Name: Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania końcowego i enkapsulacji długich RNA w wesyczkach fosfolipidowych do mikroskopii FRET-TIRF na poziomie pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki [200020_192153 dla RKOS], UZH Forschungskredit [FK-20-081 dla EA], UZH Stiftung für wissenschaftliche Forschung [dla RKOS i SZP], Graduate Research Campus (GRC) Short Grant [2024__SG_092 dla EA], Graduate School of Chemical and Molecular Sciences Zurych (CMSZH) oraz Uniwersytetu w Zurychu jest wdzięczne.

Dual-Color End-Labeling and Vesicle Encapsulation of RNAs for smFRET-TIRF Studies

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
<li>Liu, T., Patel, S., Pyle, A. M. Making RNA: Using T7 RNA polymerase to produce high yields of RNA from DNA templates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+T+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Academic Press. (2023).</li>
<li>Leamy, K. A., Assmann, S. M., Mathews, D. H., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+in+vitro+and+in+vivo+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between in vitro and in vivo RNA folding.</a> Q Rev Biophys. 49, e10(2016).</li>
<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest unikalny, ponieważ umożliwia obserwację i analizę pojedynczych cząsteczek, ujawniając niejednorodność próbki i wychwytując stany przejściowe, które mogą być przesłonięte w pomiarach zespołowych 1,2. Obserwacja pojedynczych cząsteczek RNA za pomocą smFRET dostarcza informacji o wysokiej rozdzielczości na temat ich ścieżek fałdowania i dynamiki. Protokół ten opisuje chemiczne znakowanie RNA na dwóch końcach i jego unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację pęcherzyków fosfolipidowych, które razem umożliwiają śledzenie dynamicznych zmian konformacyjnych za pomocą mikroskopii smFRET-TIRF.
Badanie dynamiki RNA to stale rozwijająca się dziedzina, w której potrzebne są nowe strategie znakowania fluorescencyjnego specyficzne dla danego miejsca. Znakujemy końce RNA, kierując 5'-fosforan za pomocą karbodiimidów, a cukier 3'-rybozy za pomocą periodatu. Podejścia te zostały opisane wcześniej (5'-koniec18,19 i 3'-koniec 19,20,21,22), ale nie były wcześniej stosowane do RNA o podobnej wielkości do dzikiego typu Sc.ai5γ grupy II intronu rybozymu, który wymagał optymalizacji. Aktywacja 5'-fosforanu przez karbodimid (np. EDC) jest odwracalna. Dlatego imidazol zastosowano do nieodwracalnej reakcji z produktem pośrednim O-acylisourea, tworząc wysoce reaktywny fosforymidazolid 19,20. Jednak obecnie wiadomo, że przy wyższym pH karbodiimidy mogą modyfikować zasady nukleotydowe, w szczególności guaniny i uracyle, co ostatnio doprowadziło do ich zastosowania jako strukturalnych środków sondujących23,24.
Aby uniknąć reaktywności krzyżowej, kluczowe znaczenie ma oczyszczenie aktywowanego RNA z EDC przed podniesieniem pH do 7,5 na etapie sprzęgania barwnika. Jednak kiedy wprowadziliśmy etap oczyszczania między aktywacją a nasadkąbarwnika 25, uzyskaliśmy bardzo niskie plony. Analogicznie, w znakowaniu białek, dostępne powierzchniowo reszty lizyny mogą być aktywowane za pomocą karbodiimidów. Jednak zamiast imidazolu, który zapobiega odwróceniu aktywacji, rutynowo stosuje się NHS. Przyjęliśmy również tę strategię, zastępując w ten sposób półprodukt fosforomidazolidu półproduktem fosforanowym NHS. W ten sposób uzyskaliśmy kontrolę pH, a także zwiększoną gęstość znakowania w niższych temperaturach i krótszy czas inkubacji, tj. 25 °C przez 4 godziny w porównaniu do 37 °C przez 16 godzin. Opracowana dla RNA, ta strategia znakowania 5' może być stosowana do dowolnego innego jednoniciowego kwasu nukleinowego z 5'-fosforanem.
