Name: Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego nokautowania CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z receptorem antygenowym chimerycznym. Ta technika pozwala identyfikować genetyczne czynniki wpływające na odpowiedź terapii CAR T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), National Institutes of Health K12CA090628 (SSK) i R37CA266344-01 (SSK), grant Departamentu Obrony CA201127 (SSK), Fundację Predolin (SSK) oraz Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics (SSK). CMS jest wspierany przez Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Schemat ekranu CRISPR (rysunek 1) został stworzony za pomocą BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054).

Genome-Wide CRISPR Screens in CART Cells to Investigate Therapy Resistance

<ol><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-year+follow-up+supports+curative+potential+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1).</a> Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR+T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Locke, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+activity+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%3A+A+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+1-2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial.</a> Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+adult+relapsed+or+refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).</li>
<li>Bai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antigen-specific+landscape+of+CAR+T+infusion+product+identifies+determinants+of+CD19-positive+relapse+in+patients+with+all%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all.</a> Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Med. 24, 563-571 (2018).</li>
<li>Gennert, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulatory+landscape+of+human+CAR+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+anti-CD19+CAR+T+cell+infusion+products+associated+with+efficacy+and+toxicity+in+patients+with+large+B+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.</a> Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+CRISPR%2FCAS9+to+knock+out+GM-CSF+in+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Cox, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+disruption+in+CART+cells+modulates+T+cell+activation+and+enhances+CART+cell+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity.</a> Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).</li>
<li>Ottaviano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+trial+of+CRISPR-engineered+CAR19+universal+T+cells+for+treatment+of+children+with+refractory+B+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia.</a> Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).</li>
<li>Mccutcheon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+regulators+of+human+CD8%2B+T+cell+function+identified+through+orthogonal+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens.</a> Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).</li>
<li>Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+screen+to+optimize+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype.</a> Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+of+CAR+T+cells+and+cancer+stem+cells+reveals+critical+dependencies+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.</a> Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).</li>
<li>Shifrut, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+in+primary+human+T+cells+reveal+key+regulators+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function.</a> Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).</li>
<li>Belk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+crispr+screens+of+T+cell+exhaustion+identify+chromatin+remodeling+factors+that+limit+T+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence.</a> Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC-seq+maps+the+comprehensive+and+dynamic+chromatin+accessibility+landscape+of+CAR-T+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction.</a> Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Beider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+signatures+associated+with+CAR+T+cell+exhaustion+and+impaired+clinical+response+in+patients+with+B+cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies.</a> Cells. 11 (7), 1140(2022).</li>
<li>Wherry, E. J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Prinzing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+DNMT3A+in+CAR+T+cells+prevents+exhaustion+and+enhances+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity.</a> Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).</li>
<li>Lynn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-jun+overexpression+in+CAR+T+cells+induces+exhaustion+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance.</a> Nature. 576, 293-300 (2019).</li>
<li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibition+via+CRISPR+promotes+the+long-term+efficacy+of+CAR+T+cells+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors.</a> JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biol. 16, 281(2015).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href=" https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), Humanigen (poprzez Mayo Clinic), Mettaforge (poprzez Mayo Clinic) i MustangBio (poprzez Mayo Clinic) oraz Chymal therapeutics (przez Mayo Clinic). CS, CMR i SSK są wynalazcami patentów, na które licencja jest udzielona firmie Immix Biopharma. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK odłączyło się od konsultanta dla Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma i Humanigen. CMS i SSK są wynalazcami własności intelektualnej, która powstała w wyniku tego protokołu.

Edycja genów stała się potężnym narzędziem zarówno w zrozumieniu mechanizmów oporności na terapie, jak i w projektowaniu nowatorskich terapii komórkowych CART w celu poprawy długowieczności i aktywności komórek CART 16,17,26. Podczas gdy niektóre strategie edycji genów wykazały poprawę aktywności komórek CART zarówno w modelach przedklinicznych, jak i badaniach klinicznych, nadal pozostaje wiele do zrobienia w celu optymalizacji...

