Name: In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu ludzkich komórek iPSC. Protokół identyfikuje dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzenia neurogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Stuartowi H. Orkinowi za dostarczenie nam pary zespołów Downa i izogennych euploidalnych hiPSC. Autorzy są również wdzięczni Narodowemu Centrum Nauk o Komórkach (BRIC-NCCS) w Pune za zapewnienie funduszy na przeprowadzenie tych prac.

Następujący protokół został zastosowany z dwiema parami zespołu Downa i jego izogenicznymi euploidalnymi ludzkimi iPSC. Jedna para została wygenerowana przy użyciu metody dostarczania za pośrednictwem retrowirusa reprogramming19, a druga para (NSi003-A i NSi003-B) została wygenerowana przy użyciu nieintegrującej metody dostarczania wirusa Sendai20. Protokół zasadniczo składa się z dwóch etapów: etapu neurogennego (etap 1) i etapu różnicowania neuronalnego (etap 2). Ponadto w stadium neurogennym obserwuje się dwie fazy oparte na różnicach w proliferacji zespołu Downa i izogennych euploidalnych linii komórkowych, tj. fazę wczesną i późną. Szczegółowe informacje na temat odczynników, pożywek i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Hodowla i utrzymanie hiPSC zespołu Downa oraz izogeniczne euploidalne hiPSC
<ol>
	<li>Poszycie podajnika dla hiPSCs 
	UWAGA: Jakość i gęstość karmnika są niezwykle ważne dla dobrej jakości hodowli ludzkich iPSC.
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml 0,1% żelatyny, aby pokryć 6-dołkową płytkę przez co najmniej 1-2 godziny w temperaturze 37 °C przed wysiewem z komórkami zasilającymi.</li>
		<li>Płytkę pokrytą żelatyną należy przechowywać w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.</li>
		<li>Ciepłe mysie pożywki z fibroblastami embrionalnymi (MEF) do stosowania do odrodzenia w kąpieli perełkowej/kąpieli wodnej.</li>
		<li>Porcjować 5 ml pożywki MEF do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wyjąć fiolkę z komórkami zasilającymi ze zbiornika ciekłego azotu (zbiornik LN2). 
		UWAGA: Komórki karmicielskie uzyskano przez traktowanie mysich fibroblastów embrionalnych E13.5 10 μg / ml mitomycyny C przez 3 godziny, a następnie 2-3 razy płukanie DPBS18. Ogniwa zasilające mogą być używane bezpośrednio lub zamrożone w zbiorniku LN2 do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie myszy wykorzystano po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt.</li>
		<li>Przechowywać fiolkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej za pomocą pływającego rusztu, aż pozostanie mały kawałek lodu.</li>
		<li>Weź fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego i wysterylizuj ją alkoholem przed włożeniem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Dodawać kroplą 1 ml ciepłej pożywki MEF (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Delikatnie wyjąć pożywkę z fiolki i wlać kropla po kropli do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej pożywkę MEF.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g.</li>
		<li>Zassać supernatant za pomocą systemu aspiracji próżniowej (VAS).</li>
		<li>Dodaj 1 ml pożywki MEF i delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-4 razy.</li>
		<li>Weź liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Martwe komórki wykluczono za pomocą błękitu trypanowego.</li>
		<li>Płytka 3,1-3,3 x 105 żywych komórek zasilających na dołek płytki 6-dołkowej lub 2 x 106 komórek na płytkę 6-dołkową w pożywce MEF.</li>
		<li>Przechowywać płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przy wilgotności 85% przez noc. Potrząśnij płytką wewnątrz inkubatora CO2 przód-tył i boki 2-3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek zasilających.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odrodzenie hiPSC zespołu Downa i izogennych euploidalnych hiPSC 
	UWAGA: Podgrzej wymaganą objętość pożywki hiPSC w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 °C. 
	Pożywka dla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC): Świeżo dodaj 25 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i inhibitora 10 μM Rock (RI) (Y-27632 2HCl) w pożywce hiPSC.
	<ol>
		<li>Dobrze usuń pożywkę MEF z karmników i przepłucz je jednym myciem, delikatnie dodając 1 ml / studzienkę ciepłego DMEM / F12 z boków studzienki. Odessać pożywkę i dodać 2 ml / dobrze ogrzaną pożywkę ożywiającą hiPSC. Pozostawić płytkę w inkubatorze na co najmniej 2 godziny przed posiewem hiPSC.</li>
		<li>Wyjmij fiolkę z hiPSC.</li>
		<li>Przechowywać fiolkę na pływającym ruszcie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie mały kawałek lodu.</li>
		<li>Przed umieszczeniem fiolki w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy ją wysterylizować 70% alkoholem.</li>
		<li>Dodaj 1 ml ciepłej pożywki hiPSC.</li>
		<li>Delikatnie wyjąć pożywkę z fiolki i wlać kropla po kropli do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 5 ml pożywki ożywiającej hiPSC.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przy 100 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant za pomocą VAS i usunąć osad, delikatnie stukając w rurkę.</li>
		<li>Wlać 500 μl pożywki hiPSC z 10 μM RI i zalać płytką podającą zawierającą pożywkę ożywiającą hiPSC. Oznacz tabliczkę nazwą komórki, numerem przejścia, nazwiskiem badacza i datą.</li>
		<li>Obserwuj kolonie hiPSC pod odwróconym mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu; powinny być tam skupiska komórek.</li>
		<li>Trzymając płytkę w inkubatorzeCO2, potrząśnij płytką przód-tył i boki 2-3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek. Nie naruszaj płyty przez 24 godziny.</li>
		<li>Następnego dnia niektóre kolonie mogą wyglądać na przylegające do karmników, a niektóre będą pływać. Nie odsysając żadnej pożywki, dodać świeżą pożywkę hiPSC uzupełnioną 25 ng/ml bFGF i 10 μM RI.</li>
		<li>Na drugi dzień po przebudzeniu większość kolonii była przyczepiona do powierzchni. Zamień kompletną pożywkę na pożywkę hiPSC z 25 ng/ml bFGF. W kolejnych dniach będą widoczne kolonie hiPSC. 
		UWAGA: HiPSC potrzebują co najmniej tygodnia, aby się ożywić i utworzyć kolonie z gładkimi, dobrze zdefiniowanymi granicami, jednolitą morfologią komórek i gęstym centrum kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie hiPSC zespołu Downa i izogeniczne euploidalne hiPSC na karmnikach 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być ciepłe przed rozpoczęciem. Należy unikać nadmiernego pipetowania komórek. Z komórkami obchodzić się bardzo delikatnie.
