonu altRP u prątków, specyficzna dla linii ewolucja określonych genów AltRP oraz bardzo różne środowiska, w których żyją członkowie tej grupy, stanowią wyjątkową okazję do przeanalizowania konserwatywnej i specyficznej dla linii ewolucji funkcji AltRP i mechanistycznych właściwości rybosomów Alt. Pomimo obfitości AltRP w genomach prokariotycznych, rola AltRP i rybosomów Alt została zbadana tylko u kilku bakterii9,10,11,12,13,16,17,18,19. Ustanowienie ustandaryzowanego systemu z określonymi wskaźnikami w celu walidacji warunków wzrostu ograniczających Zn2+ w prątkach poprawiłoby wyniki eksperymentalne i pogłębiłoby zrozumienie rybosomów Alt w dziedzinie badań nad rybosomami.
Zn2+ jest mikroelementem; dlatego ślady zanieczyszczenia Zn2+ w chemikaliach i wodzie przyczyniają się do biodostępności Zn2+, nawet jeśli są pominięte w preparacie pożywki. Śladowe ilości Zn2+ obecne w wodzie lub chemikaliach mogą się drastycznie różnić w zależności od laboratorium, wpływając w ten sposób na wynik wzrostu ograniczającego Zn2+. Empiryczne ilościowe oznaczanie [Zn2+] w każdym niezależnym przygotowaniu pożywki jest nadmiernie uciążliwe dla większości laboratoriów przeprowadzających rutynowe testy wzrostu, ale mechanizm eliminujący możliwość zanieczyszczenia Zn2+ w pożywkach wzrostowych byłby sam w sobie cenny. W tym celu przedstawiono szczegółową metodę przygotowania chemicznie zdefiniowanej pożywki o ograniczonej zawartości Zn2+ (ZLM), naczyń wzrostowych i kultur nasion do ograniczania wzrostu Zn2+ i produkcji rybosomów Alt u M. smegmatis i M. tuberculosis. Kluczowe cechy morfogenne (gęstość komórek mierzona za pomocą OD600, długość komórki i fluorescencja koenzymu F420) po wzroście w ZLM są wykorzystywane do sprawdzenia, czy osiągnięto ograniczenie Zn2+. Koenzym F420 jest kofaktorem deazaflawiny, który odgrywa ważną rolę w katabolizmie i obronie przed stresem oksydacyjnym w metanogenach i prątkach20,21. Co ważne, prątki ulegają autofluorescencji po wzbudzeniu przy długości fali 420 nm ze względu na obfitość tego kofaktora22. Powiązanie molekularne między [Zn2+] a fluorescencją F420 pozostaje nierozwiązane, ale podążanie za fluorescencją F420 w kulturach jest wykonalnym i niezawodnym bioindykatorem.
U M. smegmatis, fenotypy bioindykacyjne występują u bakterii typu dzikiego, ale mutant delecji pozbawiony operonu altRP nie przechodzi tego samego programu morfogenicznego i może być używany jako bioindykator różnicowy10. Chociaż M. tuberculosis nie podlega temu samemu programowi morfogennemu co M. smegmatis podczas ograniczenia Zn2+, M. tuberculosis ma silną i globalną odpowiedź na ZnOgraniczenie 2+ i kluczowy fenotyp bioindykatora zgodny z tą metodą<klasa sup="xref">23. W ten sposób zdefiniowany tutaj system umożliwia wytwarzanie rybosomów pierwotnych i alt-rybosomów w tych samych warunkach wzrostu (tj. ograniczenie Zn2+), ułatwiając mechanistyczną analizę funkcji alt-rybosomów i ich roli w kształtowaniu fizjologii bakterii. Ta metoda wzrostu została wykorzystana do określenia struktury aktywnych rybosomów Alt i wykazania ich aktywności translacyjnej u M. smegmatis24. Co więcej, potwierdzając, że ta metoda wzrostu i fenotyp bioindykacyjny podkreślają biologiczną funkcjonalność AltRP podczas ograniczenia Zn2 +, ekspresja AltRP jest wymagana do morfogenezy zależnej od Zn2 + i ma głęboki wpływ na transkryptom i proteom M. ograniczony do Zn2 + s<up class="xref">10,25. Ta sama metoda, z niewielkimi modyfikacjami ilości inokulum i czasu inkubacji, jest używana do generowania kultur M. tuberculosis2+ class="xref">9,23. W tym miejscu szczegółowo opisano protokoły i fenotypy bioindykacyjne umożliwiające osiągnięcie wzrostu ograniczającego wzrost Zn2+ zarówno u M. smegmatis, jak i M. tuberculosis, ze szczególnym uwzględnieniem M. smegmatis, ponieważ bakteria ta jest bardziej wrażliwa na zanieczyszczenie Zn2+ w pożywce i jest szerzej dostępna niż wolno rosnący patogen.

