Name: Wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania CUT and RUN (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Naucz się analizy danych CUT&RUN w bioinformatyce. Ten protokół prowadzi początkujących przez walidację sekwencjonowania i pozwala zrozumieć mechanizmy regulacji chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie ilustrowane postacie zostały stworzone za pomocą BioRender.com. CAI dziękuje za wsparcie udzielone poprzez nagrodę Ovarian Cancer Research Alliance Early Career Investigator Award, grant akceleracyjny Fundacji Forbeck oraz nagrodę Minnestoa Ovarian Cancer Alliance National Early Detection Research Award.

Beginner-Friendly Single-Language Pipeline for CUT&RUN Data Analysis

<ol><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Curr Protoc Mol Biol. 126 (1), e85(2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChiP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChiP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Xu, S., Grullon, S., Ge, K., Peng, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+S+%22Stem+cell+transcriptional+networks%3A+Methods+and+Protocols%22">Stem cell transcriptional networks: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York, NY. (2014).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+sparse+enrichment+analysis+for+cut%26run+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by sparse enrichment analysis for cut&run chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+Tool+for+the+unification+of+biology.+The+gene+ontology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: Tool for the unification of biology. The gene ontology consortium.</a> Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).</li>
<li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+ontology+%28GO%29+database+and+informatics+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The gene ontology (GO) database and informatics resource.</a> Nucleic Acids Res. 32 (Database issue), D258-D261 (2004).</li>
<li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+ontology+resource%3A+20+years+and+still+going+strong%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The gene ontology resource: 20 years and still going strong.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D330-D338 (2019).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast2go%3A+A+universal+tool+for+annotation%2C+visualization+and+analysis+in+functional+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Blast2go: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).</li>
<li>Carbon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AmiGO%3A+Online+access+to+ontology+and+annotation+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AmiGO: Online access to ontology and annotation data.</a> Bioinformatics. 25 (2), 288-289 (2009).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gorilla%3A+A+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+go+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Gorilla: A tool for discovery and visualization of enriched go terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Huang Da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+Paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Huang Da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+david+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using david bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Ge, S. X., Jung, D., Yao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShinyGO%3A+A+graphical+gene-set+enrichment+tool+for+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ShinyGO: A graphical gene-set enrichment tool for animals and plants.</a> Bioinformatics. 36 (8), 2628-2629 (2020).</li>
<li>Tang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRplot%3A+A+free+online+platform+for+data+visualization+and+graphing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SRplot: A free online platform for data visualization and graphing.</a> PLoS One. 18 (11), e0294236(2023).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deeptools2%3A+A+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deeptools2: A next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+genome+browser+at+ucsc%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The human genome browser at ucsc.</a> Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).</li>
<li>Yu, F., Sankaran, V. G., Yuan, G. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26RUNTools+2.0%3A+A+pipeline+for+single-cell+and+bulk-level+CUT%26RUN+and+CUT%26Tag+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CUT&RUNTools 2.0: A pipeline for single-cell and bulk-level CUT&RUN and CUT&Tag data analysis.</a> Bioinformatics. 38 (1), 252-254 (2021).</li>
<li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26RUNTools%3A+A+flexible+pipeline+for+CUT%26RUN+processing+and+footprint+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CUT&RUNTools: A flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biol. 20 (1), 192(2019).</li>
<li>Chris Cheshire, C. -W., et al. Nf-core/cutandrun: Nf-core/cutandrun v3.2.2 iridium ibis. , At
 <a target="_blank" href="https://github.com/nf-core/cutandrun/tree/3.2.2">https://github.com/nf-core/cutandrun/tree/3.2.2</a> (2024).</li>
<li>Kong, N. R., Chai, L., Tenen, D. G., Bassal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+CUT%26RUN+protocol+and+analysis+pipeline+to+identify+transcription+factor+binding+sites+in+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A modified CUT&RUN protocol and analysis pipeline to identify transcription factor binding sites in human cell lines.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100750(2021).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, e46314(2019).</li>
<li>Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encode+blacklist%3A+Identification+of+problematic+regions+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The encode blacklist: Identification of problematic regions of the genome.</a> Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).</li>
<li>Deberardine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRgenomics+for+analyzing+high-resolution+genomics+data+in+R%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BRgenomics for analyzing high-resolution genomics data in R.</a> Bioinformatics. 39 (6), btad331(2023).</li>
<li>Deberardine, M., Booth, G. T., Versluis, P. P., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nelf+pausing+checkpoint+mediates+the+functional+divergence+of+cdk9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The nelf pausing checkpoint mediates the functional divergence of cdk9.</a> Nat Commun. 14 (1), 2762(2023).</li>
<li>Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , At
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Krueger, F., James, F. O., Ewels, P. A., Afyounian, E., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrueger%2C+F+%22FelixKrueger%2FTrimGalore%3A+v0.6.7+-+DOI+via+Zenodo%22">FelixKrueger/TrimGalore: v0.6.7 - DOI via Zenodo</a>. , (2021).</li>
<li>Mcgaughey, D. Easy bam downsampling. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://davemcg.github.io/post/easy-bam-downsampling/">https://davemcg.github.io/post/easy-bam-downsampling/</a> (2018).</li>
<li>Positionbaseddownsamplesam (picard). , GATK Team. At
 <a target="_blank" href="https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360041850311-PositionBasedDownsampleSam-Picard">https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360041850311-PositionBasedDownsampleSam-Picard</a> (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak ujawnień.