Aktywacja 5'-fosforanu i utlenianie 3'-rybozy wzajemnie się wykluczały, ponieważ chemia nie jest ortogonalna. Aby sprostać temu wyzwaniu i uniknąć etykietowania krzyżowego, zaczęliśmy od końca 5', a następnie etapu blokowania, aby zahamować aktywowane, ale nie oznakowane miejsca, zanim przystąpiliśmy do etykietowania końca 3'. Podczas utleniania 3'-diolu, nadmiar metaperiodynianu sodu (NaIO4) może wygasić już przyłączony fluorofor na końcu 5'. W związku z tym zmniejszyliśmy stężenie NaIO4 używanego do pojedynczego etykietowania z 20 mM do 10 mM.
Zalecamy równoległą pracę z wieloma podwielokrotnościami zamiast skalowania reakcji w górę. Protokół ten wymaga wielu etapów wytrącania etanolu (EtOH). Pracując równolegle z kilkoma podwielokrotnościami, przygotuj mieszaninę wytrącania (30 ml 100% bezwzględnego EtOH i 1 ml 3 M NaOAc, pH 5,2). NaCl nie jest stosowany ze względu na niską rozpuszczalność w EtOH. Wytrącić RNA o stężeniu 3,1 obj. tej mieszaniny przez nocną inkubację w temperaturze -20 °C, a następnie odwirować. Przemyć osad RNA dwukrotnie 500 μl lodowatego 70% EtOH, za każdym razem odwirować w temperaturze 4 °C i wysuszyć w próżni. Wytrącanie EtOH wykorzystuje nierozpuszczalność RNA i rozpuszczalność wolnych barwników w 70% etanolu. Filtracja odśrodkowa skutecznie usuwa wolne barwniki ze względu na ich znaczną różnicę wielkości w stosunku do RNA i ułatwia wymianę buforową, eliminując sole. Oprócz metod wytrącania EtOH i filtracji odśrodkowej, wolne barwniki można również usuwać za pomocą technik ekstrakcji żelowej i/lub chromatografii (np. HPLC); Skala powinna być jednak odpowiednio dostosowana. Nie należy wirować długich RNA w celu ponownego zawieszenia, ponieważ może to spowodować mechaniczne ścinanie26. Optymalnym czasem na wstrzymanie protokołu jest moment granulowania RNA. Używamy probówek o niskim poziomie wiązania DNA, aby poprawić odzyskiwanie kwasów nukleinowych. Chociaż końcowa objętość reakcji wynosi 100 μl, probówki o pojemności 1,5 ml (a nie mniej) są preferowane w celu lepszego oczyszczania przez wytrącanie EtOH.
Po usunięciu nieprzereagowanych wolnych barwników przez wytrącanie i filtrację odśrodkową, potwierdziliśmy znakowanie za pomocą fluorescencyjnej elektroforezy żelowej (ryc. 4A), spektroskopii UV-Vis, analitycznej HPLC3. Należy jednak zauważyć, że metody te nie są w stanie odróżnić cząsteczki RNA przenoszącej oba fluorofory od mieszaniny RNA, z których każda jest znakowana jednym kolorem. Podobnie, nie można ich użyć do określenia, czy cząsteczka RNA zawiera wiele fluoroforów o tym samym kolorze. Spektrometria mas nie może być stosowana ze względu na ograniczenia rozmiaru. Spektroskopia Ensemble3 i jednocząsteczkowa spektroskopia FRET potwierdzają znakowanie podwójnie fluorescencyjne, jak pokazano na rysunkach 4B i 5B. Stechiometria 0,5 (stosunek sCy3 do Cy5 wynosi 1:1) w eksperymentach smFRET potwierdza równe sprzężenie dwóch fluoroforów. Jednym z problemów było podwójne etykietowanie na końcu 3' poprzez znakowanie obu aldehydów zamiast proponowanej cyklizacji. Brak gatunków o stechiometrii 0,25 (stosunek sCy3 do Cy5 wynosi 1:2) w eksperymentach smFRET sugeruje, że przyczepianie barwnika sterycznie utrudnia i zapobiega przyłączeniu drugiego barwnika.