<table><tbody><tr><td>Systemy filtracji próżniowej 1000 ml, linia standardowa</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Erlenmeyer Shaker</td> Probówki <td>hodowlane Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL, plastikowe, z dwupozycyjnymi nasadkami</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Shaker Kolby</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Lab Laboratoryjny związek biologiczny Mikroskop</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki do reakcji biologicznych, sterylne</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 ml wysokowydajne probówki wirówkowe z nasadkami flagowymi</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Niskopienny detergent w proszku</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian amonu (III), brązowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g/mol, dla 1M roztworu dodać 1,325 g do 5 ml ultraczystej wody; przechowywać w chronić przed światłem w temperaturze 4 C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantotenian wapnia</td><td>Thermo Scientific AC243300050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy bezwodny, krystaliczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza bezwodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Bulion</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600 do oznaczania gęstości komórek i testów Bradforda</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td></td><td>wycofany</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Wielomodowy czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD L-Leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP</td><td>Optoelektronika</td><td></td><td>Do użytku z mikroskopem Olympus</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Direct 8 System oczyszczania wody</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Wycofane, zastąpione przez Moticam X5 Plus; do użytku z mikroskopem złożonym</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wycofany, zastąpiony przez BX53M</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monopodstawowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Półmikro dwustronne jednorazowe kuwety plastikowe</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, kryształ</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Siarczek siedmiowodny, krystaliczny/ACS</td><td>MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu prątków ograniczonych oznaczeniem

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

Wiele bakterii buduje alternatywne rybosomy w warunkach ograniczających wzrost Zn2+, zastępując białka rybosomalne wiążące Zn2+ paralogami niezależnymi od Zn2+. Zdefiniowanie systemu do badania tych alternatywnych rybosomów okazało się trudne, ponieważ zanieczyszczenie Zn2+ w laboratorium jest powszechne. Aby rozwiązać ten problem, czynniki chelatujące są czasami dodawane do pożywek wzrostowych, ale takie podejście zagmatwa biologiczną odpowiedź na stopniowe ograniczanie Zn2 + i wiąże się z hibernacją rybosomów. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania pożywek i kultur siewnych do ograniczonego wzrostu Zn2+ bez dodawania chelatorów. Zgodnie z tą metodą modelowa bakteria, Mycobacterium smegmatis, ulega morfogenezie, która zależy od alternatywnych rybosomów. Ponieważ morfogeneza jest możliwa do opanowania i zachodzi tylko w warunkach ograniczających Zn2+, M. smegmatis może być stosowany jako bioindykator do weryfikacji biologicznie istotnych warunków wzrostu. Opisano trzy fenotypy bioindykacyjne (gęstość komórek, długość komórek i fluorescencja koenzymu F420), które wskazują na ograniczenie Zn2 + w typie dzikim, a także przedstawiono zmiany w tych bioindykatorach dla mutanta delecji, który nie może budować alternatywnych rybosomów. Ponieważ śladowe zanieczyszczenie Zn2+ jest trudne do kontrolowania dla każdej partii pożywki, a precyzyjna kwantyfikacja Zn2+ w każdym preparacie pożywki jest nadmiernie uciążliwa, śledzenie tego fenotypu bioindykatora jest dostępnym sposobem walidacji przygotowania pożywek wzrostowych z ograniczoną ilością Zn2+. Aby pomóc w określeniu właściwych warunków dla wzrostu ograniczającego wzrost Zn2 + i alternatywnej produkcji rybosomów, zmiany w fenotypach bioindykatorów sprofilowano również pod kątem preparatów z ograniczoną zawartością Zn2 + lub poważnie zubożonych w Zn2 + pożywek o ograniczonej zawartości Zn2 +. Przedstawiono dalsze szczegóły w celu osiągnięcia wzrostu Zn2+ i alternatywnej produkcji rybosomów u M. tuberculosis, wraz z powiązanym fenotypem biowskaźnika. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj szczegółowe instrukcje i fenotypy bioindykatorów pomogą ustandaryzować produkcję translacyjnie aktywnych alternatywnych rybosomów w prątkach.