	<ol>
		<li>Przejście hiPSC gdy większość kolonii zaczyna łączyć się ze sobą lub gdy pojawia się zbyt wiele zróżnicowanych kolonii. Ogólnie rzecz biorąc, rozłupywanie należy wykonać w ciągu 5-7 dni po pierwszym pasażu.</li>
		<li>Ożyw fiolkę z karmnikami na dzień przed podziałem.</li>
		<li>Podać jedno przemycie do karmników 1 ml / studzienkę ciepłego DMEM / F12 i dodać 2 ml / studzienkę ciepłej pożywki hiPSC uzupełnionej 25 ng / ml bFGF. Pozostawić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na co najmniej 2 godziny przed posiewem hiPSC.</li>
		<li>Obserwować płytkę z hiPSC pod kątem zróżnicowanych kolonii i usunąć zróżnicowaną kolonię, złomując ją za pomocą pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Wykonać jedno przemycie hiPSC 1 ml/dobrze ciepły DMEM/F12.</li>
		<li>Wlać 1 ml/dołek 1 mg/ml roztworu kolagenazy. Trzymaj płytkę w inkubatorze przez 8-10 minut, a następnie obserwuj pod odwróconym mikroskopem luźne krawędzie kolonii.</li>
		<li>Odessać kolagenazę i podać 2 płukania DMEM/F12. Następnie dodać 1 ml/dołek hiPSC Medium.</li>
		<li>Delikatnie pokrój kolonie poziomo i pionowo 8-10 razy w dołku za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 2 ml. Obserwuj kolonie pod odwróconym mikroskopem, aby sprawdzić, czy większość kolonii została przycięta do odpowiedniego rozmiaru.</li>
		<li>Jeśli kolonie są wystarczająco pocięte, delikatnie podnieś je za pomocą podnośnika komórkowego.</li>
		<li>Delikatnie odpipetuj kolonie w studzience za pomocą końcówki o pojemności 1 ml, 5-8 razy, w zależności od wielkości kolonii.</li>
		<li>Zebrać wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przy 100 x g.</li>
		<li>Delikatnie odessać supernatant za pomocą pipety, usunąć osad komórkowy, delikatnie stukając w probówkę, a następnie dodać 200 μl pożywki hiPSC z 25 ng/ml bFGF i 10 μM RRI. Odpipetować 2-3 razy pipetą o pojemności 200 μl i dodać 300 μl więcej pożywki hiPSC z 25 ng/ml bFGF i 10 μM RRI.</li>
		<li>Teraz delikatnie umieść te komórki na podajnikach zawierających pożywkę hiPSC + 25 ng / ml bFGF. Jedną studzienkę można podzielić na 1:2 lub 1:3, w zależności od liczby kolonii obecnych po usunięciu zróżnicowanych kolonii. Oznacz tabliczkę nazwą komórki, numerem przejścia, nazwiskiem badacza i datą.</li>
		<li>Trzymając płytkę w inkubatorzeCO2, potrząśnij płytką przód-tył i boki 2-3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek.</li>
		<li>Następnego dnia delikatnie przemyj ciepłym DMEM/F12 i dodaj 2,5 ml pożywki hiPSC z 25 ng/ml bFGF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HiPSC zespołu Freezing Downa i izogeniczne euploidalne hiPSC z karmników 
	UWAGA: Podczas procedury zamrażania należy unikać nadmiernego pipetowania ludzkich iPSC.
	<ol>
		<li>Podziel hiPSC, gdy są jeszcze w fazie logarytmicznej, tj. 4-5 dni po przejściu.</li>
		<li>Obserwować płytkę z hiPSC pod kątem zróżnicowanych kolonii i usunąć zróżnicowane kolonie za pomocą pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Wykonać jedno przemycie hiPSC 1 ml/dobrze ciepły DMEM/F12.</li>
		<li>Dodać 1 ml/dołek 1 mg/ml roztworu kolagenazy. Trzymaj płytkę w inkubatorze przez 8-10 minut, a następnie obserwuj pod odwróconym mikroskopem w celu podniesienia krawędzi kolonii.</li>
		<li>Odessać kolagenazę i podać 2 płukania DMEM/F12. Następnie dodać 1 ml/dołek hiPSC Medium.</li>
		<li>Delikatnie podnieś kolonie za pomocą podnośnika komórkowego.</li>
		<li>Delikatnie odpipetuj kolonie w studzience za pomocą końcówki o pojemności 1 ml 5-8 razy, w zależności od wielkości kolonii.</li>
		<li>Zebrać wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przy 100 x g.</li>
		<li>Delikatnie odessać supernatant za pomocą pipety, usunąć osad komórkowy, delikatnie stukając w probówkę, i dodać 1 ml pożywki hiPSC bez antybiotyku uzupełnionej 25 ng/ml bFGF zgodnie z liczbą dołków. Dozuj komórki do kriowialiów.</li>
		<li>Dodaj pożywkę hiPSC bez antybiotyku uzupełnioną 25 ng / ml bFGF i 20% DMSO do kriowialiów, aby uzyskać 10% końcowe stężenie DMSO.</li>
		<li>Umieść kriowiale w mroźnym pomieszczeniu z kąpielą izopropanolową, aby zapewnić powolne zamrażanie.</li>
		<li>Przechowywać mróz w temperaturze -80 °C przez noc. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika LN2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie neuronalne
UWAGA: Przygotowanie pożywki kondycjonowanej przez pożywkę (FCM): Użyj kolby T-75 i płytki 4 x 106 komórek podajnika na kolbę. Następnego dnia dodaj 40 ml pożywki hiPSC z 4 ng/ml bFGF. Zbieraj przez 7 dni. Probówkę należy przechowywać codziennie w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca. Posmaruj 15-centymetrowe naczynie 10 ml 0,1% żelatyny w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny przed dysocjacją komórek. Pokryj 6-dołkową płytkę matrycą błony podstawnej kwalifikowaną do hESC (zwaną dalej "kwalifikowaną matrycą") na 1 dzień przed dysocjacją komórek. Podczas dysocjacji komórek w całym protokole dodaj 10 μM RI do roztworu do odłączania komórek (patrz tabela materiałów), DPBS i pożywki galwanicznej (FCM uzupełniony 25 ng / ml bFGF). Przygotuj świeżą pożywkę kondycjonowaną w podajniku (FCM) dla każdego różnicowania. Należy unikać nadmiernego pipetowania hiPSC.
<ol>
	<li>Dzień In vitro (DIV) 2: Tworzenie pojedynczych komórek i wysiewanie hiPSC w celu neuroróżnicowania
	<ol>
		<li>Dodaj 10 μM RI do pożywki hiPSC uzupełnionej 25 ng / ml bFGF, DPBS, roztworem do odrywania komórek i pożywką kondycjonowaną przez zasilacz uzupełnioną 25 ng / ml bFGF. Ogrzać wszystkie te odczynniki w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Weź 6-dołkową płytkę iPSC na karmnikach, usuń zróżnicowane kolonie i dodaj świeże podłoże hiPSC uzupełnione 25 ng / ml bFGF i 10 μM RI. Przechowywać płytkę przez 2 godziny w inkubatorze.</li>
		<li>Po 2 godzinach wyjąć płytkę iPSC i przemyć ją jednym roztworem DPBS bez Ca++ i Mg++.</li>
		<li>Dodać 1 ml/studzienkę roztworu do odrywania komórek (+ 10 μM RRI) i trzymać płytkę w inkubatorze CO2 przez 12-14 minut.</li>
