Name: Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Poznaj mechanizmy gojenia ran rogówki w cukrzycy przy użyciu modelu ex vivo z rogówek świń. Badanie identyfikuje kluczowe cytokiny IL-1 beta i TGF beta, otwierając drogę do nowych terapii keratopatii cukrzycowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Keping Xu (M.D. i O.D.) i Jia Yin (M.D. i Ph.D.) za ich wkład w rozwój hodowli narządów rogówki bydła i świń oraz Rayowi Guo i Andy'emu Wu z Troy High School za grafikę na rysunku 1. Badania laboratoryjne dr Yu były finansowane z grantów NIH (R01 EY010869, R01EY035785, P30 EY04068) oraz przez badania mające na celu zapobieganie ślepocie w Kresge Eye Institute.

Ponieważ świeże rogówki wieprzowe są produktem ubocznym przemysłu spożywczego, Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt nie musiał zatwierdzać ich użycia do badań. W przeciwieństwie do ludzkich rogówek wykorzystywanych w badaniach, nie ma obaw o zagrożenie biologiczne, a niewykorzystane części oczu świni można wyrzucić jak zwykłe śmieci. Odczynniki i sprzęt używany do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie do hodowli organów
<ol>
	<li>Przed użyciem dodać penicylinę-streptomycynę do minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) jako suplementy.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną o wysokiej zawartości glukozy, dodając 3,6 g D-glukozy do 1 litra suplementowanego MEM, który zawiera 5 mM glukozy (równej 90 mg/dl), aby osiągnąć końcowe stężenie glukozy 25 mM (równe 450 mg/dl), naśladując hiperglikemię u pacjentów z cukrzycą.</li>
	<li>Przygotuj 1% agarozy w uzupełnionym MEM z 5 mM lub 25 mM glukozy, dodając 0,2 g agarozy do 20 ml MEM i podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści.</li>
	<li>Przenieść roztwór zawierający agarozę do łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 48 °C.</li>
	<li>Przed eksperymentem należy w autoklawie umieścić w autoklawie wszystkie odczynniki eksperymentalne, takie jak woda destylowana, PBS oraz sprzęt chirurgiczny: hemostat, kleszcze, trzonek skalpela, nożyczki i trepaninę, a także zlewki, ręczniki papierowe, niestrzępiące się chusteczki, rękawiczki i końcówki do pipet. Namocz silikonową formę, żyletkę i uchwyt ostrza w 70% alkoholu przez 30 minut i trzykrotnie umyj sterylnym PBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie gałek ocznych świni do posiewu rogówki
<ol>
	<li>Pozyskać gałki oczne świń z lokalnej rzeźni i przetransportować je do laboratorium na lodzie w wilgotnej komorze. 
	UWAGA: Oczy bydlęce mogą być również używane w podobny sposób. Jednak bydlęce oczy i rogówki różnią się od ludzkich oczu/rogówek bardziej znacząco. Na przykład rogówki ludzkie i świńskie mają 5-7 warstw komórek nabłonkowych, podczas gdy rogówki bydlęce mają około 20 warstw13,14. Co więcej, oczy bydła są bardziej narażone na zanieczyszczenie podczas hodowli narządów rogówki; W związku z tym do analizy statystycznej potrzeba więcej oczu bydlęcych.</li>
	<li>Umieścić oczy świni w 1-litrowej zlewce zawierającej wysterylizowany PBS. 
	UWAGA: Gałki oczne świni są zbierane w ciągu 1 godziny po uboju i transportowane do laboratorium w ciągu około 2 godzin. Ogólnie rzecz biorąc, oczy zużyto w ciągu 4 godzin (krok 2.3).</li>
	<li>Przytrzymaj gałkę oczną pęsetą i usuń tkanki zewnątrzgałkowe nożyczkami na sterylnej płytce Petriego.</li>
	<li>Przepłukać gałki oczne raz wodą destylowaną i dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Przepłukać bańki oka roztworem antyseptycznym powidonu i jodu przez 10 s, a następnie trzykrotnie wysterylizować PBS.</li>
	<li>Inkubować gałki oczne w PBS zawierającym 20 μg/ml gentamycyny przez 30 minut i przepłukać je dwukrotnie PBS.</li>
</ol>
3. Zranienie nabłonka
<ol>
	<li>Przytrzymaj gałkę oczną ze sterylizowanymi, niestrzępiącymi się chusteczkami i zaznacz środek rogówki trepanacją 6 mm.</li>
	<li>Delikatnie zeskrob komórki nabłonka w okręgu oznaczonym trepanacją małym skalpelem lub stępioną w rogu miękką żyletką, usuń wszystkie resztki komórek, ale pozostaw nienaruszoną błonę podstawną i oczyść obszar rany bawełnianymi wacikami. 
