Name: Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę współkultury sferoidów guzowych z makrofagami w macierzy kolagenowej 3D. Technika ta pozwala badać rolę KIF16B w recyklingu białek powierzchniowych makrofagów i ich wpływ na inwazję komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Andrei Mordhorst za doskonałe wsparcie techniczne i hodowlę komórkową oraz Martinowi Aepfelbacherowi za ciągłe wsparcie. Prace nad inwazją makrofagów w laboratorium SL są wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).

Ten protokół obejmuje użycie pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z próbek krwi dawcy. Zgodnie z wytycznymi etycznymi Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf pobrano próbki krwi, a dawcom wypłacono rekompensatę. Dalsze przetwarzanie próbek odbywało się zgodnie z określonymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa (np. postępowanie z nieprzebadanymi próbkami). Praca z pierwotnymi ludzkimi makrofagami w tym badaniu została oceniona jako niebudząca zastrzeżeń przez Ärztekammer Hamburg w Niemczech.
1. Generowanie sferoid guza H1299 w podejściu bez rusztowań (3 dni wcześniej)
<ol>
	<li>Hodować komórki rakowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 w kolbach do hodowli komórkowych o średnicy 25cm2 (patrz tabela materiałów) z pożywką dla komórek rakowych (zmodyfikowana pożywka dla orłów Dulbecco [DMEM] + 1% penicylina-streptomycyna [pen-strep] + 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] + 0,1 mM aminokwasów endogennych + 2 mM L-glutamina) aż do 80% zbiegu.</li>
	<li>Umyj komórki raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS) i odłącz je, dodając 1 ml kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,25%, czerwień fenolowa) przez 2 minuty. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 2 ml pożywki z komórek rakowych i sprawdź oderwanie pod mikroskopem świetlnym. 
	UWAGA: Ważne jest, aby komórki rakowe były oddzielone i aby nie było żadnych skupisk komórek rakowych.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki reakcyjnej o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 245 x g przez 5 minut. Następnie usunąć roztwór trypsyny przez pipetowanie lub za pomocą pompy, następnie przemyć osad, dodając 5 ml DPBS i ponownie odwirować w tych samych warunkach.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml pożywki z komórek nowotworowych i policzyć komórki, np. za pomocą komory Neubauera. Przenieś 8 000 komórek H1299-GFP do 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności (patrz Tabela materiałów) w końcowej objętości 25 μl pożywki z komórek rakowych.</li>
	<li>Inkubować komorę przez 3 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sprawdź sferoidy pod mikroskopem pod kątem jednorodności. Nie należy brać pod uwagę sferoid o mniejszej gęstości lub nieprzyłączonych pojedynczych komórek rakowych do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pierwotnych ludzkich makrofagów z próbek krwi dawcy
<ol>
	<li>Jeżeli próbki krwi dawcy nie zostaną natychmiast wykorzystane do izolacji komórek, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C, wstrząsając.</li>
	<li>Przenieść 20 ml krwi z worka do transfuzji do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Następnie przygotuj nową probówkę o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml pożywki do separacji limfocytów (LSM).</li>
	<li>Ostrożnie dodać 20 ml krwi do każdej probówki zawierającej LSM bez mieszania i odwirować ją w temperaturze 450 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj nową probówkę o pojemności 50 ml i dodaj 10 ml zimnej pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640.</li>
	<li>Po odwirowaniu przenieś gęstą, białą fazę ("kożuch") w probówce zawierającej krew do przygotowanej probówki zawierającej RPMI i dodaj objętość do 50 ml za pomocą zimnego RPMI.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w 10 ml zimnego RPMI.</li>
	<li>Ponownie odwirować mieszaninę przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 ml RPMI.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbkę o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,5 ml zimnego buforu monocytów (0,5% albuminy surowicy ludzkiej + 5 mM EDTA w 25 ml DPBS).</li>
