Name: Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Poznaj metodę łyżeczkowania nabłonka rogówki ze szwami u szczurów Sprague-Dawley w celu uzyskania modelu ciężkiego zapalenia rogówki bez uszkodzenia komórek macierzystych limbusu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Projekty Nauki i Technologii Prowincji Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fundusz Naukowy Prowincji Fujian dla Wybitnych Młodych Uczonych (2023J06053 [do S.O]); Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 82101084 [do S.O.] oraz Chińską Radę Stypendialną (CSC, 202306310049 [do Y.W.]).

<ol><li>Ang, L. P., Tan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+stem+cells+and+disease%3A+Current+concepts+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Acad+Med+Singap%22%5BJournal%5D)">Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications.</a> Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+p38+MAPK+signaling+pathway+ameliorates+tissue-engineered+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium.</a> Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).</li>
<li>Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+alkali+injury-induced+limbal+stem+cell+deficiency%3A+A+literature+survey+of+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models.</a> Cells. 12 (9), 1294(2023).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+microenvironment+changes+after+obstruction+of+lacrimal+gland+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).</li>
<li>Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+criteria+for+limbal+stem+cell+deficiency+before+surgical+intervention-+A+systematic+literature+review+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis.</a> Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).</li>
<li>Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+corneal+epithelial+stem+cells+at+the+limbus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus.</a> Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).</li>
<li>Ou, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ectodysplasin+a+on+the+ocular+surface+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+stem+cell+dysfunction+induced+by+severe+dry+eye+via+activation+of+the+p38+MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway.</a> Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).</li>
<li>Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timolol+induces+necroptosis%2C+apoptosis+and+senescence+concentration-dependently+in+rabbit+limbal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro.</a> Life Sci. 277, 119453(2021).</li>
<li>Castro-Munozledo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Corneal+epithelial+stem+cells%2C+their+niche+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing.</a> Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).</li>
<li>Atalay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+limbal+stem+cell+deficiency%3A+A+critical+narrative+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review.</a> Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).</li>
<li>Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+clinical+translational+relevance+of+animal+models+for+limbal+stem+cell+deficiency%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review.</a> Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+nanocomplex+based+corneal+neovascularization+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics.</a> J Control Release. 374, 50-60 (2024).</li>
<li>Zhu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergistic+therapy+with+antioxidant+and+anti-VEGF%3A+Toward+its+safe+and+effective+elimination+for+corneal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization.</a> Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).</li>
<li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assembly+drug+delivery+strategy+based+on+ultra-small+nanoparticles%3A+Toward+high+drug+permeation+and+accumulation+for+CNV+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment.</a> Chem Eng J. 450, 137968(2022).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SU6668+pure+nanoparticle-based+eyedrops%3A+Toward+its+high+drug+accumulation+and+long-time+treatment+for+corneal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tissue-engineered+corneal+epithelium+based+on+ultra-thin+amniotic+membrane+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).</li>
<li>Giroux, V., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaplasia%3A+Tissue+injury+adaptation+and+a+precursor+to+the+dysplasia-cancer+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence.</a> Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).</li>
<li>Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+metaplasia%3A+Adult+stem+cell+reprogramming+and+%28pre%29neoplastic+transformation+mediated+by+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation.</a> Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).</li>
<li>Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaplasia+and+transdifferentiation%3A+From+pure+biology+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).</li>
<li>Slack, J. M., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+and+metaplasia--switching+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chronic+smoking+on+meibomian+gland+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction.</a> PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+therapeutic+strategy+based+on+oxidant-antioxidant+balance+for+fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meibomian+gland+alteration+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology-based+diagnosis+of+Mooren%27s+ulcer+concealed+beneath+the+pterygium+on+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye.</a> J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).</li>
<li>Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+specific+keratin+markers+by+rabbit+corneal%2C+conjunctival%2C+and+esophageal+epithelia+during+vitamin+A+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency.</a> J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).</li>
<li>Espana, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+corneal+pannus+removed+from+patients+with+total+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+exposure+induced+squamous+metaplasia+of+human+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).</li>
