Name: Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: Naucz się izolować komórki ziarniste i osłonkowe z przedowulacyjnych pęcherzyków ptasich. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów i poprawia zrozumienie biologii rozrodu drobiu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Milosowi Markisowi (AviServe) za pomoc w hodowli zwierząt, Nicole Guarino (University of Delaware) za pomoc w przygotowaniu manuskryptu, Evelyn Weaver i Ramachandranowi (Uniwersytet Stanowy Pensylwanii) za pomoc w demonstracji procedury i przygotowaniu manuskryptu. Rysunki 2A i 3 zostały stworzone przy użyciu licencji instytucjonalnej sponsorowanej przez Biuro Badawcze Uniwersytetu Delaware BioRender.com przy użyciu tej licencji. Prace te były wspierane przez Laboratorium Patologii Porównawczej UD CANR. KME jest wspierane przez grant USDA NIFA 2023-67011-40333. Praca ta była wspierana przez granty z Fundacji Badawczej Uniwersytetu Delaware (UDRF) oraz programu Delaware INBRE (wspieranego przez grant z National Institute of General Medical Sciences - NIGMS P20 GM103446 z National Institutes of Health i Stanu Delaware) dla AD.

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu zostały utrzymane i poddane eutanazji zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Delaware (IACUC Protocol 110R).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>sterylizacja
	<ol>
		<li>Autoklaw szklanych misek o pojemności 5 uncji za pomocą autoklawowania grawitacyjnego (121 °C przez 20 min) pokrytych folią aluminiową z taśmą autoklawową na górze w celu utrzymania i wskazania sterylności. 
		UWAGA: Na każdy mieszek włosowy, na którym przeprowadzana jest separacja, potrzebna będzie jedna miska.</li>
		<li>Narzędzia preparacyjne w autoklawie za pomocą autoklawowania grawitacyjnego (121 °C przez 20 min), w tym nożyczki, kleszcze zakrzywione i kleszcze proste w woreczkach sterylizacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja obszaru separacji
	<ol>
		<li>Ustaw obszar separacji mieszków włosowych, jak pokazano na Rysunek 4. Napełnij pojemniki do przechowywania lodem tuż przed oddzieleniem mieszków włosowych i uzupełniaj w razie potrzeby przez cały proces oddzielania mieszków włosowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązania
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć do 10x stężenia PBS do 1x materiału roboczego i umieścić w lodówce w temperaturze +4 °C na dzień przed rozbieraniem.</li>
		<li>Rozcieńczyć izopropanol do 70% stężenia roboczego w butelce z rozpylaczem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji dojrzałą płciowo samicę ptaka.
	<ol>
		<li>Wybierz dojrzałą płciowo samicę ptaka (musi obecnie składać jaja) i poddaj się eutanazji16 zatwierdzoną metodą (wytyczne AVMA) zgodnie z instytucjonalnym protokołem opieki i użytkowania, takim jak zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>W celu schwytania największego pęcherzyka F1 należy poddać zwierzę eutanazji w ciągu pierwszych 4 godzin od nadejścia światła w ciągu dnia. Zbadaj palpacyjnie dolną część brzucha przed eutanazją, aby potwierdzić obecność jaja o twardej skorupce w macicy; Gwarantuje to, że złożenie jaj, a tym samym kolejna owulacja jeszcze nie nastąpiła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do jajnika.
	<ol>
		<li>Spryskaj zewnętrzną tuszę i pióra 70% izopropanolem. To tłumi pióra i czyści miejsce nacięcia.</li>
		<li>Używając nożyczek preparacyjnych i dłoni w rękawiczce, uszczypnij i wytnij pojedyncze poziome (poprzeczne) nacięcie linii środkowej o długości około 7,5 cm (3 cale). Uszczypnij warstwy skóry, mięśni i tłuszczu przed nacięciem, aby uniknąć nakłucia narządów.</li>
		<li>Poszerz nacięcie bocznie po prawej stronie ptaka i sonduj palcami w rękawiczce, aby zepchnąć narządy trzewne z drogi nożyczek. Kontynuuj, aż 2-3 żebra zwierzęcia zostaną przecięte po prawej stronie.</li>