Fenotypy bioindykacyjneของ M. smegmatis 
typ dziki M. smegmatis kultury hodowane w pożywce ZLM, które osiągają Zn2+–ograniczającym wzrost wykazują trzy główne fenotypy bioindykacyjne w porównaniu z komórkami hodowanymi w obecności Zn2+-warunki nasycenia: [1] zmniejszona gęstość optyczna (OD)600, [2] wydłużone komórki oraz [3] obniżoną maksymalną fluorescencję przy 420 nm. Mutant pozbawiony AltRP (ΔaltRP) nie posiada tej samej ilości Zn2+morfogeneza zależna od - jako typ dziki10, oraz jego unikalny fenotyp w Zn2+pożywka z ograniczoną zawartością nutrientów może służyć jako różnicujący bioindykator. W związku z tym wszystkie trzy parametry bioindykacyjne powinny zostać najpierw ocenione w szczepie typu dzikiego hodowanym w ZRM i ZLM. Jeśli oczekiwany Zn2+obserwuje się ograniczony fenotyp typu dzikiego, ΔaltRP Należy następnie ocenić szczep z delecją. Wzrost w pożywce ZLM nie zawsze zapewnia dostęp do Zn2+-ograniczonych warunkach, co jest właśnie powodem, dla którego niezbędne są bioindykatory. Unikalne szczepy typu dzikiego oraz ΔaltRP fenotypy bioindykatorów potwierdzają, że biologicznie istotne Zn2+-osiągnięto warunki ograniczające. Gdy kultury hodowane w ZLM nie osiągają poziomu Zn2+-ograniczenie wzrostu spowodowane niedoborem Zn2+ zanieczyszczenie pożywek lub naczyń hodowlanych (ZLM-C), fenotypy tych bioindykatorów będą mniej wyraźne, co pokazano w Rycina 1 i Rycina 2I odwrotnie, jeśli stężenie Zn2+ przy zbyt niskim poziomie Zn w ZLM wzrost jest upośledzony przez niedobór Zn2+ wyczerpanie (ZLM-D), co objawia się niską mętnością hodowli oraz zmienionymi fenotypami bioindykatorów, co szczegółowo opisano również w Rysunek 1 i Rycina 2.
Gęstość komórek jest istotnym wskaźnikiem ograniczenia dostępności Zn2+. Kultury hodowane w ZRM po 72 h konsekwentnie osiągają wysoką mętność (OD600 powyżej 5), mogą tworzyć aglomeraty i są wyraźnie bardziej żółte (dane nie zostały przedstawione) niż kultury hodowane w ZLM (Rycina 1A). Ograniczenie Zn2+ hamuje wzrost (co objawia się spadkiem OD600) wszystkich szczepów w porównaniu z warunkami nasycenia Zn2+, a szczep ΔaltRP wykazuje niższą gęstość komórek niż szczep typu dzikiego (Rycina 1A). Wzrost w warunkach ograniczonych ilością Zn2+ w ZLM konsekwentnie daje OD600 powyżej 3,5 i poniżej 5 w typie dzikim oraz poniżej 3 w szczepie ΔaltRP (Rycina 1A). Kultury hodowane w ZLM z zanieczyszczeniem Zn2+ (ZLM-C) osiągają gęstość komórek (OD600 powyżej 5) podobną do kultur nasyconych Zn2+ hodowanych w ZRM (Rycina 1A). Jeśli [Zn2+] w ZLM jest zbyt niskie, kultury będą silnie pozbawione Zn2+ (ZLM-D), a wzrost zostanie upośledzony, co potwierdza zmniejszona gęstość komórek w kulturach typu dzikiego (OD600 poniżej 3; Rycina 1A). Gęstość komórek typu dzikiego (3,5 &lt; OD600 &lt; 5) powinna być pierwszym punktem kontrolnym fenotypu bioindykatora w celu weryfikacji warunków ograniczających dostępność Zn2+. Należy brać pod uwagę wyłącznie kultury typu dzikiego, które urosły do oczekiwanej gęstości komórek, a analiza szczepu ΔaltRP powinna nastąpić po zweryfikowaniu fenotypu bioindykatora ograniczenia Zn2+ w typie dzikim.