Zdolność do mapowania zajętości białek na chromatynie ma fundamentalne znaczenie dla prowadzenia badań mechanistycznych w dziedzinie biologii chromatyny. W miarę jak laboratoria przyjmują nowe techniki mokrego laboratorium do profilowania chromatyny, możliwość analizowania danych sekwencjonowania z tych eksperymentów w mokrych laboratoriach staje się częstym wąskim gardłem dla naukowców pracujących w mokrych laboratoriach. W związku z tym opisujemy wstępny protokół krok po kroku, aby umożliwić początkującym bioinformatykom pokonanie wąskiego gardła w analizie oraz zainicjowanie analizy i kontroli jakości własnych danych sekwencjonowania CUT&RUN. 
Ten protokół analizy CUT&RUN opisuje zastosowanie kilku kroków w celu zapewnienia ilościowego określenia sygnałów w dobrej wierze. Usunięcie odczytów o niskiej jakości i sekwencji adapterów z surowych danych odczytu jest jednym z pierwszych kroków kontroli jakości i jednym z najważniejszych kroków w celu uzyskania dokładnych wyników analizy. W związku z tym ten proces analizy obejmuje łatwe do zastosowania kroki przycinania jakości i adaptera za pomocą programu Trim-galore27. Ze względu na znaczenie tego procesu, ten potok analizy obejmuje etapy porównywania jakości wyników przed (krok 4.3) i po (krok 5.3) procesie przycinania (krok 5.5). Oprócz jakości i przycinania adapterów, ten potok analizy usuwa również niekanoniczne odczyty chromosomów, regiony powtórzeń TA i regiony z czarnej listy, które mogą wprowadzać stronniczość zawartości GC i fałszywie dodatnie skoki/zwane szczyty. Te etapy filtracji stanowią odpowiedni wstęp dla początkujących bioinformatyków, aby zrozumieć krytyczne etapy kontroli jakości w analizie danych CUT&RUN.
Po etapie filtracji ten potok analizy CUT&RUN zapewnia dwie opcje normalizacji: "skalowana liczba odczytów ułamkowych (SFRC)22" i "Znormalizowane odczyty na milion zmapowane odczyty w kontroli ujemnej (SRPMC)24,25 w celu utworzenia plików wejściowych do dalszego wywoływania i wizualizacji szczytów. Jeśli oczekuje się, że zestaw danych CUT&RUN ujawni tylko lokalne różnice bez różnic w sygnałach całego genomu między próbkami, skalowana ułamkowa liczba odczytów (ułamek zliczeń pomnożony przez rozmiar referencyjnego krasnala) może wystarczyć do dalszej analizy. Jeśli jednak istnieje możliwość, że między próbkami CUT&RUN wystąpią różnice w sygnale w skali globalnej, użytkownicy mogą wybrać metodę SRPMC, która uwzględnia stosunek odczytów między impulsem a próbką (zarówno eksperymentalne CUT&RUN, jak i próbki kontroli ujemnej) wraz z normalizacją odczytów na milion (RPM) dla odczytów kontroli ujemnej, aby odczyty kontroli ujemnej były porównywalne między różnymi próbkami. Ponieważ SRPMC zapewnia znormalizowane odczyty względem znormalizowanych odczytów kontroli ujemnej, takie podejście minimalizuje sygnał kontroli ujemnej, umożliwiając porównanie zestawów danych utworzonych w różnych partiach i grupach.
Ważnym czynnikiem w wywoływaniu pików próbek CUT&RUN jest eliminacja fałszywie dodatnich pików CUT&RUN podczas analizy in silico , częściowo poprzez włączenie próbek IgG. W szczególności ten potok analizy zapewnia podejścia do wywoływania szczytów dla różnych wywołujących szczyt w celu odrzucenia wyników fałszywie dodatnich CUT&RUN nazywanych szczytami. W przypadku szczytowych wywołujących MACS2/3 nasz potok analizy stosuje próbne odczyty IgG jako próbkę wejściową podczas szczytowego wywołania. W przypadku SEACR w tym procesie analizy zaleca się najpierw niezależne wywołanie pików dla próbek eksperymentalnych i próbek kontroli ujemnej, a następnie usunięcie pików, które nakładają się na próbki eksperymentalne i próbki kontroli ujemnej, ponieważ SEACR może "stracić" większość pików, jeśli zostanie im zapewniona kontrola ujemna podczas wywoływania pików próbek eksperymentalnych. Wyselekcjonowane piki wykazują porównywalne podobieństwo między różnymi szczytowymi rozmówcami i powtórzeniami (Rysunek 5). Ogólnie rzecz biorąc, usunięcie niskiej jakości, niekanonicznych chromosomów, regionu czarnej listy i odczytów powtórzeń TA, przycinanie sekwencji adapterów, normalizacja DNA o skokowym wzroście i właściwa obsługa kontroli negatywnej podczas szczytowych etapów wywoływania zapewnia użytkownikom odpowiednie pliki odczytów, które są odpowiednie do dalszych analiz. Dzięki wysokiej jakości znormalizowanym plikom odczytu i wyselekcjonowanym zwanym szczytami, użytkownicy mogą przystąpić do porównywania podobieństwa między replikacjami oraz tworzyć mapy cieplne i metawykresy z ultraczystym sygnałem tła, aby zweryfikować efektywne wywołanie szczytu.