		<li>Poszerz nacięcie w kierunku lewej strony ptaka, tak jak zrobiono to po prawej stronie. Postępuj ze szczególną ostrożnością, ponieważ pęcherzyki przedowulacyjne jajnika znajdują się tutaj, wystają z powierzchni jajnika i mogą łatwo pęknąć. Użyj delikatnego nacisku palcami, aby mieszki przedowulacyjne były z dala od nożyczek, ponieważ 2-3 żebra są cięte po lewej stronie ptaka.</li>
		<li>Połóż jedną rękę na dolnej części brzucha ptaka, a drugą mocno na spodniej stronie mostka i ręcznie cofnij pierś ptaka do góry, aby umożliwić dalszy dostęp do jamy celomicznej ptaka.</li>
		<li>Trzymając każde z ud ptaka blisko stawu skokowego, ręcznie popchnij je do tyłu, aby zwichnąć oba stawy biodrowe jednocześnie. Teraz jest pełny dostęp do jajnika zarówno wizualnie, jak i przestrzennie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń mieszki przedowulacyjne.
	<ol>
		<li>Wykonuj wszystkie kroki za pomocą rutynowego wzroku. Jeśli dana osoba ma problemy z wizualizacją na którymkolwiek etapie, użyj mikroskopu preparacyjnego.</li>
		<li>Używając tylko palców w rękawiczkach, delikatnie obejmij każdy widoczny żółty pęcherzyk przedowulacyjny i wyjmij go z jajnika. Podczas ekstrakcji ściskaj łodygę tylko wtedy, gdy pomaga w przecięciu łodygi. Nie ściskaj samego mieszka włosowego, ponieważ może on pęknąć.</li>
		<li>Umieść każdy pęcherzyk w sterylnym pojemniku z lodowatym PBS.</li>
		<li>Mieszki przedowulacyjne pozostawić na lodzie na co najmniej 5 minut, aby umożliwić zastygnięcie żółtka. Ciepłe żółtko będzie przylegać do otaczających warstw komórek mieszkowych, co utrudni wykonanie kolejnych technik separacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Separacja w laboratorium
<ol>
	<li>Pobrać wyizolowany pęcherzyk ze sterylnego pojemnika i umieścić pojemnik z pozostałymi pęcherzykami z powrotem na lodzie. Zbadaj pęcherzyk przed manipulacją, zwracając uwagę na lokalizację trzech cech: łodygi, znamienia i krążka zarodkowego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Rozpocznij od usunięcia błony surowiczej z powierzchni pęcherzyka. Delikatnie przetocz mieszek włosowy na suchy ręcznik papierowy, aby usunąć warstwę surowiczą, delikatnie ją ściągając w razie potrzeby.</li>
	<li>Przytrzymaj mieszek włosowy za łodygę nad miską wypełnioną PBS. Użyj grawitacji, aby zobaczyć, gdzie kończy się łodyga na powierzchni mieszka włosowego i za pomocą nożyczek odetnij tylko łodygę, nie nakłuwając powierzchni mieszków włosowych. Kontynuuj usuwanie błony surowiczej, aż przestanie być widoczna.</li>
	<li>Używając lightboxa do oświetlenia i dysku zarodkowego jako odniesienia, przenieś znamię po przeciwnej stronie i delikatnie przytrzymaj mieszek włosowy z widoczną stroną znamionowania. Trzymaj mieszek włosowy bezpośrednio nad miską lodowatego PBS.</li>
	<li>Podnieś skalpel, delikatnie pokrój wzdłuż znamienia i natychmiast wrzuć mieszek włosowy do PBS, gdy żółtko zacznie wypadać. Nie trzymaj mieszków włosowych mocno, ponieważ spowoduje to wypchnięcie żółtka, zamiast pozwolić mu po prostu wypaść pod wpływem grawitacji.</li>
	<li>Za pomocą prostych, nieząbkowanych kleszczyków tkankowych delikatnie oderwij różową warstwę ściany pęcherzyka od żółtka po jednej stronie plasterka. Zakończ tę ekstrakcję, wykonując małe ruchy szczypiące i ciągnące, które odciągają ścianę mieszków włosowych od żółtka.</li>
	<li>Separacja warstw działa najlepiej, gdy jednorazowo z żółtka odsuwa się około 5 mm tkanki ściany mieszków włosowych. Gdy 5-milimetrowy odcinek ściany pęcherzyka zostanie pomyślnie wycofany z żółtka, użyj kleszczyków kątowych w połączeniu z kleszczami prostymi, aby sondować wzdłuż otoczki mieszków włosowych.</li>