Dzięki temu podwójnemu znakowaniu fluorescencyjnemu zmiany sygnału FRET można przypisać rearanżacjom strukturalnym podczas fałdowania RNA i katalizy. Aby utrzymać znakowany fluorescencyjnie RNA w ulotnym polu do obrazowania pojedynczych cząsteczek TIRF, enkapsulacja jest preferowana w stosunku do bezpośredniego wiązania powierzchniowego. Podejście to polega na uwięzieniu pojedynczych cząsteczek RNA w dwuwarstwach lipidowych pęcherzyków, tworząc kontrolowane środowisko sprzyjające obserwacji ich dynamicznego zachowania. Opisany protokół wzbogaca monokapsułkowanie, jak pokazuje fotowybielanie w jednym kroku11. Aby zrozumieć fałdowanie i funkcję RNA, niezbędne jest wypełnienie luki in vitro i in vivo 27. Molekularne środki tłumiące mogą naśladować warunki panujące wewnątrz komórek w celu zwiększenia katalizy RNA przez introny grupy II 7,28. Alternatywnie, enkapsulacja tworzy ograniczone mikrośrodowiska, które sprzyjają fałdowaniu RNA29, zbliżając nasze zrozumienie struktury i dynamiki RNA do realistycznego kontekstu komórkowego.

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) to potężna i czuła technika do badania między- i wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań biomolekuł w nanoskali. Opiera się na nieradiacyjnym transferze energii ze wzbudzonej cząsteczki donorowej do pobliskiej cząsteczki akceptora, który zachodzi na odległościach zwykle od 1 nm do 10 nm. Odległość między barwnikami donorowymi i akceptorowymi decyduje o efektywności tego transferu energii, co sprawia, że FRET jest nieocenionym narzędziem do badania dynamiki molekularnej, zmian konformacyjnych i interakcji w szerokim zakresie systemów biologicznych1,2, w tym RNA. Mikroskopia z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencji (TIRF) okazała się potężną techniką do badań smFRET, ponieważ selektywnie oświetla cząsteczki tylko blisko powierzchni, umożliwiając dynamikę FRET poszczególnych cząsteczek z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Jednak przed wykonaniem eksperymentów smFRET-TIRF cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania musi najpierw zostać fluorescencyjnie znakowana odpowiednią parą FRET, a następnie unieruchomiona na powierzchni mikroskopii. Opisany tutaj protokół smFRET-TIRF został zwalidowany przy użyciu intronu Sc.ai5γ grupy II typu dzikiego z mitochondriów Saccharomyces cerevisiae, otoczonego przez jego dwie sekwencje egzoniczne (915 nukleotydów)3. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat intronów grupy II znakowania fluorescencyjnego i ich unieruchomienia w mikroskopii smFRET TIRF, zapoznaj się z naszą recenzją4.
Idealna strategia znakowania RNA specyficzna dla danego miejsca pozwoliłaby na precyzyjne wprowadzanie barwników donorowych i akceptorowych w określonych pozycjach bez zmiany struktury lub funkcji RNA, zapewniając dokładne i efektywne pomiary FRET. Jest to trudne ze względu na podobieństwa chemiczne między czterema zasadami nukleotydowymi, co komplikuje selektywne znakowanie. Znakowanie końcowe wiąże barwniki donorowe i akceptorowe z końcami RNA, celując w 5'-fosforan i 3'-rybozę. Podejście to oferuje minimalnie inwazyjne podejście, a jednocześnie dostarcza cennych informacji na temat dynamiki strukturalnej i interakcji. Zdolność intronu grupy II do samołączenia w obecności Mg2+ ogranicza stosowanie enzymów zależnych od jonów metali. W tym miejscu przedstawiamy podejście do podwójnie znakowanych końcowych długich i katalitycznie aktywnych RNA (rybozymów), które omijają potrzebę enzymów lub syntezy wyspecjalizowanych sond.
Powszechnym podejściem do przywiązania cząsteczek RNA do powierzchni dla mikroskopii TIRF jest kowalencyjne połączenie ugrupowania biotyny bezpośrednio z RNA lub hybrydyzacja antysensownego oligonukleotydu przenoszącego biotynę (ASO)5,6,7. Jednak ta metoda bezpośredniego unieruchomienia może wprowadzać artefakty spowodowane interakcjami RNA-powierzchnia, potencjalnie powodując nieprawidłowo sfałdowane RNAs8. Eleganckim rozwiązaniem łagodzącym te artefakty immobilizacji jest enkapsulacja RNA w powierzchniowo przyczepionych nanoskalowych pęcherzykach fosfolipidowych9,10,11. Te pęcherzyki, które mają średnicę około 100 nm, są zakotwiczone na powierzchni poprzez połączenie biotyna-streptawidyna12,13,14, umożliwiając swobodną dyfuzję RNA wewnątrz, umożliwiając jednocześnie wymianę jonów przez błonę lipidową10. Po kowalencyjnym znakowaniu dużego funkcjonalnego RNA3, przedstawiamy podejście do enkapsulacji takich RNA w pęcherzykach fosfolipidowych poprzez połączenie ustalonych protokołów pasywacji powierzchniowej i enkapsulacji pęcherzyków, dostosowanych do zachowania funkcjonalności RNA10,11,14. To podejście oparte na podwójnym znakowaniu i enkapsulacji pozwala osiągnąć wysoki wskaźnik monoenkapsulacji funkcjonalnych RNA w mikroskopii smFRET TIRF.