Kultury typu dzikiego w fazie stacjonarnej hodowane w podłożu ZLM z ograniczoną zawartością Zn2+ są wydłużone, przy średniej długości komórki wynoszącej około 9 µm, podczas gdy kultury z wystarczającą ilością Zn2+ hodowane w ZRM są krótkie, o średniej długości komórki około 3 µm (Rysunek 1B). Kultury typu dzikiego hodowane w ZLM z zanieczyszczeniem Zn2+ (ZLM-C) nie wydłużają się całkowicie, lecz są nieco dłuższe niż komórki z wystarczającą ilością Zn2+, ze średnią długością komórki 5 µm. Bioindykacja zanieczyszczenia Zn2+ w całych partiach ZLM wskazuje na możliwe zanieczyszczenie podczas przygotowania, natomiast w poszczególnych kulturach (tj. kolbach) wskazuje na zanieczyszczenie wynikające z niewłaściwego mycia kolb lub przygotowania kultury. Kultury typu dzikiego hodowane w ZLM z silnym deficytem Zn2+ (ZLM-D) wykazują mniej wyraźne wydłużenie, przy średniej długości komórki około 7 µm (Rysunek 1B). Wydłużony fenotyp typu dzikiego nie jest obserwowany w szczepie ΔaltRP, a komórki ΔaltRP z ograniczoną zawartością Zn2+ mają średnią długość około 5 µm (Rysunek 1B). Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy komórek hodowanych w różnych wariantach ZLM lub ZRM (zgodnie z krokiem 2) i wizualizowanych za pomocą złożonego mikroskopu świetlnego. Po wykonaniu kroku 4 komórki z wielu pól widzenia na obrazach, takich jak ten pokazany na Rysunku 2, są wykorzystywane do obliczenia średniej długości komórek kultur przedstawionych na Rysunku 1B. Wydłużony fenotyp typu dzikiego jest specyficzny dla warunków ograniczonych pod względem Zn2+; wydłużenia komórek nie obserwuje się, gdy kultury mają wystarczającą ilość Zn2+ lub gdy występuje silny deficyt Zn2+ (Rysunek 1B i Rysunek 2).
Fenotyp bioindykatora z obniżoną fluorescencją F420 jest najlepiej widoczny w skanach fluorescencyjnych (Rysunek 1C). Obniżoną fluorescencję kofaktora F420 określa się ilościowo, obliczając stosunek procentowy intensywności fluorescencji przy 375 nm (tło) do 420 nm (autofluorescencja kofaktora F420), zgodnie z opisem w kroku 3.16.5, co reprezentowane jest jako F375/420. W przypadku monochromatycznych czytników płytek bez możliwości skanowania fluorescencyjnego, do obliczenia F375/420 odpowiednie są pomiary punktowe przy 375 nm i 420 nm (w obu przypadkach z emisją przy 475 nm). Kultury typu dzikiego hodowane w warunkach nasycenia Zn2+ (t.j. w ZRM) wykazują wysoce powtarzalną wartość F375/420 na poziomie około 17% (Rysunek 1D). Redukcja fluorescencji F420 w kulturach z ograniczoną zawartością Zn2+ hodowanych w ZLM objawia się wzrostem F375/420 do około 27% (Rysunek 1D). Fluorescencja F420 w szczepie ΔaltRP z ograniczoną zawartością Zn2+ jest znacznie niższa niż w typie dzikim w tych samych warunkach, co jest wyraźnie widoczne w skanach fluorescencyjnych (Rysunek 1C). Wartość F375/420 jest bardziej zmienna w szczepie ΔaltRP z ograniczoną zawartością Zn2+, mieszcząc się w zakresie od około 50% do 80% (Rysunek 1D). Kultury hodowane w ZLM, lecz wykazujące bioindykację zanieczyszczenia Zn2+ (ZLM-C), mają obniżoną wartość F375/420 do około 21%, natomiast kultury z całkowitym brakiem Zn2+ (ZLM-D) mają F375/420 na poziomie około 35% (Rysunek 1D).
Podsumowując, w celu weryfikacji stanu ograniczenia Zn2+ w kulturach hodowanych w ZLM, należy ocenić trzy fenotypy bioindykatorów w szczepach typu dzikiego oraz ΔaltRP. W przypadku biologicznie istotnego wzrostu z ograniczeniem Zn2+ bioindykatory powinny prezentować się następująco: [1] OD600 typu dzikiego wynosi 3,5 - 5, a szczepu ΔaltRP mniej niż 3, [2] komórki typu dzikiego mają około 10 µm długości, a komórki ΔaltRP połowę tej długości, oraz [3] wartość F375/420 szczepu ΔaltRP jest wysoka, tj. powyżej 50%.
Fenotypy bioindykatorowe M. tuberculosis 
