Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu gotowej terapii komórkowej CAR dla inwazyjnych infekcji grzybiczych. Naszym celem jest zidentyfikowanie najlepszych celów, projektów CAR i kombinacji komórek odpornościowych, aby osiągnąć optymalne wyniki terapeutyczne. Ostatnie osiągnięcia, w tym nasze własne prace, koncentrują się na opracowaniu terapii limfocytami T CAR ukierunkowanych na Aspergillus fumigatus.

Te zmodyfikowane komórki wykazały obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych, znacznie zmniejszając obciążenie grzybami, kontrolując odporność przeciwgrzybiczą i poprawiając całkowite przeżycie. Obecnie większość badań w tej dziedzinie koncentruje się na wytwarzaniu limfocytów T CAR specyficznych dla bardzo ograniczonego zestawu celów przy użyciu wektorów wirusowych lub systemu transpozonów śpiącej królewny. Główne wyzwania polegają na zidentyfikowaniu optymalnych celów grzybów i wytworzeniu gotowego do użycia produktu komórkowego, który jest zarówno skuteczny, jak i skalowalny do zastosowań klinicznych.

Dzięki temu protokołowi odpowiadamy na zapotrzebowanie na opłacalne i skalowalne metody generowania niewirusowych komórek CAR-NK. Stanowi ona przystępne podejście do badań przesiewowych nowych celów przeciwgrzybiczych, stanowiąc fundamentalny krok w kierunku gotowej terapii komórkowej CAR-NK w przypadku infekcji grzybiczych. Na początek sprawdź komórki NK-92 pod mikroskopem pod kątem klastrów na przezroczystym tle, dodaj 2 mililitry pożywki do hodowli komórkowej na dołek dla każdego stanu na sześciodołkową płytkę i umieść płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Przenieś 8 razy 10 do mocy 6 komórek NK-92 do 15-mililitrowej stożkowej probówki dolnej i odwiruj probówkę przy 200 G przez pięć minut z przyspieszeniem i opóźnieniem 3. Po odrzuceniu supernatantu napełnić probówkę zawierającą osad komórkowy do 15 mililitrami wstępnie podgrzanego PBS i ponownie odwirować. Podczas wirowania należy odpipetować 8 mikrogramów plazmidowego DNA Af-CAR i 4 mikrogramy minikoła SB100X do jednej probówki reakcyjnej i pozostawić DNA drugiej probówki wolne, aby służyło jako pozorowana kontrola.

W przypadku systemu transfekcji dodaj 3 mililitry buforu elektrolitycznego do pierwszej probówki i umieść ją w stacji pipetowej. Po odwirowaniu delikatnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu do rezaspensji. Następnie dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z dwóch probówek reakcyjnych i delikatnie wymieszać.

Odpipetować mieszaninę komórek DNA z pierwszej probówki reakcyjnej za pomocą pipety systemu transfekcji, a następnie włożyć pipetę do transfekcji pionowo do probówki w stacji pipetowej. Ustaw pierwszy impuls na 1 650 woltów i czas impulsu na 20 milisekund przed naciśnięciem startu, aby zainicjować impuls. Po pierwszym impulsie ustaw drugi impuls na 500 woltów, a czas impulsu na 100 milisekund i zainicjuj drugi impuls.

Po zakończeniu drugiego impulsu powoli wyjmij pipetę ze stacji pipetowej. Natychmiast przenieś komórki do jednego dołka przygotowanej płytki hodowlanej zawierającej 2 mililitry wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i delikatnie przesuwaj płytkę ruchami okrężnymi, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po 30 minutach inkubacji dodać interleukinę-2 do studzienek w końcowym stężeniu 150 jednostek międzynarodowych na mililitr. Aby rozpocząć, przetransfekuj komórki NK-92 żądanym plazmidem. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie odwirować komórki i rozcieńczyć je do stężenia 1 do 2 razy 10 do mocy 6 komórek na 100 mikrolitrów za pomocą buforu. Dodaj jeden mikrolitr biotyny anty EGFR-T na 1 razy 10 do mocy 6 komórek i delikatnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu. Inkubować probówkę przez 25 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po inkubacji napełnij probówkę do 10 mililitrami buforu. Następnie odwirować probówkę o sile 200 G przez pięć minut z przyspieszeniem i opóźnieniem 3, a po odwirowaniu odrzucić supernatant. Następnie dodaj 8 mikrolitrów zimnego buforu, a następnie dwa mikrolitry kulek magnetycznych antybiotyny na 1 razy 10 do mocy 6 komórek.

Inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby umyć komórki, napełnij probówkę do 10 mililitrami buforu i odwirówki. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu.

Umieść kolumnę LS w maksymalnym magnesie i umyj ją 3 mililitrami buforu. Dodaj zawiesinę komórki, gdy bufor całkowicie przeprowadzi się przez kolumnę. Po umyciu kolumny wyjmij ją z magnesu i umieść w czystej stożkowej rurze dolnej o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj 5 mililitrów buforu do kolumny i użyj tłoka, aby jak najszybciej wypłukać dodatnie komórki EGF-R. Wydajność transfekcji po wyzdrowieniu osiągnęła od 10 do 20%, a maksymalne wzbogacenie zwiększyło czystość komórek Af-CAR-NK-92 do ponad 95%Na początek uzyskaj wzbogacone komórki NK-92 z ekspresją transgenu za pomocą techniki sortowania komórek aktywowanych magnetycznie. Następnie przygotować zawiesinę konidiów Aspergillus fumigatus o stężeniu 2,5 razy 10 do mocy 5 konidiów na mililitr w pożywce.

Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny konidiów do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Drugiego dnia przemyć makietę i transfekowane plazmidem komórki NK-92 dwukrotnie pożywką i dodać 5 razy 10 do mocy 4 komórek NK-92 w 100 mikrolitrach pożywki na studzienkę płytki zawierającej grzyba do kohodowli. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla przez co najmniej 6 godzin.

Po odwirowaniu płytki o sile 300 G przez pięć minut, zebrać 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki, nie dotykając dna. Na koniec przenieś supernatanty do probówek reakcyjnych w celu przeprowadzenia testu ELISA. Komórki Af-CAR-NK-92 wykazywały znacznie wyższe wydzielanie interferonu gamma w porównaniu z pozorowanymi komórkami NK-92 podczas kohodowli z rurkami rozrodczymi Aspergillus.