	UWAGA: Skalpel z zebranymi komórkami nabłonka można przenieść do probówki mikrowirówkowej umieszczonej na lodzie. Komórki mogą być natychmiast poddane lizie lub przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aby służyły jako kontrole.</li>
</ol>
4. Posiew narządów rogówki i modelowanie hiperglikemii ex vivo
<ol>
	<li>Wypreparować gałkę oczną, przecinając wzdłuż brzegów rogówki i twardówki skalpelem i nożyczkami, a następnie przepłukać rogówki w wysterylizowanej zlewce o pojemności 1000 ml zawierającej PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Umieść wycięte rogówki do góry nogami w sterylnej formie wykonanej z nietoksycznego płynnego silikonu do produkcji pleśni. 
	UWAGA: Wlej nietoksyczny płyn silikonowy do wytwarzania form do otworów stojaka na hodowle tkankowe/probówki o pojemności 50 ml, używając dna probówki ultrawirówki o pojemności 30 ml do wykonania półokrągłej formy.</li>
	<li>Wypełnić śródbłonek rogówki MEM zawierającym 1% agarozy w temperaturze 48 °C i pozostawić mieszaninę do żelowania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwróć i przenieś rogówkę do szalki o średnicy 35 mm i dodaj kroplami 2 ml MEM z czynnikiem testowym (czynnikami) testowym lub bez niego na powierzchnię środkowej rogówki, aby pokryć obszar spojówki rąbkowej, pozostawiając nabłonek wystawiony na działanie powietrza (<klasa silna = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Umieścić szalki hodowlane w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C i codziennie przez 2 dni zastępować pożywkę świeżą pożywką MEM z lub bez środka(-ów) testowego(-ych).</li>
	<li>Ustal model hiperglikemii ex vivo, dodając L-glukozę do MEM, aby osiągnąć łącznie 25 mM glukozy, która jest używana do przygotowania 1% żelu agarozowego i jako pożywka hodowlana.</li>
</ol>
5. Ocena funkcji rogówki
<ol>
	<li>Określ szybkość gojenia się ran nabłonkowych, barwiąc zranione rogówki barwieniem Richardsona20, aby zaznaczyć pozostały obszar rany i sfotografować go (ryc. 2 i ryc. 3). Określ ilościowo rozmiar rany za pomocą oprogramowania Image-J lub Photoshop (histogram).</li>
	<li>Przetwarzaj rogówki do analiz histologicznych, histochemicznych i immunohistochemicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3), osadzając je w OCT i sekcji kriostatu. Utrwal skrawki lodowatym acetonem, zabarwić barwieniem H&E lub zablokować 1% BSA przez 1 godzinę w celu barwienia TUNEL lub immunohistochemii w celu wykrycia białek i cząsteczek sygnałowych (takich jak fosforylowane Erk i ATK). 
	UWAGA: Większość dostępnych na rynku przeciwciał nie została przebadana na obecność antygenów świń. Jeśli jednak przeciwciało rozpoznaje zarówno antygeny ludzkie, jak i mysie, można je najczęściej wykorzystać do wykrywania odpowiedniego antygenu świńskiego Western blot i immunohistochemii.</li>
	<li>Umyj poplamione rogówki PBS i użyj trepanacji tej samej wielkości, aby oznaczyć oryginalną ranę i zeskrobać komórki nabłonka w okręgach znacznikowych.
