Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich
18 października 2024
Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.
Nasze badania koncentrują się na postępujących chorobach neurodegeneracyjnych charakteryzujących się akumulacją białka jądrowego TDP-43 w cytoplazmie, takich jak ALS lub FTLD-TDP. Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób patologie TDP-43 rozprzestrzeniają się w mózgu w sposób podobny do prionów. Wcześniej odkryliśmy, że uwalnianie TDP-43 przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odbywa się za pośrednictwem rozregulowania autofagii.
Progranulina FTLD-TDP ułatwia ten proces. Kolejnym wyzwaniem jest wyjaśnienie, w jaki sposób autofagia reguluje produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających TDP-43, co może prowadzić do odkrycia celów terapeutycznych dla ALS lub FTLD-TDP. Na początek weź wyhodowane komórki HeLa, policz je za pomocą licznika komórek i zasiej jeden razy dziesięć do potęgi sześciu komórek na sześciocentymetrowej płytce zawierającej pożywkę hodowlaną.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny. Następnie przygotuj 20-mikromolowy roztwór siRNA. Wymieszaj 100 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i trzy mikrolitry siRNA w probówce o niskiej retencji, aby przygotować roztwór A. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i pięć mikrolitrów odczynnika do transfekcji w probówce o niskiej retencji, aby przygotować roztwór B. Następnie wymieszaj roztwór A i roztwór B, a następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Teraz dodaj mieszaninę roztworów A i B do pożywki używanej do hodowli komórek HeLa i inkubuj przez 24 godziny. Następnego dnia umyj komórki PBS i wystawij je na działanie 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny i jednego milimolowego roztworu EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i kontrolowaną wilgotnością przez pięć minut. Następnie dodać 2,5 mililitra pożywki hodowlanej do komórek i za pomocą pipety transferowej Pasteura z dołączoną końcówką do pipety o pojemności 20 mikrolitrów przygotować zawiesinę jednokomórkową.
Po policzeniu komórek wysiewaj się jeden razy dziesięć do potęgi sześciu komórek na dziesięciocentymetrowej płytce i inkubuj, jak pokazano wcześniej. Pod koniec inkubacji przygotować pożywkę zawierającą nośnik lub 100 nanomolową bafilomycynę A1. Następnie wystawić komórki na działanie pożywki zawierającej nośnik lub 100-nanomolową bafilomycynę A1 i inkubować przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz całą pożywkę hodowlaną z 10-centymetrowej płytki.
Przenieś zebrane podłoże do 15-mililitrowej probówki i odwiruj je w temperaturze 3 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Aby wyizolować frakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych P1, należy przenieść supernatant po odwirowaniu w stężeniu 3 000 G do probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o sile 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę.
W celu wyizolowania frakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych P2 supernatant po odwirowaniu w stężeniu 20 000 G przenieść do probówki ultrawirówkowej. Odwirować go w temperaturze 110 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Po wytarciu nadmiaru wilgoci wewnątrz probówki chusteczką laboratoryjną, pozostałe granulki należy ponownie zawiesić w probówce wirówkowej w 50 mikrolitrach buforu do podwójnej próbki, aby przygotować frakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych P1.
Następnie usunąć supernatant przez dekantację. Zetrzyj nadmiar wilgoci z wnętrza probówki chusteczką laboratoryjną i ponownie zawieś pozostałe granulki w probówce ultrawirówkowej w 50 mikrolitrach buforu do podwójnej próbki w celu przygotowania frakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych P2. Inkubować frakcje pęcherzyków zewnątrzkomórkowych P1 i P2 w temperaturze 100 stopni Celsjusza na bloku grzewczym przez 10 minut.
Po przeniesieniu pożywki hodowlanej z 10-centymetrowej płytki do 15-mililitrowej probówki, umyj komórki w 10-centymetrowym naczyniu PBS. Następnie wystawiaj komórki na działanie dwóch mililitrów 0,25% trypsyny i jednego milimolowego roztworu EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i kontrolowaną wilgotnością przez pięć minut. Dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej do komórek.
Używając pipety transferowej Pasteura z dołączoną końcówką do pipety o pojemności 200 mikrolitrów, odpipetuj komórki, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwiruj ją w temperaturze 1 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usunąć supernatant za pomocą aspiratora.
Dodać PBS do osadu komórkowego i odwirować w stężeniu 1 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu PBS, sonikować osad komórkowy w jednym mililitrze buforu A68 zawierającego 1% sarkosilu. Wymieszaj 300 mikrolitrów lizatu komórkowego ze 100 mikrolitrami czterokrotnego buforu próbki.