	<li>Umieść zawiesinę komórkową na lodzie, dodaj 250 μl mikrogranulek anty-CD14 i inkubuj przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Przygotować kolumnę separacyjną przez dodanie filtra do stojaka separatora magnetycznego i dodać 900 μl buforu monocytów w celu zrównoważenia.</li>
	<li>Wlej zawiesinę komórkową na filtr i pozwól jej przepłynąć grawitacyjnie do rurki odpływowej.</li>
	<li>Przemyć kolumnę, która zawiera komórki związane z kulkami magnetycznymi, dodając 1 ml buforu monocytów.</li>
	<li>Przygotuj świeżą probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 20 ml RPMI i umieść probówkę odpływową pod kolumną.</li>
	<li>Dodaj 3 ml buforu monocytów do kolumny, wyjmij go ze stojaka magnetycznego i przymocuj stempel.</li>
	<li>Wciśnij komórki do przygotowanej probówki o pojemności 50 ml i napełnij ją do 30 ml objętości RPMI.</li>
	<li>Policz komórki (np. za pomocą komory liczącej Neubauera) pod mikroskopem świetlnym i dostosuj liczbę komórek, dodając RPMI do 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Pobrać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka w komorze 6-dołkowej i inkubować płytkę przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Sprawdź, czy komórki prawidłowo przylegają i zastąp RPMI 1,5 ml monopożywki (20% ludzkiej surowicy + 1% paciorkowca w RPMI).</li>
	<li>Zmienić podłoże po 24 godzinach inkubacji. W tych warunkach monocyty różnicują się w makrofagi w ciągu 6 dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie makrofagów
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu należy odłączyć makrofagi odpowiednią ilością akutazy dla indywidualnych warunków hodowli. Na przykład użyj 500 μl akutazy, jeśli komórki są wysiane w naczyniu 6-dołkowym. Inkubować komórki przez około 40 minut w roztworze, przemyć je raz 2 ml DPBS i policzyć w komorze Neubauera.</li>
	<li>W przypadku jednej sferoidy rozcieńczyć żądaną liczbę makrofagów w 40 μl mieszanki kolagenu I (2,5 mg/ml kolagenu z ogona szczura I) i wymieszać je, krótko wirując rurkę reakcyjną. W przeprowadzonych eksperymentach 200 000 komórek/ml wykazało wykrywalną różnicę w inwazji komórek rakowych. Trzymaj mieszankę kolagenowo-komórkową na lodzie, ponieważ zacznie szybko polimeryzować w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
4. Konfiguracja testu koinwazji
UWAGA: W zależności od formatu komory obrazowania, celu analizy lub odpowiedniej konfiguracji obrazowania, sferoida guza może wymagać przeniesienia z płytki o bardzo niskiej przyczepności i dostosowania wartości dla kolagenu i podłoża. Poniższe kroki opisują konfigurację dla jednej próbki w 15-dołkowym szkiełku μ.
<ol>
	<li>Najpierw umyj sferoidę, dodając 300 μl DPBS. Odetnij końcówkę niebieskiej końcówki do pipety o pojemności 1 ml i podnieś sferoidę za pomocą DPBS. Po zaaspiracji sferoidy osadzonej w końcówce, na krótko popchnij pipetę na dno komory obrazowania, aby przenieść guz-sferoidę za pomocą napięcia powierzchniowego. 
	UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że tarcie na niezmodyfikowanych końcówkach może zakłócić integralność sferoidy.</li>
	<li>Usunąć resztki DPBS przeniesione wraz ze sferoidą w jak największym stopniu za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Szybko dodaj 40 μl mieszanki kolagenu I/makrofagów (patrz krok 3.4) do komory obrazowania, która zawiera sferoidę H1299-GFP.</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora komórkowego i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnych warunkach, aby w pełni spolimeryzować mieszaninę kolagenu.</li>
	<li>Po polimeryzacji ostrożnie dodać 25 μl pożywki z komórek rakowych do każdej studzienki i inkubować płytkę przez 3 dni w inkubatorze w opisanych wcześniej warunkach. W razie potrzeby zobrazuj żywą próbkę za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego w żądanych punktach czasowych.</li>
</ol>
5. Dodatkowe utrwalanie i barwienie
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego należy utrwalić makrofagi i sferoidy H1299-GFP w matrycy kolagenu I. Najpierw ostrożnie usunąć supernatant z każdej próbki za pomocą pompy, nie dotykając matrycy. 