	<ol>
		<li>Zbierz komórki nabłonka za pomocą małego skalpela, zanurz skalpel z zebranymi komórkami w probówce wirówkowej wstępnie schłodzonej na lodzie.</li>
		<li>Przechowuj pobrane komórki w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub natychmiast je wyekstrahuj i przeprowadź lizę w celu Western blotting i/lub ELISA lub w buforze do ekstrakcji RNA do PCR (jeśli jest to wymagane)10,16,21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Ex Vivo Porcine Corneal Culture System for Toxicity Testing and Wound Healing

<ol><li>Post, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+graft+compliance+mismatch+on+intimal+hyperplasia+using+an+ex+vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of graft compliance mismatch on intimal hyperplasia using an ex vivo organ culture model.</a> Acta Biomater. 8, 84-94 (2019).</li>
<li>Verma, A., Verma, M., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+tissue+culture+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal tissue culture principles and applications.</a> Animal Biotechnol. , 269-293 (2020).</li>
<li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell Tissue Bank. 19 (3), 269-276 (2018).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+basement+membrane+and+integrin+alterations+in+diabetes+and+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial basement membrane and integrin alterations in diabetes and diabetic retinopathy.</a> J Histochem Cytochem. 46 (9), 1033-1041 (1998).</li>
<li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+dual+epigenetic+repression+of+non-canonical+Wnt-5a+normalizes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Reversal of dual epigenetic repression of non-canonical Wnt-5a normalizes diabetic corneal epithelial wound healing and stem cells.</a> Diabetologia. 66 (10), 1943-1958 (2023).</li>
<li>Poe, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+miR-146a+in+corneal+epithelial+wound+healing+via+its+inflammatory+targets+in+human+diabetic+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of miR-146a in corneal epithelial wound healing via its inflammatory targets in human diabetic cornea.</a> Ocul Surf. 25, 92-100 (2022).</li>
<li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol Sci. 58 (2), 306-314 (2000).</li>
<li>Wilson, S. L., Ahearne, M., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+current+techniques+for+ocular+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">An overview of current techniques for ocular toxicity testing.</a> Toxicology. 327, 32-46 (2015).</li>
<li>Rose, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+study+to+test+the+efficacy+of+mesenchymal+stem+cells+in+reducing+corneal+scarring+in+an+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An experimental study to test the efficacy of mesenchymal stem cells in reducing corneal scarring in an ex-vivo organ culture model.</a> Exp Eye Res. 190, 107891(2020).</li>
<li>Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+suppresses+epidermal+growth+factor+receptor%2Fphosphatidylinositol+3-kinase%2FAkt+signaling+pathway+and+attenuates+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing.</a> Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).</li>
<li>Seyed-Safi, A. G., Daniels, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+porcine+corneal+organ+culture+model+to+study+the+limbal+response+to+corneal+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A validated porcine corneal organ culture model to study the limbal response to corneal epithelial injury.</a> Exp Eye Res. 197, 108063(2020).</li>
<li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+of+human+corneal+rim+perfusion+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model of human corneal rim perfusion organ culture.</a> Exp Eye Res. 214, 108891(2022).</li>
<li>Elsheikh, A., Alhasso, D., Rama, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+properties+of+human+and+porcine+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Biomechanical properties of human and porcine corneas.</a> Exp Eye Res. 86 (5), 783-790 (2008).</li>
<li>Zeng, Y., Yang, J., Huang, K., Lee, Z., Lee, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+biomechanical+properties+between+human+and+porcine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A comparison of biomechanical properties between human and porcine cornea.</a> J Biomech. 34 (4), 533-537 (2001).</li>
<li>Yoon, C. H., Choi, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+xenotransplantation%3A+Where+are+we+standing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corneal xenotransplantation: Where are we standing.</a> Prog Retin Eye Res. 80, 100876(2021).</li>
<li>Xu, K. P., Ding, Y., Ling, J., Dong, Z., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+HB-EGF+ectodomain+shedding+and+EGFR+activation+in+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Wound-induced HB-EGF ectodomain shedding and EGFR activation in corneal epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 813-820 (2004).</li>
<li>Xu, K. P., Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+promoting+corneal+epithelial+wound+healing+by+transactivation+of+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid promoting corneal epithelial wound healing by transactivation of epidermal growth factor receptor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 636-643 (2007).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Imbalance+between+IL-1beta+and+IL-1+receptor+antagonist+ameliorates+delayed+epithelium+wound+healing+in+diabetic+mouse+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Targeting Imbalance between IL-1beta and IL-1 receptor antagonist ameliorates delayed epithelium wound healing in diabetic mouse corneas.</a> Am J Pathol. 186 (6), 1466-1480 (2016).</li>