<li>Marino, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+basement+membrane+injury+and+regeneration+modulates+corneal+fibrosis+after+pseudomonas+corneal+ulcers+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits.</a> Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w rozwoju niedoboru rąbkowych komórek macierzystych18, ale jego specyficzne mechanizmy i skutki wymagają dalszych badań. Aby rozwiązać ten problem, wywołaliśmy LSCD poprzez zeskrobanie centralnego nabłonka rogówki i zszycie środkowego zrębu rogówki, aby spowodować poważne zapalenie rogówki. Obserwowaliśmy ewolucję stanu zapalnego rogówki i stan rąbkowych komórek macierzystych w 1, 3 i 7 dniu po modelowaniu. W trzecim dniu po modelowaniu zaobserwowano znaczny obrzęk rąbka szczura, wyraźną neowaskularyzację i zwiększoną miejscową proliferację tkanek, które są typowymi cechami niedoboru rąbkowych komórek macierzystych. Do 7 dnia obrzęk rogówki jeszcze bardziej się nasilił, a liczba nowych naczyń krwionośnych nadal rosła. Za pomocą technik barwienia RT-qPCR i immunofluorescencji zaobserwowaliśmy, że w 7 dniu po modelowaniu poziomy ekspresji markera makrofagów ED1, markera neutrofili PMN i czynników zapalnych centralnego nabłonka rogówki MIP-1α i IL-1β były znacznie podwyższone. Podczas progresji stanu zapalnego obrazowanie immunologiczne i powiązane poziomy ekspresji mRNA czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla komórek nabłonka rogówki Pax6 i keratyny specyficznej dla rogówki Krt12 zostały znacznie zmniejszone. Ekspresja mRNA markera metaplazji nabłonka płaskiego związanego ze skórą Krt10 i markera nabłonka rogówki Sprr1b wzrosła podczas progresji stanu zapalnego, co wskazuje na nieprawidłowe różnicowanie. Ekspresja mRNA markera komórek macierzystych ABCG2 znacznie się zmniejszyła. Stwierdzono również ekspresję markera komórek prekursorowych p63. Obrazy barwienia fioletem krystalicznym i CFE wykazały, że w stanach zapalnych liczba komórek macierzystych rąbka zmniejszyła się. Kompleksowa analiza wykazała, że siedem dni po modelowaniu czynniki zapalne w nabłonku rogówki znacznie wzrosły, różnicowanie nabłonka rogówki było nieprawidłowe, liczba komórek macierzystych nabłonka rogówki znacznie się zmniejszyła, a zdolność proliferacji komórek i charakterystyka komórek macierzystych uległy zmniejszeniu.
Model ten indukuje stan zapalny rogówki bez bezpośredniego uszkadzania komórek macierzystych nabłonka rąbka, promując w ten sposób badania nad skutkami i mechanizmami zapalenia rogówki na komórki macierzyste nabłonka rąbka. W tkankach nabłonkowych, w tym w nabłonku rogówki, przeprogramowanie komórek macierzystych objawia się jako transdyferencjacja nabłonka. Proces ten jest ściśle związany ze stanem zapalnym i charakteryzuje się nieprawidłowym różnicowaniem indukowanym przez różne cytokiny, czynniki wzrostu i inne rozpuszczalne czynniki w mikrośrodowisku 19,20,21,22. W stanie zapalnym, zwłaszcza w długotrwałych uporczywych stanach zapalnych, takich jak zespół suchego oka i inne choroby powierzchni oka 23,24,26, nabłonek rogówki może zostać przeprogramowany w nabłonek skóry, stan znany jako metaplazja płaskonabłonkowa. Przejście to wiąże się z osłabieniem lub utratą markerów specyficznych dla nabłonka rogówki Krt12, które są zastępowane markerami specyficznymi dla skóry Krt10 i Sprr1b27,28. Model opisany w tym protokole wykazuje podobne zjawiska. Początkowo dochodzi do aktywacji rąbkowych komórek macierzystych, a następnie, przy utrzymującym się stanie zapalnym, dochodzi do metaplazji płaskonabłonkowej nabłonka rogówki. Zaobserwowaliśmy typowe płaskonabłonkowe komórki nabłonka w nabłonku rogówki, charakteryzujące się zmniejszoną ekspresją Krt12 i Pax6 oraz zwiększoną ekspresją Krt10 i Sprr1b (markery metaplazji płaskonabłonkowej). Wczesne zapalenie zwiększało proliferację nabłonka rogówki, podczas gdy w późniejszych stadiach nastąpił spadek proliferacji. Zgodnie z tym, co odkryliśmy w naszych badaniach nad LSCD spowodowanym zespołem Stevensa-Johnsona lub wrodzoną aniridią, markery rąbkowych komórek macierzystych ABCG2 i złoty standard oceny komórek macierzystych, wydajność tworzenia kolonii, zostały znacznie zmniejszone. Jednak komórki klonalne zachowały zdolność różnicowania się w dojrzałe komórki nabłonka rogówki. W poprzednich badaniach metaplazję płaskonabłonkową nabłonka rogówki obserwowano w hodowlach na granicy faz powietrze-ciecz, ale komórki macierzyste nabłonka rogówki nadal wykazywały potencjał do różnicowania się w normalny fenotyp nabłonka rogówki i zwiększoną zdolność proliferacyjną. Jest to bardzo podobne do naszych obecnych badań29.
Dlatego model badawczy opracowany w tym protokole potwierdza, że ciężki stan zapalny może prowadzić do uszkodzenia rąbkowych komórek macierzystych bez bezpośredniego uszkodzenia niszy rąbkowych komórek macierzystych. Odkrycie to jest bardzo korzystne dla obserwacji wpływu ciężkiego stanu zapalnego na mechanizmy biologiczne rąbkowych komórek macierzystych i stanowi idealną platformę eksperymentalną do badania mechanizmów LSCD spowodowanych zapaleniem rogówki.
Model ten ma jednak swoje ograniczenia. Znieczulone szczury poddawane są mechanicznemu skrobaniu nabłonka rogówki, a następnie zszywaniu rogówki, przy czym obie te procedury są inwazyjnymi zabiegami o wysokim ryzyku infekcji śródoperacyjnej i pooperacyjnej30. Co więcej, cienkość rogówki szczura sprawia, że jest ona podatna na perforację podczas szycia, co wymaga dużej biegłości operatora.
Dlatego podczas zabiegu musimy zwrócić uwagę na następujące punkty: (i) czystość i dezynfekcja: Wszystkie narzędzia muszą być wysterylizowane przed zabiegiem. Krople do oczu z antybiotykiem należy podawać dzień przed i w dniu zabiegu, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Ponieważ szew rogówkowy jest ciałem obcym, które może powodować stan zapalny i infekcję, należy przestrzegać ścisłej techniki aseptycznej, a krople do oczu z antybiotykiem należy kontynuować przez trzy dni po operacji. (ii) Obchodzenie się z rogówką szczura: Rogówka szczura jest stosunkowo cienka i podatna na perforację podczas szycia. Użyj kleszczyków zębatych, aby przytrzymać spojówkę po przeciwnej stronie miejsca szwu, aby ustabilizować gałkę oczną i ułatwić operację. Szew należy umieścić w odległości około 1,5-2 mm od rąbka rogówki, gdzie rogówka jest grubsza i mniej podatna na perforację, unikając jednocześnie uszkodzenia rąbkowych komórek macierzystych. (iii) Usuwanie nabłonka rogówki: Trepanacja rogówki i skrobak do nabłonka rogówki mogą szybko usunąć nabłonek rogówki i są łatwe w obsłudze, ale są dość ostre i mogą uszkodzić zrąb lub spowodować perforację. Kontroluj intensywność siły podczas usuwania, aby zapobiec perforacji. Aby zapewnić jednolitość w obszarze usuwania, użyj okrągłego markera, aby zaznaczyć obszar przed usunięciem nabłonka rogówki.