	UWAGA: Aby uniknąć zniszczenia próbki, supernatant można również usunąć przez ręczne pipetowanie bez użycia pompy.</li>
	<li>Dodać 50 μl 3,7% formaldehydu z DPBS do każdego dołka i inkubować próbki przez 5 minut na lodzie. Następnie usuń roztwór utrwalający i ponownie dodaj do niego 50 μl świeżego roztworu utrwalającego. Ten krok jest ważny, aby osiągnąć bardziej równomierny poziom formaldehydu w studni. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W zależności od ilości mieszanego kolagenu, czas inkubacji może wydłużyć się do kilku godzin.</li>
	<li>Następnego dnia usunąć utrwalacz i umyć próbki poprzez wielokrotne usuwanie co najmniej dwukrotnego DPBS, w zależności od objętości komory obrazowania. Krótko inkubować je przez 5 minut na lodzie na wytrząsarce przed wyjęciem DPBS przez pipetowanie. Próbki są teraz gotowe do barwienia.</li>
	<li>Wybarwić próbki, dodając mieszaninę 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w stosunku 1:100 (1 mg / ml, do barwienia jąder) i falloidyny 568 (do barwienia F-aktyny) w DPBS przez co najmniej 30 minut i przemywać je dwukrotnie DPBS przed obrazowaniem.</li>
</ol>
6. Obrazowanie i analiza różnych parametrów wzrostu guza
UWAGA: Następujące kroki mogą być wykonane dla stałych próbek obrazowania żywych komórek.
<ol>
	<li>Do obserwacji guza-sferoidy należy użyć odwróconego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu 10x, który umożliwia obrazowanie stosu z mniej więcej dolnej jednej trzeciej sferoidy. 
	UWAGA: Ze względu na grubość próbki korzystny może być również mikroskop 2-fotonowy. Do optymalnej identyfikacji poszczególnych komórek może być potrzebna wyższa moc lasera i czas naświetlania.</li>
	<li>Po akwizycji połącz stosy za pomocą projekcji z za pomocą Fiji, czyli oprogramowania ImageJ (Fiji). Następnie przetworzyć wynikowy kanał sygnału H1299-GFP, stosując automatyczny próg (np. Automatyczny próg Huang) i usunąć szum szczątkowy, usuwając plamki obrazu w zależności od ilości tła i intensywności sygnału.</li>
	<li>Zmierz parametry sferoidy za pomocą Fidżi.
	<ol>
		<li>Obszar: Zmierz rozmiar sferoidy za pomocą narzędzia Różdżka.</li>
		<li>Obwód: Uwzględnij obwód w ustawieniach pomiaru.</li>
		<li>Średnica: Uwzględnij średnicę Fereta w ustawieniach pomiaru.</li>
		<li>Obiegowość: Uwzględnij deskryptory kształtu w ustawieniach pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz parametry poszczególnych komórek rakowych za pomocą Fidżi.
	<ol>
		<li>Zmierz liczbę atakujących komórek.
		<ol>
			<li>Wybierz centralną sferoidę za pomocą narzędzia Różdżka i usuń sygnał. Spowoduje to usunięcie sferoidy, a także wszystkich połączonych sygnałów komórek, które są nadal przyłączone do sferoidy, z analizy.</li>
			<li>Następnie użyj narzędzia Analizuj cząstki lub określ ilościowo wszystkie szczątkowe pojedyncze sygnały. 
			UWAGA: Wynikiem będzie liczba atakujących komórek rakowych. Ponadto wynik może również pokazywać reprezentatywny obszar pokryty komórkami nowotworowymi i być interpretowany jako inwazja zbiorowa lub inwazja jednokomórkowa, w zależności od wielkości obszaru. Aby jeszcze bardziej potwierdzić liczbę atakujących komórek rakowych, maskę analizowanych cząstek można było położyć nad kanałem DAPI i policzyć jądra.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie oceń wyniki za pomocą programu statystycznego, takiego jak GraphPad Prism lub Microsoft Excel. 