		<li>Po 12-14 minutach obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem; większość komórek zaczyna odłączać się od płytki. Jeśli niektóre komórki nadal przylegają, delikatnie postukaj w płytkę z boków.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór do odrywania komórek, dodając 3 ml / basenik DPBS z Ca++ i Mg++ (+ 10 μM RI). Używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie pipetuj 2-3 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków.</li>
		<li>Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 40 μM.</li>
		<li>Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g i delikatnie zassać pożywkę za pomocą VAS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki hiPSC (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI). Umieść komórki na 0,1% pokrytym żelatyną naczyniu o średnicy 15 cm na 1,5 godziny, aby usunąć karmniki, ponieważ karmniki mają preferowaną przyczepność do powierzchni pokrytej żelatyną w porównaniu z hiPSC.</li>
		<li>Po 1,5 h delikatnie zebrać pożywkę z komórkami i odwirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g. Zasysać pożywkę za pomocą VAS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml FCM (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI) i pobrać liczbę komórek.</li>
		<li>Używając FCM (+ 25 ng / ml bFGF + 10 μM RI), wykonaj zawiesinę komórek 30 000-50 000 komórek/ml i zasiew 5 ml zawiesiny komórek/płytkę 60 mm lub 2 ml / dołek płytki 6-dołkowej lub 500 μl / dołek płytki 24-dołkowej. Płyty powinny być pokryte kwalifikowaną matrycą (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DIV 0: (~48 h później): Zmień pożywkę kondycjonowaną przez podajnik na pożywkę NPC (DDM + B27 bez witaminy A + N2) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>DIV 2: Dodaj pożywkę NPC z 0,125 μM Dorsomorphin co drugi dzień do DIV 18.</li>
	<li>DIV 18: Dodaj pożywkę NPC bez Dorsomorphiny i uzupełniaj co drugi dzień aż do DIV 28.</li>
	<li>DIV 28-30: Tworzenie pojedynczych komórek i rozsiewanie NPC dla Etapu 2
	<ol>
		<li>Na DIV 28 wyjmij płytkę (zawierającą NPC) i zastąp ją nośnikiem NPC (+ 10 μM RI). Umieść płytkę w inkubatorze CO2 na 2 godziny.</li>
		<li>Po 2 godzinach odessać pożywkę i przepłukać ją jednym roztworem DPBS (bez Ca++ i Mg++).</li>
		<li>Dodać 1 ml/studzienkę roztworu do odrywania komórek (+ 10 μM RRI) i trzymać płytkę w inkubatorze przez 14 minut.</li>
		<li>Po 14 minutach obserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym pod kątem 4x. Większość komórek zaczyna odłączać się od płytki. Jeśli niektóre komórki nadal przylegają, delikatnie postukaj w płytkę z boków.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór do oddzielania komórek, dodając 3 ml / basenik DPBS z Ca++ i Mg++ (+ 10 μM RI). Używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie pipetuj 2-3 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków.</li>
		<li>Przepuścić przez sitko o pojemności 40 μM umieszczone na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g. Delikatnie zassać pożywkę za pomocą VAS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w DDM + B27 z witaminą A (+ 10 μM RRI).</li>
		<li>Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego z hemocytometrem.</li>
		<li>Wysiewaj 50 000 komórek/studzienkę na kwalifikowanej płytce pokrytej matrycą (1x) z płytki 48-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DIV 33: Zmiana pożywki na pożywkę różnicującą neurony (patrz Tabela materiałów). Zmieniaj podłoże co 5 dni. Uzupełniaj nośniki do DIV 85/90.</li>
</ol>
3. Immunocytochemia (ICC)
UWAGA: Dodaj wystarczająco dużo buforu na wszystkich etapach, aby pokryć komórki i uniknąć wysuszenia studzienki podczas zasysania podczas etapu mycia.
<ol>
	<li>Wyjąć zróżnicowaną płytkę komórkową poza obszar hodowli komórkowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę i przepłukać DPBS.</li>
	<li>W celu utrwalenia dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do komórek. Przykryj talerz folią aluminiową i umieść go na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
	<li>Odessać PFA i wykonać trzy płukania DPBS przez 15 minut (bez Ca++ i Mg++).</li>
	<li>Dodać bufor blokujący (3% BSA + 5% surowicy osła (lub surowicy od zwierzęcia gospodarza przeciwciała drugorzędowego) + 0,2% Triton-X w DPBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 250 μl/basenik przeciwciał pierwszorzędowych [Ki67 (rozcieńczenie 1:100), TUBB3 (rozcieńczenie 1:500), PAX6 (1:100)] i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce kołyskowej. Rozcieńczenie przeprowadzono w roztworze blokującym.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie DPBS po inkubacji przeciwciał pierwotnych.</li>
	<li>Dodać 250 μl/basenik przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego 1:250 w 3% BSA + 0,2% Triton-X w DPBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3 razy DPBS po wtórnej inkubacji przeciwciał.</li>
	<li>Dodać DAPI (1: 1000 rozcieńczenie 5 mg/ml bulionu w DPBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy za pomocą DPBS. Pozostaw ostatnie płukanie na płytce hodowlanej i obserwuj pod mikroskopem.</li>
</ol>
4. Akwizycja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w rozdzielczości 20x.</li>
	<li>Rejestruj obrazy Ki67, a także obrazy barwienia TUBB3 przy użyciu filtra wzbudzenia 540 nm, PAX6 przy użyciu filtra wzbudzenia 488 nm oraz obrazy DAPI przy użyciu filtra wzbudzenia 358 nm.</li>
	<li>Przechwytuj obrazy z dziesięciu różnych losowych pól do analizy.</li>
	<li>Analizuj obrazy ICC za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>W przypadku analizy TUBB3 i PAX6 należy wykonać progowanie wszystkich obrazów odpowiednio dla sygnałów czerwonego i zielonego oraz intensywności sygnału niebieskiego dla DAPI. Średnia intensywność czerwonych pikseli TUBB3 i zielonych pikseli PAX6 została znormalizowana średnią intensywnością niebieskich pikseli DAPI.</li>
	<li>W przypadku analizy Ki67 policz komórki za pomocą funkcji automatycznego liczenia komórek w oprogramowaniu ImageJ. Znormalizuj liczbę komórek Ki67-dodatnich liczbą komórek DAPI-dodatnich.</li>
	<li>Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego, porównując dwie grupy za pomocą niesparowanych testów t. Dane powinny być wyrażone jako średnia ± SEM z trzech niezależnych doświadczeń. Wartość p mniejsza niż 0,05 jest uważana za statystycznie istotną.</li>
</ol>