Inkubować mieszaninę w temperaturze 100 stopni Celsjusza na bloku grzewczym przez 10 minut, aby przygotować frakcję komórkową.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę białka TDP-43 w chorobach neurodegeneracyjnych oraz jego uwalnianie poprzez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs). Badania podkreślają udział autofagii w regulacji uwalniania TDP-43, co może wskazać potencjalne cele terapeutyczne dla ALS oraz FTLD-TDP.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Choroby neurodegeneracyjne
Wprowadzenie
- TDP-43 jest białkiem jądrowym powiązanym z chorobami neurodegeneracyjnymi.
- ALS oraz FTLD-TDP charakteryzują się akumulacją TDP-43 w cytoplazmie.
- Zrozumienie patologii TDP-43 może ujawnić mechanizmy rozprzestrzeniania się choroby.
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają rolę w uwalnianiu TDP-43.
Cel badania
- Wyjaśnienie, w jaki sposób autofagia reguluje produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) zawierających TDP-43.
- Zbadanie potencjalnych celów terapeutycznych dla ALS i FTLD-TDP.
- Zbadanie roli progranuliny w uwalnianiu TDP-43.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek HeLa.
- Liczenie komórek przy użyciu licznika komórek.
- Wysiewanie komórek w pożywce hodowlanej do celów eksperymentalnych.
- Immunoblotting w celu oceny poziomu markerów autofagosomów.
Główne wyniki
- Identyfikacja roli STX6 w uwalnianiu EV dodatnich dla LC3-II.
- Analiza efektów hamowania fuzji autofagosomów z lizosomami.
- Dowody na dysregulację autofagii podczas uwalniania TDP-43.
- Wpływ progranuliny na ułatwienie uwalniania TDP-43 za pośrednictwem EV.
Wnioski
- Autofagia jest kluczowa dla regulacji uwalniania białka TDP-43.
- Kierowanie terapią na autofagię może otworzyć nowe drogi terapeutyczne w leczeniu ALS oraz FTLD-TDP.
- Konieczne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć zaangażowane mechanizmy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena uwalniania LC3-II za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) umożliwia wgląd w mechanizmy transportu białek zależnego od autofagii, procesu zaangażowanego w progresję chorób neurodegeneracyjnych. Niniejszy protokół pozwala zespołom biofarmaceutycznym badać molekularne uwarunkowania patologicznego rozprzestrzeniania się białek, co wspiera walidację celów terapeutycznych i optymalizację ryzyka w rozwoju portfolio leków na neurodegenerację. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na styku modulacji autofagii i uwalniania biomarkerów za pośrednictwem EVs.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ocenę funkcjonalną genów związanych z autofagią w eksporcie białek pośredniczonym przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV).
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację wpływu potencjalnych celów, takich jak STX6, na transport LC3-II.
- Ułatwia analizę ścieżek istotnych dla chorób w procesach neurodegeneracji w oparciu o sformułowane hipotezy.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia powtarzalny schemat analizy metodą immunoblotingu do ilościowego oznaczania LC3-II w frakcjach komórkowych i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).
- Ustanawia kontrole analizy z użyciem bafilomycyny A1 w celu określenia poziomu zahamowania fuzji autofagosom-lizosom.
- Umożliwia standaryzację izolacji EV oraz ilościowego oznaczania markerów dla zastosowań w badaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodna ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez ilościowe określanie poziomu LC3-II związanego z pęcherzykami EV w warunkach perturbacji istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej interwencji modulujących autofagię.
- Stanowi platformę do oceny pozakomórkowego rozprzestrzeniania się białek patologicznych w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając ilościowe i mechanistyczne odczyty autofagii oraz biologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej dla genów docelowych regulujących eksport LC3-II za pośrednictwem EV.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki immunoblotingu do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Analityka: Umożliwia pomiar LC3-II i TSG101 jako ortogonalnych markerów specyficzności szlaków i pęcherzyków.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia mechanistyczne z istotnymi w kontekście chorób modelami agregacji i rozprzestrzeniania się białek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułowy schemat postępowania, który można dostosować do różnych programów badawczych nad autofagią i EV.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla szlaków autofagii i EV.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację EV oraz kwantyfikację LC3-II w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności badań.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go dla celów w chorobach neurodegeneracyjnych poprzez wyjaśnienie roli mechanistycznej w rozprzestrzenianiu białek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów modulujących autofagię w potokach badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest biegłość w technikach hodowli komórkowych, transfekcji siRNA oraz immunoblottingu.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury do wirowania przy wysokich i ultrawysokich prędkościach w celu izolacji EV.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja przygotowania próbek i kwantyfikacji markerów pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych modeli komórkowych, lecz może wymagać optymalizacji dla systemów pierwotnych lub specyficznych dla danej choroby.
- Interpretacja wyników dla LC3-II i TSG101 musi uwzględniać specyficzność szlaków oraz kontrole eksperymentalne.