	UWAGA: Wykazano, że ten protokół jest zarówno solidny, jak i elastyczny. Był używany w naszym laboratorium ponad 50 razy, zawsze z pierwotnymi ludzkimi makrofagami od co najmniej 3 dawców, aby uwzględnić zmienność dawców. Wykazano, że w obecnej formie protokół prowadzi do wskaźnika sukcesu na poziomie 90-95%. Ponieważ jednak konfiguracja jest złożona, różne wyniki mogą być również wynikiem, ponieważ interakcja makrofagów dla każdej sferoidy jest indywidualna. Dlatego sugeruje się wykonanie eksperymentu co najmniej 3 razy z 5 sferoidami, aby uzyskać statystycznie istotny wynik.</li>
</ol>

Examining Macrophage-Tumor Spheroid Interactions in a 3D Collagen Matrix Setup

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Inwazja komórek nowotworowych pozostaje ważnym, ale niedostatecznie zbadanym tematem w kontekście współinwazji komórek odpornościowych, takich jak makrofagi. Zbiorowa i indywidualna inwazja komórek nowotworowych jest krytycznym procesem podczas przerzutów i wykazano, że obniża wskaźnik przeżycia pacjentów z rakiem ze względu na mnogość inwazji różnych narządów 8,9. Badania in vivo są złożone i ograniczają się do laboratoriów z dostępem do pomieszczeń dla zwierząt. Co więcej, trudno jest również kontrolować warunki in vivo lub specyficznie manipulować poszczególnymi aspektami. W związku z tym potrzeba bardziej dostępnego systemu pozostaje niezbędna, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania w pierwszej linii badań.
Dzięki przedstawionej tutaj metodzie opracowaliśmy sposób, w jaki i) komórka odpornościowa i ii) zachowanie komórek nowotworowych, iii) wzrost i rozwój stałej sferoidy oraz iv) wpływ komórek w otaczającym mikrośrodowisku guza (TME) na komponenty ECM może być dalej analizowany. Można go wykorzystać do porównania wpływu zmodyfikowanych (np. zubożonych na określone regulatory przez leczenie siRNA) makrofagów na inwazyjność pojedynczych komórek nowotworowych z litej sferoidy. To, czy fizyczna rearanżacja TME, czy wydzielane czynniki stanowi główną przyczynę obserwowanego zachowania komórek nowotworowych, jest obecnie niejasne i wymaga bardziej szczegółowej analizy.
Ponadto również same komórki nowotworowe mogą być manipulowane, na przykład poprzez leczenie siRNA lub nokautowanie określonych regulatorów. Co więcej, analizę można ulepszyć, porównując liczbę zliczonych jąder w obrębie zidentyfikowanego profilu komórkowego, aby umożliwić bardziej precyzyjne określenie atakujących komórek nowotworowych.
Wykorzystaliśmy ten test do określenia wpływu makrofagów w TME na inwazję komórek nowotworowych. Należy jednak również zauważyć, że komórki nowotworowe mogą wpływać na aktywność makrofagów, prawdopodobnie poprzez czynniki wydzielane w pożywce. W związku z tym warto byłoby również podjąć próbę zidentyfikowania zmian w makrofagach, takich jak zmieniony stan polaryzacji (M1 vs. M2) przez barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu odpowiednich przeciwciał. W przeszłości porównanie między komórkami rosnącymi w monowarstwach a komórkami hodowanymi w środowisku 3D wykazało znaczące różnice w ich profilach ekspresji10.
Ponadto pouczające może być sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) subpopulacji makrofagów i ich integracja z procedurą eksperymentalną. Wreszcie, co nie mniej ważne, bardziej szczegółowe obrazowanie obszarów kontaktu, w których makrofagi oddziałują z komórkami nowotworowymi lub sferoidalną powierzchnią guza, może doprowadzić do identyfikacji dalszych mechanizmów związanych z inwazją i interakcją 3D.
