Name: Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj inżynierię komórek CAR-NK ukierunkowanych na Aspergillus fumigatus przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny. Ta metoda umożliwia skalowalną terapię przeciwgrzybiczą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie i wsparcie dla projektu zostały zapewnione przez Wilhelm Sander Stiftung, projekt 2020.017.1 dla M.H. i J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Centrum Badań Współpracujących/Transregio 124 Grzyby chorobotwórcze i ich ludzki gospodarz: Sieci interakcji-FungiNet; projekt A8 do M.H. i H.E.).

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty muszą być przeprowadzane w sterylnych warunkach. W tym protokole pokazujemy dwa warunki: (I) symulowaną transfekcję bez DNA, które posłuży jako kontrola, oraz (II) transfekcję CAR przy użyciu wcześniej opisanej klasy Af-CAR<sup="xref">6. Plazmid Af-CAR zawiera sekwencję skróconego receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFRt) za CAR, która zostanie wykorzystana jako marker transfekcji (rysunek uzupełniający S1). Dla każdego warunku wymagane są 4 × 106 komórek NK-92.
1. Hodowla komórek NK-92
<ol>
	<li>Na jeden lub dwa dni przed transfekcją należy przygotować świeżą pożywkę do hodowli komórkowych o następującym składzie: 75% (v/v) pożywka alfa-MEM (z nukleozydami) + 12,5% (v/v) inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) + 12,5% (v/v) inaktywowana termicznie surowica konia + 2 mM L-glutamina.</li>
	<li>Ponownie zawieś co najmniej 107 komórek NK-92 o gęstości komórek 5 × 105 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać IL-2 do zawiesiny komórek w stężeniu 150 UI/ml.</li>
	<li>Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: IL-2 może być stosowana w końcowym stężeniu 5 ng/ml.</li>
</ol>
2. Transfekcja niewirusowa
<ol>
	<li>Sprawdź jakość komórek pod mikroskopem. Zawieszenie skupisk komórkowych i wyraźne tło wskazują na zdrową hodowlę komórkową.</li>
	<li>Na 6-dołkowej płytce dodaj 2 ml pożywki do hodowli komórkowych na dołek dla każdego stanu. Umieścić płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Antybiotyki mogą zmniejszać żywotność komórek po transfekcji. Pożywkę należy przechowywać w stanie wolnym od antybiotyków.</li>
	<li>Policz komórki i sprawdź ich żywotność za pomocą (np. barwienia błękitem trypanowym).</li>
	<li>Przenieś 8 × 106 komórek NK-92 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy ciśnieniu 200 × g przez 5 minut z przyspieszeniem i opóźnieniem 3. Użyj tego programu do wszystkich następujących etapów wirowania.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotuj dwie probówki reakcyjne o pojemności 1,5 ml. Odpipetować DNA dla Af-CAR (8 μg plazmidu-DNA i 4 μg SB100X Mini Circle, Tabela 1) do jednej z probówek. Utrzymuj drugi wolny od DNA, aby był próbną kontrolą.</li>
	<li>Gdy wirówka jest gotowa, delikatnie wyrzucić supernatant i napełnić probówkę zawierającą komórki do 15 ml wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Wirówka (krok 2.4).</li>
	<li>Podczas wirowania należy przygotować jedną probówkę systemu transfekcji dla każdego stanu, dodając 3 ml buforu elektrolitycznego do każdej probówki. Umieść pierwszą probówkę w stacji pipetowej.</li>
	<li>Gdy wirówka jest gotowa, delikatnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu do resuspensji (100 μl/4 × 106 komórek). 
	UWAGA: Należy unikać pozostawiania komórek w buforze do rezawieszania na dłużej niż 15-30 minut, ponieważ obniża to żywotność komórek i skuteczność transfekcji.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch probówek reakcyjnych. Delikatnie wymieszaj. 
	UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ powodują one iskrzenie, które prowadzi do śmierci komórek.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę DNA-komórka z pierwszej probówki reakcyjnej za pomocą pipety systemu transfekcji i włożyć pipetę pionowo do probówki umieszczonej w stacji pipetowej. 
	UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest prawidłowo dopasowana.</li>
	<li>Ustaw pierwszy impuls na 1 650 V i czas impulsu na 20 ms i naciśnij Start.</li>
	<li>Po zakończeniu ustaw drugi impuls na 500 V i czas impulsu na 100 ms. Naciśnij przycisk Start.</li>
	<li>Po zakończeniu powoli wyjąć pipetę ze stacji pipetowania i natychmiast przenieść komórki do jednego dołka przygotowanej płytki hodowlanej zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek (patrz krok 2.2). Delikatnie przesuń płytkę po okręgu, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone.</li>
	<li>W przypadku próbki próbnej należy pobrać 100 μl zawiesiny komórek z probówki reakcyjnej bez DNA (patrz krok 2.9) i powtórzyć tę samą procedurę od kroku 2.11 do kroku 2.14, używając nowej probówki i nowej końcówki pipety.</li>
	<li>Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji dodać IL-2 w końcowym stężeniu 150 UI/ml.</li>
</ol>
3. Sprawdzanie skuteczności transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po 1 tygodniu hodowli i dzielenia komórek co drugi dzień, weź 1-5 × 105 komórek każdego stanu do polistyrenowej probówki z okrągłym dnem.</li>
	<li>Przepłukać komórki, dodając 1 ml buforu (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); odwirować i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu. Dodaj 1 μl 7-AAD, aby wykryć martwe komórki.</li>
	<li>Dodać 5 μl przeciwciała anty-tEGFR-Alexa fluor 647, aby wybarwić transfekowane komórki.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj komórki (patrz krok 3.2).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu.</li>
	<li>Zmierzyć próbki za pomocą cytometru przepływowego. 
	UWAGA: Jeśli wydajność transfekcji nie jest zadowalająca, przystąp do wzbogacania komórek wykazujących ekspresję transgenu.</li>
</ol>
4. Wzbogacanie komórek wykazujących ekspresję transgenu przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS)
UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, rozpocznij protokół od 8-10 × 106 komórek. Wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.2. Rozcieńczyć komórki w stężeniu 1-2 × 106/100 μl z buforem w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj 1 μl anty-EGFRt-biotyny na 1-2 × 106 komórek i delikatnie zakręć probówką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu.</li>
	<li>Inkubować przez 25 minut w temperaturze 4 °C, a następnie napełnić probówkę do 10 ml buforu.</li>
	<li>wirówka. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 8 μl/1 × 106 komórek zimnego buforu.</li>
	<li>Dodaj 2 μl kulek magnetycznych antybiotyny na 1 × 106 komórek.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć, napełniając do 10 ml buforem.</li>
	<li>wirówka. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu.</li>
	<li>Umieść kolumnę LS w magnesie MACS i przemyj 3 ml buforu.</li>
	<li>Gdy tylko bufor całkowicie przeprowadzi się przez kolumnę, dodaj zawiesinę komórki.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 3 razy, każdy z 3 ml buforu.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu do kolumny. Za pomocą tłoka wypłukać ogniwa EGFR-dodatnie tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Hoduj komórki przez kilka dni, a następnie sprawdź wydajność za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Testy funkcjonalne
UWAGA: Na nadchodzący eksperyment przygotuj i użyj następującego medium: RPMI + 20% FBS.
<ol>
	<li>Dzień 1 - Wysiew konidiów Aspergillus fumigatus
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę konidiów A. fumigatus o stężeniu 2,5 × 105 konidiów/ml w pożywce.</li>
		<li>Na 96-dołkowej płytce hodowlanej odpipetować 100 μl zawiesiny konidiów na basenik i inkubować w temperaturze 25 °C przez 16 h. 
		UWAGA: Po okresie inkubacji konidia wykiełkują (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2 - Współhodowla z komórkami CAR NK-92
	<ol>
		<li>Umyj ogniwa Mock i Af-CAR NK-92 2x za pomocą pożywki.</li>
		<li>Współhodowla z grzybem w stosunku efektora do celu 2:1 poprzez dodanie 5 × 104 komórek w 100 μl pożywki na studzienkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>W celu kontroli pozytywnej dodać 1 ng PMA i 100 ng jonomycyny na studzienkę w 100 μl pożywki. Używaj komórek w pożywce tylko jako kontroli negatywnej.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze CO2 przez co najmniej 6 godzin.</li>
		<li>Odwirować płytkę o masie 300 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Zbierz 100 μl z każdej studzienki, unikając dotykania dna. Przenieść supernatanty do probówek reakcyjnych. 