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) wykazała imponujący sukces w leczeniu nowotworów złośliwych komórek B; jednak trwała odpowiedź jest ograniczona do 30-40%1,2,3,4,5. Chociaż naukowcy opracowali i przetestowali kilka podejść mających na celu rozwiązanie problemów z mechanizmami oporności na terapię komórkową CART, w tym optymalizację konstrukcji CAR, edycję genów i terapie skojarzone, rozwój oporności pozostaje w dużej mierze nieznany. Ostatnio pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wyjściowy profil ekspresji genów w produktach z komórek CART przed infuzją jest ważnym czynnikiem determinującym zarówno toksyczność, jak i skuteczność terapii CART6,7,8,9. W związku z tym edycja genów podczas produkcji komórek CART stała się popularnym podejściem do poprawy skuteczności terapii komórkowej CART.
Na przykład, nasze laboratorium wcześniej pokazało, że użycie technologii Cas9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) do wyeliminowania czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów genu (GM-CSF) poprawia aktywność komórek CART i zmniejsza oznaki toksyczności związanej z CART10,11,12. Dodatkowo, terapia komórkowa modyfikowana przez CRISPR została przetestowana w badaniach klinicznych i wykazała skuteczność i bezpieczeństwo13. Razem wskazuje to, że edycja genów za pomocą technologii CRISPR może nie tylko poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii komórek CART, ale także wygenerować translowalne produkty komórkowe CART.
Ekrany nokautujące CRISPR dla całego genomu stają się coraz bardziej popularnymi narzędziami w badaniach nad biologią nowotworów, pozwalającymi zrozumieć mechanizmy oporności na terapie. W tej technice dziesiątki tysięcy przewodnikowych RNA (gRNA) są dostarczane do pul komórek, aby zachęcić do wejścia jednego gRNA na komórkę14. Następnie komórki poddawane są warunkom wywołującym ciśnienie, w których komórki transdukowane gRNA ukierunkowane na niezbędne geny umierają, a komórki transdukowane gRNA ukierunkowane na geny hamujące przeżywają i namnażają się. Korzystając z sekwencjonowania nowej generacji, możemy określić, jak zmienia się reprezentacja gRNA w całym ekranie CRISPR14.
Jednak skala i czas selekcji wymagane do perturbacji genów w całym genomie mogą być trudne do osiągnięcia w komórkach pierwotnych, takich jak komórki CART. W związku z tym grupy wykorzystały ukierunkowane badania przesiewowe CRISPR, aby lepiej zrozumieć mechanizmy oporności terapeutycznej15,16. Ekrany docelowe są często łatwiejsze do wykonania w komórkach podstawowych, ponieważ mają mniejsze biblioteki, które wymagają mniejszej liczby komórek, aby uzyskać odpowiednią reprezentację biblioteki. Chociaż badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmów oporności na terapię komórkową CART, celowane badania przesiewowe wprowadzają błąd systematyczny ze względu na ręczną selekcję docelowych genów. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie metody przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w komórkach CART od zdrowych dawców. W związku z tym to wysokoprzepustowe podejście pozwala na wydajną, bezstronną identyfikację kluczowych szlaków i genów, które można edytować w celu poprawy odpowiedzi terapeutycznych17,18,19.
W szczególności, protokół opisany w tym artykule ma na celu zwiększenie wiedzy na temat wyczerpania komórek CART poprzez uzupełnienie ekranu nokautu CRISPR obejmującego cały genom modelem in vitro dla wyczerpania. Wyczerpanie to dysfunkcyjny los komórki CART, który jest związany z brakiem odpowiedzi na terapię komórkową CART20,21,22. Wiadomo, że ten los komórkowy jest regulowany epigenetycznie i charakteryzuje się spadkiem proliferacji komórek CART, spadkiem produkcji cytokin efektorowych i wzrostem ekspresji receptorów hamujących23. We wcześniejszej literaturze edycja genów była w stanie zapobiec rozwojowi wyczerpania poprzez regulację kluczowych genów w górę lub w dół24,25,26. Biorąc pod uwagę zarówno spadek zdolności proliferacyjnej w miarę wyczerpania komórek CART, jak i dowody na to, że edycja genów może zapobiec jego wystąpieniu, modelowaliśmy nasz ekran nokautujący CRISPR w całym genomie in vitro na tym losie komórkowym. Protokół ten może jednak zostać zmieniony w przyszłości w celu zbadania innych mechanizmów oporności na terapię komórkową CART.