<ol><li>Chapman, R. S., Hesketh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotype+of+individuals+with+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ment+Retard+Dev+Disabil+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotype of individuals with Down syndrome.</a> Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 6 (2), 84-95 (2000).</li>
<li>Haydar, T. F., Reeves, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+21+and+early+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trisomy 21 and early brain development.</a> Trends Neurosci. 35 (2), 81-91 (2012).</li>
<li>Wisniewski, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+syndrome+children+often+have+brain+with+maturation+delay%2C+retardation+of+growth%2C+and+cortical+dysgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+Suppl%22%5BJournal%5D)">Down syndrome children often have brain with maturation delay, retardation of growth, and cortical dysgenesis.</a> Am J Med Genet Suppl. 7, 274-281 (1990).</li>
<li>Guidi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+impairment+and+increased+cell+death+reduce+total+neuron+number+in+the+hippocampal+region+of+fetuses+with+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis impairment and increased cell death reduce total neuron number in the hippocampal region of fetuses with Down syndrome.</a> Brain Pathol. 18 (2), 180-197 (2008).</li>
<li>Lott, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+phenotypes+for+Down+syndrome+across+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neurological phenotypes for Down syndrome across the life span.</a> Prog Brain Res. 197, 101-121 (2012).</li>
<li>Stagni, F., Giacomini, A., Emili, M., Guidi, S., Bartesaghi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+impairment%3A+An+early+developmental+defect+in+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis impairment: An early developmental defect in Down syndrome.</a> Free Radic Biol Med. 114, 15-32 (2018).</li>
<li>Golden, J. A., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+superior+temporal+neocortex+is+anomalous+in+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the superior temporal neocortex is anomalous in trisomy 21.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 53 (5), 513-520 (1994).</li>
<li>Gupta, M., Dhanasekaran, A. R., Gardiner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+Down+syndrome%3A+Gene+content+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse models of Down syndrome: Gene content and consequences.</a> Mamm Genome. 27 (11-12), 538-555 (2016).</li>
<li>Wu, Y., West, N. R., Bhattacharyya, A., Wiseman, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+models+for+Down+syndrome-Alzheimer%27s+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neuronal+Signal%22%5BJournal%5D)">Cell models for Down syndrome-Alzheimer's disease research.</a> Neuronal Signal. 6 (1), NS20210054(2022).</li>
<li>Zhao, X., Bhattacharyya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+models+are+needed+for+studying+human+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders.</a> Am J Hum Genet. 103 (6), 829-857 (2018).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+model+genetic+and+neural+developmental+features+of+Down+syndrome+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Integration-free induced pluripotent stem cells model genetic and neural developmental features of Down syndrome etiology.</a> Stem Cells. 31 (3), 467-478 (2013).</li>
<li>Hibaoui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+rescuing+neurodevelopmental+defect+of+Down+syndrome+using+induced+pluripotent+stem+cells+from+monozygotic+twins+discordant+for+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modeling and rescuing neurodevelopmental defect of Down syndrome using induced pluripotent stem cells from monozygotic twins discordant for trisomy 21.</a> EMBO Mol Med. 6 (2), 259-277 (2014).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+stem+cell+model+of+early+Alzheimer%27s+disease+pathology+in+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A human stem cell model of early Alzheimer's disease pathology in Down syndrome.</a> Sci Transl Med. 4 (124), 124ra29(2012).</li>
<li>Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+human+trisomy+21+iPSCs+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in human trisomy 21 iPSCs and neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9962-9967 (2013).</li>
<li>Meharena, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+syndrome-induced+senescence+disrupts+the+nuclear+architecture+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).</li>
<li>Sharma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+cell+cycle+defect+causes+impaired+neurogenesis+in+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome.</a> Front Genet. 13, 1007519(2022).</li>
<li>Maclean, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+hematopoiesis+in+trisomy+21+as+revealed+through+in+vitro+differentiation+of+isogenic+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).</li>
<li>Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+Down+syndrome+and+isogenic+euploid+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 67, 103041(2023).</li>
<li>Yu, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li>
<li>Gaspard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cortical+neurons+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cortical neurons from mouse embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 4 (10), 1454-1463 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

