Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Nasze badania koncentrują się na dynamice katalitycznych aktywnych RNA i na tym, jak ta dynamika zmienia się w różnych warunkach środowiskowych. Używamy jednocząsteczkowego FRET do badania wpływu takich czynników, jak monowalentne i dwuwartościowe linie pośrednie, białka opiekuńcze i czynniki tłumiące na dynamikę RNA. Precyzyjne włączenie fluoroforów donorowych i akceptorowych bez zakłócania struktury i funkcji RNA jest wyzwaniem.

Ponadto śledzenie fałdowania dużego dynamicznego RNA jest trudne. Jednak ustalony protokół znakowania i enkapsulacji pozwala nam monitorować dynamikę fałdowania funkcjonalnego RNA w czasie. Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie polegające na obserwacji dużych, katalitycznie aktywnych RNA w czasie rzeczywistym i w warunkach neofizjologicznych.

Poprzez kowalencyjne znakowanie i kapsułkowanie RNA i pęcherzyków, które są następnie unieruchomione powierzchniowo, możemy monitorować funkcję RNA za pomocą jednocząsteczkowego TIRF. Koncentrujemy się na kowalencyjnym znakowaniu FRET długich katalitycznych RNA, a zwłaszcza intronów grupy II. Jest to wyzwanie ze względu na ich złożoność strukturalną.

Po zamknięciu w pęcherzykach możemy utrzymać RNA w ulotnym polu do mikroskopii TIRF, a mimo to RNA może swobodnie unosić się na wodzie. W ten sposób smFRET może bez przeszkód ujawnić dynamiczne zachowanie RNA. Będziemy nadal próbować zrozumieć, jak naprawdę działa natura, koncentrując się na relacji struktura-funkcja i dynamice rybosomów, ryboprzełączników i innych regulatorowych RNA przy użyciu podejścia wielotechnikowego.

Tak więc przejście do badań w warunkach fizjologicznych i komórkowych będzie głównym celem naszej pracy w przyszłości. Na początek podwielokrotnić interesujący RNA, mając od 50 do 75 mikrogramów RNA na probówkę w 55 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody, a następnie dodać 45 mikrolitrów mieszaniny octanu sodu EDC/NHS o pH 6 do RNA. Inkubuj mieszaninę przez cztery godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 500 obr./min.

Po inkubacji ponownie zawieś aktywowany osad RNA w 95 mikrolitrach 100-milimolowego buforu MOPS o pH 7,5. Następnie dodaj pięć mikrolitrów dwumilimolowej sulfonowanej cyjaniny-3aminy do aktywowanego RNA i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin przy 500 obr./min, aby sprzęgnąć fluorofor z aktywowanym 5-pierwszym fosforanem. Następnego dnia dodaj 200 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, aby poprawić separację.

Następnie oczyść RNA znakowane 5-pierwszym fosforanem przez wytrącanie etanolu. Po oczyszczeniu ponownie zawiesić znakowany RNA w 100 mikrolitrach 100-milimolowego tris HCl i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie, aby usunąć wolne barwniki, umyj oznakowane RNA w podwójnie destylowanej wodzie z filtracją odśrodkową.

W przypadku znakowania podwójnego końca, podwielokrotność RNA znakowanego na 5 końcach głównych, zawierająca około 50 do 75 mikrogramów RNA na probówkę w 90 mikrolitrach roztworu. Dodać pięć mikrolitrów jednomolowego buforu octanu sodu o pH 5,5. Następnie dodać cztery mikrolitry świeżo przygotowanego 500-milimolowego roztworu podstawowego metaperiodianu sodu.

W przypadku pojedynczego znakowania na 3 głównych końcach dodać osiem mikrolitrów roztworu podstawowego metaperiodatu. Po inkubacji roztworów w ciemności przez dwie godziny, odpipetować 30 mikrolitrów 50% glicerolu, aby zatrzymać reakcję. Po 30 minutach inkubacji dodać 400 mikrolitrów lodowatej mieszaniny wytrącania octanu sodu

Ponownie zawiesić utlenioną osadę RNA w 95 mikrolitrach 50-milimolowego buforu octanu sodu o pH sześć. Oczyść RNA znakowane podwójnie końcami przez wytrącanie etanolu i filtrację odśrodkową, jak wykazano wcześniej. Eluuj oczyszczone RNA w podwójnie destylowanej wodzie.

Porównaj wizualnie kolory supernatantu i osadu uzyskane po każdym kroku. Obliczyć stężenia RNA i sprzężonego barwnika na spektrofotometrze w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV. Fluorescencyjna elektroforeza żelowa potwierdziła udane pojedyncze i podwójne znakowanie RNA, na co wskazuje komigracja RNA z fluoroforami.

Wydajność FRET wzrastała w obecności jonów metali, co wskazywało na fałdowanie RNA, co prowadziło do zmniejszenia emisji donorów i wzrostu emisji akceptorowej. Aby przygotować komorę mikroprzepływową, użyj wiertła diamentowego, aby wywiercić cztery otwory w szkiełkach kwarcowych, aby utworzyć dwa kanały. Umieść wywiercone szkiełka kwarcowe i około dwa razy więcej szkiełek nakrywkowych w szklanym słoiku do barwienia Coplin z pokrywką.