Dysfunkcja komórek macierzystych rąbka (LSCD) charakteryzuje się uporczywymi wadami nabłonka, unaczynieniem rogówki, przewlekłym stanem zapalnym, bliznowaceniem i spojówką rogówki1,2. Może wynikać z wyczerpania lub dysfunkcji rąbkowych komórek macierzystych po ciężkich chorobach powierzchni oka, takich jak oparzenia chemiczne, oparzenia termiczne, zespół Stevensa-Johnsona i jatrogenne uszkodzenia spowodowane operacjami oczu2,3,4. Mechanizmy chorobotwórcze LSCD obejmują głównie zmiany w komórkach macierzystych i zaburzenia w mikrośrodowisku komórek macierzystych5,6, co wpływa na homeostazę nabłonka rogówki2,7. Istnieją dwa podstawowe typy zmian losu w rąbkowych komórkach macierzystych w LSCD: 1) Kierunkowy potencjał różnicowania komórek macierzystych nabłonka rogówki staje się nieprawidłowy, co prowadzi do ich różnicowania się w komórki nabłonka skóry. Świadczy o tym spadek ekspresji czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla komórek nabłonka rogówki Pax6 oraz keratyny specyficznej dla rogówki Krt12 i Krt3, wraz ze znacznym wzrostem ekspresji markerów metaplazji nabłonka płaskiego związanych ze skórą Krt10, Krt1 i Sprr1b8; 2) Uraz powierzchni oka bezpośrednio niszczy komórki macierzyste rąbka rogówki, powodując martwicę lub apoptozę, a następnie powodując proliferację tkanki spojówki, która pokrywa rogówkę9. Doniesiono, że podczas rozwoju LSCD komórki zapalne, takie jak makrofagi, neutrofile i komórki dendrytyczne, znacznie zwiększają się w mikrośrodowisku komórek macierzystych nabłonka rogówki. Odpowiednio, cytokiny, takie jak interferon-gamma (IFN)-γ, czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α, interleukina (IL)-1β i białka zapalne makrofagów (MIP)-1α/β również wykazują znaczne wzrosty10.
Ustalono różne modele LSCD, w tym te wywołane szwami, urazami chemicznymi i plamami chlorku benzalkoniowego11. Każdy z tych modeli ma swoje wady i zalety. Urazy chemiczne mogą uszkodzić całą powierzchnię oka i bezpośrednio zniszczyć rąbkowe komórki macierzyste12. Chlorek benzalkoniowy działa podobnie do urazów chemicznych, ale ma stosunkowo powolny efekt13. Model szwu rogówkowego może wywołać stabilną i długotrwałą reakcję zapalną, ale reakcja zapalna jest stosunkowo łagodna i nie może powodować LSCD.
Aby zbadać rolę i mechanizmy zapalenia w rozwoju LSCD rogówki, stworzono model zwierzęcy, który łączy łyżeczkowanie środkowego nabłonka rogówki ze szwami rogówkowymi. Model ten indukuje uporczywe zapalenie nabłonka rogówki, nie uszkadzając bezpośrednio komórek macierzystych rąbka.

