In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych
7 marca 2025
Ten protokół przedstawia metodologię rekapitulacji upośledzonej neurogenezy zespołu Downa (DS) przy użyciu ludzkich iPSC DS. W protokole zidentyfikowano dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzenia neurogenezy w zespole Downa. Stanowi solidną platformę do zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw nieprawidłowej neurogenezy związanej z ZD.
Długoterminowe badania koncentrują się na znalezieniu potencjalnych metod leczenia zaburzeń neurologicznych w zespole Downa. Obecnie skupiamy się na upośledzonej neurogenezie zespołu Downa, głównej przyczynie niepełnosprawności intelektualnej. Odkryliśmy, że upośledzona neurogeneza zespołu Downa jest spowodowana dwufazowym defektem cyklu komórkowego, w przeciwieństwie do powszechnego przekonania, że jest to spowodowane tylko starzeniem się nerwowych komórek progenitorowych zespołu Downa.
Identyfikacja dwufazowego defektu cyklu komórkowego przy użyciu ludzkiego protokołu opartego na IPSC opisanego w tym manuskrypcie będzie napędzać potencjalne strategie terapeutyczne rozwoju, biorąc pod uwagę zarówno stan cyklu komórkowego, który jest zmniejszoną proliferacją we wczesnej fazie, jak i niepowodzenie wyjścia z cyklu komórkowego w późnej fazie. Na początek dodaj 10 mikromolów inhibitora skały do kompletnego ludzkiego podłoża iPCS, DPBS, roztworu do odrywania komórek i pożywki kondycjonowanej przez pożywkę uzupełnioną 25 nanogramami na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów. Podgrzej wszystkie odczynniki do 37 stopni Celsjusza.
Weź sześciodołkową płytkę iPSC na podajnikach. Odpipetować zróżnicowane kolonie i dodać świeżą, kompletną pożywkę iPSC dla ludzi. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla na dwie godziny.
Po inkubacji przemyj studzienki raz DPBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla na 12 do 14 minut.
Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Jeśli większość komórek odrywa się, ale niektóre pozostają przyklejone, delikatnie postukaj w płytkę z boków. Dodaj trzy mililitry DPBS uzupełnionego wapniem i magnezem do każdej studzienki, aby rozcieńczyć roztwór do odrywania komórek.
Za pomocą pipety o pojemności pięciu mililitrów wykonaj delikatne pipetowanie dwa do trzech razy, aby rozbić grudki, unikając pęcherzyków. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do wirówki o pojemności 50 mililitrów 2. Odwirować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 200 G. Użyj systemu aspiracji próżniowej, aby delikatnie zassać pożywkę.
Teraz ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach ludzkiego podłoża iPSC. Przenieś wszystkie komórki w zawiesinie na 15-centymetrowe naczynie pokryte 0,1% żelatyną i inkubuj w inkubatorze dwutlenku węgla. Zebrać pożywkę z komórkami do wirówki 2.
Wirować w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 200 G. Następnie delikatnie zassać pożywkę za pomocą systemu zasysania próżniowego. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki kondycjonowanej przez pożywkę, uzupełnionej 25 nanogramami na mililitr BFGF i 10 mikromolami inhibitora skały. Po zliczeniu komórek przygotuj zawiesinę od 30 000 do 50 000 komórek na mililitr.
Wysiew zawiesinę umieścić w płytce studzienki. Po dwóch dniach zastąp pożywkę kondycjonowaną przez pożywkę pożywką neuronalną komórką progenitorową lub pożywką NPC. Zmień media w drugim i 18 dniu, zgodnie z podano.
W 28 dniu zastąp pożywkę w płytce pożywką NPC uzupełnioną 10 mikromolami inhibitora skalnego. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwie godziny. Po inkubacji odessać supernatant i raz przemyć studzienki DPBS bez wapnia i magnezu.
Dodaj jeden mililitr roztworu do odrywania komórek do każdej studzienki. Następnie obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu. Następnie odpipetuj trzy mililitry DPBS uzupełnionego wapniem i magnezem do każdego dołka płytki.
Za pomocą pięciomililitrowej pipety delikatnie odpipetuj zawiesinę i rozbij wszelkie grudki. Przecedź zawiesinę komórkową przez 40-mikrometrowe sitko umieszczone nad 50-mililitrową wirówką 2. Odwirować i zassać, jak pokazano wcześniej, a następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze określonego podłoża różnicującego uzupełnionego witaminą B 27 z witaminą A. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
Następnie wysiewaj 50 000 komórek do każdego dołka kwalifikowanej płytki 48-dołkowej pokrytej matrycą. W 33 dniu zastąp pożywkę w studzienkach hodowlanych pożywką różnicującą neurony. W hodowlach zespołu Downa zaobserwowano znaczne zmniejszenie liczby neuronów TUBB3-dodatnich w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi, z około dwukrotnym spadkiem widocznym w 85 dniu.
Znacznie mniejszy odsetek komórek KI67 dodatnich zaobserwowano w hodowlach zespołu Downa we wczesnym stadium neurogennym w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi, wykazując około czterokrotną redukcję. W późnym stadium neurogennym większość izogenicznych komórek euploidalnych opuściła cykl komórkowy z minimalnym zabarwieniem KI67, podczas gdy większość komórek zespołu Downa pozostała KI67-dodatnia, wykazując pięciokrotny wzrost. Druga para zespołu Sseeda i izogenicznych euploidalnych ludzkich iPSC potwierdziła obniżony poziom neuronów TUBB3-dodatnich i podwyższony PAX6-dodatnie neuronalne komórki progenitorowe w hodowlach zespołu Downa pod koniec różnicowania neuronalnego, z dwukrotnym zmniejszeniem liczby neuronów TUBB3-dodatnich i ponad dwukrotnym wzrostem komórek PAX6-dodatnich.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodologię odtworzenia upośledzonej neurogenezy charakterystycznej dla zespołu Downa (DS) z wykorzystaniem ludzkich iPSC z zespołem Downa. Badanie wskazuje na dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzonej neurogenezy w zespole Downa, zapewniając solidną platformę do zrozumienia leżących u podstaw komórkowych i molekularnych mechanizmów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Zespół Downa wiąże się z upośledzoną neurogenezą, co przyczynia się do niepełnosprawności intelektualnej.