	<li>W niektórych przypadkach warstwa ziarnista może być ściślej związana z żółtkiem niż z warstwą osłonki. W takiej sytuacji po prostu bardzo delikatnie przetrzyj powierzchnię żółtka za pomocą dowolnej pary kleszczy, aby spróbować odciągnąć warstwę przypominającą bibułę od żółtka. Po zlokalizowaniu warstwy granulozy przyciśnij ją mocno do warstwy osłonki i kontynuuj odciąganie obu warstw od żółtka, jak opisano wcześniej.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie zepchnąć żółtko z uszczypniętych warstw. Zmieść lub usuń nadmiar żółtka z miski. Nie zeskrobuj warstwy ziarnistej; Spowoduje to rozdarcie. Energiczne ruchy zaciemnią rozwiązanie PBS i ograniczą wizualizację. Postępuj ostrożnymi i przemyślanymi ruchami.</li>
	<li>Po cofnięciu każdego 5-10 mm odcinka ściany pęcherzyka należy zrobić przerwę, aby pobrać warstwy osłonki i ziarnistości w każdym zestawie kleszczy i upewnić się, że obie warstwy są stopniowo odrywane od siebie, tak jak obie są odrywane od żółtka. Kontynuuj ten proces na zewnątrz mieszka włosowego. Jeśli manipulacja staje się trudna ze względu na płat warstwy ziarnisto-osłonkowej, obróć mieszek włosowy, aby rozpocząć proces z drugiej strony plastra.</li>
	<li>Podczas procesu separacji napotkany zostanie dysk zarodkowy (żeńska gameta i pęcherzyk zarodkowy). Jest to obszar, który jest niezwykle przylegający zarówno do warstwy ziarnistej, jak i żółtka. Ostrożnie podejdź do krążka rozrodczego, używając prostych kleszczy, aby mocno przytrzymać warstwę ziarnistości do warstwy osłonki, ponieważ zakrzywione kleszcze są używane lekkimi ruchami szczotkowania, aby odepchnąć krążek rozrodczy od komórek ziarnistych na powierzchnię żółtka.
	<ol>
		<li>Jeśli krążek rozrodczy jest pożądany jako próbka badawcza, zetrzyj żółtko w tym miejscu za pomocą ustawionych pod kątem kleszczy i przechowuj według uznania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj oddzielanie żółtka od ściany pęcherzyka za pomocą zakrzywionych kleszczyków, aż cała kula mieszka włosowego zostanie usunięta.</li>
	<li>Gdy pozostała część żółtka zostanie zepchnięta z warstw, oddziel ostatnią część warstwy granulozy od warstwy osłonki. Całkowicie oddzielona warstwa ziarnistości może nie być całkowicie pozbawiona żółtka, ale upewnij się, że nie jest nim pokryta. Warstwę granulatu i warstwę kalkulacyjną umieścić w oddzielnych pojemnikach o temperaturze PBS o temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Gdy warstwa granulozy znajdzie się w oddzielnym pojemniku od warstwy osłonki, delikatnie mieszaj warstwę ziarnistości tam iz powrotem w PBS za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że wszelkie pozostałe resztki warstwy ziarnistej odklejają się. 
		UWAGA: Niektóre metody przetwarzania po oddzieleniu mogą uwzględniać usuwanie resztek lipidów przez trawienie lub wirowanie, w zależności od pożądanego badania.</li>
		<li>Kiedy po raz pierwszy ćwiczysz tę technikę, przygotuj i przeanalizuj histologicznie reprezentatywne oddzielone próbki, aby potwierdzić dokładne rozdzielenie warstw i pobranie.
		<ol>
			<li>Aby to zrobić, utrwal fragmenty oddzielonych tkanek w neutralnej buforowanej formalinie za pomocą kaset z siatkową tkanką lub gąbek, aby zapobiec utracie próbki, a następnie zatapiać parafinę, ciąć i barwić skrawek hematoksyliną i eozyną (H&E).</li>
			<li>Ze względu na delikatną naturę, należy ostrożnie obchodzić się z warstwą ziarnistości i umieszczać ją na gąbkach biopsyjnych w kasecie histologicznej, aby upewnić się, że warstwa komórkowa pozostaje nienaruszona.</li>
			<li>Umieść warstwę osłonki bezpośrednio w kasecie histologicznej. Umożliwi to również wizualizację poziomu zanieczyszczenia próbki inną tkanką pęcherzykową (tj. próbką warstwy komórek ziarnistych z przylegającym białkiem żółtka lub komórkami tekalnymi). 
			UWAGA: Nie zawsze możliwe jest uzyskanie tylko jednej warstwy zainteresowania ze względu na ścisłe powiązanie tkanek mieszkowych. Jednak wiedza na temat poziomu możliwego zanieczyszczenia może stanowić podstawę do interpretacji kolejnych podejść multiomicznych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Separation of Hen Ovarian Follicle Layers for Reproductive Research Applications