W niniejszej pracy opisano skuteczny nieskierowany monowarstwowy protokół neuroróżnicowania kory mózgowej dla izogenicznej pary euploidalnych hiPSC i DS hiPSC. Ponieważ komórki są hodowane jako monowarstwy, są bardziej narażone na warunki hodowli, co nie jest możliwe w takim samym stopniu, jak użycie ciał embrionalnych do różnicowania iPSC, które są zwykle stosowane w innych protokołach14,16. Podczas gdy użyteczność systemów organoidowych rośnie, jednowarstwowy s...

Zespół Downa (DS), czyli trisomia 21, jest najczęstszą nieprawidłowością chromosomalną i główną przyczyną niepełnosprawności intelektualnej (ID)1. Upośledzona neurogeneza podczas rozwoju płodu z ZD jest jedną z przyczyn niepełnosprawności intelektualnej w DS2. Badania płodu u ludzi wykazały zmniejszenie masy i objętości mózgu, zmniejszenie liczby neuronów, zwiększenie liczby astrocytów3,4 oraz nieprawidłowy rozkład neuronów w warstwach II i IV5,6. Dodatkowo, druga faza rozwoju kory mózgowej, tj. pojawienie się laminacji, jest zarówno opóźniona, jak i zdezorganizowana w DS7.
Defekty neurorozwojowe w DS były badane głównie przy użyciu mysich modeli DS, takich jak Ts65Dn, Ts1Rhr i Ts1cje8. Jednak te modele myszy nie były w stanie w pełni podsumować różnych fenotypów obserwowanych w badaniach DS ze względu na fizjologiczne i rozwojowe różnice między myszami a ludźmi9, co doprowadziło do nieudanych badań klinicznych10. Wynalezienie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych11,12 dało możliwość modelowania zaburzeń neurologicznych zespołu Downa przy użyciu komórek pochodzących bezpośrednio od osób z ZD. Jednak wcześniejsze próby modelowania wad neurorozwojowych DS przy użyciu ludzkich iPSC spotkały się z niespójnymi wynikami i nie mogły w pełni wyjaśnić wad neurorozwojowych obserwowanych w sekcjach mózgu płodu DS13,14,15,16. Na przykład raport opublikowany przez Shi i wsp. znalazł fenotypy związane z chorobą Alzheimera, ale nie wykazał różnicy w neurogenezie DS w porównaniu z kontrolami euploidalnymi15. Podobnie, Weick i wsp. zgłosili zmniejszoną aktywność synaptyczną, ale normalną neurogenezę w DS w porównaniu z kontrolami euploidalnymi16. Jednak prawidłowa neurogeneza w ZD opisana w tych publikacjach nie była zgodna z obserwacją z odcinków mózgu płodu DS. Późniejszy raport Hibaoui i wsp. donosił o zmniejszonej neurogenezie w DS, co było zgodne z obserwacją z sekcji mózgu płodu DS14. Jednak ten raport i inny niedawny raport opisały zmniejszoną proliferację NPC DS jako przyczynę zmniejszonej neurogenezy w DS14,17. Jednak tylko zmniejszona proliferacja NPC DS nie może wyjaśnić zwiększonej liczby komórek astroglejowych i opóźnionego pojawiania się laminacji podczas rozwoju mózgu płodu DS.
W ostatnio opublikowanej pracy, opracowano model neurogenezy upośledzonej przez DS u u ludzi, który wykazał zmniejszoną neurogenezę. Model ten wykazał, że upośledzona neurogeneza w ZD jest spowodowana dwufazowymi defektami cyklu komórkowego na etapie neurogennym (etap, podczas którego neuronalne komórki progenitorowe są generowane z pluripotencjalnych komórek macierzystych). W pierwszej fazie w stadium neurogennym NPC DS wykazują zmniejszoną proliferację w porównaniu z izogenicznymi euploidalnymi komórkami nerwowymi, a następnie zwiększoną proliferację NPC DS w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi w późnej fazie stadium neurogennego18.
W tym manuskrypcie opisano krok po kroku szczegółowy protokół różnicowania hiPSC zespołu Downa i jego izogenicznych euploidalnych hiPSC w neurony korowe. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku protokołu różnicowania pary hiPSC DS i jego izogenicznych euploidalnych hiPSC w neurony korowe, ze szczególnym uwzględnieniem modelowania defektów neurogenezy związanych z DS. Protokół ten ma na celu zaoferowanie solidnego i powtarzalnego systemu do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw nieprawidłowości powodujących neurogenezę upośledzoną przez DS.
Uzasadnieniem dla rozwoju tego protokołu jest umożliwienie różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony korowe poprzez wykorzystanie zasad neurobiologii rozwojowej, co pozwala na identyfikację fenotypów, które powstają w wyniku choroby/zaburzenia. Jego celem było przyjęcie minimalistycznego podejścia do różnicowania neuronalnego iPSC poprzez unikanie związków takich jak cAMP lub DAPT, które mogą maskować fenotypy chorobowe powstające w wyniku defektów odpowiednio w kanale Ca++ lub szlaku NOTCH. Podobnie unikano stosowania kwasu askorbinowego, BDNF i GDNF, które mogą maskować inne fenotypy związane z chorobami neurologicznymi poprzez nasilanie neurogenezy.
Przewaga tej techniki nad alternatywnymi metodami polega na dostarczeniu solidnej rekapitulacji neurologicznych fenotypów obserwowanych w sekcjach mózgu płodu DS. Warto zauważyć, że w porównaniu z modelami mysimi, ludzki system oparty na iPSC eliminuje różnice międzygatunkowe, zapewniając bardziej odpowiedni model do badania procesów neurorozwojowych specyficznych dla człowieka9, ale do tej pory nie udało mu się podsumować upośledzonej neurogenezy DS obserwowanej w stadiach płodowych DS. Co więcej, zastosowanie izogenicznych par hiPSC zmniejsza zmienność i zwiększa wiarygodność obserwowanych różnic fenotypowych. Protokół ten będzie szczególnie interesujący dla naukowców zajmujących się zaburzeniami neurorozwojowymi i neurogenezą człowieka. Jest to szczególnie istotne dla osób dążących do modelowania specyficznych dla człowieka aspektów ZD lub zainteresowanych opracowywaniem interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na defekty neurogenezy związane z trisomią 21.

