Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych
10 stycznia 2025
Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.
Badamy wrodzoną odporność rogówki w gojeniu się ran cukrzycowych. W szczególności staramy się zrozumieć, dlaczego pacjenci z cukrzycą są bardziej podatni na infekcje bakteryjne i co powoduje opóźnione gojenie się ran związanych z hiperglikemią. Stwierdziliśmy, że równowaga między IL-1 beta i antagonistą receptora IL-1, a także TGF beta jeden i TGF beta trzy, jest ważna dla gojenia się ran rogówki.
Może to prowadzić do nowego leczenia keratopatii cukrzycowej. Nasz model naśladuje opóźnione gojenie się ran u pacjentów z cukrzycą. Dzięki temu możemy badać zaprogramowany szlak śmierci komórki i opracowywać terapie celowane.
Na początek weź oczy świni umieszczone w litrowej zlewce. Przytrzymaj gałkę oczną pęsetą i usuń tkanki zewnątrzgałkowe nożyczkami na sterylnej płytce Petriego. W przypadku zranienia nabłonka przytrzymaj gałkę oczną za pomocą wysterylizowanych, niestrzępiących się chusteczek i zaznacz środek rogówki sześciomilimetrową trepanacją.
Następnie, za pomocą małego skalpela lub stępionej w rogach miękkiej żyletki, delikatnie zeskrob komórki nabłonka w okręgu oznaczonym trepaniną. Usuń wszystkie resztki komórek, upewniając się, że błona podstawna pozostaje nienaruszona. Następnie oczyść obszar rany bawełnianymi wacikami.
Za pomocą skalpela i nożyczek rozetnij gałkę oczną, przecinając wzdłuż brzegów twardówki rogówki. Następnie opłucz rogówki w wysterylizowanej 500-mililitrowej zlewce zawierającej PBS. Następnie umieść wycięte rogówki do góry nogami w sterylnej formie.
Wypełnij śródbłonkową jamę rogówki minimalną niezbędną pożywką lub MEM zawierającą 1% agarozy utrzymywaną w temperaturze 48 stopni Celsjusza. Teraz odwróć i przenieś rogówki do 35-milimetrowej naczynia. Dodaj kroplami dwa mililitry MEM, z czynnikiem testowym lub bez, na powierzchnię centralnej rogówki, upewniając się, że obszar spojówki rąbkowej jest pokryty, pozostawiając nabłonek wystawiony na działanie powietrza.
Następnie umieść szalki hodowlane w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 40 godzinach od zranienia zabarwić zranione rogówki roztworem barwiącym Richardsona. Umyj poplamione rogówki PBS przed ich sfotografowaniem.
Następnie użyj trepanacji tego samego rozmiaru, aby oznaczyć oryginalną ranę i za pomocą małego skalpela. Zeskrob komórki nabłonka w zaznaczonych okręgach. Usuń zebrane komórki i przenieś je do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej.
Pozostała powierzchnia rany była znacznie większa w rogówkach leczonych nepafenakiem 0,1% w porównaniu z rogówkami leczonymi bromfenakiem 0,09% i ketorolakiem 0,45%Rogówki leczone LL-37 w dawce 0,2 i 0,5 mikrograma na mililitr wykazywały znacznie przyspieszone gojenie się ran w warunkach wysokiego stężenia glukozy w porównaniu z rogówkami nieleczonymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wrodzoną odporność rogówki w procesie gojenia ran przy cukrzycy, koncentrując się na podatności pacjentów z cukrzycą na infekcje bakteryjne oraz opóźnionym gojeniu. Badanie identyfikuje kluczowe równowagi molekularne, które mogą stać się podstawą nowych metod leczenia keratopatii cukrzycowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Immunologia
Wstęp
- Pacjenci z cukrzycą cierpią na opóźnione gojenie ran.
- U tych pacjentów odnotowuje się zwiększoną podatność na infekcje.
- Zrozumienie mechanizmów leżących u podłoża tego procesu jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Gojenie ran rogówki stanowi istotny obszar badań.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów gojenia ran rogówki w warunkach cukrzycy.