<ol><li>Finter, N. B., Liu, O. C., Henle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+host-virus+interactions+in+the+chick+embryo-influenza+virus+system.+X.+An+experimental+analysis+of+the+von+Magnus+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on host-virus interactions in the chick embryo-influenza virus system. X. An experimental analysis of the von Magnus phenomenon.</a> J Exp Med. 101 (5), 461-478 (1955).</li>
<li>Fredrickson, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tumors+of+the+hen%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Ovarian tumors of the hen.</a> Environ Health Perspect. 73, 35-51 (1987).</li>
<li>Etches, R. J., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reptilian+and+avian+follicular+hierarchies%3A+models+for+the+study+of+ovarian+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+Suppl%22%5BJournal%5D)">Reptilian and avian follicular hierarchies: models for the study of ovarian development.</a> J Exp Zool Suppl. 4, 112-122 (1990).</li>
<li>McCarrey, J. R., Abbott, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+genetic+sex+determination%2C+gonadal+sex+differentiation%2C+and+germ-cell+development+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of genetic sex determination, gonadal sex differentiation, and germ-cell development in animals.</a> Adv Genet. 20, 217-290 (1979).</li>
<li>Tilly, J. L., Kowalski, K. I., Johnson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+of+ovarian+follicular+development+associated+with+the+initiation+of+steroidogenic+competence+in+avian+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stage of ovarian follicular development associated with the initiation of steroidogenic competence in avian granulosa cells.</a> Biol Reprod. 44 (2), 305-314 (1991).</li>
<li>Gilbert, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+ovarian+follicle+of+the+domestic+hen%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol+Cogn+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Innervation of the ovarian follicle of the domestic hen.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 50 (4), 437-445 (1965).</li>
<li>Johnson, P. A., Stoklosowa, S., Bahr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+granulosa+and+theca+layers+in+the+control+of+progesterone+secretion+in+the+domestic+hen%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interaction of granulosa and theca layers in the control of progesterone secretion in the domestic hen.</a> Biol Reprod. 37 (5), 1149-1155 (1987).</li>
<li>Apperson, K. D., Bird, K. E., Cherian, G., Lohr, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+the+ovary+of+the+laying+hen+%28Gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Histology of the ovary of the laying hen (Gallus domesticus).</a> Vet Sci. 4 (4), 66(2017).</li>
<li>Johnson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicle+selection+and+granulosa+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicle selection and granulosa cell differentiation.</a> Poult Sci. 94 (4), 781-785 (2015).</li>
<li>Kim, D., Johnson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+granulosa+layer+from+hen+prehierarchal+follicles+associated+with+follicle-stimulating+hormone+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the granulosa layer from hen prehierarchal follicles associated with follicle-stimulating hormone receptor signaling.</a> Mol Reprod Dev. 85 (8-9), 729-737 (2018).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exogenous+energy+on+synthesis+of+steroid+hormones+and+expression+characteristics+of+the+CREB%2FStAR+signaling+pathway+in+theca+cells+of+laying+hen%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of exogenous energy on synthesis of steroid hormones and expression characteristics of the CREB/StAR signaling pathway in theca cells of laying hen.</a> Poult Sci. 103 (3), 103414(2024).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+among+different+species+reveals+that+the+androgen+receptor+regulates+chicken+follicle+selection+through+species-specific+genes+related+to+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis among different species reveals that the androgen receptor regulates chicken follicle selection through species-specific genes related to follicle development.</a> Front Genet. 12, 752976(2021).</li>
<li>Tilly, J. L., Johnson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+androstenedione+production+by+adenosine+3%27%2C5%27-monophosphate+and+phorbol+myristate+acetate+in+ovarian+thecal+cells+of+the+domestic+hen%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of androstenedione production by adenosine 3',5'-monophosphate and phorbol myristate acetate in ovarian thecal cells of the domestic hen.</a> Endocrinology. 125 (3), 1691-1699 (1989).</li>
<li>Young, J. M., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theca%3A+the+forgotten+cell+of+the+ovarian+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle.</a> Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).</li>
<li>Gilbert, A. B., Evans, A. J., Perry, M. M., Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+separating+the+granulosa+cells%2C+the+basal+lamina+and+the+theca+of+the+preovulatory+ovarian+follicle+of+the+domestic+fowl+%28Gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">A method for separating the granulosa cells, the basal lamina and the theca of the preovulatory ovarian follicle of the domestic fowl (Gallus domesticus).</a> J Reprod Fertil. 50 (1), 179-181 (1977).</li>
<li>AVMA Panel on Euthanasia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%3A+2020+edition%22">AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition</a>. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL. (2020).</li>
<li>Mori, M., Kohmoto, K., Shoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+granulosa+and+theca+cells+on+in+vitro+progesterone+production+in+preovulatory+follicles+of+the+Japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of granulosa and theca cells on in vitro progesterone production in preovulatory follicles of the Japanese quail.</a> Japan Poult Sci. 21 (4), 206-214 (1984).</li>
<li>Porter, T. E., Hargis, B. M., Silsby, J. L., El Halawani, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dissimilar+steroid+productions+by+granulosa%2C+theca+interna+and+theca+externa+cells+during+follicular+maturation+in+the+turkey+%28Meleagris+gallopavo%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of dissimilar steroid productions by granulosa, theca interna and theca externa cells during follicular maturation in the turkey (Meleagris gallopavo).</a> Gen Comp Endocrinol. 84 (1), 1-8 (1991).</li>
<li>Bahr, J. M., Wang, S. C., Huang, M. Y., Calvo, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+concentrations+in+isolated+theca+and+granulosa+layers+of+preovulatory+follicles+during+the+ovulatory+cycle+of+the+domestic+hen%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Steroid concentrations in isolated theca and granulosa layers of preovulatory follicles during the ovulatory cycle of the domestic hen.</a> Biol Reprod. 29 (2), 326-334 (1983).</li>
<li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking+of+fresh+frozen+tissue%3A+RNA+is+stable+in+nonfixed+surgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens.</a> Lab Invest. 86 (2), 202-211 (2006).</li>
<li>Madisen, L., Hoar, D. I., Holroyd, C. D., Crisp, M., Hodes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+banking%3A+the+effects+of+storage+of+blood+and+isolated+DNA+on+the+integrity+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA banking: the effects of storage of blood and isolated DNA on the integrity of DNA.</a> Am J Med Genet. 27 (2), 379-390 (1987).</li>
<li>Yang, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+characteristics+of+follicles+and+reproductive+hormone+secretion+during+ovarian+follicle+development+in+laying+geese%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Histological characteristics of follicles and reproductive hormone secretion during ovarian follicle development in laying geese.</a> Poult Sci. 98 (11), 6063-6070 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analyses+during+formation+of+chicken+egg+yolk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analyses during formation of chicken egg yolk.</a> Food Chem. 374, 131828(2022).</li>
<li>Vanmontfort, D., Rombauts, L., Decuypere, E., Verhoeven, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+of+immunoreactive+inhibin+in+the+chicken+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Source of immunoreactive inhibin in the chicken ovary.</a> Biol Reprod. 47 (6), 977-983 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów, które mogliby zgłaszać.