<table><tbody><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Komórki używane do produkcji lentiwirusa</td></tr><tr><td>Przeciwciało Biotyna BiałkoL</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>przeciwciało łańcuchowe anty-kappa do wykrywania CAR</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina sól disodowa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1389-1G</td><td>Antybiotyk karbenicylinowy</td></tr><tr><td>CD4 Izolacja Koraliki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kulki izolacyjne CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez DNaz</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951RF</td><td>Zestaw do izolacji ujemnej</td></tr><tr><td>Endura Electrocompetent Cells&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60242-1</td><td>Elektrokompetentne ogniwa z pożywką regeneracyjną</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>Biblioteka CRISPR plazmid</td></tr><tr><td>Gene Pulser II&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>Elektroporator</td></tr><tr><td>glikogen</td><td>Millipore Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19+ komórki docelowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td><td>Zestaw odczynników do transfekcji z odczynnikiem do transfekcji (odczynnik Lipofectamine 3000) i neutralnym odczynnikiem kolipidowym (p3000)</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7851</td><td>Gradient gęstości średni</td></tr><tr><td>Zestawy Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Zestaw do przygotowania Maxi ThermoFisher Scientific</td><td>12748412</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541S</td><td>Mastermix do PCR o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Zredukowana pożywka w surowicy</td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>Plazmid do pakowania lentiwirusowego</td></tr><tr><td>Pennicylina-streptomycyna-glutamina (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>VSV-G otoczka z ekspresją plazmidu</td></tr><tr><td>Pooled Human AB Surowica&nbsp;</td><td>Innowacyjne badania</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Zestaw do ekstrakcji Gek</td></tr><tr><td>Zestaw Qucik-DNA Midiprep Plus Zymo</td><td>Research</td><td>D4075</td><td>Zestaw służący do izolacji gDNA</td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Automatyczny separator komórek</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>Rurka do separacji gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało streptawidyny (PE)</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>Przeciwciało drugorzędowe używany do wykrywania CAR</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka (Optima XPN-80)</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Systemy filtrów próżniowych, 0,22 i mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>Systemy filtrów próżniowych, 0,45 &mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicy</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Pożywka z komórek krwiotwórczych</td></tr></tbody></table>

wykonywanie badania przesiewowego nokautującego crispr in vitro w całym genomie w limfocytach t z chimerycznym receptorem antygenowym

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) jest innowacyjną formą celowanej immunoterapii, która zrewolucjonizowała leczenie raka. Jednak trwała reakcja pozostaje ograniczona. Ostatnie badania wykazały, że epigenetyczny krajobraz produktów z komórek CART przed infuzją może wpływać na odpowiedź na terapię, a jako rozwiązanie zaproponowano edycję genów. Konieczne jest jednak wykonanie dalszych prac w celu określenia optymalnej strategii edycji genów. Badania przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom stały się popularnymi narzędziami zarówno do badania mechanizmów oporności, jak i optymalizacji strategii edycji genów. Jednak ich zastosowanie w komórkach pierwotnych wiąże się z wieloma wyzwaniami. W tym miejscu opisujemy metodę przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR obejmującego cały genom w komórkach CART od zdrowych dawców. Jako model potwierdzający słuszność koncepcji zaprojektowaliśmy tę metodę w celu zbadania rozwoju wyczerpania w komórkach CART ukierunkowanych na antygen CD19. Uważamy jednak, że podejście to może być wykorzystane do zajęcia się różnymi mechanizmami oporności na terapię w różnych konstruktach CAR i modelach nowotworów.

Aby w sposób bezstronny zbadać geny i szlaki sygnałowe, których edycja może poprawić aktywność komórek CART, zaprojektowaliśmy in vitro genomowy screening CRISPR knockout (Rysunek 1). Przesiewanie to składa się z dwóch faz: fazy produkcji komórek CART oraz fazy presji selekcyjnej. W fazie produkcji komórek CART co najmniej 110 × 106 Limfocyty T są najpierw izolowane z PBMC zdrowego dawcy, a następnie aktywowane za pomocą CD3+/CD28+ kulek. Następnego ...

Artykuł opisuje protokół zastosowania modelu in vitro do wyczerpania w celu przeprowadzenia całego genomu ekranu nokautującego CRISPR w zdrowych limfocytach T receptora chimerycznego antygenu dawcy.

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy is an innovative form of targeted immunotherapy that has revolutionized the treatment of cancer. However, ...