- Zbadanie roli specyficznych cytokin w procesach gojenia.
- Opracowanie celowanych terapii w leczeniu keratopatii cukrzycowej.
Zastosowane metody
- Kultura ex vivo rogówek świńskich.
- Analiza równowagi cytokin, w tym IL-1 beta oraz TGF beta.
- Modelowanie opóźnionego gojenia ran u ludzi.
- Badanie szlaków programowanej śmierci komórki.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano krytyczne równowagi między IL-1 beta a antagonistą receptora IL-1.
- Wskazano na znaczenie TGF beta jeden oraz TGF beta trzy w procesie gojenia.
- Opracowano model naśladujący proces gojenia ran cukrzycowych u ludzi.
- Potencjał do opracowania nowych metod leczenia celujących w zidentyfikowane szlaki.
Wnioski
- Zrozumienie oddziaływań cytokin jest kluczowe dla poprawy gojenia ran w przebiegu cukrzycy.
- Wyniki badań mogą doprowadzić do opracowania innowacyjnych terapii keratopatii cukrzycowej.
- Modele ex vivo stanowią powtarzalną platformę do testowania toksyczności okularnej oraz środków terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Rogówki świńskie hodowane w kulturze organowej stanowią istotną translacyjnie platformę ex vivo do oceny toksyczności ocznej oraz terapeutycznego gojenia ran, ściśle odzwierciedlając fizjologię rogówki ludzkiej. System ten umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki oraz zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie opracowywania leków okulistycznych. Ilościowe wyniki gojenia ran oraz analizy molekularne w tym modelu służą do selekcji portfolio oraz podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w systemie rogówkowym istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez ilościowe określanie gojenia ran w warunkach cukrzycowych i niecukrzycowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów molekularnych, takich jak szlaki cytokinowe.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy rozwoju kandydatów na leki okulistyczne.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny test ex vivo w celu oceny toksyczności chemicznej i skuteczności terapeutycznej.
- Generuje ilościowe dane dotyczące zamykania rany i przepuszczalności w celu oceny związków.
- Wspiera skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy dla wielu badanych substancji.
- Umożliwia późniejsze analizy molekularne, w tym immunohistochemię i qPCR.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z mechanizmami chorób ludzkich, w szczególności z keratopatią cukrzycową i opóźnionym gojeniem ran.
- Łączy odkrycia badawcze z walidacją przedkliniczną z wykorzystaniem modelu istotnego fizjologicznie.
- Wspiera identyfikację i priorytetyzację translacyjnych biomarkerów dla terapii okulistycznych.
- Zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach poprzez dostarczenie wczesnych informacji o mechanizmach działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten ex vivo model rogówki świńskiej integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno walidację celu, jak i identyfikację wiodących związków w terapii okulistycznej.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie gojenia ran i efektów szlaków cytokinowych w celu wyjaśnienia mechanizmów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Zapewnienie powtarzalnych, ilościowych wyników do oceny toksyczności i skuteczności.
- Analityka: Umożliwienie analiz molekularnych i komórkowych w celu porównania wpływu czynników na gojenie i stan zapalny.
- Badania translacyjne: Modelowanie stanów chorobowych istotnych dla ludzi, wspieranie zgodności biomarkerów i ciągłości przedklinicznej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnienie platformy wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania związków i badań mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w procesie odkrywania leków okulistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy toksyczności i skuteczności dzięki skalowalnym, powtarzalnym schematom postępowania.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka w przypadku wczesnych kandydatów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych w okulistyce.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkanką ex vivo oraz w biologii rogówki.
- Wymaga dostępu do sterylnych warunków hodowli oraz aparatury do analiz molekularnych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności tworzenia i pomiaru ran.
- Można dostosować do różnych czynników chemicznych i terapeutycznych, jednak zastosowanie ogranicza się do rogówki.
- Zależy od dostępności świeżej tkanki wieprzowej oraz stałych warunków hodowli.