		UWAGA: Upewnij się, że pipetowany jest tylko supernatant, a nie wyrośnięty grzyb. W razie wątpliwości dodaj kolejny etap wirowania.</li>
		<li>Wykonaj test IFN-ɣ ELISA zgodnie z instrukcjami producenta lub przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Sleeping Beauty Approach to Obtain CAR-NK Cells for Targeting Fungal Pathogens

<ol><li>Fang, W., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+profile%3A+Aspergillus+fumigatus%3A+A+saprotrophic+and+opportunistic+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen.</a> Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).</li>
<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+Human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: Human fungal infections.</a> Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).</li>
<li>Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcome+and+prognostic+factors+associated+with+invasive+pulmonary+aspergillosis%3A+An+11-year+follow-up+report+from+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan.</a> PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).</li>
<li>Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+globally+emerging+azole+resistance+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).</li>
<li>Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+beyond+cancer%3A+Hope+for+immunomodulatory+therapy+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases.</a> Front Immunol. 10, 2711(2019).</li>
<li>Seif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+targeting+Aspergillus+fumigatus+are+effective+at+treating+invasive+pulmonary+aspergillosis+in+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models.</a> Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lentiviral+vector-based+approach+to+generate+chimeric+antigen+receptor+T+cells+targeting+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 15 (4), e0341323(2024).</li>
<li>Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CAR-T+cells+to+CAR-NK+cells%3A+A+developing+immunotherapy+method+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies.</a> Front Oncol. 11, 720501(2021).</li>
<li>Robertson, M. J., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of human natural killer cells.</a> Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).</li>
<li>Ziegler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD56+is+a+pathogen+recognition+receptor+on+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).</li>
<li>Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+of+chimeric+antigen+receptor+%28car%29+t+versus+car+nk+cell+for+immunotherapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors.</a> Life Sci. 337, 122381(2024).</li>
<li>Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+current+applications+of+chimeric+antigen+receptor-modified+NK-92+cells+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy.</a> Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).</li>
<li>Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-transduced+natural+killer+cells+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy.</a> Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+The+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Amberger, M., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+advances+for+the+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+23+years+of+insomnia+but+prettier+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever.</a> BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).</li>
<li>Ingegnere, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+car+nk+cells%3A+A+new+non-viral+method+allowing+high+efficient+transfection+and+strong+tumor+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing.</a> Front Immunol. 10, 957(2019).</li>
<li>Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+DNA-dependent+cell+death+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages.</a> Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).</li>
<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
<li>Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+cellular+immunotherapy%3A+Chimeric+antigen+receptor-natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells.</a> Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).</li>
</ol>

M.H.: Wynalazca w zgłoszeniach patentowych i udzielonych patentach związanych z technologią CAR, częściowo licencjonowanych dla przemysłu. Współzałożyciel i właściciel udziałów T-CURX GmbH, Würzburg. Honorowi mówcy: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Wsparcie badawcze: BMS. M. B. donosi o wsparciu dla podróży ze strony firmy farmaceutycznej "Eli Lilly and company", która nie jest związana z tym badaniem. Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Dostarczony protokół oferuje prostą i niezawodną metodę tworzenia komórek CAR-NK, które celują w patogeny grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Sleeping Beauty. Metoda ta pozwala na stabilną i trwałą insercję dużych transgenów, co umożliwia ekspansję komórek w celu uzyskania niezbędnych ilości do dalszej analizy14,16.
Na powodzenie transfekcji może mieć wpływ kilka kluczowych czynników, w tym liczba i żywotność komórek, siła i czas trwania impulsu, a także jakość i ilość DNA17. Bardzo ważne jest, aby ocenić stan komórek przed rozpoczęciem, zapewniając ich żywotność na poziomie co najmniej 90%. Wykazano, że zwiększona siła impulsu może zwiększyć wydajność transfekcji populacji komórek. Jednak takie podejście może również skutkować znacznym zmniejszeniem żywotności komórek. W przypadku nadmiaru komórek i ograniczonej ilości lub jakości DNA, liczba komórek, które z powodzeniem pobierają plazmid, może być niewystarczająca17. Niemniej jednak wykazano, że wysokie stężenia DNA są toksyczne i zmniejszają żywotność komórek18.