<li>Gao, N., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+elevated+expression+of+TGFbeta3+contributes+to+the+delay+of+epithelial+wound+healing+in+diabetic+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lack of elevated expression of TGFbeta3 contributes to the delay of epithelial wound healing in diabetic corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 35(2024).</li>
<li>Richardson, K. C., Jarett, L., Finke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+in+epoxy+resins+for+ultrathin+sectioning+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Embedding in epoxy resins for ultrathin sectioning in electron microscopy.</a> Stain Technol. 35, 313-323 (1960).</li>
<li>Xu, K., McDermott, M., Villanueva, L., Schiffman, R. M., Hollander, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+corneal+epithelial+wound+healing+following+exposure+to+ophthalmic+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo corneal epithelial wound healing following exposure to ophthalmic nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Clinical Ophthalmol. 5, 269-274 (2011).</li>
<li>Goldstein, M. H., Silva, F. Q., Blender, N., Tran, T., Vantipalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+benzalkonium+chloride+exposure%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Ocular benzalkonium chloride exposure: problems and solutions.</a> Eye (Lond). 36 (2), 361-368 (2022).</li>
<li>Xu, K., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+epithelial+wound+healing+and+EGFR+signaling+pathways+in+the+corneas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3301-3308 (2011).</li>
<li>Gao, N., Yin, J., Yoon, G. S., Mi, Q. S., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-epithelium+interplay+is+a+determinant+factor+for+corneal+epithelial+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-epithelium interplay is a determinant factor for corneal epithelial wound repair.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2243-2253 (2011).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LL-37+via+EGFR+transactivation+to+promote+high+glucose-attenuated+epithelial+wound+healing+in+organ-cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">LL-37 via EGFR transactivation to promote high glucose-attenuated epithelial wound healing in organ-cultured corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1891-1897 (2010).</li>
<li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol Sci. 58 (2), 306-314 (2000).</li>
<li>Abhari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomic+studies+of+the+miniature+swine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Anatomic studies of the miniature swine cornea.</a> Anat Rec (Hoboken). 301 (11), 1955-1967 (2018).</li>
<li>Araj, H., Tseng, H., Yeung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+discovery+and+development+of+medical+countermeasures+for+chemical+injury+to+eye+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Supporting discovery and development of medical countermeasures for chemical injury to eye and skin.</a> Exp Eye Res. 221, 109156(2022).</li>
<li>Araj, H., Tumminia, S. J., Yeung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface%3A+Merging+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Ocular surface: Merging challenges and opportunities.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (12), 3(2020).</li>
<li>Lee, M., Hwang, J. H., Lim, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+in+vivo+draize+rabbit+eye+and+skin+irritation+tests+with+a+focus+on+3D+reconstructed+human+cornea-like+epithelium+and+epidermis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Res%22%5BJournal%5D)">Alternatives to in vivo draize rabbit eye and skin irritation tests with a focus on 3D reconstructed human cornea-like epithelium and epidermis models.</a> Toxicol Res. 33 (3), 191-203 (2017).</li>
<li>Xu, K., McDermott, M., Villanueva, L., Schiffman, R. M., Hollander, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+corneal+epithelial+wound+healing+following+exposure+to+ophthalmic+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo corneal epithelial wound healing following exposure to ophthalmic nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Clin Ophthalmol. 5, 269-274 (2011).</li>
<li>Bettahi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcriptional+analysis+of+differentially+expressed+genes+in+diabetic%2C+healing+corneal+epithelial+cells%3A+Hyperglycemia-suppressed+TGFbeta3+expression+contributes+to+the+delay+of+epithelial+wound+healing+in+diabetic+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcriptional analysis of differentially expressed genes in diabetic, healing corneal epithelial cells: Hyperglycemia-suppressed TGFbeta3 expression contributes to the delay of epithelial wound healing in diabetic corneas.</a> Diabetes. 63 (2), 715-727 (2014).</li>
<li>Yeung, D. T., Araj, H., Harper, J. R., Platoff, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+developing+medical+countermeasures+against+chemical+ocular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Considerations in developing medical countermeasures against chemical ocular toxicity.</a> Toxicol Lett. 334, 1-3 (2020).</li>
</ol>

Hodowane rogówki bydlęce, a głównie wieprzowe, wykorzystano do oceny toksyczności chemikaliów kosmetycznych, leków na jaskrę i niesteroidowych leków przeciwzapalnych21,26. Rogówki świń były również wykorzystywane jako model ex vivo ludzkiej keratopatii cukrzycowej. W przeciwieństwie do oczu królika, oko świni przypomina oko ludzkie anatomicznie, fizjologicznie i biomechanicznie27, stąd jest używane do ksenotrans...