Sonikować szkiełka podstawowe i nakrywkowe w wodzie podwójnie destylowanej przez pięć minut. Następnie poddaj słoik sonikowaniu w 10% roztworze do czyszczenia szkła laboratoryjnego przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Po przepłukaniu słoika podwójnie destylowaną wodą, sonikować w jednomolowym roztworze wodorotlenku potasu przez 30 minut i pozostawić go w roztworze na noc.

Po wielokrotnym płukaniu i sonikacji wodą destylowaną, wysuszyć szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe za pomocą przepływu azotu gazowego. Wysuszone szkiełka i szkiełka nakrywkowe należy traktować środkiem do czyszczenia plazmą tlenową przez 30 minut. Umieść czyste szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia Coplin zawierającym 3% roztwór etanolu z testu AP Sonicate przez jedną minutę, a następnie inkubuj przez 30 minut.

Opłucz szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe po trzy razy absolutnym etanolem i wodą podwójnie destylowaną, a następnie wysusz je pod strumieniem azotu. Następnie przygotuj wilgotne pudełko, napełniając do połowy puste pudełko z końcówką pipety wodą podwójnie destylowaną. Umieść szkiełka w pudełku stroną przeznaczoną do leczenia, skierowaną do góry.

Dodaj 30-mikrolitrowe kropelki świeżo przygotowanej mieszaniny bPEG/mPEG na środek szkiełka, aby pokryć oba kanały. Przykryj kroplę czystym szkiełkiem nakrywkowym i zamknij wilgotne pudełko. Inkubuj pudełko przez noc w ciemności w celu pegylacji.

Następnego dnia spłucz pasywowane PEG i biotynylowane szkiełka nakrywkowe wodą podwójnie destylowaną i obserwuj zmianę hydrofobowości obrabianych powierzchni. Przymocuj dwustronną naklejkę do szkiełka, upewniając się, że naklejka zakrywa obszar zainteresowania. Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, wyrównując powierzchnie PEGylowane tak, aby były zwrócone do siebie.

Przenieś zmontowaną komorę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i napełnij probówkę gazowym azotem. Na początek użyj sterylnej igły, aby wybić otwór od wewnątrz w pokrywie sterylnej, czystej dwumililitrowej tubki. Do probówki dodać 109 mikrolitrów mieszaniny bPE-DMPC.

Umieść tekturową wkładkę do przegrody komórkowej z pudełka do przechowywania mikroprobówek w 500-mililitrowej kolbie Schlenka, aby służyła jako uchwyt na probówkę. Za pomocą długiej pęsety ostrożnie umieść probówki zawierające mieszaninę lipidów w uchwycie probówki. Odparować chloroform pod niskim przepływem azotu gazowego przez noc.

Po uzyskaniu wysuszonej warstwy lipidowej należy uszczelnić rurki parafilmem, aby zakryć otwory. Zmontuj ekstruder za pomocą 100-nanometrowej membrany poliwęglanowej i 10-milimetrowej poliestrowej tarczy spustowej. Zrównoważyć strzykawkę i membrany buforem zapobiegającym mruganiu.

Po zmieszaniu podwójnie znakowanego RNA z buforem zapobiegającym mruganiu, należy uwodnić ciastko lipidowe mieszaniną buforową RNA zapobiegającą mruganiu w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Wstrząsaj przez pięć minut przy 1 400 obr./min, a następnie przez 15 minut przy 700 obr./min. Odwirować mieszaninę przez dwie minuty przy stężeniu 13 000 G i rozcieńczyć supernatant 250 mikrolitrami buforu zapobiegającego mruganiu.

Napełnij strzykawkę zawiesiną lipidów RNA i wytłaczaj 35 razy w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bloku grzewczym, aby zamknąć RNA znakowane podwójnie końcami w pęcherzykach fosfolipidowych o średnicy 100 nanometrów. Przepłukać komorę dwukrotnie 200 mikrolitrami standardowego buforu 5X w temperaturze pokojowej. Napełnij komorę 50 mikrolitrami po 20 mikrolitrów na mililitr roztworu streptawidyny i inkubuj przez pięć minut.

Następnie przepłukać komorę 200 mikrolitrami buforu standardowego i 100 mikrolitrami buforu przeciwmrugającego. Dodać 75 mikrolitrów zawiesiny pęcherzyków i inkubować przez 10 minut w celu unieruchomienia kapsułkowanego RNA na powierzchni. Po unieruchomieniu przepłukać komorę 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego buforu obrazowego.

W celu akwizycji danych zamontuj komorę na mikroskopie TIRF i uzyskaj dane smFRET ze zmiennym wzbudzeniem laserowym. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET przy użyciu mikroskopii TIRF śledziło pojedyncze cząsteczki RNA i wykrywało zmiany w wydajności FRET w czasie rzeczywistym. Dynamiczne ślady jednocząsteczkowe wykazały antyskorelowane fluktuacje między sygnałami donorowymi i akceptorowymi, co wskazuje na potwierdzające zmiany w RNA.