W niniejszym badaniu przedstawiono procedurę wyraźnego oddzielenia zarówno ziarnistych, jak i komórek osłonowych od pęcherzyków przedowulacyjnych u drobiu. W przeciwieństwie do istniejącej metody ustanowionej przez Gilberta i wsp. w 1977 r., adaptacje dokonane w tej metodzie pozwalają na bardziej kontrolowane środowisko podczas ręcznego oddzielania warstwy komórek ziarnistych od warstwy osłonki od wszystkich pęcherzyków przedowulacyjnych15. Co więcej, umożliwia naukowcom wizualizację warstwy komór...

Kury produkujące jaja są kluczowym elementem światowego łańcucha dostaw żywności i są rozwijającym się modelem zwierzęcym do badań nad płodnością i rakiem jajników. Kurczak ma długą historię stosowania w laboratoriach, od badań in ovo szczepionek przeciw grypie1 do badań nad wzrostem guzów nowotworowych2, i jest kluczowym zwierzęciem dla wglądu w rozwój gonad3,4,5. Zrozumienie roli układu rozrodczego kur, a w szczególności cyklicznego charakteru rozwoju pęcherzyków jajnikowych i typów zaangażowanych komórek, jest obszarem dużego zainteresowania i potencjalnego zastosowania. Multiomiczne podejścia do badania jajnika kury mają zastosowanie w zwiększaniu plonów rolnych poprzez analizę produktywności i wyjaśnianie czynników wpływających na zdrowie człowieka za pomocą kury jako modelu choroby reprodukcyjnej.
Ptasi jajnik ma bardzo wyraźne rozwojowe stadia pęcherzykowe składające się z (1) małych pierwotnych i pierwotnych pęcherzyków (>1 mm), (2) pęcherzyków przedrekrutacyjnych o różnej wielkości (od białych do bladożółtych, 2-8 mm) i (3) dużych, wypełnionych żółtkiem pęcherzyków przedowulacyjnych (żółtych) (Rysunek 1)5,6,7. Dojrzały płciowo jajnik ptaka składa się z zewnętrznej kory, w której znajdują się pęcherzyki jajnikowe i wewnętrznego rdzenia składającego się z mięśni gładkich, nerwów i naczyń krwionośnych8. Cały cykl rozwoju pęcherzyków włosowych odbywa się w korze mózgowej. Jednak dopiero w wieku około pięciu miesięcy tylko lewy jajnik wykazuje pełną hierarchię rozwojową pęcherzyków przedowulacyjnych (tj. żółtych), a kura przejdzie pierwszą owulację i składanie jaj (składanie jaj). Pęcherzyki przedowulacyjne tworzą rażąco widoczną hierarchię około 5 do 6 pęcherzyków, które wahają się od największego i obok owulacji - pęcherzyka F1 - do mniej rozwiniętego, najmniejszego pęcherzyka - F5 lub F6. Pęcherzyki przedowulacyjne są łatwe do odróżnienia od mniejszych pęcherzyków przedrekrutacyjnych ze względu na ich większy rozmiar, rozległe unerwienie i ciemnożółte żółtko.
Wszystkie pęcherzyki zawierają wyspecjalizowane typy komórek, które pełnią różne role w sygnalizacji, wzroście i rozwoju pęcherzyka, gdy przechodzi on przez różne etapy przed owulacją - są to komórki ziarniste, komórki osłonki i oocyty (gamety żeńskie) (<klasa silna="xfig">Rysunek 2A). W szczególności warstwy komórek ziarnistych tworzą wewnętrzną ścianę pęcherzyka, a komórki osłonki tworzą drugą ścianę otaczającą oocyt. W miarę jak pęcherzyk przechodzi przez hierarchię przedowulacyjną, warstwy komórek osłonki i ziarnistości zaczynają się przerzedzać, szczególnie wzdłuż punktu bezpośrednio naprzeciwko łodygi pęcherzyka przedowulacyjnego. Łodyga jest punktem przyczepienia pęcherzyka do jajnika (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2B). Ta linia warstw ziarnistości i osłonki naprzeciwko łodygi nazywana jest znamieniem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Całkowicie pozbawiony jest unaczynienia i będzie punktem pęknięcia pęcherzyka podczas owulacji pęcherzyka F1. Widoczny jest również krążek rozrodczy, czyli puszysta biała warstwa komórek podporowych, które otaczają oocyt (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2B).
Zarówno komórki ziarniste, jak i osłonki są kluczowymi składnikami rozwoju pęcherzyków, ponieważ otaczają i wspierają oocyt poprzez złożoną sygnalizację hormonalną. Warstwa komórkowa ziarnistości wspiera szlaki steroidogenne poprzez cykliczną sygnalizację AMP (cAMP) w celu wywołania produkcji progesteronu9,10,11. Z drugiej strony komórki osłonki czasowo wytwarzają estradiol, który jest znacznie inny niż u ssaków, których komórki osłonki wytwarzają androgen i progesteron12,13,14. W połączeniu z sygnalizacją zewnętrzną, komórki ziarnistości i osłonki są kluczowymi czynnikami wpływającymi na dojrzewanie pęcherzyków i składanie jaj. Technika oddzielania warstw ziarnistości i osłonki została po raz pierwszy opisana przez Gilberta i in. w 197715. Osiągnięcie kompleksowego oddzielenia warstw ziarnistości i osłonki oraz zapewnienie, że nie pozostanie żaden materiał ziarnisty, może stwarzać trudności w przypadku metody Gilberta. Co więcej, brak jasnego wizualnego przewodnika do zakończenia separacji może sprawić, że zadanie będzie trudne do wykonania. Badanie to ma na celu opisanie ekstrakcji i oddzielenia warstw ziarnistych, osłonek i oocytów od pęcherzyków przedowulacyjnych, oferując adaptacje i zapewniając wyraźną reprezentację wizualną za pomocą zarówno obrazów, jak i filmów (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Wizualizacja tej techniki pozwoli naukowcom badającym pęcherzyki jajnikowe ptaków na powtarzalne wychwytywanie warstw ziarnistych i osłonek zarówno w rolnictwie, jak i biomedycynie.