M. tuberculosis w warunkach ograniczenia Zn2+ nie wykazuje takiego samego programu morfogenetycznego jak M. smegmatis. W szczególności nie stwierdzono różnic w OD600 między kulturami z wystarczającą ilością Zn2+ a kulturami z ograniczoną ilością Zn2+, a kultury z ograniczoną ilością Zn2+ nie wykazują żadnego wyraźnego fenotypu morfologicznego, t. j. nie ulegają wydłużeniu23. Podobnie, w przypadku M. tuberculosis nie występuje fenotyp bioindykatorowy wynikający z niedoboru Zn2+ (t. j. zmniejszona gęstość komórek), który obserwuje się u M. smegmatis. Kultury z ograniczoną ilością Zn2+ wykazują bardziej wyraźne agregowanie w porównaniu z kulturami z wystarczającą ilością Zn2+, choć w obu warunkach do 10. dnia obserwuje się znaczne agregowanie (zaobserwowano to zarówno dla Mtb-H37Rv, jak i Mtb-Aux). Kluczowym fenotypem bioindykatorowym dla ograniczenia Zn2+ u M. tuberculosis jest obniżona maksymalna fluorescencja F420, co zgłoszono we wcześniejszych doniesieniach23. Wyniki dla kultur hodowanych przez 8 dni są tutaj przedstawione zamiast wyników z 10 dni, aby zminimalizować agregowanie. Zmniejszona fluorescencja F420 jest widoczna w kulturach z ograniczoną ilością Zn2+ zarówno przy użyciu monochromatycznych czytników płytek (Rycina 3), jak i czytników z filtrami. W przypadku czytników z filtrami, przy użyciu szczepu Mtb-H37Rv, kultury z ograniczoną ilością Zn2+ (t. j. hodowane w ZLM) mają surowe wartości fluorescencji wynoszące około 50% wartości dla kultur z wystarczającą ilością Zn2+ (t. j. hodowanych w ZRM; dane nie zostały przedstawione). Przy użyciu monochromatycznego czytnika płytek w trybie odczytu od dołu i szczepu Mtb-Aux, kultury z wystarczającą ilością Zn2+ wykazują F375/420 na poziomie około 75%, a kultury ZLM zanieczyszczone Zn2+ mają podobne wartości. Zmniejszona fluorescencja F420 w kulturach z ograniczoną ilością Zn2+ hodowanych w ZLM odzwierciedlona jest przez F375/420 powyżej 100%. Szczep ΔaltRP z ograniczoną ilością Zn2+ wykazuje podobny wzrost i fluorescencję F420 jak w przypadku typu dzikiego z ograniczoną ilością Zn2+ (Rycina 3) i nie jest użyteczny jako bioindykator u M. tuberculosis, w przeciwieństwie do M. smegmatis (Rycina 1). W związku z tym zaleca się testowanie pożywek, które będą używane do hodowli M. tuberculosis, przy użyciu szybko rosnącego M. smegmatis.
<img alt="Krzywe wzrostu, rozkład długości i analiza fluorescencji w badaniu bakterii; wykresy i wykresy pudełkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Fenotypy bioindykatorowe M. smegmatis hodowanych w warunkach ograniczenia Zn2+ oraz wpływ zanieczyszczenia Zn2+ i deficytu Zn2+ na fenotypy. Reprezentatywne przykłady fenotypu bioindykatorowego przedstawione na każdym panelu pochodzą z tych samych kultur po 72 h. Przykłady wyników wzrostu w warunkach zanieczyszczenia Zn2+ (ZLM-C), ograniczenia Zn2+ (ZLM-L) i deficytu Zn2+ (ZLM-D) pochodzą z niezależnych preparatów pożywek, przygotowanych zgodnie z opisaną tutaj metodą (krok 2). Reprezentatywne fenotypy dla szczepu dzikiego i szczepu ΔaltRP w warunkach ograniczenia Zn2+ pochodzą z tej samej partii ZLM. Wszystkie szczepy i warunki posiadają trzy powtórzenia biologiczne (n=3). (A) Krzywe wzrostu przedstawiające gęstość optyczną mierzoną przy 600 nm (OD600) oraz spadek gęstości komórek przy ograniczeniu i deficycie Zn2+. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe między powtórzeniami. (B) Długości komórek szczepu dzikiego i szczepu ΔaltRP wykazujące wydłużony fenotyp szczepu dzikiego w warunkach ograniczenia Zn2+. Wykres pudełkowy z wąsami przedstawia rozstęp międzykwartylowy, minimum, maksimum i medianę długości komórek w µm. (C) Reprezentatywne skany fluorescencji kultur wykazujące obniżony szczyt fluorescencji F420 przy ograniczeniu Zn2+ oraz zmniejszoną fluorescencję F420 w szczepie ΔaltRP przy ograniczeniu Zn2+. Przedstawiono tylko jedną reprezentatywną kulturę z powtórzeń biologicznych dla każdego z różnych preparatów pożywek. Skany fluorescencji wykorzystują zakres długości fali wzbudzenia od 230 nm do 440 nm z krokiem 5 nm oraz długość fali emisji 475 nm. Panel wstawiony w lewym górnym rogu jest powiększeniem szczepu dzikiego i szczepu ΔaltRP w warunkach ograniczenia Zn2+, aby podkreślić obniżony szczyt fluorescencji przy 420 nm w szczepie ΔaltRP przy ograniczeniu Zn2+. Jednostki osi są takie same jak na wykresie głównym. Wszystkie legendy są takie same jak w (A). (D) Kwantyfikacja zmniejszonej fluorescencji kofaktora F420, obliczona z procentowego udziału F375/420. Procenty obliczono na podstawie wartości uzyskanych ze skanów fluorescencji w (C). Wykres pudełkowy z wąsami przedstawia rozstęp międzykwartylowy, minimum, maksimum i medianę procentową. Skróty określające status pożywki względem Zn2+ podane w nawiasach po typie pożywki to: R = nasycona Zn2+, C = zanieczyszczona Zn2+, L = ograniczona Zn2+ oraz D = z deficytem Zn2+; pozostałe skróty: WT = szczep dziki, a.u. = jednostki arbitralne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy stanu Zn²⁺, WT vs ΔaltRP, analiza rozdzielania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopowe M. smegmatis po 72 h. Zdjęcia pochodzą z kultur przedstawionych na Rycynie 1. Komórki obrazowano za pomocą złożonego mikroskopu świetlnego przy całkowitym powiększeniu 1000x, stosując obiektyw imersyjny 100x. Paski skali odpowiadają 10 µm. Skróty określające stan zawartości Zn2+ w pożywce, podane w nawiasach po typie pożywki, to: R = nasycona Zn2+, C = zanieczyszczona Zn2+, L = ograniczona Zn2+ oraz D = pozbawiona Zn2+; pozostałe skróty to: WT = szczep dziki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres widma wzbudzenia fluorescencji; długość fali względem fluorescencji; analiza badania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Utrata fenotypu bioindykatora F420 u M. tuberculosis w warunkach ograniczonej dostępności Zn2+ wykazana na reprezentatywnych skanach fluorescencji aukotroficznego szczepu Mtb mc26206 (Mtb-Aux). Przykłady wyników wzrostu w warunkach zanieczyszczenia Zn2+ oraz ograniczonej dostępności Zn2+ pochodzą z niezależnych preparatów pożywek. Szczepy typu dzikiego oraz ΔaltRP w warunkach ograniczonej dostępności Zn2+ pochodzą z tej samej partii ZLM. Wszystkie szczepy i warunki posiadają trzy powtórzenia biologiczne (n=3). Na wykresie przedstawiono tylko jedną reprezentatywną kulturę z powtórzeń biologicznych dla każdej z różnych pożywek i szczepów. Skanowanie fluorescencji wykonano w trybie odczytu od dołu po 8 dniach wzrostu, stosując zakres długości fali wzbudzenia od 230 nm do 440 nm z krokiem 5 nm oraz długość fali emisji 475 nm. Skróty określające status Zn2+ w pożywce podane w nawiasach po typie pożywki to: R = nasycona Zn2+, C = zanieczyszczona Zn2+, L = z ograniczoną dostępnością Zn2+ oraz D = pozbawiona Zn2+, a pozostałe skróty to: WT = szczep typu dzikiego, a.u. = jednostki umowne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie pożywek o ograniczonym poziomie Zn2++, naczyń wzrostowych i kultur nasion do produkcji rybosomów z ograniczoną ilością Zn2+ w prątkach. Ślady Zn2+ prowadzą do wzrostu ograniczającego wzrost Zn2+ i opisujemy cechy morfogenne wykorzystywane jako bioindykatory do weryfikacji ograniczenia Zn2+ in vitro w modelowej bakterii Mycobacterium smegmatis i ludzkim patogenie M. tuberculosis.