Warto zauważyć, że nie można go w pełni kontrolować, jest precyzyjne umieszczenie sferoidy w środku studni po dodaniu mieszanki kolagenu. Ilość kolagenu pod sferoidą jest szczególnie trudna do regulacji. W tym przypadku ustalono inne metody, które pozwalają na precyzyjne pozycjonowanie sferoidy, np. na wierzchu form agarozowych o większej liczbie próbek11. Ponieważ jednak uwalnianie cytokin jest powszechnym mechanizmem, wszystkie sferoidy w tym teście wielosferoidalnym są narażone na wydzielane czynniki, a liczba komórek odpornościowych działających na pojedynczą sferoidę jest trudna do kontrolowania.
Jednym z podstawowych ograniczeń tego protokołu jest zdolność linii komórek rakowych do tworzenia jednolitych sferoid, a zatem ma zastosowanie tylko do podzbioru linii komórkowych. Na przykład komórki czerniaka MeWo tworzą nierówne, arkuszowe struktury 3D, ale bez jednolitych sferoid.
Należy również zauważyć, że test jest wysoce elastyczny, ponieważ wiele jego cech można modyfikować, takich jak materiał ECM, liczba komórek lub poprzez dodanie określonych czynników, takich jak cytokiny do supernatantu. W związku z tym powinien on być wysoce odpowiedni do wstępnych badań in vitro interakcji między komórką nowotworową a komórką odpornościową i może być dostosowany do konkretnego pytania badawczego, które jest obecnie przedmiotem konsultacji.

Makrofagi są główną częścią wrodzonego układu odpornościowego i stanowią pierwszą linię obrony w wielu stanach patologicznych, takich jak infekcje czy usuwanie resztek komórkowych po urazach1. W ciągu ostatnich dziesięcioleci wpływ komórek odpornościowych na progresję raka był jednym z aspektów wielu badań. W związku z tym wykazano, że makrofagi mogą ułatwiać przerzuty poprzez kojarzenie się z guzami pierwotnymi i stawanie się makrofagami związanymi z nowotworem (TAM)2. Makrofagi mogą zmieniać swój profil ekspresji po wystawieniu na działanie komórek rakowych, sprzyjając ucieczce przerzutów z układu odpornościowego3. Ponadto wykazano, że komórki rakowe mogą wykorzystywać defekty w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) generowane przez makrofagi do ucieczki z guza pierwotnego i że ich zachowanie jest również manipulowane przez wychwyt wydzielanych czynników, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)4,5. To wzajemne oddziaływanie aspektów fizycznych i chemicznych wymaga opracowania nowych metod charakteryzowania wpływu komórek odpornościowych na rozprzestrzenianie się guza i otaczające go mikrośrodowisko.
Opracowano różne podejścia do badania zachowania komórek odpornościowych w kontekście przerzutów in vivo6. Jednakże, podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów na zwierzętach, potrzebna jest licencja na przeprowadzanie testów na zwierzętach i obiekt dla zwierząt; Podejścia te już teraz wymagają dużego rozwoju i przygotowania. Co więcej, analiza jest często skomplikowana, zwłaszcza w odniesieniu do obrazowania żywych komórek, ponieważ nie wszystkie próbki są dostępne dla większości ustawień mikroskopowych. Opracowanie nowych metod testowania hipotez w pierwszej kolejności w kwalifikowanych warunkach in vitro jest również konieczne i aktualne, ponieważ nauka i społeczeństwo dążą do prowadzenia badań bez udziału zwierząt w celu zmniejszenia liczby uśmiercanych zwierząt.