Wywoływanie szczytów z wysokiej jakości odczytami oznacza rozpoczęcie wyciągania interpretacji biologicznych na podstawie danych CUT&RUN. Protokół ten opisuje uzyskiwanie skoncentrowanych sygnałów szczytowych na mapach cieplnych i metawykresach poprzez wyznaczenie najwyższych lub najbardziej statystycznie istotnych lokalizacji sygnału jako środków pików. Niektóre podejścia do wywołania szczytowego nie wybierają najwyższych sygnałów ani najbardziej istotnych statystycznie sygnałów w ich centralnej lokalizacji. W związku z tym ponowne zdefiniowanie środka każdego piku jako najwyższego sygnału lub najbardziej statystycznie istotnej lokalizacji sygnału służy jako ważny krok do tworzenia wizualnych danych wyjściowych z dobrze skoncentrowanymi sygnałami w środku wykresów. Pliki łóżka oryginalnych nazywanych pików są zachowywane w celu przeprowadzenia adnotacji pików i analizy istotności funkcjonalnej jako kolejne kroki po zakończeniu kroków opisanych w tym protokole.
Chociaż ten potok analizy CUT&RUN zawiera kroki opisujące instalację wymaganych programów, początkujący bioinformatycy mogą napotkać trudności w instalacji narzędzi analitycznych. W związku z tym utworzono powiązaną stronę problemu z Github, aby zapewnić bardziej szczegółowe opisy krok po kroku instalacji programu i ułatwić komunikację w celu wsparcia użytkowników podczas instalacji programu w ich własnym systemie. Kolejne kroki w procesie analizy CUT&RUN, wykraczające poza protokół opisany w tym artykule, obejmują adnotację pików, identyfikację nakładania się różnych typów wywoływanych pików oraz adnotację funkcjonalną dla wywołanych pików. Zakończenie etapów kontroli jakości i wywołanie pików opisane w tym protokole w połączeniu z adnotacją o pikach w dół umożliwi użytkownikom wyciągnięcie biologicznego znaczenia z ich danych CUT&RUN. 
Ten potok analizy CUT&RUN został zbudowany w celu zapewnienia ogólnych, wprowadzających wskazówek krok po kroku dotyczących masowej analizy CUT&RUN. Ten potok ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, chociaż ten potok analizy próbuje poradzić sobie z efektem zmienności zawartości GC poprzez filtrowanie odczytów w regionach czarnej listy (które obejmują "regiony artefaktów o wysokim sygnale" i "regiony powtórzeń artefaktów" oraz regiony powtórzeń TA), podejście to może nie być wystarczające dla niektórych organizmów, które mogą mieć charakterystyczną zawartość GC w swoim genomie. Dlatego jeśli użytkownicy obawiają się jakichkolwiek uprzedzeń związanych z treścią GC, rozważ dodanie kolejnego kroku w celu poprawienia zmapowanych odczytów. Dla początkujących bioinformatyków "computeGCBias" i "correctGCBias" w Deeptools mogą być opcjami do tego celu. Po drugie, ten potok analizy obsługuje zarówno odczyty o regularnym rozmiarze wkładki (100 bp-1 kb), jak i odczyty o małym rozmiarze wkładki (< 100 pz), które mogą być rzeczywistymi odczytami niektórych białek związanych z chromatyną, w tym samym pliku. Ponieważ ten potok analizy jest napisany w skryptach powłoki, użytkownicy mogą modyfikować "Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh", aby pobierać krótkie odczyty rozmiaru wstawienia oddzielnie od zwykłych odczytów rozmiaru fragmentu podczas etapu generowania zmapowanego pliku łóżka odczytów. Następnie, krótki rozmiar wkładki odczytuje plik łóżka może być znormalizowany niezależnie od zwykłych odczytów mapowanych rozmiarów wkładek, aby zminimalizować efekt zmniejszania. Po trzecie, aby zmniejszyć złożoność procesu analizy, Easy Shells CUTnRUN nie obejmuje etapu próbkowania w dół, aby dopasować głębokość sekwencjonowania próbek CUT&RUN. Użytkownicy mogą jednak zastosować krok próbkowania w dół po przefiltrowaniu plików bam przy użyciu widoku samtools28 lub PositionBasedDownsampleSam (Picard)29. 
Wszystkie kroki analizy w tym protokole są napisane w skryptach powłoki, aby umożliwić początkującym bioinformatykom nauczenie się podstaw analizy CUT&RUN poprzez przejrzenie skryptów. Oczekujemy, że użytkownicy będą mogli ćwiczyć analizę bioinformatyczną krok po kroku, uruchamiając każdy skrypt powłoki sekwencyjnie w terminalu. Co więcej, prostota skryptów powłoki dostępnych w tym procesie analizy CUT&RUN pozwala użytkownikom na korygowanie i dostosowywanie tych skryptów w celu zastosowania tego potoku analizy do własnych danych CUT&RUN. Ostatecznie oczekujemy, że ten proces analizy CUT&RUN może zmniejszyć typowe wąskie gardła w procesie analizy danych CUT&RUN, umożliwiając badaczom z mokrych laboratoriów i początkującym bioinformatykom wyciąganie wniosków biologicznych z własnych danych sekwencjonowania CUT&RUN.