<table><tbody><tr><td>MEF medium: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej glukozie</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>10% stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Hyklon</td><td>SH30238.01</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td><silny>hiPSC średni:< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>20% stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Hyclon</td><td>SH30238.01</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050061</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Hyklon penicyliny/streptomycyny</td><td></td><td>SV30010</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr> <tr><td>&beta;-Merkaptoetanol (1000X)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td><mocny>DDM średni: </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Hyclon</td><td>SH30238.01</td><td>1X końcowe stężenie</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050061</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Albumax (10%)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>11020-021</td><td>0,5 X 10% Albumax to stężenie końcowe</td></tr><tr><td>NPC podłoże:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDM medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17502048</td> 1X Suplement B-27 o <td>stężeniu końcowym</td></tr><tr><td>(50X), bez witaminy A</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12587010</td><td>1X stężenie końcowe</td></tr><tr><td><silne> Pożywka różnicowania neuronalnego (ND):</silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka</td><td></td><td></td> DDM <td>1/2 objętości</td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td>1/2 tomu</td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17502048</td><td>0,5 X Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50X)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504044</td><td>0,5 X stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050061</td><td>1X pożywki neuropodstawowej</td></tr><tr><td>Hyklon penicyliny/streptomycyny</td><td></td><td>SV30010</td><td>1X pożywki neurobazalnej</td></tr><tr><td><silnej>przeciwciała i odczynniki do barwienia immunologicznego: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>4%</td></tr> <tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100 Roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0,20%</td></tr> <tr><td>BSA</td><td>Hyclon</td><td>A7979-50ML</td><td>1,00%</td></tr> <tr><td>Oczyszczona antytubulina &beta;-3 (TUBB3) (TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Donkey anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa fluor 594</td> Life <td>Tech Invitrogen&nbsp;</td><td>A21203</td><td>Rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz anty-ludzka Ki67</td><td>BD Pharmingen</td><td>550609</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-PAX6</td><td>BioLegends</td><td>901302</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Osioł (anty-królik)</td><td>Life Tech Invitrogen&nbsp;</td><td>A21206</td><td>Rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Roztwór DAPI (5 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td><silne>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odrywania komórek (Accutase)&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>A11105-01</td><td>Gotowe do użycia roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Inhibitor skał (RI)&nbsp;</td><td>Sellechckem&nbsp;</td><td>Y27632</td><td>10 mM/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Dorsomorfina&nbsp;</td><td>Sellechckem&nbsp;</td><td>S7306</td><td>0,125 nM/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>DPBS z wapniem i magnisium (DPBS+Ca, Mg)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040133</td><td>Gotowe do użycia rozwiązanie robocze</td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnisium</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14190136</td><td>Gotowy do użycia roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Żelatyna Typ A</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr> <tr><td>Matryca membrany podstawnej z kwalifikacją 0,10%hESC (Matrigel GFR)&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>356230</td><td>1 mg fiolka podstawowa rozcieńczona 1:240</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>0,40%</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibrabblastów (bFGF)</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-18B</td><td>25 ng/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Kolagenaza&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17104-019</td><td>Stężenie końcowe 1mg/ml</td></tr></tbody></table>