<table><tbody><tr><td>Znakowanie RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; mL probówek DNA LoBind&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC-HCl lub EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, format bez ważenia. Przechowywać w&nbsp; -20 &stopni; Kwas</td></tr><tr><td>C 3-morfolinopropano-1-sulfonowy (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, do biologii molekularnej, &ge; 99,5% (miareczkowanie)</td></tr><tr><td>Kwas octowy (lodowaty)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100%, bezwodny do analizy EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Jednostka filtracji odśrodkowej&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu; L</td></tr><tr><td>Cyjanine5 hydrazyd (Cy5-hydrazyd)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, numer CAS 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolutny &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>do biologii molekularnej, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>dymiący 37%, do analizy EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>Octan sodu (NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>bezwodny, ReagentPlus, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Metaperiodynian sodu (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Linia produktów</td></tr><tr><td>Pierce Sulfo-cyjanininy3 amina (sCy3-amina)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, numer CAS 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>Biologia molekularna klasa</td></tr><tr><td><silny>Przygotowanie komory</ silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylo)trietoksysilan (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>do analizy EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Walerianian biotyny-glikolu polietylenowego-sukcynimidylu (biotyna-PEG-SVA, bPEG) i glikol metoksypolietylenowy-walerianian sukcynimidylu (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5.000 i MPEG-SVA, MW 5.000 - Zestaw Combo</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0,13-0,16&nbsp; mm grubości</td></tr><tr><td>Deconex 11 uniwersalny</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Laboratoryjny roztwór do czyszczenia szkła</td></tr><tr><td>Wiertło rdzeniowe z powłoką diamentową</td><td>Crystalite corporation</td><td></td><td>Grubość 1 mm</td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td></td><td></td><td></td>diamentowa</tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolutny &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Szklany słoik do barwienia Coplin z pokrywą</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przekładka obrazowania</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 dołków,&nbsp; 9&nbsp; mm i razy; 0,12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tlenowy środek do czyszczenia plazmy</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>do biologii molekularnej, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie kwarcowe</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7,5&nbsp; x&nbsp; 2,5&nbsp; cm, grubość 1 mm</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99.5-100.5%</td></tr><tr><td><mocny>Przygotowanie ciasta lipidowego</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-(cap biotynyl) (sól sodowa), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>Stabilny przez 1 rok w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina lub 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina, C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml probówki do mikrowirówek, autoklaw Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>do sterylizacji</td></tr><tr><td>500&nbsp; ml kolba</td><td></td><td></td><td></td>Schlenka</tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>do analizy EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Kwas -6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>Kwas 3-morfolinopropano-1-sulfonowy (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, do biologii molekularnej, &ge; 99,5% (miareczkowanie). Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C w ciemności.</td></tr><tr><td>Samoprzylepne zakładki uszczelniające</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>z wątroby bydlęcej, zawiesina wodna, 10 000-40 000 jednostek/mg białka</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge; 99,5% (GC), BioXtra</td></tr><tr><td>Extruder membrana poliwęglanowa (PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0,1 &mu; m, 19 mm</td></tr><tr><td>Zestaw ekstrudera z blokiem grzewczym</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>od Aspergillus niger, Typ VII,&nbsp; liofilizowany proszek, &ge; 100 000 jednostek/g ciała stałego (bez dodatku tlenu)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>do biologii molekularnej, 1,00 M &plusmn; 0,01 M roztwór</td></tr><tr><td>Poliestrowy (PE), membrana</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, do biologii molekularnej, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>do biologii molekularnej, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich rna w mikroskopii jednocząsteczkowej fret-tirf

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) przoduje w badaniu dynamicznych biomolekuł, umożliwiając precyzyjną obserwację ich zmian konformacyjnych w czasie. Aby monitorować dynamikę RNA za pomocą smFRET, opracowaliśmy metodę kowalencyjnego znakowania RNA na ich końcach za pomocą pary fluoroforów FRET. Ta strategia bezpośredniego znakowania końcowego jest ukierunkowana na 5'-fosforan przez aktywację karbodimidu (EDC)/N-hydroksysukcynimidu (NHS) oraz 3'-rybozy przez utlenianie periodyczne, które można dostosować do innych RNA niezależnie od ich wielkości i sekwencji, aby badać je niezależnie od sztucznych modyfikacji. Ponadto aktywacja 5'-EDC/NHS jest przedmiotem ogólnego zainteresowania wszystkich kwasów nukleinowych z 5'-fosforanem. Zastosowanie dostępnych na rynku substancji chemicznych eliminuje potrzebę syntezy sond specyficznych dla RNA.
Mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) wymaga, aby unieruchomione powierzchniowo cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania znajdowały się w polu ulotnym, które ma być oświetlone. Wyrafinowanym sposobem utrzymywania cząsteczek RNA w ulotnym polu jest zamknięcie ich w pęcherzykach fosfolipidowych. Hermetyzacja korzysta z tego, co najlepsze z obu światów, wiążąc cząsteczkę z powierzchnią, umożliwiając jednocześnie swobodną dyfuzję cząsteczki. Zapewniamy, że każdy pęcherzyk zawiera tylko jedną cząsteczkę RNA, co umożliwia obrazowanie pojedynczej cząsteczki. Po podwójnym znakowaniu końca i enkapsulacji interesującego RNA, pomiary smFRET oferują dynamiczny i szczegółowy wgląd w zachowanie RNA.

Prezentujemy specyficzne dla danej lokalizacji pojedyncze i podwójne znakowanie fluorescencyjne 915-nt RNA, którym jest mitochondrialny intron grupy II drożdży Sc.ai5γ, flankowany sekwencjami eksonowymi. Para fluoroforów FRET została umieszczona na końcach RNA poprzez aktywację 5'-fosforanu za pomocą EDC/NHS oraz utlenianie 3'-rybozy nadjodynianem, a następnie poprzez odpowiednie przyłączenie barwników. Następnie zweryfikowano konjugaty RNA-barwnik za pomocą fluorescencyjnej elektroforezy żelowej, jak przedstawiono na Rysunku 4A. Współmigracja RNA i fluoroforów na żelu agarozy potwierdza pomyślne znakowanie. Następnie, jak pokazano na Rysunku 4B, do charakterystyki podwójnie znakowanego intronu grupy II wykorzystano ansamblową spektroskopię fluorescencyjną. Po wzbudzeniu barwnika donora zaobserwowano transfer energii, czyli FRET, co dowodzi podwójnego znakowania RNA. Co istotne, zgodnie z zależnością FRET od odległości, zwijanie się RNA intronu grupy II w obecności jonów metali doprowadziło do wzrostu wydajności FRET, o czym świadczy spadek emisji donora (zielona strzałka) i odpowiadający mu wzrost emisji akceptora (czerwona strzałka). Wskazuje to, że takie znakowanie FRET pozwala śledzić zmiany konformacyjne rybozymu.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Charakterystyka koniugatów RNA z barwnikiem. (A) Analityczna analiza żelowa RNA znakowanych pojedynczo i podwójnie fluorescencyjnie wykazuje współmigrację barwników z RNA na żelu agarozowym 2%. Kolokalizacja fluoroforów w próbce znakowanej podwójnie jest wskazana przez żółty prążek na obrazie złączonym (na dole) kanałów Cy3 (góra, zielony) i Cy5 (środek, czerwony), wizualizowanych odpowiednio przy oświetleniu 532 nm i 635 nm. Ścieżka 1: RNA znakowane tylko 5'-sCy3, ścieżka 2: RNA znakowane tylko 3'-Cy5 i ścieżka 3: RNA znakowane z obu końców (5'-sCy3 i 3'-Cy5). (B) Zespołowa spektroskopia fluorescencyjna potwierdza podwójne znakowanie. Transfer energii po pobudzeniu donora (λex = 515 nm, λem = 670 nm) potwierdza, że oba barwniki zostały pomyślnie sprzężone z RNA. Krzywa szara reprezentuje profil emisji prekatalitycznego RNA, natomiast krzywa czarna wykazuje zwiększoną efektywność FRET w sfałdowanym RNA intronu grupy II (inkubowanym z 500 mM KCl w 70 °C przez 3 min, schłodzonym do 42 °C przez 5 min, a następnie z dodatkiem 100 mM MgCl2). Rysunek został zaadaptowany z pracy Ahunbay et al.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Mając do dyspozycji podwójnie znakowany fluorescencyjnie intron grupy II typu dzikiego, możemy teraz zbadać jego dynamikę na poziomie pojedynczych cząsteczek. Po zamknięciu w pęcherzykach fosfolipidowych, znakowane RNA jest unieruchamiane na powierzchni mikroskopowej przy bardzo niskiej gęstości powierzchniowej, aby uzyskać rozdzielczość pojedynczych cząsteczek dla techniki smFRET-TIRF. Jak pokazano na Rysunku 5A, można jednocześnie śledzić kilka pojedynczych cząsteczek. Mikroskopia TIRF umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wydajności FRET oraz jej zmian w czasie. Rysunek 5B przedstawia statyczne i dynamiczne ślady smFRET znakowanego i zamkniętego w pęcherzykach RNA. Typowy ślad dynamiczny wykazuje antykorelację między sygnałami donora i akceptora, co powoduje fluktuacje wydajności FRET. Gdy emisja akceptora po pobudzeniu donora wzrasta, emisja donora odpowiednio maleje, co wskazuje na dynamiczną zmianę odległości między barwnikami. Ta antykorelacją sugeruje zmiany konformacyjne w cząsteczce RNA.