Możliwość mierzenia interakcji między białkami a genomowym DNA jest fundamentalna dla zrozumienia biologii regulacji chromatyny. Skuteczne testy, które mierzą zajętość chromatyny dla danego białka, dostarczają co najmniej dwóch kluczowych informacji: i) lokalizacji genomowej oraz ii) obfitości białka w danym regionie genomu. Śledzenie zmian rekrutacji i lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w chromatynie może ujawnić bezpośrednie docelowe loci białka i ujawnić mechanistyczne role tego białka w procesach biologicznych opartych na chromatynie, takich jak regulacja transkrypcji, naprawa DNA lub replikacja DNA. Dostępne obecnie techniki profilowania interakcji białko-DNA umożliwiają naukowcom badanie regulacji w niespotykanej dotąd rozdzielczości. Taki postęp techniczny był możliwy dzięki wprowadzeniu nowych technik profilowania chromatyny, które obejmują opracowanie przez laboratorium Henikoff metody rozszczepienia pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy (Cleavage Under Targets and Release Using Nucleaase). CUT&RUN oferuje kilka zalet technicznych w porównaniu z konwencjonalną immunoprecypitacją chromatyny (ChIP), które obejmują niższe wymagania dotyczące wprowadzania komórek, niższe wymagania dotyczące głębokości sekwencjonowania oraz zwiększoną czułość przy zmniejszonym sygnale tła ze względu na brak środków sieciujących, które w przeciwnym razie maskują epitopy przeciwciał. Przyjęcie tej techniki do badania regulacji chromatyny wymaga dogłębnego zrozumienia zasady leżącej u podstaw tej techniki oraz zrozumienia, jak analizować, walidować i interpretować dane CUT&RUN.
Procedura CUT&RUN rozpoczyna się od wiązania komórek z konkanawaliną A sprzężoną z kulkami magnetycznymi, aby umożliwić manipulowanie niską liczbą komórek podczas całej procedury. Wyizolowane komórki są przepuszczane przy użyciu łagodnego detergentu, aby ułatwić wprowadzenie przeciwciała, które jest skierowane przeciwko białemu zainteresowaniu. Nukleaza mikrokokkowa (MNaza) jest następnie rekrutowana do związanego przeciwciała za pomocą znacznika białka A lub białka A / G połączonego z enzymem. Wapń jest wprowadzany w celu zainicjowania aktywności enzymatycznej. W wyniku trawienia MNazy powstają mononukleosomalne kompleksy DNA-białko. Wapń jest następnie chelatowany w celu zakończenia reakcji trawienia, a krótkie fragmenty DNA z trawienia MNazy są uwalniane z jąder, a następnie poddawane oczyszczaniu DNA, przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Podejścia in silico do mapowania i ilościowego określania obecności białek w całym genomie rozwinęły się równolegle z metodami mokrego laboratorium, używanymi do wzbogacania tych interakcji DNA-białko. Identyfikacja regionów wzbogaconych sygnałów (pików) jest jednym z najbardziej krytycznych etapów analizy bioinformatycznej. Początkowe metody analizy ChIP-seq wykorzystywały algorytmy, takie jak MACS2 i SICER3, które wykorzystywały modele statystyczne do odróżnienia bona fide miejsc wiązania białko-DNA od szumu tła. Jednak niższy szum tła i wyższa rozdzielczość danych CUT&RUN sprawiają, że niektóre programy wywołujące wartości szczytowe stosowane w analizie ChIP-seq nie nadają się do analizy CUT&RUN4. Wyzwanie to uwypukla potrzebę opracowania nowych narzędzi, które lepiej nadają się do analizy danych CUT&RUN. SEACR4 reprezentuje jedno z takich narzędzi, które zostało ostatnio opracowane w celu umożliwienia wywoływania szczytów z danych CUT&RUN, przy jednoczesnym pokonywaniu ograniczeń związanych z narzędziami zwykle stosowanymi do analizy ChIP-seq.