<table><tbody><tr><td>3,5 cala Małe szklane miski, 5 uncji</td><td>Amazon</td><td>B0BXP5PJTN</td><td>Szklane miski do sterylizacji w autoklawie o średnicy co najmniej 3,5 cala</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Costco</td><td>720</td><td>Cover Miski autoklawu</td></tr> Amazon <tr><td>Pet Training Pads, regularne, 100-Count</td><td>Amazon</td><td>B0B58WTPFS</td><td>Do stosowania jako podkładki nekrospyjne sprawdzi się każda podkładka chłonna</td></tr><tr><td>Taśma autoklawu</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacze światłowodowe LED Cole-Parmer</td><td></td><td>EW-41723-02</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione bardzo cienkie precyzyjne kleszcze końcówkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-123</td><td>Nieząbkowany</td></tr><tr><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Leica&nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne nożyczki</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-155</td><td>Nieząbkowane</td></tr><tr><td>pojemniki na żywność z pokrywką Zestaw 17 przezroczystych / zielonych zamrażarek mikrofalowych Można myć w zmywarce</td><td>Amazon</td><td>B09QGZCRDB</td><td>Użyj dowolnego pojemnika, który może pomieścić lód ORAZ małą szklaną miskę o średnicy 3,5 cala</td></tr><tr><td>Precyzja 45 stopni, zakrzywiona, stożkowa, bardzo delikatna pęseta punktowa / kleszcze</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-125</td><td>Bez ząbków</td></tr><tr><td>Wysoka precyzja Prosta, bardzo drobna pęseta punktowa</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-120</td><td>Izopropanol nieząbkowany</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>A426P-4</td><td></td></tr><tr><td>McKesson Pojemnik na próbki, sterylny, zakrętka, szczelny, 120 ml</td><td>McKesson</td><td>16-9526</td><td>4 uncje / 120 cc, sól</td></tr><tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanami z podziałką (PBS, 10x), pH 7,6</td><td>ThermoFisher</td><td>J62692. K7</td><td>będzie musiał zostać przerobiony na 1x</td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem</td> PBS <td>Cole-Parmer</td><td>EW-06091-01</td> Do sterylnych ostrzy chirurgicznych <td>z 70% izopropanolu</td></tr><tr><td>#22</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>122</td><td></td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji 10 "x 16"</td> <td>Amazon</td><td>B07MFB455C</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe kleszcze z ultracienką końcówką Fisherbrand&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do biopsji z pianki nieząbkowanej, prostokątne</td><td>Fisherbrand</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, 10% (histologiczny)</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do przetwarzania/zatapiania tkanek z pokrywką</td><td>Simport M490-2</td><td>Z672122</td><td></td></tr></tbody></table>

oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Separation of Avian Preovulatory Follicle Granulosa and Theca Cell Layers for Downstream Applications

Kury nioski (kury znoszące) i hodowcy brojlerów (stado hodowlane dla kurcząt produkujących mięso) są kluczowe dla światowego zaopatrzenia w żywność jako niezawodne źródło białka. Są one również wyłaniającym się modelem zwierzęcym do badań nad chorobami rozrodczymi człowieka. Wraz z rozwojem badań nad drobiem, zdrowie i funkcja jajnika hodowcy kur niosek i brojlerów będzie ważnym punktem badań zarówno dla badaczy rolnych, jak i biomedycznych. Jednym z wyzwań związanych z tym rosnącym zainteresowaniem jest potrzeba powtarzalnych technik, które wszyscy badacze mogą zastosować w pobieraniu próbek jajników. W szczególności należy ustanowić szczegółowy proces wizualny w celu określenia prawidłowego oddzielenia wyspecjalizowanych warstw komórek ziarnistości i osłonki od pęcherzyków kurzych, aby osiągnąć zgodność i spójność między badaczami. 
To badanie opisuje ekstrakcję pęcherzyków przedowulacyjnych i tkanki jajnikowej u białych kur leghorn w najlepszym wieku rozrodczym. Oddzielenie tych pęcherzyków odbywa się w zimnych, płynnych warunkach, aby zastygnąć żółtko w celu łatwiejszej manipulacji i zapobieżenia rozrywaniu warstw komórkowych przez własny ciężar pęcherzyka podczas procesu separacji. Po zakończeniu separacji pożądane warstwy komórkowe mogą być dalej trawione w celu uzyskania metod hodowli tkankowej lub mogą być kriokonserwowane w celu analiz genomowych i proteomicznych.