Terapia komórkami Car T jest innowacyjnym rodzajem immunoterapii nowotworów, która doprowadziła do remisji trwającej ponad dekadę. Wskaźniki trwałych odpowiedzi są jednak nadal ograniczone. Dzięki temu protokołowi zamierzamy pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów stojących za opornością i stworzyć narzędzia poprawiające odpowiedź na terapię komórkami CAR T.Obecnie stosuje się wiele podejść w celu ulepszenia terapii komórkami CAR T, w tym terapie skojarzone i optymalizację konstrukcji CAR. Jednak ze względu na coraz więcej dowodów na to, że profil epigenetyczny produktów z komórek T CAR przed infuzją jest ważną odpowiedzią determinującą, technologie edycji genetycznej stały się popularnymi narzędziami.Edycja genomu limfocytów CAR T okazała się skuteczna w zapobieganiu toksyczności oraz zwiększaniu ekspansji i trwałości komórek CAR T w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Nasz protokół badania przesiewowego CRISPR w całym genomie zapewnia skuteczne i bezstronne podejście do określenia najlepszych zmian genetycznych w celu poprawy funkcji komórek CAR T.Perturbacje genów w całym genomie wymagają odpowiednich warunków selekcji na dużą skalę, aby były skuteczne. Aby zbadać rozwój wyczerpania limfocytów CAR T, dowiedzieliśmy się, że musimy stymulować ponad 80 milionów limfocytów CAR T przez dwa tygodnie, aby wybrać optymalne edycje genów.Podczas gdy nasz protokół został opracowany w celu oceny rozwoju wyczerpania, protokół ten można dostosować do oceny rozwoju innych mechanizmów oporności. Przeprowadzając badania przesiewowe całego genomu w różnych warunkach, możemy ostatecznie określić najlepsze zmiany, aby poprawić ogólną odpowiedź na terapię komórkami CAR T.[Narrator] Po transdukcji limfocytów CAR T za pomocą biblioteki CRISPR, odwiruj próbki o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby je umyć. Odessać supernatant i ponownie zawiesić próbki w 20 mililitrach pożywki z limfocytów T. Aby zachować próbki do sekwencjonowania nowej generacji, należy podwielokrotnić wystarczającą ilość komórek CAR T do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby utrzymać reprezentację przewodnika RNA wynoszącą 500 komórek na przewodnik RNA. Odwirować próbkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze PBS i przenieś go do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umyj 50-mililitrową probówkę stożkową jednym mililitrem PBS i przenieś popłuczynę do tej samej probówki mikrowirówkowej. Następnie odwirować próbki o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usuń supernatant i przechowuj granulki komórek w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć kohodowlę, dodaj limfocyty CAR T do komórek JeKo-1 CD19-dodatnich w stosunku jeden do jednego. Doprowadzić całkowitą objętość kokultury do 160 mililitrów za pomocą pożywki z limfocytów T i przechowywać próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Aby ponownie stymulować limfocyty CAR T, zbierz kokultury do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj próbki przy 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić każdą próbkę w 80 mililitrach pożywki z limfocytów T i dodać 80 razy 10 do mocy sześciu komórek JeKo-1 w 80 mililitrach pożywki z komórek T. Przechowuj próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W 15 dniu, aby wyizolować limfocyty CAR T z kohodowli, najpierw policz komórki. Połącz zestaw do pozytywnej selekcji limfocytów T CD4-dodatnich z zestawem do pozytywnej selekcji limfocytów T CD8-dodatnich, aby wyizolować limfocyty T z kokultur CAR T JeKo-1. Następnie policz izolowane limfocyty T. Aby zachować próbki do sekwencjonowania nowej generacji, należy podwielokrotnić 33 razy 10 do mocy sześciu komórek CAR T do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować próbkę przy 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS i przenieść go do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Następnie umyj 50-mililitrową probówkę stożkową jednym mililitrem PBS i przenieś popłuczynę do tej samej probówki mikrowirówkowej. Po odwirowaniu próbek i usunięciu supernatantu, przechowuj granulki komórek w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Na początek wyizoluj genomowe DNA z zamrożonych granulek komórek CAR T za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA. Oczyść wyizolowane genomowe DNA poprzez wytrącanie etanolu, najpierw wstępnie schładzając 100% etanolu do -20 stopni Celsjusza. Podziel wymyte DNA równomiernie na kilka probówek do mikrowirówek, upewniając się, że każda podwielokrotność wynosi od 200 do 250 mikrolitrów. Dodaj dwie objętości wstępnie schłodzonego 100% etanolu, 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu i jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr glikogenu. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Drugiego dnia wiruj próbki o wadze 13 000 g przez 20 minut, aby osadzać wytrącone DNA. Usuń supernatant i umyj granulki jednym mililitrem 70% etanolu, wirując z prędkością 7,500 g przez 10 minut. Po całkowitym wysuszeniu granulek, ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach sterylnej wody. Aby przygotować genomowe DNA do sekwencjonowania nowej generacji, należy skonfigurować PCR z określoną mieszaniną reakcyjną pokazaną tutaj. Następnie wykonaj PCR w następujących warunkach cyklicznych. Przeciągnij reakcje PCR dla każdej próbki i oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzić trzy mikrogramy produktu PCR dla każdej próbki na 2% żelu agarozowym. Usuń produkt PCR z żelu, ekstrahując DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.

performing-an-vitro-genome-wide-crispr-knockout-screen-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Poznaj metodę przesiewowego nokautowania CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z receptorem antygenowym chimerycznym. Ta technika pozwala identyfikować genetyczne czynniki wpływające na odpowiedź terapii CAR T.

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym (Wideo) | JoVE Journal

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

Przeglądaj więcej filmów