<table><tbody><tr><td>Linia szwów 10-0</td><td>Alcon, Inc., USA</td><td>8065698001</td><td></td></tr><tr><td>trepanacja rogówki 2 mm</td><td>Suzhou XVI Vision Company, Chiny</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>20 &mu; L, 100 &mu; L, 1 mL głowice pistoletów do pipet, płytki do hodowli komórkowych, probówki wirówkowe</td><td>Guangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.jetbiofil.com/index.html-20</td><td></td></tr><tr><td>/-80 &deg; Lodówka C</td><td>Qingdao Haier Company, Chiny</td><td>https://www.haier.com/cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>&nbsp; Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chiny</td><td>https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html</td><td></td></tr><tr><td>Przestrzegaj slajdu</td><td>ShiTai Company</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>alkoholu amylenowego</td><td>w Szanghaju. Macklin Biochemical, Chiny</td><td>http://www.macklin.cn/products/</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Cytokertin</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab76318</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-keratynowe 12 EPR17882</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab185627</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PAX6</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab195045</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Chiny</td><td>https://cn.citotest.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Autoklaw</td><td>Hirayama, Japonia</td><td>https://hirayama.com.cn/about/</td><td></td></tr> <tr><td>Avertin</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology, Chiny</td><td>https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.siobp.com/web</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Oven, kruszarka ultradźwiękowa, wirówka</td><td>Thermo Fisher Technologies Inc., Stany Zjednoczone</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.clinx.cn/about</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze nabłonkowe rogówki</td><td>Suzhou XVI Vision Company, Chiny</td><td>53418D</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector. Inc., Stany Zjednoczone</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Woda DEPC</td><td>&nbsp; Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.siobp.com/web</td><td></td></tr><tr><td>Krem pod oczy Dicuro (krem pod oczy z ofloksacyną)</td><td>Santian Pharmaceutical Corporation, Japonia</td><td>https://www.santen.com/asia</td><td></td></tr><tr><td>D-KSFM, pożywka hodowlana, podwójne przeciwciało i PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., USA</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>ED1</td><td>AbD Serote c, Wielka Brytania</td><td>&nbsp; </td><td></td>MCA341GA</tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Shanghai Ohaus Biotechnology Company, Chiny</td><td>http://shbio.com/company</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa membrany</td><td>Parafilm, Inc., USA</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn</td><td></td></tr><tr><td>Pasek testowy sodu fluoresceiny zastosowano w okulistyce</td><td>Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny system mikrograficzny z odwróconym kontrastem fazowym</td><td>TE-2000U, Nikon, Japonia</td><td>https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do zamrażania</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>https://www.eppendorf.sh.cn&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rama z tafli szkła</td><td>Xiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chiny</td><td>http://www.tagene.net/</td><td></td></tr> <tr><td>H-1200 ze środkiem uszczelniającym DAPI</td><td>Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.bosonbio.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Zestaw do barwienia HE</td><td>Auragene, Chiny</td><td>http://jushengwu.com/a048/</td><td></td></tr> <tr><td>Zestaw roztworu barwnika Hematoksylina i eozyny</td><td>AURAGEN, Stany Zjednoczone</td><td>P032IH</td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna o wysokiej i niskiej precyzji</td><td>Sdolis, Niemcy</td><td>https://www.solisinverters.com/global</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Shanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chiny</td><td>https://en.reagent.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Przeciwciało Ki-67</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>ciekły azot</td><td>Xiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chiny</td><td>https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/</td><td></td></tr> <tr><td>Uchwyt na mikrowskazówki</td><td>Suzhou XVI Vision Company, Chiny</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Multiformaldehyd w proszku</td><td>Sigm, Ameryka</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka o normalnej temperaturze 46</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>https://www.thermofisher.cn</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Chiny</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Zwykły biologiczny system mikrograficzny</td><td>Eclipse 50i, Nikon, Japonia</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Shanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, Chiny</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>PCR i aparatura reaktora</td><td>Biometra Thermocycler, Niemcy</td><td>https://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/</td><td></td></tr> <tr><td>Pipety o różnych specyfikacjach</td><td>Eppendorf Company, Niemcy</td><td>https://www.eppendorf.com/cn-zh/</td><td></td></tr> <tr><td>Primery do Rt-PCR</td><td>Shanghai Bio-Tech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek promeainy 0,5% krople do oczu</td><td>Alcon, Inc., USA</td><td>https://www.alcon.com/about-us</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało PMN</td><td>Fitzgerald, Stany Zjednoczone</td><td>20R-PR020</td><td></td></tr><tr><td>Ilościowa fluorescencja w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems,&nbsp; Stany Zjednoczone</td><td>https://www.thermofisher.cn</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji</td><td>TAKARA, Japonia</td><td>https://www.takarabiomed.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Lampa szczelinowa</td><td>TOPCON, Japonia</td><td>https://topconchina.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Kleszcze gładkie</td><td>Suzhou XVI Vision Company, Chiny</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Specimen-box</td><td>Lambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chiny</td><td>http://chuangdianbio.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Ławka Superclean</td><td>New Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singapur</td><td>https://www.hi-p.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Kleszcze zębate</td><td>Suzhou XVI Vision Company, Chiny</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Toppicamidowe krople do oczu (Medol)</td><td>Alcon, Inc., USA</td><td>https://www.alcon.com/about-us</td><td></td></tr><tr><td>Śladowe białko kwasu nukleinowego tester stężenia</td><td>Thermo Fisher Technologies Inc., USA</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen Stany Zjednoczone</td><td>https://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss, z mikroskopem operacyjnym</td><td>Carl ZEIS, Niemcy</td><td>https://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Establishing a Severe Corneal Inflammation Model in Rats Based on Corneal Epithelium Curettage Combined with Corneal Sutures