Podczas gdy modele komórkowe mają ograniczone populacje klonalne i nie są w stanie odtworzyć architektury organizmu in vivo, hodowla organów lub eksplantat oferują wgląd w funkcje narządów, rozwój, mechanizmy chorobowe i potencjalne terapie, zapewniając jednocześnie etyczne i fizjologiczne korzyści w porównaniu z innymi modelami eksperymentalnymi1,2. Oprócz zmniejszenia liczby potrzebnych zwierząt, hodowla eksplantatów kontroluje i rozsądnie manipuluje warunkami otoczenia, co jest idealne do szczegółowej eksploracji czynników kontrolujących proliferację komórek, migrację, reakcję na rany i różnicowanie komórkowe w warunkach hodowli narządów2,3. Spośród różnych tkanek/narządów, eksplantaty rogówki, w tym ludzkiej4,5,6, były szeroko stosowane do oceny toksyczności dla oczu, podrażnienia7,8, do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw funkcji komórek macierzystych9 i gojenie się ran10,11oraz do Pierwotnej jaskry otwartego kąta12.
Rogówki świń mają kilka strukturalnych i fizjologicznych podobieństw do rogówek ludzkich, co czyni je doskonałym modelem do badania biologii i chorób ludzkiej rogówki. Strukturalnie oba mają warstwę Bowmana, 5-7 warstw komórek nabłonkowych oraz podobną krzywiznę i średnicę. Fizjologicznie są wysoce przezroczyste, mają podobny skład filmu łzowego i nawodnienie rogówki, wykazują porównywalne wzorce i funkcje unerwienia rogówki oraz podążają za podobnymi procesami gojenia się ran, co czyni je doskonałym modelem do badania biologii i chorób rogówki człowieka13,14. Podczas gdy rogówki ludzkie i świńskie mają niewielkie różnice w ułożeniu włókien kolagenowych i zawartości wody, ich sygnalizacja immunologiczna i reakcje nie są identyczne. Te różnice stanowią wyzwanie dla xenotransplantation15. W związku z tym przy interpretacji danych doświadczalnych należy wziąć pod uwagę różnice specyficzne dla danego gatunku.
W porównaniu do ludzkich rogówek, oczy świń są łatwo dostępne jako produkty uboczne przemysłu mięsnego, co czyni je opłacalnymi i łatwo dostępnymi do badań14. Stosowanie rogówek od świń pomaga zmniejszyć zapotrzebowanie na rogówki od ludzkich dawców i minimalizuje obawy etyczne związane z testami na zwierzętach. Co więcej, dostępność wielu rogówek świń w tym samym czasie pozwala na spójne i powtarzalne eksperymenty, co ma kluczowe znaczenie dla wiarygodnych wyników badań.
System hodowli narządów rogówki u świń został początkowo użyty do zastąpienia testów na zwierzętach chemikaliów kosmetycznych i leków do oczu7. System ten został wykorzystany do badania gojenia się ran nabłonka rogówki i identyfikacji kilku ważnych szlaków sygnałowych, takich jak wydzielanie ektodomeny HB-EGF, stymulacja kwasem lizofosfatydowym mediatorem lipidowym i aktywacja EGFR w celu gojenia ran rogówki16,17. Wykorzystując wysoki poziom glukozy jako czynnik patologiczny, ustalono model hiperglikemii ex vivo z opóźnionym gojeniem się ran nabłonkowych, aby naśladować ludzką keratopatię cukrzycową. Korzystając z tego modelu, wykazano, że wyrażenia równowagi IL-1β w porównaniu z IL-1Ra18 i TGFβ3 w porównaniu z TGFβ119 są ważnymi czynnikami prawidłowego gojenia się ran w rogówce, a manipulacja tymi równowagami może być stosowana w leczeniu keratopatii cukrzycowej. W związku z tym hodowla narządów świń stanowi istotny, ekonomiczny i manipulacyjny system eksperymentalny o różnych zastosowaniach w testach toksyczności chemicznej, badaniach biomedycznych, odkrywaniu leków oraz ocenie uszkodzeń i naprawy tkanek w odpowiedzi na narażenie oczu na broń chemiczną.
