Wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania CUT&RUN
December 13th, 2024
Ten protokół prowadzi początkujących bioinformatyków przez wprowadzający potok analizy CUT&RUN, który umożliwia użytkownikom przeprowadzenie wstępnej analizy i walidacji danych sekwencjonowania CUT&RUN. Wykonanie opisanych tutaj kroków analizy, w połączeniu z adnotacją pików, pozwoli użytkownikom na uzyskanie mechanistycznego wglądu w regulację chromatyny.
Nasze badania dotyczą roli powtarzających się elementów DNA w inicjacji i progresji raka. Pytamy, czy te elementy są bezpośrednio zaangażowane w mechanizmy inicjacji raka, a jeśli tak, to czy możemy wykorzystać te informacje do poprawy wyników leczenia pacjentów? Opracowano wiele technologii sekwencjonowania i analiz nowej generacji w celu uchwycenia cech i zmian czynników epigenetycznych, takich jak transkrypcyjne lub potranslacyjne zmiany chromatyny, a także wiązanie w określonej lokalizacji chromatyny i sekwencjonowanie DNA lub RNA, które są wychwytywane przez białko czujnika zarówno w rozdzielczości masowej, jak i pojedynczej.
Technologie wykorzystywane do postępu badań w naszej dziedzinie to te, które mogą mapować pozycje genomowe zmodyfikowanych histonów lub czynników transkrypcyjnych na chromatynie. Dla naszych celów najbardziej odpowiednią techniką w ramach tego parasola technologii jest technika zwana CUT&RUN. Wiele publicznie dostępnych procesów analizy CUT&RUN jest stosunkowo skomplikowanych dla początkujących bioinformatyków, którzy chcą zrozumieć przebieg analizy i opracować własny potok analiz dla swojego projektu.
Jednak nasze analizy CUT&RUN są opracowywane krok po kroku w jednym języku programowym, który jest znacznie łatwiejszy do zrozumienia przepływu i łatwiejszy do modyfikacji, aby uzyskać dane o jakości publikacji i zbudować doświadczenie w bioinformatyce. Wciąż koncentrujemy się na znalezieniu odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób przewlekła ekspresja dwuniciowego RNA wpływa na unikanie biomimikry i rozwój raka opornego na immunoterapię oraz jak białko TP53 może regulować przewlekłą ekspresję dwuniciowego RNA i unikanie biomimikry. Na koniec chcemy zrozumieć, w jaki sposób możemy wyleczyć raka opornego na immunoterapię, rozumiejąc i celując w przewlekłą ekspresję dwuniciowego RNA i proces unikania biomimikry.
Aby rozpocząć, pobierz skompresowany potok analizy z usługi GitHub, wpisując polecenie w terminalu. Po pobraniu wprowadź polecenie, aby rozpakować plik zip. Po zakończeniu dekompresji usuń plik zip i zmień nazwę zdekompresowanego folderu.
Następnie ustaw uprawnienia do pliku wykonywalnego dla wszystkich skryptów powłoki w katalogu roboczym. Z dostępnych opcji znajdź odpowiedni skrypt powłoki instalacyjnej. Poszukaj skryptu o nazwie Script_01_installation.sh.
Otwórz terminal i wpisz echo shell, aby sprawdzić domyślną powłokę używaną w aktywnym terminalu. Jeśli bash nie jest domyślną powłoką, ustaw ją, wpisując chsh s w terminalu. Wpisz skrypt fastq download w terminalu lub przeciągnij plik skryptu do terminala i naciśnij Enter.
Po uruchomieniu skryptu sprawdź, czy w pliku dziennika nie ma komunikatów o błędach. Teraz wprowadź skrypt przycinania w terminalu i wykonaj go. Następnie wpisz skrypt bowtie-2-index w terminalu i wykonaj go.
Na koniec uruchom skrypt bowtie-2-mapping i naciśnij Enter. Wpisz skrypt filtrowania i sortowania bam w terminalu i wykonaj go. Następnie przekonwertuj bam na formaty BEDPE-BED i bedGraph, wpisując odpowiednie polecenie w terminalu i naciskając Enter.
Wykonaj normalizację przy użyciu metody SRPMC. Następnie uruchom skrypt insert-size-analysis. Wykonaj wywołanie szczytu za pomocą polecenia MACS w terminalu.