Biologiczne interpretacje z danych sekwencjonowania CUT&RUN są pobierane z danych wyjściowych poniżej wywołania piku w potoku analizy. Można zaimplementować kilka funkcjonalnych programów adnotacyjnych w celu przewidywania potencjalnego znaczenia biologicznego wywoływanych pików na podstawie danych CUT&RUN. Na przykład projekt Gene Ontology (GO) zapewnia ugruntowaną funkcjonalną identyfikację genów będących przedmiotem zainteresowania5,6,7. Różne narzędzia i zasoby programowe ułatwiają analizę GO w celu ujawnienia genów i zestawów genów wzbogaconych wśród szczytów CUT&RUN8,9,10,11,12,13,14. Ponadto oprogramowanie do wizualizacji, takie jak Deeptools15, Integrative genomics viewer (IGV)16 i UCSC Genome Browser17 umożliwiają wizualizację rozkładu sygnałów i wzorców w interesujących regionach genomu.
Zdolność do wyciągania interpretacji biologicznych z danych CUT&RUN zależy przede wszystkim od walidacji jakości danych. Kluczowe komponenty do walidacji obejmują ocenę: i) jakości sekwencjonowania biblioteki CUT&RUN, ii) podobieństwa replikacji oraz iii) dystrybucji sygnału w centrach szczytów. Zakończenie walidacji wszystkich trzech komponentów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wiarygodności próbek z biblioteki CUT&RUN i wyników dalszej analizy. W związku z tym konieczne jest opracowanie wstępnych przewodników po analizie CUT&RUN, aby umożliwić początkującym bioinformatykom i badaczom w laboratoriach mokrych przeprowadzenie takich etapów walidacji w ramach standardowych procesów analizy CUT&RUN.
Wraz z rozwojem eksperymentu CUT&RUN w laboratorium mokrym, różne metody analizy in silico CUT&RUN, takie jak CUT&RUNTools 2.018,19, nf-core/cutandrun20 oraz CnRAP21, zostały opracowane do obsługi analizy danych CUT&RUN. Narzędzia te zapewniają zaawansowane podejścia do analizy jednokomórkowych i zbiorczych zestawów danych CUT&RUN i CUT&Tag. Jednak stosunkowo złożona modułowa struktura programu i wymagana znajomość wielu języków programowania do przeprowadzania tych potoków analitycznych może utrudniać przyjęcie ich przez początkujących bioinformatyków, którzy chcą dokładnie zrozumieć etapy analizy CUT&RUN i dostosować własne potoki. Obejście tej bariery wymaga nowego, wprowadzającego potoku analizy CUT&RUN, który jest dostarczany w postaci prostych skryptów krok po kroku zakodowanych przy użyciu prostego, pojedynczego języka programowania.
W tym artykule opisujemy prosty, jednojęzyczny protokół potoku analizy CUT&RUN, który dostarcza krok po kroku skrypty wspierane szczegółowymi opisami, aby umożliwić nowym i początkującym użytkownikom przeprowadzanie analizy sekwencjonowania CUT&RUN. Programy używane w tym potoku są publicznie dostępne przez oryginalne grupy deweloperów. Główne kroki opisane w tym protokole obejmują wyrównanie odczytu, wywołanie pików, analizę funkcjonalną i, co najważniejsze, etapy walidacji w celu oceny jakości próbki w celu określenia przydatności i wiarygodności danych do interpretacji biologicznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Co więcej, potok ten daje użytkownikom możliwość porównywania wyników analiz z publicznie dostępnymi zestawami danych CUT&RUN. Ostatecznie, ten protokół procesu analizy CUT&RUN służy jako przewodnik wprowadzający i odniesienie dla początkujących analityków bioinformatycznych i badaczy w laboratoriach mokrych.