in vitro modelowanie neurogenezy zespołu downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

In Vitro Modeling of Down Syndrome Neurogenesis Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Zespół Downa (DS), spowodowany dodatkową kopią chromosomu 21, jest główną przyczyną niepełnosprawności intelektualnej. Jednym z kluczowych czynników przyczyniających się do tej niepełnosprawności intelektualnej jest upośledzona neurogeneza obserwowana od etapów płodowych. Aby zbadać te nieprawidłowości neurorozwojowe, cenny i istotny model stanowią indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) generowane przy użyciu komórek uzyskanych od pacjentów z ZD. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół podsumowujący neurogenezę upośledzoną przez ZS obserwowaną w stadiach płodowych ZD. Protokół ten wykorzystuje parę DS-hiPSC mających trzy kopie chromosomu 21 i jego izogeniczne euploidalne hiPSC mające dwie kopie chromosomu 21. Co ważne, opisany tutaj protokół podsumowuje neurogenezę upośledzoną przez DS i stwierdza, że dwufazowy defekt cyklu komórkowego, tj. zmniejszona proliferacja nerwowych komórek progenitorowych DS (NPC) we wczesnej fazie stadium neurogennego, a następnie zwiększona proliferacja NPC DS w późnej fazie stadium neurogennego jest przyczyną upośledzonej neurogenezy DS. Zwiększona proliferacja DS NPC w późnej fazie neurogennej prowadzi do opóźnionego wyjścia z cyklu komórkowego, powodując zmniejszone wytwarzanie neuronów postmitotycznych z NPC DS. Protokół ten zawiera szczegółowe kroki dotyczące utrzymania hiPSC, ich różnicowania w linie nerwowe wykazujące dwufazowy defekt cyklu komórkowego w stadium neurogennym, a następnie walidacji zmniejszonego różnicowania neuronalnego w komórkach DS. Postępując zgodnie z tą metodologią, naukowcy mogą stworzyć solidny system eksperymentalny, który naśladuje neurorozwojowe warunki DS, umożliwiając im zbadanie konkretnych zmian w rozwoju mózgu spowodowanych trisomią 21.

Rozdzielone ludzkie iPSC wysiano na odpowiednie płytki pokryte macierzą w formie zawiesiny pojedynczych komórek, a różnicowanie zainicjowano poprzez usunięcie bFGF. Aby zahamować różnicowanie pozaektodermalne, od 2 do 18 dnia in vitro (DIV 2-18) dodano dorsomorfinę, inhibitor sygnalizacji BMP21. W celu dalszego różnicowania komórek progenitorowych z etapu neurogenicznego, zawiesiny pojedynczych komórek przesiano przy niskiej gęstości na odpowiednią macierz (Rycina 1) ...

Ten protokół przedstawia metodologię rekapitulacji upośledzonej neurogenezy zespołu Downa (DS) przy użyciu ludzkich iPSC DS. W protokole zidentyfikowano dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzenia neurogenezy w zespole Downa. Stanowi solidną platformę do zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw nieprawidłowej neurogenezy związanej z ZD.

In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Down syndrome (DS), caused by an extra copy of chromosome 21, is a leading cause of intellectual disability. One of the key factors contributing to this ...