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg" /> 
Rycina 5: Wysoce dynamiczne zachowanie RNA intronu grupy II ujawnione za pomocą smFRET. RNA intronu grupy II z etykietami na obu końcach jest zamknięte w pęcherzyku fosfolipidowym i unieruchomione na powierzchni w celu obrazowania za pomocą mikroskopu TIRF z obiektywem. (A) Złożony obraz pojedynczych znakowanych cząsteczek RNA wykazujących emisję donora (sCy3, zielony) i emisję akceptora (Cy5, czerwony) przy wzbudzeniu 532 nm. (B) Typowe trajektorie smFRET (po lewej) statycznej cząsteczki RNA, w której natężenia donora i akceptora nie fluktuują w czasie, oraz (po prawej) dynamicznej cząsteczki RNA, w której natężenia donora i akceptora są antykorelowane, z wydajnościami FRET zaznaczonymi na żółto. Pojedyncze cząsteczki są lokalizowane i analizowane przy użyciu MASH-FRET17. Zastosowano korekcje bezpośredniego wzbudzenia, przenikania sygnału (bleed-through) oraz współczynnika γ. Skróty: smFRET = jednocząsteczkowy transfer energii rezonansowej Förstera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje dwukolorowe znakowanie długich RNA na końcach i ich unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację w pęcherzykach fosfolipidowych dla zastosowań mikroskopii pojedynczej cząsteczki FRET TIRF. Połączenie tych technik umożliwia precyzyjną wizualizację i analizę dynamiki RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Nasze badania koncentrują się na dynamice katalitycznych aktywnych RNA i na tym, jak ta dynamika zmienia się w różnych warunkach środowiskowych. Używamy jednocząsteczkowego FRET do badania wpływu takich czynników, jak monowalentne i dwuwartościowe linie pośrednie, białka opiekuńcze i czynniki tłumiące na dynamikę RNA. Precyzyjne włączenie fluoroforów donorowych i akceptorowych bez zakłócania struktury i funkcji RNA jest wyzwaniem.Ponadto śledzenie fałdowania dużego dynamicznego RNA jest trudne. Jednak ustalony protokół znakowania i enkapsulacji pozwala nam monitorować dynamikę fałdowania funkcjonalnego RNA w czasie. Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie polegające na obserwacji dużych, katalitycznie aktywnych RNA w czasie rzeczywistym i w warunkach neofizjologicznych.Poprzez kowalencyjne znakowanie i kapsułkowanie RNA i pęcherzyków, które są następnie unieruchomione powierzchniowo, możemy monitorować funkcję RNA za pomocą jednocząsteczkowego TIRF. Koncentrujemy się na kowalencyjnym znakowaniu FRET długich katalitycznych RNA, a zwłaszcza intronów grupy II. Jest to wyzwanie ze względu na ich złożoność strukturalną.Po zamknięciu w pęcherzykach możemy utrzymać RNA w ulotnym polu do mikroskopii TIRF, a mimo to RNA może swobodnie unosić się na wodzie. W ten sposób smFRET może bez przeszkód ujawnić dynamiczne zachowanie RNA. Będziemy nadal próbować zrozumieć, jak naprawdę działa natura, koncentrując się na relacji struktura-funkcja i dynamice rybosomów, ryboprzełączników i innych regulatorowych RNA przy użyciu podejścia wielotechnikowego.Tak więc przejście do badań w warunkach fizjologicznych i komórkowych będzie głównym celem naszej pracy w przyszłości. Na początek podwielokrotnić interesujący RNA, mając od 50 do 75 mikrogramów RNA na probówkę w 55 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody, a następnie dodać 45 mikrolitrów mieszaniny octanu sodu EDC/NHS o pH 6 do RNA. Inkubuj mieszaninę przez cztery godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 500 obr./min.Po inkubacji ponownie zawieś aktywowany osad RNA w 95 mikrolitrach 100-milimolowego buforu MOPS o pH 7,5. Następnie