<table><tbody><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>ENCODE</td><td>https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td> <td>Oprogramowanie do kompresji i konwersji readcounts bedGraph do bigWig</td></tr><tr><td>bedtools-2.31.1</td><td>The Quinlan Lab @ the U. of Utah</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania plików bam/bed/bedGraph</td></tr><tr><td>bowtie2 2.5.4</td><td>Uniwersytet</td> <td>Johnsa Hopkinsahttps://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td>Oprogramowanie do budowy indeksu muszki i wykonywania wyrównania</td></tr><tr><td>CollectInsertSizeMetrics (Picard)</td><td>Broad institute</td><td>https://github.com/broadinstitute/picard</td><td>Oprogramowanie do analizy rozkładu wielkości płytki</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>NBIS</td><td>https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html</td><td>Oprogramowanie do przycinania adapterów</td></tr><tr><td>Deeptoolsv3.5.1</td><td>Instytut Maxa Plancka</td><td>https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html</td><td>Oprogramowanie do wykonywania analizy korelacji współczynników Pearsona, analizy głównych składowych oraz analizy mapy cieplnej/wykresu średniej</td></tr><tr><td>FastQC Wersja 0.12.0</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>https://github.com/s-andrews/FastQC</td><td>Oprogramowanie do sprawdzania jakości pliku fastq</td></tr><tr><td>Interwencjav0.6.1</td><td>Biologia obliczeniowa i Regulacja genów - grupa Matheliera</td><td>https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>Oprogramowanie do wykonywania analizy diagramu Venna przy użyciu plików szczytowych</td></tr><tr><td>MACSv2.2.9.1</td><td>Inicjatywa Chana Zuckerberga</td><td>https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2</td><td>Oprogramowanie do wywoływania szczytów</td></tr><tr><td>MACSv3.0.2</td><td>Inicjatywa Chana Zuckerberga</td><td>https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master</td><td>Oprogramowanie do wywoływania szczytów</td></tr><tr><td>Samtools-1.21</td><td>Wellcome Sanger Institute</td><td>https://github.com/samtools/samtools</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania plików sam/bam</td></tr><tr><td>SEACRv1.3</td><td>Howard Hughes Medial institute</td><td>https://github.com/FredHutch/SEACR</td><td>Oprogramowanie do wywoływania szczytów</td></tr><tr><td>Toolkit Release 3.1.1</td><td>NCBI</td><td>https://github.com/ncbi/-tools</td><td>Oprogramowanie do pobierania SRR z GEO</td></tr><tr><td>Trim_Galore v0.6.10</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</td><td>oprogramowanie do wykonywania wysokiej jakości i szybkiego przycinania</td></tr></tbody></table>

wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania cut&run

Introductory Analysis and Validation of CUT&#38;RUN Sequencing Data

Technika CUT&RUN ułatwia wykrywanie interakcji białko-DNA w całym genomie. Typowe zastosowania CUT&RUN obejmują profilowanie zmian w modyfikacjach ogona histonowego lub mapowanie zajętości chromatyny czynnika transkrypcyjnego. Powszechne zastosowanie CUT&RUN jest częściowo napędzane przez zalety techniczne w porównaniu z konwencjonalnym sekwencją ChIP, które obejmują niższe wymagania dotyczące wprowadzania komórek, niższe wymagania dotyczące głębokości sekwencjonowania oraz zwiększoną czułość przy zmniejszonym sygnale tła ze względu na brak środków sieciujących, które w przeciwnym razie maskują epitopy przeciwciał. Powszechne przyjęcie CUT&RUN zostało również osiągnięte dzięki hojnemu udostępnianiu odczynników przez laboratorium Henikoff oraz opracowaniu komercyjnych zestawów w celu przyspieszenia wdrożenia przez początkujących. Wraz ze wzrostem technicznego zastosowania CUT&RUN, analiza sekwencjonowania CUT&RUN i walidacja stają się krytycznymi wąskimi gardłami, które muszą zostać pokonane, aby umożliwić pełne przyjęcie przez zespoły laboratoryjne, w których przeważają mokre laboratoria. Analiza CUT&RUN zazwyczaj rozpoczyna się od kontroli jakości surowych odczytów sekwencjonowania w celu oceny głębokości sekwencjonowania, jakości odczytu i potencjalnych odchyleń. Odczyty są następnie dopasowywane do referencyjnego zestawu sekwencji genomu, a następnie wykorzystuje się kilka narzędzi bioinformatycznych do opisywania regionów genomu wzbogacenia białek, potwierdzania możliwości interpretacji danych i wyciągania wniosków biologicznych. Chociaż opracowano wiele potoków analizy in silico w celu wsparcia analizy danych CUT&RUN, ich złożona, wielomodułowa struktura i wykorzystanie wielu języków programowania sprawiają, że platformy te są trudne dla początkujących bioinformatyków, którzy mogą nie znać wielu języków programowania, ale chcą zrozumieć procedurę analizy CUT&RUN i dostosować swoje potoki analityczne. W tym miejscu udostępniamy jednojęzyczny protokół potoku analizy krok po kroku CUT&RUN, przeznaczony dla użytkowników o dowolnym poziomie doświadczenia bioinformatycznego. Protokół ten obejmuje przeprowadzanie krytycznych kontroli jakości w celu sprawdzenia, czy dane sekwencjonowania są odpowiednie do interpretacji biologicznej. Oczekujemy, że przestrzeganie protokołu wprowadzającego przedstawionego w tym artykule w połączeniu z adnotacją o pikach w dół pozwoli użytkownikom na wyciąganie wniosków biologicznych z własnych zestawów danych CUT&RUN.

Ten protokół prowadzi początkujących bioinformatyków przez wprowadzający potok analizy CUT&RUN, który umożliwia użytkownikom przeprowadzenie wstępnej analizy i walidacji danych sekwencjonowania CUT&RUN. Wykonanie opisanych tutaj kroków analizy, w połączeniu z adnotacją pików, pozwoli użytkownikom na uzyskanie mechanistycznego wglądu w regulację chromatyny.

Wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania CUT&RUN

The CUT&amp;RUN technique facilitates detection of protein-DNA interactions across the genome. Typical applications of CUT&amp;RUN include profiling ...