W niedawnej publikacji7, badaliśmy wpływ pierwotnych ludzkich makrofagów na inwazyjność inwazyjnych komórek rakowych ze sferoidy guza. W tym celu opracowaliśmy test koinwazji makrofagów i guza sferoidalnego oparty na kolagenie I. W tym kontekście naszym celem było wyjaśnienie roli szybkich szlaków recyklingu metaloproteinazy macierzy membranowej typu 1 (MT1-MMP) w makrofagach. Przetestowaliśmy makrofagi, które zostały zubożone pod kątem super procesywnej kinezyny KIF16B, którą zidentyfikowaliśmy jako główny czynnik recyklingu MT1-MMP, oraz ich wpływu na zdolności inwazyjne komórek H1299 - białka zielonej fluorescencji (GFP) z litej sferoidy. Makrofagi zubożone w KIF16B wykazują obniżony poziom MT1-MMP związanego z błoną na swojej powierzchni, podczas gdy same komórki H1299 nie były leczone.
O ile nam wiadomo, nie opisano podobnej metody, która pozwalałaby na pełne obrazowanie i analizę jednoczesnej inwazji makrofagów, guzów i sferoidów. Chociaż w naszej ostatniej publikacji7 skupiliśmy się na analizie indywidualnie migrujących komórek odległych od sferoidy, test pozwala na wiele dalszych badań, takich jak liczba inwazyjnych nici, białka zaangażowane w interakcję komórka rakowa - makrofag, stopień degradacji kolagenu I lub inne właściwości sferoidalne, takie jak długość jego obwodu.

<table><tbody><tr><td>15 &mikro;-Angiogeneza szkiełkowa&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Falloidyna&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Mikrokulki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I Ogon szczura&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio& Komórka</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi&nbsp;</td><td>Wersja NIH</td><td>ImageJ 2: 2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%&nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Linia</td> komórkowa Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td>H1299-GFP</td> Albumina surowicy ludzkiej Sigma-Aldrich A5843 Leica TCS SP8 X Leica l-glutamina&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów (LSM) 1077</td><td>Kolumny PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 Well, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp;</td><td>Branże naukowe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

Interakcja komórek immunologicznych i nowotworowych oraz ich wpływ na przerzuty stanowi ważny aspekt badań nad rakiem. Jak dotąd dostępnych jest tylko kilka protokołów, które pozwalają na przybliżenie in vitro sytuacji in vivo. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie podejście do obserwacji wpływu ludzkich makrofagów na inwazyjność komórek nowotworowych, z wykorzystaniem sferoid nowotworowych komórek niedrobnokomórkowego raka płuca H1299 osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I. Dzięki tej konfiguracji do kohodowli przetestowaliśmy wpływ niedoboru czynników regulacyjnych w makrofagach opartego na małych interferujących RNA (siRNA) na inwazję 3D komórek rakowych ze sferoidy guza w porównaniu z kontrolami. Metoda ta pozwala na określenie różnych parametrów, takich jak obszar sferoidalny czy liczba inwazyjnych komórek nowotworowych, a co za tym idzie, na wykrycie różnic w inwazji komórek nowotworowych. W tym artykule przedstawiamy odpowiednią konfigurację, omawiamy późniejszą analizę, a także zalety i potencjalne pułapki tej metody.

Rysunek 1 przedstawia sferoid H1299-GFP obrazowany w odpowiednich dniach inkubacji w matrycy z kolagenu I. Odpowiedni obraz w świetle przechodzącym, wykonany w dniu 0, pokazuje również pierwotne ludzkie makrofagi współhodowane ze sferoidem. Reprezentatywny obraz zarejestrowany w 3. dniu eksperymentu został powiększony po obróbce. Wskazano różne parametry, które mogą być analizowane, w tym liczbę naciekających komórek, miejsca inwazji zbiorowej oraz obwód sferoidu. Dołączona tabela przedstawia wyniki uzyskane z tego obrazu. Liczba wykrytych sygnałów odpowiada wrażeniom wizualnym. Nie są widoczne żadne uszkodzenia centralnego sferoidu, co wskazuje na rzeczywistą inwazję pojedynczych komórek nowotworowych, a nie na obecność komórek pochodzących z fragmentów sferoidu. Wyniki dla różnych sferoidów i warunków można teraz porównać za pomocą analizy statystycznej.