Wykorzystanie Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu prątków ograniczonych oznaczeniem

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

Tak więc nasze badania dotyczą adaptacji bakterii do ograniczenia, które wykraczają poza samą konserwację. Używamy więc bakterii chorobotwórczych, Mycobacterium tuberculosis i niepatogennych, Mycobacterium smegmatis, aby zobaczyć, jak ograniczenie wpływa na takie rzeczy, jak fizjologia i patogeneza bakterii. Kolejną rzeczą, która nas interesuje, są alternatywne białka rybosomalne, które są wyrażane przez wiele bakterii podczas ograniczenia, ale nadal nie wiemy o nich zbyt wiele.Zarówno chorobotwórcze, jak i niepatogenne prątki wykazywały dramatyczne reakcje na ograniczenie, przy czym poziom ekspresji w setkach genów i białek był pod wpływem dostępności mikroelementu. Z fizjologicznego punktu widzenia powoduje to głęboką morfogenezę Mycobacterium smegmatis i znacznie zwiększoną reakcję na stres oksydacyjny zarówno u Mycobacterium smegmatis, jak i u patogennej Mycobacterium tuberculosis. Protokół ten rozwiązuje problem trudności w rozmnażaniu i standaryzacji warunków ograniczających wzrost w produkcji translacyjnie aktywnych alternatywnych rybosomów w prątkach.Zaobserwowaliśmy czynniki pozostające poza naszą kontrolą, takie jak ulewne deszcze, korelujące z zanieczyszczeniem i przygotowaniem pożywek o ograniczonym stopniu. Przedstawiony tutaj fenotyp bioindykacyjny zapewnia odtwarzalność wyników wzrostu ograniczających. Opisany tu kwantyfikowalny fenotyp bioindykatora pozwala na osiągnięcie warunków ograniczających bez użycia czynników chelatujących.W związku z tym umożliwia standaryzowaną produkcję aktywnych translacyjnie alternatywnych rybosomów i dalsze zastosowania, takie jak makrofagi lub infekcje zwierząt, w celu badania interakcji gospodarz-patogen. Dlatego nasze laboratorium pracuje nad zrozumieniem specyficznych funkcji każdego alternatywnego białka rybosomalnego i tego, jak włączenie tych białek do rybosomów może wpływać na translację. Próbujemy również sprawdzić, czy wyniki, które obserwujemy w M.smegmatis można zastosować również do MTB i czy można je wykorzystać do opracowania lepszych metod leczenia gruźlicy.Na początek dodaj pięć mililitrów pożywki 7H9-ADC do 50-mililitrowej probówki bioreaktora. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozmrożonych komórek wyjściowych glicerolu Mycobacterium smegmatis i przykręć pokrywkę do probówki. Ustaw probówkę pod kątem około 45 stopni i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 120 obr./min przez 18 godzin.Po inkubacji zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrach i potwierdź, że wynosi około 0,5 do 0,8. Odwirować kulturę przy 3000 x g przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki o ograniczonej zawartości lub ZLM.Podczas wirowania wysterylizuj kuwetę, napełniając ją 70% etanolem, aż się przeleje i pozostaw na 10 minut. Następnie przepłucz kuwetę trzykrotnie środkiem ZLM. Po końcowym odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach ZLM.Ślepe wygaszenie spektrofotometru za pomocą 600 mikrolitrów ZLM w kuwecie. Przenieś 600 mikrolitrów umytych komórek do wysterylizowanej kuwety i zmierz absorbancję przy 600 nanometrach. Jeśli gęstość optyczna jest wyższa niż jeden, użyj podanego wzoru.Aby obliczyć objętość ZLM, która ma zostać dodana do 600 mikrolitrów umytych komórek w kuwecie w celu uzyskania gęstości optycznej jeden, należy dodać obliczoną objętość ZLM do kuwety. Dobrze wymieszać, pipetując od pięciu do 10 razy i ponownie zmierzyć absorbancję. Następnie dodaj 50 mililitrów ZLM do sterylnej, podwójnie autoklawizowanej plastikowej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mililitrów.Zaszczepić kolby, dodając 50 mikrolitrów kultury dostosowanej do gęstości optycznej równej jednemu z kuwety. W przypadku pożywek zawierających dodaj 30 mikrolitrów 10-milimolowego siarczanu, aby uzyskać końcowe stężenie sześciu mikromolowych. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 100 obr./min, wstrząsając przez trzy dni, aby osiągnąć fazę stacjonarną.Każdego dnia wzrostu dodaj 200 mikrolitrów kultury do 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem i zmierz wskaźniki wzrostu na monochromatorowym czytniku mikropłytek. Aby zgłosić gęstość komórek uzyskaną z czytnika mikropłytek, wygeneruj krzywą standardową, aby przeliczyć odczyt z długości ścieżki przy użyciu ustawionej objętości na standardową długość ścieżki wynoszącą jeden centymetr. Ustaw długość fali wzbudzenia na 420 nanometrów i emisję na 475 nanometrów, aby zmierzyć fluorescencję kofaktora F420.Następnie ustaw długość fali wzbudzenia na 375 nanometrów, a długość fali emisji na 475 nanometrów, aby zmierzyć fluorescencję tła. Wygeneruj skan intensywności fluorescencji od wzbudzenia przy 230 nanometrach do 440 nanometrów w krokach pięcionanometrowych, ze stałą emisją przy 475 nanometrach. Korzystając z poniższego równania, oblicz procentową intensywność fluorescencji przy 375 nanometrach do 420 nanometrach.Po trzech dniach, aby zarejestrować długość komórki, wyczyść szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe niestrzępiącą się chusteczką. Odpipetować kroplę kultury o objętości 10 mikrolitrów na szkiełko podstawowe i umieścić szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby kultura rozprzestrzeniła się i wypełniła prawie cały obszar pod spodem.Za pomocą mikroskopu złożonego ze 100-krotnym zanurzeniem w oleju i 10-krotnymi obiektywami okularowymi Z mocowaniem kamery zwizualizuj przygotowany preparat. Rób zdjęcia obszarów z wieloma komórkami, które są ostre w płaszczyźnie i się nie poruszają. Używając tego samego mikroskopu i obiektywu, zobrazuj szkiełko kalibracyjne.W oprogramowaniu Fiji wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię na całej długości suwaka kalibracyjnego. Wybierz opcję Analizuj, a następnie Ustaw skalę i wprowadź znaną odległość w jednostkach dla paska skali. Następnie wybierz opcję globalny, aby zastosować skalę do wszystkich obrazów i pomiarów.Teraz otwórz obraz i użyj narzędzia linii prostej, aby narysować linię wzdłuż długości komórki, aby ją zmierzyć. Skopiuj dane dotyczące długości komórki z wyskakującego okienka do arkusza kalkulacyjnego lub zapisz je jako plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami do analizy statystycznej. Kultury typu dzikiego hodowane w ZLM wykazywały niższe wartości gęstości optycznej w porównaniu z pożywkami pełnymi, przy czym szczepy delta altRP miały jeszcze niższe wartości.Wydłużenie komórek zaobserwowano w hodowlach ZLM typu dzikiego o średniej długości komórki dziewięciu mikrometrów, podczas gdy komórki wypełnione były krótsze i wynosiły około trzech mikrometrów. Komórki Delta altRP nie wykazywały znaczącego wydłużenia w warunkach ograniczonej zawartości. Skany fluorescencyjne wykazały zmniejszoną fluorescencję kofaktora F420 w kulturach dzikich ZLM, przy czym szczepy delta altRP wykazywały znacznie większą zmienność fluorescencji.