Wcześniejsze badania osiągnęły wyższą skuteczność transfekcji, ale koncentrowały się wyłącznie na przejściowej ekspresji białka17. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół zapewnia stabilną insercję transgenu. Aby rozwiązać problem niskiej wydajności transfekcji, wdrożyliśmy wzbogacanie komórek dodatnio transfekowanych i uzyskaliśmy około 95% komórek wykazujących ekspresję CAR. Wydłużyło to jednak czas produkcji do ~1 tygodnia. Jeśli pożądane są krótsze czasy produkcji, transpozon DNA może być dostarczony jako miniokrąg, co może zwiększyć wydajność transfekcji i może wyeliminować potrzebę etapu wzbogacania19. Niemniej jednak czas produkcji nie może zostać skrócony do <1 tygodnia, aby umożliwić regenerację i proliferację komórek.
Biorąc pod uwagę ostry charakter inwazyjnej aspergilozy, korzystne byłyby "gotowe" terapie komórkowe. Wyzwania i koszty związane z izolacją komórek od pacjentów i ekspansją komórek pierwotnych zwiększyły popularność NK-92 jako wygodnej linii komórkowej do produkcji komórek CAR-NK20. Komórki NK-92 są na ogół wytrzymałe i szybko się namnażają w obecności IL-2, co ułatwia osiągnięcie dużej ilości komórek w stosunkowo krótkim czasie. W świetle tych zalet opracowaliśmy protokół inżynierii genetycznej komórek NK-92, wykazując, że możliwa jest bezpieczna transfekcja i przygotowanie produktów komórkowych CAR-NK o wysokiej czystości. Chociaż protokół ten można dostosować do przygotowania pierwotnych komórek CAR-NK, należy rozważyć kilka modyfikacji. Obejmują one optymalizację liczby i intensywności impulsów, ilości użytego DNA oraz ustalenie odpowiedniego protokołu ekspansji. Wszelkie modyfikacje protokołu wymagałyby dokładnego zbadania w celu zapewnienia skuteczności. Niemniej jednak nasz protokół zapewnia podstawowy szablon, który może zostać zaadaptowany do pierwotnych komórek NK w przyszłych eksperymentach.
Podsumowując, ten innowacyjny protokół transfekcji do produkcji stabilnych komórek Af-CAR-NK jest wydajną i powtarzalną metodą, która może być stosowana do zwalczania innych chorób. Ponadto może być stosowany jako opłacalna metoda badań przesiewowych w kierunku nowych CAR ukierunkowanych na różne antygeny.

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) jest wszechobecnym grzybem, a przeciętny człowiek wdycha od 100 do 1000 konidiów dziennie1. U pacjentów z nabytymi lub wrodzonymi niedoborami odporności, takich jak osoby poddawane chemioterapii lub cierpiących na białaczkę, A. fumigatus może prowadzić do ciężkiej inwazyjnej apsergilozy. Każdego roku ponad 200 000 osób na całym świecie zapada na aspergilozę. Pomimo stosowania leków przeciwgrzybiczych w profilaktyce i terapii pochodnymi azolu, śmiertelność utrzymuje się między 30% a 95%2,3. Dodatkowo leczenie ma znaczące skutki uboczne, a 7% kultur A. fumigatus jest już odpornych na azole4.
Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) wykazała kliniczny sukces w leczeniu chorób nowotworowych i osiągnęła obiecujące wyniki przedkliniczne w zwalczaniu chorób zakaźnych, takich jak inwazyjna aspergiloza5,6,7,8. Nasze wcześniej opisane komórki Af-CAR-T celujące w białko w ścianie komórkowej strzępek A. fumigatus wykazały obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych6.
Zmniejszone ryzyko choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, zespołu uwalniania cytokin i neurotoksyczności sprawia, że komórki CAR-NK są cenną alternatywą dla komórek CAR-T jako "gotowe" leczenie ostrych infekcji9. Ponadto wykazano, że komórki NK odgrywają kluczową rolę w przeciwgrzybiczej odpowiedzi immunologicznej. Po stymulacji A. fumigatus, komórki NK wydzielają cytokiny, takie jak IFN-ɣ i chemokiny, takie jak CCL-3 i CCL-4, i uwalniają cytotoksyczne granulki10,11.