<img alt="Badanie inwazji sferoidów H1299-GFP, interakcja z makrofagami; schemat z przedstawionymi wynikami danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki. (Panel górny) Sferoid H1299-GFP obrazowany w dniu 0, 1, 2 i 3 inkubacji w matrycy z kolagenu I. (Panel środkowy lewy) Obraz sferoidu w świetle przechodzącym, pokazujący współhodowane pierwotne ludzkie makrofagi. (Panel środkowy prawy) Reprezentatywny obraz uzyskany w 3. dniu, powiększony po obróbce, pokazujący różne parametry, które można analizować (obwód sferoidu zaznaczony na czerwono; odrysowany ręcznie dla lepszej wizualizacji). (Panel dolny) Wyniki uzyskane z obrazu w panelu środkowym prawym. Uwaga: Makrofagi nie są widoczne, ponieważ zarejestrowano tylko kanał GFP, aby wyjaśnić zachowanie komórek nowotworowych. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Chcemy zbadać wzajemne oddziaływanie komórek nowotworowych i odpornościowych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób oddziałują one na siebie podczas przerzutów. W większości przypadków modele in vivo są rutynowym sposobem na zadawanie pytań badawczych dotyczących inwazji 3D komórek nowotworowych w kontekście układu odpornościowego lub skupiania się na wyizolowanych elementach systemu. Metoda pozwalająca na analizę zachowania komórek, która naśladuje złożoność sytuacji in vivo, ale pozwala na bardziej bezpośrednią manipulację określonymi cechami środowiskowymi pod mikroskopem.Wykazujemy, że niezmienione komórki rakowe powinny zmniejszać inwazję w macierzy kolagenu 3D I, gdy są współhodowane razem z makrofagami, które zostały zubożone dla białka motorycznego KIF16B. Wskazuje to na rolę recyklingu białek powierzchniowych makrofagów w mikrośrodowisku guza za pomocą KIF16B. Chcielibyśmy nadal ulepszać naszą metodę w sposób, który umożliwia wizualizację degradacji macierzy na styku makrofagów w kontekście komórek rakowych, uzyskując w ten sposób lepsze zrozumienie mechanizmów degradacji i adhezji.Na początek hoduj komórki H1299 GFP z pożywką z komórek rakowych w kolbie do hodowli komórek o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż osiągną 80% konfluencji. Umyj komórki raz DPBS i dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA przez dwie do trzech minut, aż komórki zostaną odłączone. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając dwa mililitry pożywki z komórek rakowych.Następnie odwirować odłączoną zawiesinę komórkową w 15-mililitrowej probówce o stężeniu 245 G przez pięć minut. Usunąć sklarowany osad zawierający roztwór trypsyny przed przemyciem osadu pięcioma mililitrami DPBS. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki z komórek rakowych.Policz komórki za pomocą komory Neubauera. Przenieś 8 000 komórek do 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności w końcowej objętości 25 mikrolitrów pożywki z komórkami rakowymi. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po trzech dniach sprawdź sferoidy pod mikroskopem pod kątem jednorodności. Po pobraniu próbki krwi ludzkiej przenieś 20 mililitrów krwi z worka do transfuzji do 50-mililitrowej probówki reakcyjnej. Dodaj 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów do nowej 50-mililitrowej probówki.Ostrożnie przenieść 20 mililitrów krwi do probówki zawierającej pożywkę do separacji limfocytów bez mieszania i odwirować mieszaninę w stężeniu 450 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas wirowania dodaj 10 mililitrów zimnego podłoża RPMI 1640 do nowej 50-mililitrowej probówki. Po odwirowaniu przenieś gęstą białą fazę z probówki zawierającej krew do przygotowanej probówki zawierającej RPMI i napełnij ją do 50 mililitrów zimnym RPMI.Odwirować zawiesinę o sile 450 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić sklarowany osad. Ponownie zawieś pellet w 10 