Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

Terapia komórkami Car T jest innowacyjnym rodzajem immunoterapii nowotworów, która doprowadziła do remisji trwającej ponad dekadę. Wskaźniki trwałych odpowiedzi są jednak nadal ograniczone. Dzięki temu protokołowi zamierzamy pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów stojących za opornością i stworzyć narzędzia poprawiające odpowiedź na terapię komórkami CAR T.

Obecnie stosuje się wiele podejść w celu ulepszenia terapii komórkami CAR T, w tym terapie skojarzone i optymalizację konstrukcji CAR. Jednak ze względu na coraz więcej dowodów na to, że profil epigenetyczny produktów z komórek T CAR przed infuzją jest ważną odpowiedzią determinującą, technologie edycji genetycznej stały się popularnymi narzędziami.

Edycja genomu limfocytów CAR T okazała się skuteczna w zapobieganiu toksyczności oraz zwiększaniu ekspansji i trwałości komórek CAR T w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Nasz protokół badania przesiewowego CRISPR w całym genomie zapewnia skuteczne i bezstronne podejście do określenia najlepszych zmian genetycznych w celu poprawy funkcji komórek CAR T.

Perturbacje genów w całym genomie wymagają odpowiednich warunków selekcji na dużą skalę, aby były skuteczne. Aby zbadać rozwój wyczerpania limfocytów CAR T, dowiedzieliśmy się, że musimy stymulować ponad 80 milionów limfocytów CAR T przez dwa tygodnie, aby wybrać optymalne edycje genów.

Podczas gdy nasz protokół został opracowany w celu oceny rozwoju wyczerpania, protokół ten można dostosować do oceny rozwoju innych mechanizmów oporności. Przeprowadzając badania przesiewowe całego genomu w różnych warunkach, możemy ostatecznie określić najlepsze zmiany, aby poprawić ogólną odpowiedź na terapię komórkami CAR T.

[Narrator] Po transdukcji limfocytów CAR T za pomocą biblioteki CRISPR, odwiruj próbki o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby je umyć. Odessać supernatant i ponownie zawiesić próbki w 20 mililitrach pożywki z limfocytów T. Aby zachować próbki do sekwencjonowania nowej generacji, należy podwielokrotnić wystarczającą ilość komórek CAR T do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby utrzymać reprezentację przewodnika RNA wynoszącą 500 komórek na przewodnik RNA. Odwirować próbkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze PBS i przenieś go do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umyj 50-mililitrową probówkę stożkową jednym mililitrem PBS i przenieś popłuczynę do tej samej probówki mikrowirówkowej. Następnie odwirować próbki o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usuń supernatant i przechowuj granulki komórek w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć kohodowlę, dodaj limfocyty CAR T do komórek JeKo-1 CD19-dodatnich w stosunku jeden do jednego. Doprowadzić całkowitą objętość kokultury do 160 mililitrów za pomocą pożywki z limfocytów T i przechowywać próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Aby ponownie stymulować limfocyty CAR T, zbierz kokultury do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj próbki przy 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić każdą próbkę w 80 mililitrach pożywki z limfocytów T i dodać 80 razy 10 do mocy sześciu komórek JeKo-1 w 80 mililitrach pożywki z komórek T. Przechowuj próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W 15 dniu, aby wyizolować limfocyty CAR T z kohodowli, najpierw policz komórki. Połącz zestaw do pozytywnej selekcji limfocytów T CD4-dodatnich z zestawem do pozytywnej selekcji limfocytów T CD8-dodatnich, aby wyizolować limfocyty T z kokultur CAR T JeKo-1. Następnie policz izolowane limfocyty T. Aby zachować próbki do sekwencjonowania nowej generacji, należy podwielokrotnić 33 razy 10 do mocy sześciu komórek CAR T do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować próbkę przy 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS i przenieść go do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Następnie umyj 50-mililitrową probówkę stożkową jednym mililitrem PBS i przenieś popłuczynę do tej samej probówki mikrowirówkowej. Po odwirowaniu próbek i usunięciu supernatantu, przechowuj granulki komórek w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Na początek wyizoluj genomowe DNA z zamrożonych granulek komórek CAR T za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA. Oczyść wyizolowane genomowe DNA poprzez wytrącanie etanolu, najpierw wstępnie schładzając 100% etanolu do -20 stopni Celsjusza. Podziel wymyte DNA równomiernie na kilka probówek do mikrowirówek, upewniając się, że każda podwielokrotność wynosi od 200 do 250 mikrolitrów. Dodaj dwie objętości wstępnie schłodzonego 100% etanolu, 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu i jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr glikogenu. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Drugiego dnia wiruj próbki o wadze 13 000 g przez 20 minut, aby osadzać wytrącone DNA. Usuń supernatant i umyj granulki jednym mililitrem 70% etanolu, wirując z prędkością 7,500 g przez 10 minut. Po całkowitym wysuszeniu granulek, ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach sterylnej wody. Aby przygotować genomowe DNA do sekwencjonowania nowej generacji, należy skonfigurować PCR z określoną mieszaniną reakcyjną pokazaną tutaj. Następnie wykonaj PCR w następujących warunkach cyklicznych. Przeciągnij reakcje PCR dla każdej próbki i oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzić trzy mikrogramy produktu PCR dla każdej próbki na 2% żelu agarozowym. Usuń produkt PCR z żelu, ekstrahując DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.