Zapalenie rogówki, szczególnie ciężkie zapalenie rogówki, odgrywa znaczącą rolę w rozwoju dysfunkcji komórek macierzystych rąbka rogówki. Skonstruowanie odpowiednich modeli zwierzęcych może pomóc nam skupić się na wpływie ciężkiego stanu zapalnego na komórki macierzyste rąbka rogówki. Odrdzewiacz o średnicy 2 mm został użyty do usunięcia środkowego nabłonka rogówki szczurów Sprague Dawley (SD) w celu spowodowania urazu. Następnie zszyto środkowe zrąb rogówki nylonowymi szwami w celu wywołania uporczywego stanu zapalnego. W ten sposób skonstruowano model zapalenia rogówki z centralnym ścieraniem nabłonka rogówki i szyciem zrębu centralnego, co wywołało ciężkie zapalenie rogówki. Zaobserwowano zmiany w stanie zapalnym rogówki i stanie rąbkowych komórek macierzystych po 1, 3 i 7 dniach od modelowania. W3 dniu po modelowaniu rąbek rogówki szczurów był poważnie obrzęknięty, z oczywistą neowaskularyzacją i miejscowym przerostem, które są typowymi objawami niedoboru rąbkowych komórek macierzystych. Do 7dnia obrzęk rogówki stopniowo się pogarszał, a neowaskularyzacja nadal się nasilała. Poprzez ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) i barwienie immunofluorescencyjne stwierdziliśmy, że czynniki zapalne nabłonka rogówki były znacznie regulowane w górę, różnicowanie nabłonka rogówki było nieprawidłowe, komórki macierzyste nabłonka rogówki były znacznie zmniejszone, a proliferacja komórek i łodyga również się zmniejszyły. Dlatego model ten pokazuje, że ciężki stan zapalny może wywołać uszkodzenie rąbkowych komórek macierzystych bez bezpośredniego uszkodzenia rąbkowych komórek macierzystych. Model jest korzystny dla obserwacji wpływu ciężkiego stanu zapalnego na mechanizmy biologiczne komórek macierzystych i stanowi idealną platformę do badania mechanizmów dysfunkcji komórek macierzystych nabłonka rogówki wywołanej stanem zapalnym.