using-mycobacterium-smegmatis-as-bioindicator-for-zinc-limited-growth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Źródło: Gupta, S., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje procedurę hodowli Mycobacterium tuberculosis w warunkach ograniczonych żelazem w celu wywołania stresu żelazowego i promowania wydzielania sideroforów, które wspierają przeżycie bakterii.

Hodowla prątków gruźlicy w warunkach ograniczonych żelazem

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie.  CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).

Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Ten protokół opisuje solidną metodę tworzenia biofilmu błonki. Metoda jest skalowalna do różnych objętości hodowli, co pozwala na łatwe zastosowanie do różnych celów eksperymentalnych. Konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę potencjału biofilmotwórczego kilku gatunków prątków.

Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Wychwytywanie limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem jednorazowego chipa mikroprzepływowego w badaniach nad HIV

Strategie patogenności prątków są wciąż słabo poznane. Powolny tempo wzrostu większości gatunków, nieprzenikniona natura ściany komórkowej oraz zagrożenia związane z pracą z patogenami sprawiają, że prątki są trudne do badania, co w dużej mierze odpowiada za naszą ograniczoną wiedzę na temat tych organizmów. W tym filmie zaprezentujemy technikę elektroporacji, która polega na poddaniu komórek krótkiemu impulsowi o wysokim napięciu elektrycznym w celu umożliwienia wniknięcia DNA. Jest to...

Elektroporacja Mycobacterium

Poznaj metodę wykorzystania Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu przy ograniczeniu cynku. Protokół ten umożliwia standaryzację badań nad fizjologią prątków i interakcjami z gospodarzem.

Wykorzystanie Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu prątków ograniczonych oznaczeniem

Przeglądaj więcej filmów