mililitrach zimnego RPMI i napełnij go do 50 mililitrów RPMI 1640. Ponownie odwiruj mieszaninę i ponownie zawieś granulkę w 50 mililitrach RPMI.Ponownie odwiruj próbkę i ponownie zawieś osad komórkowy w 1,5 mililitra zimnego buforu monocytów. Następnie dodaj 250 mikrolitrów mikrogranulek anty CD14 do zawiesiny komórkowej i inkubuj przez 15 minut na lodzie. Podczas inkubacji należy przygotować kolumnę separacyjną, mocując filtr do stojaka separatora magnetycznego.Dodaj 900 mikrolitrów buforu monocytów do kolumny w celu zrównoważenia. Po inkubacji wlać zawiesinę komórkową na filtr i pozwolić jej przepłynąć grawitacyjnie do rurki odpływowej. Dodaj jeden mililitr buforu monocytów, aby umyć kolumnę zawierającą komórki związane z kulkami magnetycznymi.Wymień rurkę odpływową pod kolumną na świeżą 50-mililitrową rurkę zawierającą 20 mililitrów RPMI. Dodaj trzy mililitry buforu monocytów do kolumny. Zdejmij kolumnę ze stojaka magnetycznego i przymocuj stempel.Wciśnij ogniwa do przygotowanej rurki o pojemności 50 mililitrów i napełnij ją do 30 mililitrów RPMI. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera pod mikroskopem świetlnym i dostosuj liczbę komórek do dwóch razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr za pomocą RPMI. Wysiewaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki komory sześciodołkowej i inkubuj przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po inkubacji sprawdź, czy komórki prawidłowo przylegają i zastąp RPMI 1,5 mililitra monopożywki. Kontynuuj inkubację przez okres do sześciu dni, aż monocyty zróżnicują się w makrofagi. Po wyprowadzeniu pierwotnych ludzkich makrofagów z próbek krwi dawcy na sześciodołkowej płytce, dodaj 500 mikrolitrów Accutase i inkubuj przez 40 minut, aby oderwać makrofagi.Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki i przenieś do 15-mililitrowej probówki wirówkowej w celu odwirowania. Następnie umyj komórki raz dwoma mililitrami DPBS i policz je za pomocą komory Neubauera. Rozcieńczyć żądaną liczbę makrofagów w 40 mikrolitrach kolagenu, który mieszam, i krótko przekręcić rurkę.Aby umyć sferoidy, dodaj 300 mikrolitrów DPBS do dołków 96-dołkowej płytki. Użyj jednomililitrowej niebieskiej końcówki pipety z odciętym końcem, aby zebrać steryd z DPBS. Gdy steryd osiądzie w końcówce, na krótko popchnij pipetę na dno komory obrazowania, aby przenieść steryd guza przez napięcie powierzchniowe.Usuń jak najwięcej pozostałości DPBS przenoszonych z sterydów, jak to możliwe. Szybko dodaj 40 mikrolitrów mieszanki makrofagów kolagenu I do komory obrazowania zawierającej steryd. Inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnych warunkach, aby w pełni spolimeryzować mieszankę kolagenową.Po polimeryzacji ostrożnie dodaj 25 mikrolitrów pożywki z komórek rakowych do każdej studzienki i kontynuuj inkubację przez trzy dni. Zobrazuj żywą próbkę za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego w żądanych punktach czasowych. Obszar sferoidalny H1299 GFP został zmierzony na 40 307 mikrometrów kwadratowych w trzecim dniu inwazji, podczas gdy obwód sferoidalny okazał się mieć 1700,17 mikrometrów, co wskazuje na wzrost w czasie.Zaobserwowano zbiorową inwazję komórek nowotworowych ze sferoidy. Zidentyfikowano 51 wyizolowanych cząstek, które służą jako wskaźnik inwazji poszczególnych komórek rakowych. Sferoida zachowała współczynnik kształtu 1,10 i okrągłość 0,18, wykazując niską deformację.

a-macrophage-tumor-spheroid-co-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Poznaj metodę współkultury sferoidów guzowych z makrofagami w macierzy kolagenowej 3D. Technika ta pozwala badać rolę KIF16B w recyklingu białek powierzchniowych makrofagów i ich wpływ na inwazję komórek nowotworowych.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Przeglądaj więcej filmów