- Niniejsze badanie podważa przekonanie, że upośledzenie neurogenezy wynika wyłącznie z procesów starzenia się komórek progenitorowych neuronów.
- Zidentyfikowano, że istotnym czynnikiem są dwufazowe defekty cyklu komórkowego.
Cel badania
- Wyjaśnienie mechanizmów upośledzenia neurogenezy w zespole Downa.
- Opracowanie protokołu badania iPSC związanych z zespołem Downa.
- Zbadanie potencjalnych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na stany cyklu komórkowego.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano ludzkie iPSC do modelowania neurogenezy w zespole Downa.
- Głównym modelem biologicznym była hodowla komórek progenitorowych neuronów.
- Kluczowe etapy obejmowały odklejanie komórek, inkubację oraz specyficzną wymianę pożywki w ciągu 33 dni.
- Ważnymi elementami metodologicznymi były liczenie komórek oraz pożywka różnicująca.
Główne wyniki
- Kultury z zespołem Downa wykazały istotną redukcję neuronów pozytywnych pod kątem TUBB3 oraz niższą proporcję komórek pozytywnych pod kątem Ki67 podczas wczesnej neurogenezy.
- Podczas późnej neurogenezy komórki z zespołem Downa wykazywały przedłużone utrzymywanie się w cyklu komórkowym w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi.
- Wyniki te podkreślają krytyczny wpływ dwufazowych defektów cyklu komórkowego na upośledzenie neurogenezy.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia nową wiedzę na temat upośledzenia neurogenezy w zespole Downa, kładąc nacisk na dynamikę cyklu komórkowego.
- Wyniki te mogą stanowić podstawę dla podejść terapeutycznych ukierunkowanych na neurogenezę w zespole Downa.
- Zrozumienie tych mechanizmów może pogłębić wiedzę na temat rozwoju neuronów oraz zaburzeń neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie neurogenezy w zespole Downa z wykorzystaniem ludzkich iPSC umożliwia precyzyjne badanie istotnych dla choroby mechanizmów komórkowych, wspierając wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. System ten zapewnia pewność prognostyczną w zakresie modulacji szlaków neurorozwojowych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych dla programów terapeutycznych ukierunkowanych na OUN. Podejście to łączy biologię odkrywczą z badaniami translacyjnymi poprzez odwzorowanie dwufazowych defektów cyklu komórkowego obserwowanych w progenitorach neuronalnych w zespole Downa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę mechanizmów upośledzenia neurogenezy w ludzkim kontekście genetycznym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie defektów proliferacji i różnicowania w komórkach progenitorowych neuronów w DS.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie nieprawidłowości wczesnej od późnej fazy cyklu komórkowego.
- Zapewnia solidny system do weryfikacji hipotez dotyczących wpływu trisomii 21 na rozwój układu nerwowego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Tworzy zwalidowane modele progenitorów neuronalnych pochodzących z hiPSC do ilościowego przesiewania fenotypowego.
- Zapewnia powtarzalne odczyty, takie jak ilościowe oznaczenia markerów TUBB3, KI67 i PAX6, w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia skalowalną ocenę związków kandydujących celujących w szlaki neurogenezy w DS.
- Wspiera dalsze procesy przesiewowe poprzez dostarczenie fenotypów komórkowych istotnych dla danej choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność translacyjną poprzez powiązanie wyników in vitro z istotnymi dla choroby biomarkerami neurorozwojowymi.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka w rozwoju programów dotyczących OUN poprzez modelowanie defektów neurogenezy specyficznych dla ludzi.
- Stanowi platformę do przedklinicznej oceny strategii terapeutycznych celujących w regulację cyklu komórkowego w DS.
- Wspiera predykcyjne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do wyników późnej dyferencjacji neuronalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model neurogenezy oparty na hiPSC integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesną walidację mechanistyczną oraz wspierając identyfikację wiodących związków w badaniach nad schorzeniami OUN.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wpływu trisomii 21 na proliferację i różnicowanie progenitorów neuronalnych.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki do oceny związków ukierunkowanych na defekty neurogenezy.
- Analityka: Dostarcza mierzalne punkty końcowe, takie jak uzysk neuronów TUBB3-dodatnich oraz ekspresja markerów KI67/PAX6 do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy komórkowe in vitro z biomarkerami neurorozwojowymi istotnymi dla choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalną, zestandaryzowaną platformę do modelowania zaburzeń neurorozwojowych poza zespołem Downa.
Wpływ operacyjny i instytucjonalny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w zakresie upośledzenia neurogenezy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie chorób i powtarzalność testów w celu zapewnienia porównywalności międzyprogramowej.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka we wczesnych etapach odkrywania leków na OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na terapie neurorozwojowe z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli hiPSC, różnicowaniu neuronalnym oraz ilościowej immunocytochemii.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury do hodowli komórkowej, obrazowania i analizy.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów różnicowania oraz kwantyfikacji markerów pomiędzy zespołami.
- Można wymagać adaptacji w celu modelowania innych zaburzeń neurorozwojowych lub różnych tło genetycznych.
- Ograniczenia obejmują uwarunkowania systemu in vitro oraz potrzebę dalszej walidacji in vivo.