W tym artykule opisano szczegółowy protokół hodowli narządów rogówki u świń, a jego zastosowania do oceny potencjalnego wpływu kropli do oczu z NLPZ (NS) na zdrowie rogówki oraz do określania szlaków sygnałowych i procesów biologicznych związanych z patogenezą keratopatii cukrzycowej.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>AXYMCT175SP</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0491</td><td></td></tr><tr><td>Bromfenac (Prolensa) 0.09%&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Canon</td><td>PowerShot A620</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp;</td><td>Kleszcze Zeiss</td><td>Stemi 2000c</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FisherScientific</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FisherScientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Ketorolac (Acular) 0,45%</td><td></td><td>Kresge Clinic</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech</td><td></td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>LL-37</td><td>Tocris</td><td>5213/1</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne podłoże (MEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1048901</td><td></td></tr><tr><td>Nepafenac (Ilevro) 0.1%&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Oczy wieprzowe&nbsp;</td><td>Bernthal Packing Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>76322-164</td><td></td></tr><tr><td>Rogówki dla świń</td><td>Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powidon-Jod&nbsp;</td><td>Waciki bawełniane Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tips</td><td>Q-Tips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72002-01</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na żyletkę&nbsp;</td><td>Stotz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Bard-Parker</td><td>377112</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Bard-Parker</td><td>#3</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FisherScientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma</td><td></td><td></td><td></td>silikonowa</tr><tr><td>Obudowa do kultywowania tkanek</td><td>Labconco</td><td>5100000</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Acu.Punch</td><td>3813775</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1235</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Evaluating Therapeutic and Chemical Toxicity Using Organ-Cultured Porcine Corneas and Epithelial Wound Healing

Ze względu na swoje anatomiczne i fizjologiczne podobieństwa do ludzkiego oka, oko świni służy jako solidny model do badań biomedycznych i oceny toksyczności ocznej. Opracowano system hodowli rogówki powietrzem/płynem z wykorzystaniem oczu świń, a gojenie ran nabłonkowych ex vivo wykorzystano jako krytyczny parametr w tych badaniach. Świeże rogówki świń poddano obróbce w celu hodowli narządów, z ranieniem nabłonka lub bez. Rogówki hodowano w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C w MEM, z użyciem lub bez środków testowych. Zmierzono przepuszczalność rogówki i szybkość gojenia się ran, a komórki nabłonkowe i/lub całe rogówki można przetworzyć do immunohistochemii, western blottingu i qPCR do analiz molekularnych i komórkowych. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół i przedstawiono dwa badania z wykorzystaniem tego systemu ex vivo. Dane pokazują, że hodowla narządów rogówki świń w połączeniu z gojeniem się ran nabłonkowych jest odpowiednim modelem ex vivo do testowania toksyczności chemicznej, badania keratopatii cukrzycowej i identyfikowania potencjalnych terapii.

Operacja zaćmy jest jednym z najczęściej wykonywanych zabiegów na świecie, a krople do oczu odgrywają kluczową rolę w opiece pooperacyjnej. Stosowanie kropli do oczu po operacji zaćmy pomaga zapobiegać takim powikłaniom jak infekcje oka, stany zapalne oraz obrzęk plamki żółtej. Krople do oczu zawierające NLPZ (NS), w tym ketorolak, bromfenak i nepafenak, są powszechnie stosowane w celu łagodzenia bólu i obrzęku oka przed, w trakcie i po operacji zaćmy. Długotrwałe stosowanie tych kropli, które zawierają różne ilości kons...

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Due to its anatomical and physiological similarities to the human eye, the porcine eye serves as a robust model for biomedical research and ocular ...