dodaj pięć mikrolitrów dwumilimolowej sulfonowanej cyjaniny-3aminy do aktywowanego RNA i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin przy 500 obr./min, aby sprzęgnąć fluorofor z aktywowanym 5-pierwszym fosforanem. Następnego dnia dodaj 200 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, aby poprawić separację.Następnie oczyść RNA znakowane 5-pierwszym fosforanem przez wytrącanie etanolu. Po oczyszczeniu ponownie zawiesić znakowany RNA w 100 mikrolitrach 100-milimolowego tris HCl i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie, aby usunąć wolne barwniki, umyj oznakowane RNA w podwójnie destylowanej wodzie z filtracją odśrodkową.W przypadku znakowania podwójnego końca, podwielokrotność RNA znakowanego na 5 końcach głównych, zawierająca około 50 do 75 mikrogramów RNA na probówkę w 90 mikrolitrach roztworu. Dodać pięć mikrolitrów jednomolowego buforu octanu sodu o pH 5,5. Następnie dodać cztery mikrolitry świeżo przygotowanego 500-milimolowego roztworu podstawowego metaperiodianu sodu.W przypadku pojedynczego znakowania na 3 głównych końcach dodać osiem mikrolitrów roztworu podstawowego metaperiodatu. Po inkubacji roztworów w ciemności przez dwie godziny, odpipetować 30 mikrolitrów 50% glicerolu, aby zatrzymać reakcję. Po 30 minutach inkubacji dodać 400 mikrolitrów lodowatej mieszaniny wytrącania octanu sodu etanolu.Ponownie zawiesić utlenioną osadę RNA w 95 mikrolitrach 50-milimolowego buforu octanu sodu o pH sześć. Oczyść RNA znakowane podwójnie końcami przez wytrącanie etanolu i filtrację odśrodkową, jak wykazano wcześniej. Eluuj oczyszczone RNA w podwójnie destylowanej wodzie.Porównaj wizualnie kolory supernatantu i osadu uzyskane po każdym kroku. Obliczyć stężenia RNA i sprzężonego barwnika na spektrofotometrze w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV. Fluorescencyjna elektroforeza żelowa potwierdziła udane pojedyncze i podwójne znakowanie RNA, na co wskazuje komigracja RNA z fluoroforami.Wydajność FRET wzrastała w obecności jonów metali, co wskazywało na fałdowanie RNA, co prowadziło do zmniejszenia emisji donorów i wzrostu emisji akceptorowej. Aby przygotować komorę mikroprzepływową, użyj wiertła diamentowego, aby wywiercić cztery otwory w szkiełkach kwarcowych, aby utworzyć dwa kanały. Umieść wywiercone szkiełka kwarcowe i około dwa razy więcej szkiełek nakrywkowych w szklanym słoiku do barwienia Coplin z pokrywką.Sonikować szkiełka podstawowe i nakrywkowe w wodzie podwójnie destylowanej przez pięć minut. Następnie poddaj słoik sonikowaniu w 10% roztworze do czyszczenia szkła laboratoryjnego przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Po przepłukaniu słoika podwójnie destylowaną wodą, sonikować w jednomolowym roztworze wodorotlenku potasu przez 30 minut i pozostawić go w roztworze na noc.Po wielokrotnym płukaniu i sonikacji wodą destylowaną, wysuszyć szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe za pomocą przepływu azotu gazowego. Wysuszone szkiełka i szkiełka nakrywkowe należy traktować środkiem do czyszczenia plazmą tlenową przez 30 minut. Umieść czyste szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia Coplin zawierającym 3% roztwór etanolu z testu AP Sonicate przez jedną minutę, a następnie inkubuj przez 30 minut.Opłucz szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe po trzy razy absolutnym etanolem i wodą podwójnie destylowaną, a następnie wysusz je pod strumieniem azotu. Następnie przygotuj wilgotne pudełko, napełniając do połowy puste pudełko z końcówką pipety wodą podwójnie destylowaną. Umieść szkiełka w