Nasze badania dotyczą roli powtarzających się elementów DNA w inicjacji i progresji raka. Pytamy, czy te elementy są bezpośrednio zaangażowane w mechanizmy inicjacji raka, a jeśli tak, to czy możemy wykorzystać te informacje do poprawy wyników leczenia pacjentów? Opracowano wiele technologii sekwencjonowania i analiz nowej generacji w celu uchwycenia cech i zmian czynników epigenetycznych, takich jak transkrypcyjne lub potranslacyjne zmiany chromatyny, a także wiązanie w określonej lokalizacji chromatyny i sekwencjonowanie DNA lub RNA, które są wychwytywane przez białko czujnika zarówno w rozdzielczości masowej, jak i pojedynczej.Technologie wykorzystywane do postępu badań w naszej dziedzinie to te, które mogą mapować pozycje genomowe zmodyfikowanych histonów lub czynników transkrypcyjnych na chromatynie. Dla naszych celów najbardziej odpowiednią techniką w ramach tego parasola technologii jest technika zwana CUT&RUN. Wiele publicznie dostępnych procesów analizy CUT&RUN jest stosunkowo skomplikowanych dla początkujących bioinformatyków, którzy chcą zrozumieć przebieg analizy i opracować własny potok analiz dla swojego projektu.Jednak nasze analizy CUT&RUN są opracowywane krok po kroku w jednym języku programowym, który jest znacznie łatwiejszy do zrozumienia przepływu i łatwiejszy do modyfikacji, aby uzyskać dane o jakości publikacji i zbudować doświadczenie w bioinformatyce. Wciąż koncentrujemy się na znalezieniu odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób przewlekła ekspresja dwuniciowego RNA wpływa na unikanie biomimikry i rozwój raka opornego na immunoterapię oraz jak białko TP53 może regulować przewlekłą ekspresję dwuniciowego RNA i unikanie biomimikry. Na koniec chcemy zrozumieć, w jaki sposób możemy wyleczyć raka opornego na immunoterapię, rozumiejąc i celując w przewlekłą ekspresję dwuniciowego RNA i proces unikania biomimikry.Aby rozpocząć, pobierz skompresowany potok analizy z usługi GitHub, wpisując polecenie w terminalu. Po pobraniu wprowadź polecenie, aby rozpakować plik zip. Po zakończeniu dekompresji usuń plik zip i zmień nazwę zdekompresowanego folderu.Następnie ustaw uprawnienia do pliku wykonywalnego dla wszystkich skryptów powłoki w katalogu roboczym. Z dostępnych opcji znajdź odpowiedni skrypt powłoki instalacyjnej. Poszukaj skryptu o nazwie Script_01_installation.sh.Otwórz terminal i wpisz echo shell, aby sprawdzić domyślną powłokę używaną w aktywnym terminalu. Jeśli bash nie jest domyślną powłoką, ustaw ją, wpisując chsh s w terminalu. Wpisz skrypt fastq download w terminalu lub przeciągnij plik skryptu do terminala i naciśnij Enter.Po uruchomieniu skryptu sprawdź, czy w pliku dziennika nie ma komunikatów o błędach. Teraz wprowadź skrypt przycinania w terminalu i wykonaj go. Następnie wpisz skrypt bowtie-2-index w terminalu i wykonaj go.Na koniec uruchom skrypt bowtie-2-mapping i naciśnij Enter. Wpisz skrypt filtrowania i sortowania bam w terminalu i wykonaj go. Następnie przekonwertuj bam na formaty BEDPE-BED i bedGraph, wpisując odpowiednie polecenie w terminalu i naciskając Enter.Wykonaj normalizację przy użyciu metody SRPMC. Następnie uruchom skrypt insert-size-analysis. Wykonaj wywołanie szczytu za pomocą polecenia MACS w terminalu.Następnie wpisz polecenie wywoływania szczytów za pomocą SEACR i naciśnij Enter. Utwórz pliki ze szczytem za pomocą odpowiedniego polecenia w terminalu, a następnie przefiltruj szczyty. Następnie wprowadź polecenie, aby scalić szczyty MACS.Wpisz polecenie w terminalu, aby scalić szczyty SEACR. Wygeneruj wykres korelacji i uruchom polecenie do analizy składowych głównych w terminalu. Następnie utwórz diagram Venna porównujący różne metody za pomocą odpowiedniego polecenia.Wprowadź polecenie, aby wygenerować diagram Venna dla replikacji. Na koniec wygeneruj skoncentrowaną mapę cieplną centrum szczytu. Następnie wygeneruj całą mapę cieplną centrum szczytu.

introductory-analysis-and-validation-of-cut-run-sequencing-data

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Wcześniej sprawdziliśmy protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonie na platformie sekwencjonowania nanoporowego. W tym miejscu bardziej szczegółowo opisujemy stosowane metody i określamy poziom błędu nanoporowej celi przepływowej R10.

Walidacja sekwencjonowania nanoporowego całego genomu na przykładzie wirusa Usutu

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Ten protokół opisuje eksperymentalną metodę i proces analizy danych dla rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN) w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans.

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

Opisano zoptymalizowany protokół rozszczepienia pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&amp;RUN-seq) dla neuroendokrynnych linii komórkowych raka płuc z drobnymi komórkami. Umożliwia mapowanie różnych modyfikacji histonów oraz miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (np. E2F7) na poziomie genomu w celu badania deregulacji epigenetycznej i transkrypcyjnej w patobiologii SCLC.

Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Naucz się analizy danych CUT&RUN w bioinformatyce. Ten protokół prowadzi początkujących przez walidację sekwencjonowania i pozwala zrozumieć mechanizmy regulacji chromatyny.

Wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania CUT&RUN

Przeglądaj więcej filmów