Badamy wrodzoną odporność rogówki w gojeniu się ran cukrzycowych. W szczególności staramy się zrozumieć, dlaczego pacjenci z cukrzycą są bardziej podatni na infekcje bakteryjne i co powoduje opóźnione gojenie się ran związanych z hiperglikemią. Stwierdziliśmy, że równowaga między IL-1 beta i antagonistą receptora IL-1, a także TGF beta jeden i TGF beta trzy, jest ważna dla gojenia się ran rogówki.Może to prowadzić do nowego leczenia keratopatii cukrzycowej. Nasz model naśladuje opóźnione gojenie się ran u pacjentów z cukrzycą. Dzięki temu możemy badać zaprogramowany szlak śmierci komórki i opracowywać terapie celowane.Na początek weź oczy świni umieszczone w litrowej zlewce. Przytrzymaj gałkę oczną pęsetą i usuń tkanki zewnątrzgałkowe nożyczkami na sterylnej płytce Petriego. W przypadku zranienia nabłonka przytrzymaj gałkę oczną za pomocą wysterylizowanych, niestrzępiących się chusteczek i zaznacz środek rogówki sześciomilimetrową trepanacją.Następnie, za pomocą małego skalpela lub stępionej w rogach miękkiej żyletki, delikatnie zeskrob komórki nabłonka w okręgu oznaczonym trepaniną. Usuń wszystkie resztki komórek, upewniając się, że błona podstawna pozostaje nienaruszona. Następnie oczyść obszar rany bawełnianymi wacikami.Za pomocą skalpela i nożyczek rozetnij gałkę oczną, przecinając wzdłuż brzegów twardówki rogówki. Następnie opłucz rogówki w wysterylizowanej 500-mililitrowej zlewce zawierającej PBS. Następnie umieść wycięte rogówki do góry nogami w sterylnej formie.Wypełnij śródbłonkową jamę rogówki minimalną niezbędną pożywką lub MEM zawierającą 1% agarozy utrzymywaną w temperaturze 48 stopni Celsjusza. Teraz odwróć i przenieś rogówki do 35-milimetrowej naczynia. Dodaj kroplami dwa mililitry MEM, z czynnikiem testowym lub bez, na powierzchnię centralnej rogówki, upewniając się, że obszar spojówki rąbkowej jest pokryty, pozostawiając nabłonek wystawiony na działanie powietrza.Następnie umieść szalki hodowlane w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 40 godzinach od zranienia zabarwić zranione rogówki roztworem barwiącym Richardsona. Umyj poplamione rogówki PBS przed ich sfotografowaniem.Następnie użyj trepanacji tego samego rozmiaru, aby oznaczyć oryginalną ranę i za pomocą małego skalpela. Zeskrob komórki nabłonka w zaznaczonych okręgach. Usuń zebrane komórki i przenieś je do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej.Pozostała powierzchnia rany była znacznie większa w rogówkach leczonych nepafenakiem 0,1% w porównaniu z rogówkami leczonymi bromfenakiem 0,09% i ketorolakiem 0,45%Rogówki leczone LL-37 w dawce 0,2 i 0,5 mikrograma na mililitr wykazywały znacznie przyspieszone gojenie się ran w warunkach wysokiego stężenia glukozy w porównaniu z rogówkami nieleczonymi.

evaluating-therapeutic-chemical-toxicity-using-organ-cultured-porcine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu ex vivo świńskiego zapalenia bakteryjnego rogówki. Pseudomonas aeruginosa jest używany jako organizm prototypowy. Ten innowacyjny model naśladuje infekcję in vivo, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności bakterii do uszkadzania tkanki rogówki.

Ustanowienie modelu rogówki ex vivo świni do badania leczenia farmakologicznego przeciwko bakteryjnemu zapaleniu rogówki

Opisujemy użycie rogówki świni do testowania skuteczności przeciwwirusowej eksperymentalnych leków.

Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Poznaj mechanizmy gojenia ran rogówki w cukrzycy przy użyciu modelu ex vivo z rogówek świń. Badanie identyfikuje kluczowe cytokiny IL-1 beta i TGF beta, otwierając drogę do nowych terapii keratopatii cukrzycowej.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Przeglądaj więcej filmów