Jak pokazano w Rycina 1Apoprzez badanie w lampie szczelinowej stwierdzono upośledzenie gojenia nabłonka rogówki. W warunkach prawidłowych nabłonek centralny rogówki uległby całkowitemu zagojeniu w ciągu 24–48 h po usunięciu, natomiast w modelu wycięcia centralnego nabłonka rogówki z jednoczesnym założeniem szwów, nowe naczynia krwionośne nadal występowały. W trzeciej dobie po utworzeniu modelu zaobserwowano znaczny obrzęk limbusa rogówki oraz neowaskularyzację, z miejscowym wystąpieniem typowych oznak niedoboru komórek macierzystych limbusa rogówki. Z czasem, do 7th tego dnia gojenie wciąż nie było zakończone. Wskaźnik stanu zapalnego rogówki oceniano na podstawie przekrwienia rzęskowego, obrzęku paracentralnego rogówki oraz obrzęku centralnego rogówki. Obrzęk rogówki stopniowo się nasilał, a stan zapalny rogówki (Rysunek 1A) nadal ulegały pogorszeniu. Ponadto neowaskularyzacja rogówki jest wskaźnikiem stanu zapalnego. Wraz z postępem stanu zapalnego neowaskularyzacja rogówki (Rysunek 1B) oraz indeks stanu zapalnego (Rycina 1C) wykazało ciągły wzrost.
Kriozatopienie tkanek oka przeprowadzono 7 dni po stworzeniu modelu. Barwienie hematoksyliną i eozyną (Rysunek 2A) wykazało pogrubienie nabłonka w obrębie limbusa oraz centralnej części rogówki, przy czym układ nabłonka utracił swoją prawidłową morfologię, co wskazywało na hiperplazję atypową. Zręb rogówki wydawał się obrzęknięty, z istotną infiltracją komórek zapalnych. Przy użyciu barwienia immunofluorescencyjnego PMN i ED1 (Rysunek 2B) zaobserwowano znaczny wzrost infiltracji neutrofili i makrofagów. W badaniu oceniono czynniki zapalne za pomocą IL-1β (Rysunek 2C) oraz MIP-1α (Rysunek 2D), stwierdzając, że poziom IL-1β osiągnął szczyt w 3. dniu, a następnie stopniowo spadał, podczas gdy poziom MIP-1α stale wzrastał w czasie.
Przewlekły stan zapalny zazwyczaj prowadzi do szeregu niedoborów komórek macierzystych limbusa, takich jak obniżenie poziomu Pax6, zmniejszona ekspresja Krt12 oraz metaplazja płaskonabłonkowa nabłonka rogówki. Aby zweryfikować, czy model opracowany w niniejszym badaniu mógł wywołać te zmiany w fenotypie nabłonka rogówki, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne na obecność Krt12 (Rycyna 3A) oraz Pax6 (Rycyna 3B) w nabłonku rogówki. Ekspresja Krt12 zmniejszała się wraz z przedłużającym się stanem zapalnym, przy czym w 7. dniu zaobserwowano jedynie pojedyncze komórki wykazujące pozytywny wynik dla Krt12, a ekspresja Pax6 była znacznie zredukowana w nabłonku rogówki. Na poziomie mRNA poziomy ekspresji prawidłowych markerów nabłonka rogówki, Krt12 (Rycyna 3C) oraz Pax6 (Rycyna 3D), uległy istotnemu obniżeniu w 7. dniu. Natomiast poziomy ekspresji markerów metaplazji płaskonabłonkowej, Krt10 (Rycyna 3E) i Sprr1b (Rycyna 3F), uległy istotnemu zwiększeniu w 7. dniu.
Do barwienia nabłonka rogówki wykorzystaliśmy marker proliferacji Ki67; wyniki wykazały istotny spadek liczby komórek nabłonka rogówki wykazujących ekspresję Ki67 do 7. dnia (Rycina 4A). Stan komórek macierzystych nabłonka rogówki oceniono za pomocą specyficznego dla komórek macierzystych obrąbka rogówki markera ABCG2 (Rycina 4B) oraz markera komórek progenitorowych nabłonka P63 (Rycina 4C). Poziomy ABCG2 i P63 były istotnie niższe niż w grupie kontrolnej. Dodatkowo, aby ocenić zmiany w komórkach macierzystych obrąbka rogówki w trakcie tego procesu, zastosowaliśmy metodę hodowli klonalnej, będącą złotym standardem w badaniach komórek macierzystych. Zaobserwowaliśmy, że częstość tworzenia klonów przez komórki macierzyste obrąbka rogówki (Rycina 4D) spadła do 3. dnia i uległa istotnemu obniżeniu do 7. dnia, przy czym średnia powierzchnia klonów uległa zmniejszeniu, a w 7. dniu widocznych było tylko kilka holoklonów. Wydajność tworzenia kolonii (CFE) uzyskano poprzez zliczenie klonów komórkowych widocznych w polu widzenia mikroskopu w naczyniu hodowlanym. Wartość CFE (Rycina 4E) wskazała na stopniowy spadek liczby komórek macierzystych obrąbka rogówki w warunkach zapalnych. Sugeruje to, że silny stan zapalny w tym modelu prowadzi do wyczerpania puli komórek macierzystych nabłonka obrąbka rogówki, a proces ten nie indukuje transformacji fenotypowej komórek macierzystych obrąbka rogówki, lecz raczej wiąże się z zaburzeniami różnicowania lub samoodnawiania.
Model stanu zapalnego zastosowany w niniejszym badaniu wywołał zmiany rogówkowe charakterystyczne dla LSCD, w tym rozległą infiltrację komórek zapalnych do rogówki, dysplazję nabłonka rogówki oraz zaburzoną lub zmniejszoną ekspresję Pax6 i Krt12 w prawidłowym fenotypie nabłonka rogówki. Dodatkowo odnotowano istotny wzrost ekspresji mRNA Krt10. Podsumowując, ten model eksperymentalny jest odpowiedni do badania nieprawidłowego różnicowania komórek macierzystych nabłonka rogówki indukowanego stanem zapalnym.
<img alt="Proces gojenia rogówki, obrazy i wykresy pokazują postęp w ciągu dni, wyniki analizy ilościowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ustanowienie modelu stanu zapalnego. W celu zbadania wpływu silnego stanu zapalnego na macierzyste komórki nabłonka rogówki ustanowiono model silnego stanu zapalnego. (A) Po indukowaniu modelu rogówkę obserwowano za pomocą fotografii w lampie szczelinowej. Trzy dni po modelowaniu w limbusie rogówki szczura wystąpił silny obrzęk, z wyraźną neowaskularyzacją i miejscową hiperplazją, co jest typowym objawem niedoboru macierzystych komórek limbusa rogówki. Do siódmego dnia obrzęk rogówki stopniowo się pogarszał, a neowaskularyzacja nadal narastała. Wraz z postępem stanu zapalnego (B) neowaskularyzacja rogówki oraz (C) indeks stanu zapalnego wykazywały ciągły wzrost. *p &lt; 0.05, ****P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia H&amp;E i immunofluorescencyjna tkanki, wykresy analizy ekspresji dla IL-1beta, MIP-1alpha." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Odpowiedź zapalna po modelowaniu. Oceniono odpowiedź zapalną wywołaną w rogówce przez zastosowany model. (A) Barwienie hematoksyliną i eozyną gałki ocznej wykazało, że podczas procesu zapalnego nastąpiło pogrubienie nabłonka rogówki zarówno w strefie limbalnej, jak i centralnej, a układ nabłonka rogówki utracił swoją prawidłową morfologię, wykazując oznaki hiperplazji atypowej. (B) Odnotowano znaczący wzrost markerów makrofagów ED1 (zielony) oraz markerów neutrofili PMN (czerwony). RT-qPCR wykazał istotny wzrost czynników zapalnych nabłonka rogówki: (C) IL-1β oraz (D) MIP-1α. Kolor niebieski reprezentuje barwienie jąder komórkowych DAPI, pasek skali = 50 µm; ***p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja, analiza qPCR, Krt12, Pax6, tkanka rogówki, zmiany ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zmiany fenotypowe komórek w warunkach zapalnych. Barwienie immunocytochemiczne na (A, czerwony) KRT12 w nabłonku łbemkowym oraz (B) PAX6. (C) Poziomy ekspresji mRNA KRT12 wykazują istotny spadek wraz z postępem stanu zapalnego. (D) Ekspresja mRNA PAX6 wykazuje nieprawidłowy rozkład i wyraźny spadek w nabłonku łbemkowym w warunkach zapalnych. Przeciwnie, ekspresja mRNA (E) Krt10 oraz markera nieprawidłowo zróżnicowanego nabłonka rogówki (F) Sprr1b istotnie wzrasta podczas stanu zapalnego. Kolor niebieski oznacza barwienie jąder DAPI, pasek skali = 50 µm; **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz barwienia Ki67/DAPI, wykresy słupkowe ekspresji mRNA, wyniki tworzenia kolonii, analiza CFE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zmiany w komórkach macierzystych rogówki w stanie zapalnym. Obrazy immunofluorescencyjne (A, czerwony) Ki67 ilustrują zmiany w komórkach proliferujących po indukcji stanu zapalnego. Ekspresja mRNA markera komórek macierzystych (B) ABCG2 jest znacząco obniżona. Ekspresja markera komórek progenitorowych (C) p63 jest również widoczna. (D) Obrazy barwienia fioletem krystalicznym oraz (E) CFE wykazują spadek liczby komórek macierzystych rogówki w warunkach zapalnych. Kolor niebieski oznacza jądra barwione DAPI; pasek skali wynosi 50 µm; *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Nazwa startera</td>
			<td colspan="3">Sekwencja startera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">TNF-α</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">IL-1β</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Pax6</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Krt12</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Krt10</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sprr1b</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Aktyna</td>
			<td>Wstęp</td>
			<td colspan="3">5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócenie</td>
			<td colspan="3">5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje starterów użytych do ilościowej RT-PCR.

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Corneal inflammation, especially severe corneal inflammation, plays a significant role in the development of corneal limbal stem cell dysfunction. ...

Witamy w ustanawianiu odnawialnego modelu niedoboru komórek gwiazdowych liczbowych i udało nam się ustalić model niedoboru komórek gwiazdy liczbowej spowodowanego poważnymi informacjami poprzez skrobanie nabłonka rogówki w połączeniu z szyciem rogówki. Ze względu na fakt, że grubość czerwonej rogówki to tylko jedna trzecia śmierci ludzkiego oka, szycie na powierzchni rogówki może łatwo spowodować perforację, co stanowi duże wymaganie dla naszych umiejętności chirurgicznych. Model indukuje stan zapalny rogówki bez bezpośredniego uszkadzania komórek macierzystych nabłonka limbo, wspierając w ten sposób badania nad skutkami i mechanizmami zapalenia rogówki na komórkach macierzystych nabłonka limbo.Pomaga to zaobserwować wpływ ciężkiego stanu zapalnego na mechanizmy biologiczne komórek macierzystych limbo. Na początek ułóż narzędzia chirurgiczne, w tym wysterylizowany środek do usuwania rdzy rogówki, marker do pobierania próbek skóry, uchwyty igieł, noże do warstw płytek, okulistyczne nożyczki chirurgiczne i kleszcze na platformie roboczej, wybierz samice szczurów Sprague dolly w wieku od siedmiu do ośmiu tygodni i sprawdź brak zmian na powierzchni oka pod lampą szczelinową. Po znieczuleniu szczur dezynfekuje skórę i włosy wokół oczu za pomocą joty czterech.Aby ustalić model stanu zapalnego, ustaw szczura w bocznej pozycji odleżynowa. Wystaw gałkę oczną pod mikroskopem operacyjnym. Następnie wyśrodkuj dwumilimetrowy marker do pobierania próbek skóry wokół środkowej źrenicy.Za pomocą cienkiego drzewa rogówki i skrobaka do nabłonka rogówki, zeskrob wewnętrzny nabłonek rogówki. Za pomocą drutu nylonowego 10.0, uchwytu igły, okulistycznych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, umieść trzy szwy rogówkowe 120 stopni około trzech milimetrów od rąbka. Po zszyciu należy nałożyć maść do oczu z ofloksacyną, aby zapobiec infekcji.Obserwuj i fotografuj rogówkę w pierwszym, trzecim i siódmym dniu, po operacji pod lampą szczelinową z 10-krotnym powiększeniem. Oceń poziom przekrwienia ciała rzęskowego. Przypisz zero punktów za brak zatorów, jeden punkt za przekrwienie mniej niż jeden milimetr, dwa punkty za przekrwienie od jednego do dwóch milimetrów i trzy punkty za przekrwienie powyżej dwóch milimetrów.Następnie naciąć centralny obrzęk rogówki. Przypisz zero punktów za brak obrzęku. Jeden punkt za obrzęk z wyraźną widocznością tęczówki, dwa punkty za obrzęk z niewyraźną widocznością tęczówki i trzy punkty za obrzęk zasłaniający tęczówkę.Podobnie należy ocenić przyśrodkowy obrzęk rogówki. Oblicz wskaźnik stanu zapalnego, sumując wszystkie wyniki i dzieląc przez dziewięć. Za pomocą lampy szczelinowej obserwuj neowaskularyzację rogówki.Analizuj i przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu w lampie szczelinowej. Rejestruj wzrost neowaskularyzacji rogówki w każdym punkcie czasowym obserwacji, mierząc najdłuższą neowaskularyzację rogówki w kierunku środkowej rogówki przy minimalnej krzywiźnie. Stopień neowaskularyzacji rogówki.Gojenie nabłonka rogówki było upośledzone w modelu wycięcia środkowego nabłonka rogówki z szyciem, na co wskazywało niepełne gojenie do siódmego dnia, wraz z obrzękiem rąbka rogówki i neowaskularyzacją widoczną w trzecim dniu. Wraz z postępem stanu zapalnego neowaskularyzacja rogówki i wskaźnik stanu zapalnego wykazywały ciągły wzrost.

establishing-severe-corneal-inflammation-model-rats-based-on-corneal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje protokół tworzenia modelu ex vivo dla bakteryjnego zapalenia rogówki za pomocą guzika korneo-twardówkowego wypreparowanego z oka świni. Zaszczepione bakterie przechodzą przez nacięcia nabłonka rogówki, aby zaatakować leżące poniżej zrąb i wywołać infekcję w tkankach rogówki, która naśladuje infekcję in vivo.

Model rogówki ex vivo świńskiego bakteryjnego zapalenia rogówki: technika ustalania infekcji bakteryjnej w komórkach nabłonka rogówki

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Przedstawiono nowatorskie podejście do wywoływania przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez chirurgiczne usunięcie wszystkich gruczołów łzowych oczodołu. Ta metoda, odmienna od wcześniej opisanych, daje stabilny, powtarzalny model suchego oka z niedoborem wody wodnistej, dobrze nadający się do badania fizjologii i patofizjologii łez oraz terapii okulistycznej.

Opracowanie modelu ciężkiego zespołu suchego oka za pomocą całkowitej dacryoadenektomii u królików

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Przedstawiono protokół powtarzalny do przygotowania, wzbogacania i zastosowania in situ żelu żelatynowo-ryboflawinowego krzyżowalnego światłem niebieskim do naprawy ran stromalnych rogówki u królików, w tym kroki proceduralne dotyczące postępowania chirurgicznego, częściowej tarzoraphii i opieki pooperacyjnej.

Produkcja i chirurgiczne zastosowanie wzbogaconych żeli żelatynowych przekształconych światłem i riboflawiny do naprawy ran rogówki u królików

Poznaj metodę łyżeczkowania nabłonka rogówki ze szwami u szczurów Sprague-Dawley w celu uzyskania modelu ciężkiego zapalenia rogówki bez uszkodzenia komórek macierzystych limbusu.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi (Wideo) | JoVE Journal

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Przeglądaj więcej filmów