Długoterminowe badania koncentrują się na znalezieniu potencjalnych metod leczenia zaburzeń neurologicznych w zespole Downa. Obecnie skupiamy się na upośledzonej neurogenezie zespołu Downa, głównej przyczynie niepełnosprawności intelektualnej. Odkryliśmy, że upośledzona neurogeneza zespołu Downa jest spowodowana dwufazowym defektem cyklu komórkowego, w przeciwieństwie do powszechnego przekonania, że jest to spowodowane tylko starzeniem się nerwowych komórek progenitorowych zespołu Downa.Identyfikacja dwufazowego defektu cyklu komórkowego przy użyciu ludzkiego protokołu opartego na IPSC opisanego w tym manuskrypcie będzie napędzać potencjalne strategie terapeutyczne rozwoju, biorąc pod uwagę zarówno stan cyklu komórkowego, który jest zmniejszoną proliferacją we wczesnej fazie, jak i niepowodzenie wyjścia z cyklu komórkowego w późnej fazie. Na początek dodaj 10 mikromolów inhibitora skały do kompletnego ludzkiego podłoża iPCS, DPBS, roztworu do odrywania komórek i pożywki kondycjonowanej przez pożywkę uzupełnioną 25 nanogramami na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów. Podgrzej wszystkie odczynniki do 37 stopni Celsjusza.Weź sześciodołkową płytkę iPSC na podajnikach. Odpipetować zróżnicowane kolonie i dodać świeżą, kompletną pożywkę iPSC dla ludzi. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla na dwie godziny.Po inkubacji przemyj studzienki raz DPBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla na 12 do 14 minut.Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Jeśli większość komórek odrywa się, ale niektóre pozostają przyklejone, delikatnie postukaj w płytkę z boków. Dodaj trzy mililitry DPBS uzupełnionego wapniem i magnezem do każdej studzienki, aby rozcieńczyć roztwór do odrywania komórek.Za pomocą pipety o pojemności pięciu mililitrów wykonaj delikatne pipetowanie dwa do trzech razy, aby rozbić grudki, unikając pęcherzyków. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do wirówki o pojemności 50 mililitrów 2. Odwirować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 200 G. Użyj systemu aspiracji próżniowej, aby delikatnie zassać pożywkę.Teraz ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach ludzkiego podłoża iPSC. Przenieś wszystkie komórki w zawiesinie na 15-centymetrowe naczynie pokryte 0,1% żelatyną i inkubuj w inkubatorze dwutlenku węgla. Zebrać pożywkę z komórkami do wirówki 2.Wirować w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 200 G. Następnie delikatnie zassać pożywkę za pomocą systemu zasysania próżniowego. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki kondycjonowanej przez pożywkę, uzupełnionej 25 nanogramami na mililitr BFGF i 10 mikromolami inhibitora skały. Po zliczeniu komórek przygotuj zawiesinę od 30 000 do 50 000 komórek na mililitr.Wysiew zawiesinę umieścić w płytce studzienki. Po dwóch dniach zastąp pożywkę kondycjonowaną przez pożywkę pożywką neuronalną komórką progenitorową lub pożywką NPC. Zmień media w drugim i 18 dniu, zgodnie z podano.W 28 dniu zastąp pożywkę w płytce pożywką NPC uzupełnioną 10 mikromolami inhibitora skalnego. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwie godziny. Po inkubacji odessać supernatant i raz przemyć studzienki DPBS bez wapnia i magnezu.Dodaj jeden mililitr roztworu do odrywania komórek do każdej studzienki. Następnie obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu. Następnie odpipetuj trzy mililitry DPBS uzupełnionego wapniem i magnezem do każdego dołka płytki.Za pomocą pięciomililitrowej pipety delikatnie odpipetuj zawiesinę i rozbij wszelkie grudki. Przecedź zawiesinę komórkową przez 40-mikrometrowe sitko umieszczone nad 50-mililitrową wirówką 2. Odwirować i zassać, jak pokazano wcześniej, a następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze określonego podłoża różnicującego uzupełnionego witaminą B 27 z witaminą A. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.Następnie wysiewaj 50 000 komórek do każdego dołka kwalifikowanej płytki 48-dołkowej pokrytej matrycą. W 33 dniu zastąp pożywkę w studzienkach hodowlanych pożywką różnicującą neurony. W hodowlach zespołu Downa zaobserwowano znaczne zmniejszenie liczby neuronów TUBB3-dodatnich w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi, z około dwukrotnym spadkiem widocznym w 85 dniu.Znacznie mniejszy odsetek komórek KI67 dodatnich zaobserwowano w hodowlach zespołu Downa we wczesnym stadium neurogennym w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi, wykazując około czterokrotną redukcję. W późnym stadium neurogennym większość izogenicznych komórek euploidalnych opuściła cykl komórkowy z minimalnym zabarwieniem KI67, podczas gdy większość komórek zespołu Downa pozostała KI67-dodatnia, wykazując pięciokrotny wzrost. Druga para zespołu Sseeda i izogenicznych euploidalnych ludzkich iPSC potwierdziła obniżony poziom neuronów TUBB3-dodatnich i podwyższony PAX6-dodatnie neuronalne komórki progenitorowe w hodowlach zespołu Downa pod koniec różnicowania neuronalnego, z dwukrotnym zmniejszeniem liczby neuronów TUBB3-dodatnich i ponad dwukrotnym wzrostem komórek PAX6-dodatnich.

in-vitro-modeling-down-syndrome-neurogenesis-using-human-induced

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje, jak neuronalne komórki progenitorowe mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w celu uzyskania solidnej i replikacyjnej populacji komórek nerwowych, która może być wykorzystana do identyfikacji ścieżek rozwojowych przyczyniających się do patogenezy choroby w wielu zaburzeniach neurologicznych.

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Ten protokół opisuje generowanie wolnych od integracji iPSC z fibroblastów tkanek płodu poprzez dostarczanie plazmidów epizodycznych przez nukleofekcję, a następnie opisuje metody używane do charakterystyki iPSC i różnicowania neuronów.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obecny protokół wyjaśnia tworzenie monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu zbadania wczesnych etapów rozwoju móżdżku.

Modelowanie rozwoju móżdżku człowieka in vitro w strukturze 2D

Poznaj modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu ludzkich komórek iPSC. Protokół identyfikuje dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzenia neurogenezy.

In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów