Name: Wykorzystanie pęsety optycznej do generowania sferoid hybrydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę konstrukcji hybrydowych sferoidów limfoma-komórek mezenchymalnych przy użyciu pęset optycznych. Protokół umożliwia precyzyjną kontrolę nad procesem formowania sferoidów i badanie interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy serdecznie dziękują Mikołajowi Czarnikowi, którego staranna redakcja znacznie poprawiła przejrzystość badania.

1. Wykonanie mikform na bazie żelu agarozowego
UWAGA: Podczas pracy ze wszystkimi kulturami komórkowymi niezbędne jest stosowanie właściwych technik aseptycznych. Wszystkie odczynniki użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Do jednego eksperymentu przygotuj trzy żele z MSC, zgodnie z Rysunkiem 1A.
<img alt="Przygotowanie hydrożelu agaryzowego do formowania sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych; schemat układu hodowlanego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie sferoidów z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). (A) Ilustracja przedstawiająca etap przygotowania mikrootform agaryzowych. (B) Wysiew mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) i hodowla sferoidów mezenchymalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Rozpocznij od przygotowania mikroform agarozowych. Przepłucz mikroformową szalkę Petriego (patrz Tabela materiałów) wodą dejonizowaną (3x) i umieść pod lampą UV na 30 min w celu przeprowadzenia sterylizacji.</li>
	<li>Najpierw przygotuj 2% roztwór agarozy. Odmierz 1 g wysokiej jakości czystego, sterylnego proszku agarozy (patrz Tabela materiałów) i umieść go w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Dodaj 50 mL sterylnego 0,9% roztworu chlorku sodu (patrz Tabela materiałów) do agarozy i dokładnie wymieszaj. Zakręć pokrywkę probówki stożkowej tak, aby była zabezpieczona, ale wciąż luźna.</li>
	<li>Użyj kuchenki mikrofalowej, aby zagotować i całkowicie rozpuścić proszek agarozy. Przerywaj mikrofalowanie co 10 s i ostrożnie zakręcaj probówką stożkową, aby upewnić się, że agaroza się rozpuszcza. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza podczas mieszania lub pipetowania agarozy. Schłodź agarozę do temperatury około 70 °C. 
	UWAGA: Upewnij się, że nie pozostały żadne resztki półprzezroczystego, nierozpuszczonego proszku. 
	OSTROŻNIE: Stopiona agaroza jest ekstremalnie gorąca i może spowodować poważne oparzenia skóry.</li>
	<li>Pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując techniki aseptyczne. Przygotuj hydrożele, wypełniając wcześniej wysterylizowane mikroformy 500 µL agarozy. Za pomocą pipety odessij wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione w drobnych elementach mikroformy.</li>
	<li>Po 15 min inkubacji w temperaturze pokojowej, gdy agaroza stężeje, ostrożnie przenieś żele z mikroform do sterylnej płytki 6-dołkowej. Nie uszkadzaj struktury żelu. Przed przejściem do następnego kroku sprawdź pod mikroskopem, czy mikroformy zostały przygotowane prawidłowo i upewnij się, że krawędzie są nienaruszone. Sprawdź, czy nie ma szczelin, przez które może wyciekać pożywka.</li>
	<li>Dodaj odpowiednią ilość 1x roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS), aby całkowicie przykryć mikroformy, a następnie umieść płytkę pod lampą UV na 30 min w celu sterylizacji. 
	UWAGA: Mikroformy agarozowe mogą być przechowywane przed użyciem do 2 tygodni w probówce stożkowej przykryte 1x PBS w warunkach chłodniczych (4 °C).</li>
	<li>Przed użyciem mikroform do produkcji sferoidów zrównoważ żel, całkowicie pokrywając go pożywką RPMI (4,0 mL/dołek dla płytki 6-dołkowej) i inkubuj przez minimum 15 min.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sferoidów z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)
<ol>
	<li>Hodować linię komórkową HS-5 (patrz Tabela materiałów), będącą ludzką linią mezenchymalnych komórek zrębowych, w pożywce hodowlanej RPMI 1640 uzupełnionej o 10% dezaktywowanego termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (patrz Tabela materiałów) w standardowych warunkach, zapewniając wymianę pożywki co 48 h.</li>
	<li>Gdy komórki HS-5 osiągną około 90% konfluencji, przeprowadzić pasażowanie komórek w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety serologicznej.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 1x PBS, a następnie delikatnie zamieszać i odessać, aby usunąć pozostałości pożywki.</li>
		<li>Odczepić komórki od dna kolby hodowlanej, dodając do niej 2 mL roztworu trypsyny-EDTA (patrz Tabela materiałów) i inkubując w 37 °C w celu ułatwienia odrywania się komórek.</li>
		<li>Zatrzymać trypsynizację, dodając 2 mL pełnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Za pomocą pipety 5 mL delikatnie zawiesić komórki i przenieść je do probówki stożkowej 15 mL.</li>
		<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 300 x g przez 7 min. Usunąć nadsącz i resuspendować komórki w 1 mL świeżej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Pobrać 10 µL osadu komórkowego i przenieść do probówki 0,5 mL. Następnie dodać 10 µL 0,4% roztworu błękitu trypanu (patrz Tabela materiałów) i zliczyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Na podstawie uzyskanej gęstości komórkowej rozcieńczyć komórki do stężenia 2 x 105 komórek/mL pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z agarozowej mikrolisty.</li>
	<li>Ostrożnie nanieść 190 µL wspomnianej wyżej zawiesiny komórkowej (krok 2.2.8) do komory wysiewczej agarozowej mikrolisty. Pojedyncza studnia będzie zawierać około 150 komórek (38 000 komórek/żel).</li>
	<li>Inkubować komórki w agarozowej mikroliście w inkubatorze (5% CO2, 37 °C, atmosfera wilgotna) przez 30 min, aż komórki osiądą na dnie żelu. Po 30 min wyjąć płytkę z mikrolistą z inkubatora i powoli dodać dodatkową pożywkę na zewnątrz żeli, pokrywając je całkowicie (np. 4,0 mL/studnię dla płytki 6-dołkowej). 
	UWAGA: Nie dodawać pożywki bezpośrednio na żelową mikrolistę agarozową, lecz do naczynia hodowlanego, aby uniknąć uszkodzenia świeżo uformowanych sferoidów.</li>
	<li>Umieścić żel w inkubatorze w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 na 72 h, aż uformują się jednorodne sferoidy (Rysunek 1B). 
	UWAGA: Zaleca się obserwację formowania sferoidów przez kolejne 3 dni pod mikroskopem odwróconym. Generalnie mezenchymalne komórki zrębowe zaczynają tworzyć sferoidy w ciągu 24 h, jednak proces ten może przebiegać szybciej lub wolniej w zależności od pasażu i gęstości komórek. Po 72 h inkubacji na agarozowej mikroliście mezenchymalne komórki zrębowe tworzą stosunkowo jednorodne sferoidy; należy jednak zauważyć, że mogą one różnić się rozmiarem i kształtem mimo inkubacji w identycznych warunkach. Pożywkę należy wymienić, gdy zmieni ona kolor z purpurowo-czerwonego na żółty.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek chłoniaka i przygotowanie do pułapkowania optycznego
UWAGA: Linie komórkowe hematologiczne, w tym komórki chłoniaka, rosną w formie zawiesiny w pożywkach hodowlanych w kolbach przeznaczonych do hodowli w zawiesinie, bez przywierania do płytki lub naczynia hodowlanego. Aby zachować optymalne właściwości komórek, zaleca się rozpoczęcie przygotowania próbki nie wcześniej niż 30 min przed procedurą składania hybrydowych sferoidów za pomocą pęsety optycznej. Co istotne, protokół opisany w tej sekcji dotyczy linii komórkowej chłoniaka człowieka Ri-1, jednak podobny protokół ma zastosowanie do innych linii komórkowych nowotworów hematologicznych.
<ol>
	<li>Hodować linię komórkową chłoniaka Ri-1 (patrz Tabela materiałów) w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Przechowywać komórki chłoniaka w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli, w tym w temperaturze 37 °C i nawilżonym powietrzu z 5% CO2. Utrzymywać hodowle w gęstości od 3-5 x 105 komórek/mL w fazie logarytmicznej poprzez pasażowanie co 2-3 dni.</li>
	<li>Zebrać komórki i przenieść zawiesinę do 15 mL polistyrenowej probówki. Wirować komórki z prędkością 300 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu komórkowego. Usunąć nadsącz i dodać 10 mL świeżej pożywki, delikatnie pipetując do momentu uzyskania jednorodnej zawiesiny.</li>
	<li>Pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej do nowej probówki do wirowania i dodać 10 µL błękitu Trypan. Dokładnie wymieszać zawiesinę pipetą przed przeniesieniem 10 µL do komory liczbowej w celu określenia gęstości i żywotności komórek (zazwyczaj powyżej 95%).</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać końcową gęstość 1 x 104 komórek/mL. Przechowywać komórki chłoniaka w temperaturze 37 °C do momentu manipulacji optycznych.</li>
</ol>
4. Konfiguracja systemu pęsety optycznej
UWAGA: Poniższy protokół został opracowany specjalnie dla zbudowanych na zamówienie pęset optycznych36 (Rycina 2A). Niemniej jednak, analizę tę można przeprowadzić z użyciem innych dostępnych komercyjnie systemów pułapkowania. Niezależnie od rodzaju dostępnego sprzętu, podstawowe kroki przygotowania systemu (np. uruchomienie lasera i oprogramowania komputerowego, zamocowanie próbki oraz przetestowanie możliwości przemieszczania komórki w pułapce optycznej) pozostają takie same. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w temperaturze pokojowej, tj. 25 °C.
<img alt="Schemat mikroskopu z pułapką optyczną: układ laserowy do tworzenia sferoidów hybrydowych; zawiera wyniki IHC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przedstawiający mechanizm działania generowania sferoidów hybrydowych za pomocą pęsety optycznej. (A) Specjalnie zaprojektowany układ pęsety optycznej. (B) Proces przyłączania pojedynczych komórek chłoniaka do powierzchni sferoidu MSC. Pojedynczą komórkę chłoniaka uwięziono optycznie i przyłączono do powierzchni sferoidu zromialnego, aż do momentu utworzenia stabilnego połączenia. Proces ten kontynuowano do czasu, aż cała powierzchnia sferoidu zromialnego została pokryta komórkami chłoniaka. (C) Reprezentatywny obraz barwienia immunohistochemicznego przekroju sferoidu hybrydowego otrzymano przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-CD20 przeciwko CD20. Barwienie immunologiczne wykonano przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-ludzkiego przeciwko CD20 na autostainerze (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Włącz źródło światła mikroskopu.</li>
	<li>Załóż okulary ochronne przeznaczone do pracy z laserem.</li>
	<li>Włącz laser i ustaw moc tak, aby uzyskać sztywność pułapki wynoszącą około 50 pN/µm w systemie pęsety optycznej. Przed kontynuacją odczekaj 10 min, aby wiązka lasera uległa stabilizacji. 
	UWAGA: W systemie zbudowanym na zamówienie podana sztywność pułapki jest osiągana przy mocy lasera 100 mW na wejściu do obiektywu mikroskopu, zmierzonej dla polistyrenowej kulki o średnicy 3 µm. Jej minimalna inwazyjność względem komórek chłoniaka została wcześniej potwierdzona32,33, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do manipulowania żywymi komórkami.</li>
	<li>W międzyczasie uruchom oprogramowanie komputerowe. W oknie programu pojawi się obraz preparatu mikroskopowego. Użyj znaczników widocznych na ekranie, aby przemieścić pułapkę optyczną w pożądanym kierunku.</li>
	<li>Gdy system będzie gotowy, nanieś 30 µL wody dejonizowanej na środek dolnego obiektywu. 
	UWAGA: System zbudowany na zamówienie wykorzystuje obiektyw imersyjny wodny; jednak medium imersyjne może się różnić w zależności od konfiguracji użytkownika.</li>
	<li>Umieść na stoliku mikroskopu szalkę hodowlaną o średnicy 35 mm (patrz Tabela materiałów) z szklanym dnem. Stabilizuj szalkę za pomocą uchwytów.</li>
	<li>Podnieś obiektyw za pomocą mikrometrycznej śruby mikroskopu, aż kropla wody dotknie szklanego dna szalki.</li>
	<li>Za pomocą śruby mikrometrycznej delikatnie reguluj stolik mikroskopu, aż wiązka lasera zostanie ostro skupiona w jeden jasny punkt na ekranie. W oknie programu będzie widoczny obraz preparatu mikroskopowego. Użyj znaczników widocznych na ekranie, aby przemieścić pułapkę optyczną w dowolnym pożądanym kierunku.</li>
	<li>Dodaj 100 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek chłoniaka (patrz punkt 3.5) na środek szalki z szklanym dnem. Pozostaw je do opadnięcia na dno szalki przez około 5 min.</li>
	<li>Przesuwając stolik mikroskopu, znajdź pływającą komórkę chłoniaka. Ustaw pułapkę optyczną na próbce, klikając kursor pułapki na ekranie. Spróbuj przemieścić komórkę w pożądane miejsce. Komórka, aby nadawała się do manipulacji, musi być w stanie łatwo poruszać się w danym kierunku. 
	UWAGA: Według naszych obserwacji od 5 do 10% komórek chłoniaka dodanych do szklanej szalki trwale przytwierdza się do dna po okresie inkubacji. Procent ten wzrasta wraz z czasem trwania manipulacji i może osiągnąć 30% po 60 min. Jednak mimo tych strat liczba komórek początkowo dodanych do szalki pozwoli zarówno na skuteczną kalibrację systemu, jak i pokrycie sferoidu komórkami chłoniaka.</li>
</ol>
5. Generowanie sferoidów hybrydowych przy użyciu pęset optycznych
<ol>
	<li>Za pomocą końcówki pipety (100-1000 µL) ostrożnie wyjmij pojedynczy sferoid zrębowy z dołka formy agarozowej i umieść go na szalku mikroskopowym z szklanym dnem o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Dodaj 2 mL pożywki hodowlanej RPMI i inkubuj przez 10 min w temperaturze 37 °C w standardowych warunkach. W tym czasie sferoid delikatnie przylgnie do szkła, co zapobiegnie jego przemieszczaniu się podczas manipulacji.</li>
	<li>Umieść szalkę zawierającą sferoid na stoliku mikroskopu i ustabilizuj ją za pomocą uchwytów.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 100 µL zawiesiny komórek chłoniaka o końcowym stężeniu 1 x 104 komórek/mL (krok 3.5). Pozostaw je na około 5 min, aż opadną na dno szalki.</li>
	<li>Za pomocą ruchów stolika mikroskopu znajdź pływającą komórkę chłoniaka. Skieruj pułapkę optyczną na wybraną komórkę, klikając kursor pułapki na ekranie. Gdy komórka zostanie schwytana i stanie się mobilna, przesuń stolik mikroskopu, aby doprowadzić komórkę do kontaktu z powierzchnią sferoidu zrębowego.</li>
	<li>Rozpocznij od przytwierdzenia komórki chłoniaka do powierzchni sferoidu zrębowego na 10 s. Następnie sprawdź, czy komórka jest trwale przytwierdzona, wykonując trzy powtórzone próby odczepienia komórki chłoniaka za pomocą pęsety optycznej.</li>
	<li>Jeśli kontakt komórkowy zostanie przerwany, ponownie przytwierdź komórkę chłoniaka do powierzchni sferoidu za pomocą pułapki optycznej, jednak tym razem przez dłuższy czas, około 20 s. 
	UWAGA: Niezbędne jest osobne określenie konkretnych odstępów czasowych chwytania pojedynczych komórek dla każdej linii komórkowej. W manipulacjach wstępnych ustalono, że komórki chłoniaka linii Ri-1 wykazują silne właściwości adhezyjne do sferoidów zrębowych, przylegając do ich powierzchni głównie w czasie 10-20 s. Zatem konkretne przedziały czasu kontaktu dla chwytania pojedynczych komórek Ri-1 wynosiły 10, 20 i 30 s. Ze względu na czasochłonny charakter procedury, do tworzenia sferoidów za pomocą pęsety optycznej zaleca się stosowanie linii komórkowych o minimalnym czasie adhezji nieprzekraczającym 30 s.</li>
	<li>Powtarzaj procedurę z kolejnymi komórkami chłoniaka, aż cała powierzchnia sferoidu zrębowego zostanie pokryta komórkami chłoniaka.</li>
	<li>Aby równomiernie pokryć dostępną powierzchnię sferoidu zrębowego komórkami chłoniaka, konieczna jest zmiana pozycji pułapki optycznej w objętości próbki mikroskopowej. Poprzez zmianę płaszczyzny obrazowania za pomocą mikrometrycznej śruby mikroskopu można zmienić pozycję pułapki optycznej, co umożliwia głębsze przemieszczanie schwytanych obiektów w próbce.</li>
	<li>Aby lepiej odwzorować spontanicznie utworzony sferoid, pokryj rdzeń komórek zrębowych 2-3 warstwami komórek chłoniaka.</li>
	<li>Przenieś szalkę z szklanym dnem zawierającą sferoid do inkubatora na 1 h inkubacji w standardowych warunkach. 
	UWAGA: Hybrydowy sferoid może być hodowany długoterminowo w 20 µL pożywki RPMI w kropli wiszącej.</li>
</ol>
6. Określenie żywotności sferoidów
<ol>
	<li>Oceń żywotność sferoidów komórkowych za pomocą zestawu do barwienia żywe/martwe (patrz Tabela materiałów). Delikatnie usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz sferoidy 100 µL 1x PBS.</li>
	<li>Inkubuj sferoidy w 100 µL roztworu 1x PBS zawierającego 1 µM kalceiny-AM oraz 2 µM etydium homodimeru-1 przez 20 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Obserwuj sferoidy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów) i wykonaj zdjęcia (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Po barwieniu nie ma potrzeby płukania sferoidów. Poziom fluorescencji tła w tym teście jest z natury niski, ponieważ barwniki są praktycznie niefluorescencyjne przed wejściem w interakcję z komórkami.</li>
	<li>Za pomocą programu ImageJ (patrz Tabela materiałów) określ żywotność sferoidów, obliczając stosunek obszaru zabarwionego na zielono (komórki żywe) do całkowitego obszaru zabarwionego na czerwono (komórki martwe) i zielono.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym badaniu hybrydowe sferoidy mezenchymalnego rdzenia zrębu i komórek chłoniaka zostały zmodyfikowane w czasie rzeczywistym przy użyciu pęsety optycznej. Nowe technologie laserowe, w tym systemy pułapkowania, są obecnie dostępne na rynku i stają się coraz bardziej popularne. Jednak do tej pory większość pęset optycznych nadal to instrumenty zbudowane na zamówienie; W związku z tym kalibracja, procedury operacyjne i geometrie eksperymentalne mogą się różnić w zależności od laboratoriów38,39...

Trójwymiarowe (3D) modele komórkowe przyspieszają badania nad rakiem, ponieważ lepiej przypominają tkankę nowotworową pod względem kilku funkcjonalnych i strukturalnych właściwości. Należą do nich m.in. produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej, interakcja między komórkami, utrzymanie gradientów składników odżywczych i tlenu oraz podobne reakcje na zabiegi1,2,3,4. Ostatnio, aby lepiej odzwierciedlić warunki in vivo, opracowano zaawansowane heterogeniczne modele 3D obejmujące różne typy komórek5,6,7.
Chłoniak nieziarniczy B-komórkowy (B-NHL) to niejednorodna grupa nowotworów złośliwych wywodzących się z limfocytów B, integralnych składników układu odpornościowego8. Charakteryzujący się różnorodnym wachlarzem objawów klinicznych i cech histologicznych, B-NHL obejmuje spektrum zaburzeń, od postaci powolnych z przedłużonym przebiegiem klinicznym po agresywne warianty, które szybko postępują9,10. Patogeneza B-NHL i innych nowotworów hematologicznych jest często związana z wpływem mikrośrodowiska nowotworu11,12. Na przykład komórki chłoniaka często rozprzestrzeniają się do szpiku kostnego, potencjalnie powodując zagrażające życiu powikłania13. Uznano, że mezenchymalne komórki zrębowe (MSC), które są kluczowymi składnikami niszy szpiku kostnego, wpływają na wzrost i progresję guza14, głównie poprzez bezpośrednie interakcje komórka-komórka15,16,17; W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania modeli, które pozwolą na badanie takich wzajemnych oddziaływań. Wcześniej ustaliliśmy, że MSC, gdy są hodowane wspólnie na hydrożelach agarozowych z komórkami chłoniaka, samoczynnie agregują się w wielokomórkowe sferoidy, z komórkami zrębu tworzącymi rdzeń i równomiernie otoczonymi komórkami chłoniaka18. W tym artykule przedstawiono protokół wytwarzania hybrydowego modelu 3D komórek chłoniaka i zrębu za pomocą pęsety optycznej.
Ponad 35 lat temu, Ashkin po raz pierwszy opisał zjawisko nieinwazyjnego optycznego pułapkowania wirusów i bakterii za pomocą skupionej wiązki laserowej19. Obecnie pęsety optyczne (OT) mają dynamicznie rosnący wpływ w dziedzinie biomedycyny, w tym badań nad biologią komórki20,21,22,23. OT pozwolił nie tylko badać właściwości fizyko-mechaniczne poszczególnych komórek24,25,26, ale także bezpośrednie interakcje komórka-komórka na poziomie pojedynczej komórki, a także dalsze ułożenie i strukturyzacja komórek 2D i 3D27,28,29. Technika pułapkowania optycznego opiera się na siłach optycznych rzędu kilku pikonewtonów wywieranych jako promieniowanie elektromagnetyczne (fotony), które zmienia swój pęd, gdy wchodzi w interakcję z materią30. W rezultacie, używając jednej lub więcej wiązek laserowych, operatorzy mogą selektywnie manipulować położeniem, ruchem i dynamiką obiektów w mikro- i nanosup20. W praktyce technika pułapkowania optycznego pozwala na selektywne i nieniszczące uwięzienie żywych komórek, umieszczając je w kontakcie z powierzchnią innej komórki lub cząsteczki i wywołując inicjację procesu adhezji31. Korzystając z powyższych funkcjonalności, najpierw podjęliśmy próbę optycznego umieszczenia pojedynczej komórki chłoniaka na monowarstwie komórek zrębu, aby zbadać jej właściwości adhezyjne. Następnie przystąpiliśmy do oceny zdolności pęsety optycznej do fizycznego odtworzenia sferoidy wielokomórkowej w trybie czasu rzeczywistego33. Aby to osiągnąć, poszczególne komórki chłoniaka zostały uwięzione jedna po drugiej i przyłączone do wcześniej przygotowanej sferoidy zrębu 3D. Innym zastosowaniem pułapki optycznej było zmierzenie minimalnego czasu adhezji komórka-komórka i ocena drobnych zmian w adhezji wynikających z leczenia przeciwnowotworowego34,35. Chociaż modele 3D są szeroko stosowane w badaniach nad rakiem, badanie wczesnych etapów powstawania sferoidów pozostaje wyzwaniem. Wynika to przede wszystkim z ograniczonej dostępności metod, które pozwalają na dotykanie mikroświata z dużą precyzją i jednocześnie mało inwazyjnym oddziaływaniem. Z drugiej strony, pełny potencjał OT nie został jeszcze osiągnięty w zakresie układu i struktury komórkowej w 3D. Dlatego w tym artykule opisano krok po kroku połączony przepływ pracy w celu wygenerowania konstruktu chłoniaka 3D przy użyciu standardowych technik 3D i manipulacji w pęsetach optycznych. Co ważne, protokół może być łatwo zaadaptowany do stosowania z innymi typami komórek o znaczeniu w nowotworach hematopatologicznych.

<table><tbody><tr><td>&micro;-Dish 35 mm, wysokie szklane dno</td><td>IBIDI</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>12-256 mico-mold 3D PetriDish&nbsp;</td><td>Microtissues Inc., RI, Stany Zjednoczone</td><td>12-256TR</td><td></td></tr><tr><td>3 i mikro; m mikrosfery polistyrenowe</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty CD20 (klon L26)</td><td>Dako</td><td>IS604</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>EVE/ EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Dako</td><td>D09634</td><td></td></tr><tr><td>Kamera&nbsp;</td>Inkubator CO2 <td>Olympus</td><td>U-TV0.63XC</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture</td><td>Esco Technologies, Inc.</td>Szkiełka do liczenia komórek <td>CCL</td><td></td></tr><tr><td>, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>NE-EVS</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa HS-5</td><td>ATCC</td><td>CRL-3611</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa Ri-1&nbsp;</td><td>DSMZ&nbsp;</td><td>ACC 585</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Program Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników Live/Dead&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu 0,9%, sterylny</td><td>Odczynniki ITW ReITW, S.R.L.agents, S.R.L.</td><td>A1671</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td> Konfiguracja pęsety optycznej</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustra dichroiczne</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805R</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Mikrotron GmbH</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>System skanowania XY z lustrem galwanowym</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Obiektyw Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 2</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-200-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 1064 nm</td><td>laser Quantum</td><td>Ventus</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie pęsety optycznej do generowania sferoid hybrydowych

Using Optical Tweezers for the Generation of Hybrid Spheroids

Dwuwymiarowa (2D) hodowla komórek jest nadal jednym z najczęściej używanych modeli w przedklinicznych badaniach nad rakiem. Wydaje się jednak, że trójwymiarowe (3D) modele in vitro dokładniej oceniają środowisko in vivo, w tym bardziej odpowiednią morfologię architektoniczną, mikrośrodowisko i reakcje na leki.
Pułapkowanie optyczne wykorzystuje jedną lub więcej skupionych wiązek laserowych do nieinwazyjnego manipulowania pozycją, ruchem, interakcją i dynamiką struktur w nano- i mikroskali. Pęseta optyczna (OT) znalazła liczne zastosowania w biologii komórki; Jednak ich potencjał w badaniach nad rakiem jest nadal niedoceniany. W niniejszej pracy zalecamy nieinwazyjny protokół tworzenia sferoidów chłoniaków i komórek zrębu za pomocą pęsety optycznej. Metoda ta nie tylko konstruuje sferoidy hybrydowe de novo, ale także umożliwia kontrolowanie liczby przyłączonych komórek i czasu tworzenia się adhezji, stanowiąc ważne źródło informacji dla inżynierii tkankowej. Co więcej, OT umożliwia badanie wczesnych etapów powstawania sferoid hybrydowych, których nie można osiągnąć za pomocą standardowych technik masowych. Co ważne, opisany model może być wykorzystany do badania minimalnych zmian w adhezji indukowanych przez leki przeciwnowotworowe. Ten protokół można łatwo zastosować do innych typów komórek.

Nasze poprzednie wyniki wykazały, że mezenchymalne komórki macierzyste hodowane z komórkami chłoniaka tworzą jednorodny rdzeń zrębowy, do którego komórki nowotworowe przylegają równomiernie18. W niniejszym badaniu z sukcesem skonstruowaliśmy ludzki sferoid hybrydowy składający się z mezenchymalnych komórek macierzystych i komórek chłoniaka, wykorzystując do tego celu zbudowane na zamówienie pęsety optyczne. Rysunek 2B przedstawia reprezentatywny sferoid w mikroskopie ...

W tym artykule proponujemy protokół do produkcji hybrydowych sferoidów za pomocą pęsety optycznej. Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę wczesnych etapów procesu powstawania sferoidów, co jest nieosiągalne innymi metodami.

Wykorzystanie pęsety optycznej do generowania sferoid hybrydowych

Two-dimensional (2D) cell culture is still among the most commonly used models in preclinical cancer research. However, the three-dimensional (3D) in ...

Pęseta optyczna umożliwia fizyczne chwytanie i manipulowanie obiektami w skali mikronów i nanometrów w sposób nieinwazyjny przy użyciu tylko skupionej wiązki laserowej. Narzędzie to jest obecnie z powodzeniem stosowane do różnych struktur biologicznych, w tym do rozszczepiania komórek. Nasze laboratorium ma na celu zbadanie bezpośredniej interakcji komórka-komórka na poziomie pojedynczej komórki i dalsze leczenie tego bocznego układu i struktury przy użyciu obiecujących technik, takich jak pęseta optyczna.Po pierwsze, obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest brak protokołu budowy sferoid hybrydowych z wykorzystaniem pęsety optycznej dla całego procesu. Drugim jest stabilizacja nowego układu sferoid hybrydowych i pobieranie ich do późniejszego eksperymentalnego przetwarzania. W tym protokole demonstrujemy krok po kroku budowę sferoidy chłoniaka hybrydowego za pomocą pęsety optycznej.Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania bezpośrednich interakcji między komórkami chłoniaka a trójwymiarowym mikrośrodowiskiem w czasie rzeczywistym, co jest bardziej istotne biologicznie niż tradycyjna hodowla komórkowa. Co ważne, przedstawioną tu technikę można łatwo zaadaptować do linii komór

using-optical-tweezers-for-the-generation-of-hybrid-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Źródło: Huang, Y. et. al., Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej tomografii koherentnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie koherencji optycznej tomografia (OCT) do monitorowania sferoid guza w płytce wielodołkowej poprzez przechwytywanie obrazów przekroju poprzecznego o wysokiej rozdzielczości. Analizując odbicia światła od struktur komórkowych, OCT konstruuje modele 3D w celu oceny cech morfologicznych,...

Monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii 

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Poznaj metodę konstrukcji hybrydowych sferoidów limfoma-komórek mezenchymalnych przy użyciu pęset optycznych. Protokół umożliwia precyzyjną kontrolę nad procesem formowania sferoidów i badanie interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie pęsety optycznej do generowania sferoid hybrydowych

Przeglądaj więcej filmów