Niniejszy protokół umożliwia oddzielenie warstw komórek granulosa i tekalnych z pęcherzyka jajnikowego (Rysunek 5 oraz Rysunek 6). Warstwy te mogą następnie zostać przygotowane do badania histologicznego w celu potwierdzenia poprawnego rozdzielenia. Obrazy histologiczne te, przeanalizowane i wykonane przez certyfikowanego patologa weterynaryjnego (EMB), wyraźnie wykazują skuteczne oddzielenie warstw granulosa i teka dla pęcherzyków przedowulacyjnych F1 i F5 (<st...

Tutaj opisujemy protokół separacji żółtka, komórek ziarnistych i komórek osłonki w ptasich pęcherzykach przedowulacyjnych. Ta precyzyjna obsługa umożliwia krytyczne badania nad rolą tych warstw w funkcjach rozrodczych, pomagając w zrozumieniu rozwoju pęcherzyków włosowych, regulacji hormonalnej i badań nad chorobami w celu zwiększenia plonów rolnych i wglądu biomedycznego.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Layer hens (egg-laying chickens) and broiler breeders (breeding stock for meat-producing chickens) are crucial to the world's food supply as a reliable ...

Staramy się zrozumieć wyspecjalizowane komórki ziarniste i osłonkowe jajnika Langhanda. Badamy różnicową ekspresję genów między dwoma typami komórek w różnych momentach owulacji. Dostarcza to informacji na temat wydajności reprodukcyjnej i płodności, które zostaną wykorzystane do zrównoważonego zwiększenia produkcji jaj.Biologia rozrodu drobiu jest obecnie badana przy użyciu technologii sekwencjonowania nowej generacji i testów metabolicznych. Ma to na celu zbadanie zarówno tkanek rozrodczych, jak i wzajemnych oddziaływań hormonalnych związanych z dojrzałością płciową i owulacją. Warstwa komórkowa Granulosa nie zawsze może odchodzić jako nienaruszony arkusz.Od pacjentów w praktyce wymaga się zapewnienia większego prawdopodobieństwa sukcesu. Dodatkowym problemem jest dodatkowe żółtko pozostające na warstwie ziarnistej. Dłuższy czas inkubacji w zimnych PBS może złagodzić ten problem.W przeciwnym razie może być wymagane oczyszczanie podrzędne. Technika ta pozwoli na standaryzację wśród biologów zajmujących się rozrodem ptaków. Wraz z rozwojem technologii sekwencjonowania, wyjaśnienie ról wyspecjalizowanych komórek w narządach staje się coraz bardziej dostępne.W związku z tym wizualiza

separation-avian-preovulatory-follicle-granulosa-theca-cell-layers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł opisuje prostą metodę izolowania zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywitelinowych jaj kurzych przy jednoczesnej minimalizacji zmian strukturalnych i optymalizacji solubilizacji białek w każdej podwarstwie do analiz proteomicznych.

Mechaniczna separacja i solubilizacja białek zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywiteliny z jaj kurzych

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji i oczyszczania komórek jajnika z pęcherzyków antralnych. Omawiamy metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych, a także zbierania nienaruszonych pęcherzyków antralnych, które są traktowane enzymatycznie w celu uwolnienia wielu typów komórek rezydujących w pęcherzykach, w tym ziarnistości, osłonki, śródbłonka, komórek krwiotwórczych i zrębowych.

Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

W artykule przedstawiono model kohodowli komórek osłonki bydlęcej i komórek ziarnistych. Metoda ta może potencjalnie służyć jako wiarygodna podstawa do analiz skoncentrowanych na badaniu komunikacji parakrynnej i transportu substratu między komórkami somatycznymi w obrębie pęcherzyka.

Zmodyfikowany system kohodowli w celu zrozumienia interakcji komórek ziarnisto-osłonkowych w jajniku bydła

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

W tym filmie zaprezentujemy pomiar i obliczanie bezwzględnej wydajności kwantowej oraz współrzędnych chromatyczności bezpośrednio w próbkach proszkowych, z wykorzystaniem systemu pomiaru wydajności kwantowej Hitachi F-7000.

Pomiar absolutnej wydajności kwantowej próbek w proszku

Opisano podstawowy protokół rozdzielania fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Naucz się izolować komórki ziarniste i osłonkowe z przedowulacyjnych pęcherzyków ptasich. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów i poprawia zrozumienie biologii rozrodu drobiu.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Przeglądaj więcej filmów