Następnie wpisz polecenie wywoływania szczytów za pomocą SEACR i naciśnij Enter. Utwórz pliki ze szczytem za pomocą odpowiedniego polecenia w terminalu, a następnie przefiltruj szczyty. Następnie wprowadź polecenie, aby scalić szczyty MACS.
Wpisz polecenie w terminalu, aby scalić szczyty SEACR. Wygeneruj wykres korelacji i uruchom polecenie do analizy składowych głównych w terminalu. Następnie utwórz diagram Venna porównujący różne metody za pomocą odpowiedniego polecenia.
Wprowadź polecenie, aby wygenerować diagram Venna dla replikacji. Na koniec wygeneruj skoncentrowaną mapę cieplną centrum szczytu. Następnie wygeneruj całą mapę cieplną centrum szczytu.
Przegląd
Ten protokół prowadzi początkujących w dziedzinie bioinformatyki przez wstępny potok analityczny CUT&RUN, który umożliwia użytkownikom przeprowadzenie początkowej analizy i walidacji danych sekwencjonowania CUT&RUN. Stosując się do opisywanych kroków analizy, użytkownicy mogą zdobyć mechanizmyczne wglądy w regulację chromatyny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bioinformatyka
- Genomika
- Epigenetyka
Tło
- Badania eksplorują powtarzające się elementy DNA w raku.
- Badają ich rolę w inicjacji i progresji raka.
- Koncentrują się na poprawie wyników pacjentów poprzez zrozumienie tych elementów.
- Wykorzystują technologie sekwencjonowania nowej generacji do analizy.
Cel badania
- Aby dostarczyć przyjazny dla początkujących protokół analizy CUT&RUN.
- Aby umożliwić użytkownikom walidację danych sekwencjonowania CUT&RUN.
- Aby ułatwić zrozumienie mechanizmów regulacji chromatyny.
Stosowane metody
- Technika sekwencjonowania CUT&RUN.
- Analiza pozycji genomowych zmodyfikowanych histonów.
- Wykorzystanie dostępnych publicznie potoków analitycznych.
- Koncentracja na zarówno bulk, jak i jednokomórkowej rozdzielczości.
Główne wyniki
- Użytkownicy mogą przeprowadzić początkową analizę danych CUT&RUN.
- Annotacja szczytów w fazie downstream zapewnia wgląd w regulację chromatyny.
- Protokół pomaga w zrozumieniu przepływu analizy dla początkujących.
Wnioski
- Protokół jest niezbędny dla początkujących w dziedzinie bioinformatyki.
- Poprawia zrozumienie mechanizmów związanych z chromatyną.
- Ułatwia rozwój spersonalizowanych potoków analitycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
CUT&RUN sequencing data analysis is pivotal for advancing chromatin biology and epigenetic target validation in early discovery pipelines. The streamlined, single-language pipeline lowers technical barriers, enabling broader adoption and reproducibility across R&D teams. This approach supports robust mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of protein-DNA interactions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying chromatin regulatory pathways.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of epigenetic modifications relevant to disease models.
- Improves predictive confidence in target selection through quantitative chromatin occupancy data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin profiling systems for downstream compound screening.
- Standardizes data quality control and normalization for reproducible assay outputs.
- Enables scalable, quantitative readouts suitable for comparative analysis across conditions.
- Supports platform reuse by simplifying pipeline customization for new targets or cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin state mapping with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing interpretable, quantitative data.
- Reduces biological risk in candidate advancement by confirming target engagement in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This CUT&RUN analysis protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and downstream screening workflows.
- Discovery Biology: Provides quantitative validation of protein-DNA interactions to clarify regulatory mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quality-controlled data for robust assay development.
- Analytics: Generates interpretable outputs such as peak calls, correlation plots, and PCA for comparative analysis.
- Translational Research: Connects chromatin profiling to disease models for biomarker alignment when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, single-language pipeline adaptable across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of chromatin profiling workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets.
Implementation Considerations
- Requires foundational bioinformatics expertise and familiarity with command-line environments.
- Depends on access to sequencing infrastructure and computational resources for data processing.
- Benefits from cross-team standardization of quality control and normalization procedures.
- Adaptable to diverse cell types and experimental models with minimal pipeline modification.
- Potential limitations include the need for careful validation of antibody specificity and sequencing depth.