pudełku stroną przeznaczoną do leczenia, skierowaną do góry.Dodaj 30-mikrolitrowe kropelki świeżo przygotowanej mieszaniny bPEG/mPEG na środek szkiełka, aby pokryć oba kanały. Przykryj kroplę czystym szkiełkiem nakrywkowym i zamknij wilgotne pudełko. Inkubuj pudełko przez noc w ciemności w celu pegylacji.Następnego dnia spłucz pasywowane PEG i biotynylowane szkiełka nakrywkowe wodą podwójnie destylowaną i obserwuj zmianę hydrofobowości obrabianych powierzchni. Przymocuj dwustronną naklejkę do szkiełka, upewniając się, że naklejka zakrywa obszar zainteresowania. Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, wyrównując powierzchnie PEGylowane tak, aby były zwrócone do siebie.Przenieś zmontowaną komorę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i napełnij probówkę gazowym azotem. Na początek użyj sterylnej igły, aby wybić otwór od wewnątrz w pokrywie sterylnej, czystej dwumililitrowej tubki. Do probówki dodać 109 mikrolitrów mieszaniny bPE-DMPC.Umieść tekturową wkładkę do przegrody komórkowej z pudełka do przechowywania mikroprobówek w 500-mililitrowej kolbie Schlenka, aby służyła jako uchwyt na probówkę. Za pomocą długiej pęsety ostrożnie umieść probówki zawierające mieszaninę lipidów w uchwycie probówki. Odparować chloroform pod niskim przepływem azotu gazowego przez noc.Po uzyskaniu wysuszonej warstwy lipidowej należy uszczelnić rurki parafilmem, aby zakryć otwory. Zmontuj ekstruder za pomocą 100-nanometrowej membrany poliwęglanowej i 10-milimetrowej poliestrowej tarczy spustowej. Zrównoważyć strzykawkę i membrany buforem zapobiegającym mruganiu.Po zmieszaniu podwójnie znakowanego RNA z buforem zapobiegającym mruganiu, należy uwodnić ciastko lipidowe mieszaniną buforową RNA zapobiegającą mruganiu w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Wstrząsaj przez pięć minut przy 1 400 obr./min, a następnie przez 15 minut przy 700 obr./min. Odwirować mieszaninę przez dwie minuty przy stężeniu 13 000 G i rozcieńczyć supernatant 250 mikrolitrami buforu zapobiegającego mruganiu.Napełnij strzykawkę zawiesiną lipidów RNA i wytłaczaj 35 razy w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bloku grzewczym, aby zamknąć RNA znakowane podwójnie końcami w pęcherzykach fosfolipidowych o średnicy 100 nanometrów. Przepłukać komorę dwukrotnie 200 mikrolitrami standardowego buforu 5X w temperaturze pokojowej. Napełnij komorę 50 mikrolitrami po 20 mikrolitrów na mililitr roztworu streptawidyny i inkubuj przez pięć minut.Następnie przepłukać komorę 200 mikrolitrami buforu standardowego i 100 mikrolitrami buforu przeciwmrugającego. Dodać 75 mikrolitrów zawiesiny pęcherzyków i inkubować przez 10 minut w celu unieruchomienia kapsułkowanego RNA na powierzchni. Po unieruchomieniu przepłukać komorę 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego buforu obrazowego.W celu akwizycji danych zamontuj komorę na mikroskopie TIRF i uzyskaj dane smFRET ze zmiennym wzbudzeniem laserowym. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET przy użyciu mikroskopii TIRF śledziło pojedyncze cząsteczki RNA i wykrywało zmiany w wydajności FRET w czasie rzeczywistym. Dynamiczne ślady jednocząsteczkowe wykazały antyskorelowane fluktuacje między sygnałami donorowymi i akceptorowymi, co wskazuje na potwierdzające zmiany w RNA.

fluorescent-end-labeling-encapsulation-long-rnas-for-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania końcowego i enkapsulacji długich RNA w wesyczkach fosfolipidowych do mikroskopii FRET-TIRF na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Przeglądaj więcej filmów