Linia komórkowa NK-92 jest popularnym źródłem komórek NK do inżynierii genetycznej, oferując przewagę szybkiej proliferacji i ekspansji w stosunkowo prostych warunkach hodowli12. Kilka badań przedklinicznych wykazało potencjał terapeutyczny komórek NK-92 transdukowanych przez CAR w leczeniu zarówno guzów hematologicznych, jak i litych. Trwają liczne badania kliniczne mające na celu zbadanie ich bezpieczeństwa, skuteczności i potencjalnego zastosowania jako "gotowej" terapii komórkowej13.
Osiągnięcie wysokiej wydajności transfekcji i stabilnej ekspresji transgenu w komórkach NK jest wyzwaniem. Podczas gdy metody wirusowe obiecują wysoką skuteczność, niosą ze sobą ryzyko mutacji insercyjnych z późniejszą onkogenezą9,14. Najnowsza generacja wektorów transpozonów Śpiącej Królewny (SB) oferuje bezpieczny, silny i ekonomicznie opłacalny system stabilnego transferu genów, pokonując ograniczenia wirusowych i przejściowych metod dostarczania genów niewirusowych15.
Dlatego ten protokół przedstawia nowatorską metodologię generowania komórek Af-CAR-NK-92, które potencjalnie mogą służyć jako "gotowa" opcja terapeutyczna dla pacjentów z zagrażającą życiu inwazyjną aspergilozą. O skuteczności tego podejścia świadczy zwiększona produkcja IFN-ɣ po stymulacji strzępkami A. fumigatus.

<table><tbody><tr><td>Probówki stożkowe 15 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERYLNE</td></tr><tr><td>50 ML probówki stożkowe</td> denne <td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERYLNA</td></tr><tr><td>6- i 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Corning Inc. LifeSciences</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>Płytki wielodołkowe poddane TC, płaskie dna, Poddane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek, Sterylizowane promieniowaniem gamma, Niepirogenny</td></tr><tr><td>7-AAD (7-aminoaktynomycyna D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td>łatwy w użyciu barwnik kwasu nukleinowego do wykluczania komórek niezdolnych do życia w testach cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anty-ludzkie przeciwciało EGFR</td><td>Biolegend</td><td>352918</td><td>Clone AY13</td></tr><tr><td>Mikrokulki antybiotyny UltraPure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-637</td><td>UltraPure MicroBeads sprzężone z monoklonalną mysią antybiotyną przeciwciała</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrów biosfery (20 i 100 &mu; L)&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>&nbsp; Modyfikowany, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych, endotoksyna, testowany</td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-&gamma;</td><td>Biolegend</td><td>430104</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>do biologii molekularnej, 0,5&nbsp; M w H2O, DNaza, RNaza, NICKaza i proteaza, brak wykrywania, 0,2 i mu; m filtrowany.</td></tr><tr><td>FACS clean</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACS Flow Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS Roztwór do płukania</td><td>BD Bioscience</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych, inaktywowana termicznie przed użyciem</td></tr><tr><td>Gibco, MEM &alpha;, nukleozydy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>22571020 Czerwień fenolowa, rybonukleozydy, dezoksyrybonukleozydy, wodorowęglan sodu</td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>Sterylnie filtrowane, inaktywowane termicznie przed użyciem</td></tr><tr><td>Ludzka IL-2 IS, klasa badawcza</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>Klasa badawcza. ED50 jest &le; 0,3 ng/ml, co odpowiada aktywności &ge; 3 i razy; 106 j.m./mg.</td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>z Streptomyces conglobatus, stosowana jako kontrola pozytywna wydzielania cytokin&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W368401</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>MACS LS Kolumna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp; Kolumny i tłoki, sterylnie pakowane</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektionssystem 100&nbsp; &mu; L-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Bufor do zaparowania R, Bufor elektrolityczny E2, 100 &mu; L Neon Tips, Neonowe rurki do elektroporacji</td></tr><tr><td>Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>stosowany jako kontrola pozytywna wydzielania cytokin&nbsp;</td></tr><tr><td>Polistyrenowa probówka okrągłodenna, 5 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>S-452400</td><td>używana do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Probówka reakcyjna, 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>PP, przezroczysta, z dołączoną nakrętką, z wtryskiwaną podziałką. Sterylizowane przed użyciem.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>72400021</td><td>GlutaMax I,&nbsp; Czerwień fenolowa, HEPES, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; L XL Końcówka filtra stopniowego</td><td>StarLab</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator C60&nbsp;</td>Myjka do mikropłytek <td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HydroFLEX&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td></td> System transfekcji Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td>Neon</td><td>Pipety Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Separator Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria chimerycznych komórek nk z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej królewny

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

Terapie komórkowe oparte na chimerycznym receptorze antygenowym (CAR) wykazały imponującą skuteczność w leczeniu nowotworów hematologicznych. Ostatnio terapie te są opracowywane dla chorób zakaźnych, jednak badania ukierunkowane na infekcje grzybicze pozostają nieliczne. Aby zidentyfikować optymalne cele i zoptymalizować produkty komórkowe, opracowaliśmy metodę inżynierii komórek CAR-NK (chimeryczny receptor antygenowy-naturalny zabójca) i oceniliśmy ich reakcję na stymulację przez grzyby. W artykule opisano prostą i solidną metodę generowania komórek CAR-NK dostosowanych do celów grzybów przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Sleeping Beauty. Komórki NK-92 są transfekowane hiperaktywną transpozazą SB100X wektoryzowaną jako minicircle DNA (MC) wraz z transpozonem CAR kodowanym plazmidem. Skuteczność transfekcji ocenia się 1 tydzień później za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Przed testami funkcjonalnymi komórki wykazujące ekspresję transgenu są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie i hodowane przez 1 kolejny tydzień. Aby ocenić aktywację specyficzną dla antygenu, zmodyfikowane komórki są hodowane wspólnie z probówkami rozrodczymi Aspergillus fumigatus przez co najmniej 6 godzin. Następnie mierzy się stężenie wydzielanego interferonu gamma (IFN-γ) za pomocą testu immunoenzymatycznego.

Cały proces generowania komórek Af-CAR NK-92, obejmujący transfekcję, rekonwalescencję, wzbogacanie oraz ekspansję, trwa około 14 dni. Po transfekcji komórki są hodowane i pasażowane co drugi dzień. Żywotność komórek może spaść podczas pierwszego pasażowania w drugim dniu po transfekcji. Zazwyczaj komórki regenerują się 4 dni po transfekcji i zaczynają proliferować, przy czasie podwojenia wynoszącym 48 h.
Po regeneracji mierzy się wydajność transfekcji, która powinna osiągnąć poziom 10-20% (reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3). Wzbogacenie populacji komórek EGFR-dodatnich za pomocą MACS zwiększa odsetek komórek Af-CAR NK-92 do ponad 95% (reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 4).
Do analiz funkcjonalnych wykorzystano hodowle zawierające ponad 95% komórek Af-CAR. Przeprowadzono kokulturę komórek z rurkami kiełkowymi A. fumigatus przez 6 h i zmierzono wydzielanie IFN-ɣ jako marker aktywacji. Jak pokazano na Rysunku 5, komórki Af-CAR wykazały znaczną sekrecję cytokin (średnia = 340,6 ± 86,5 pg/mL) w porównaniu do komórek Mock NK-92 (średnia = 75,6 ± 19,5 pg/mL), co wskazuje na istotnie wyższą aktywację komórek Af-CAR (wartość p = 0,03).
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórek bakteryjnych, analiza statycznej równowagi, eksperymentalne badanie mikrobiologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kiełki rurkowe Aspergillus fumigatus. Obraz mikroskopowy A. fumigatus po 16 h inkubacji. Zaobserwowano kiełki rurkowe/małe strzępki, rozmieszczone homogenicznie wokół dołka. Pasek skali = 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu hodowli komórkowych; obserwacja gęstości komórek, skupisk i wzorców wzrostu do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ko-kultura rurek kiełkowych Aspergillus fumigatus z komórkami NK-92. Obraz mikroskopowy ko-kultury. Komórki NK-92 tworzą skupiska i pozostają w kontakcie z rurkami kiełkowymi A. fumigatus. Pasek skali = 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna; schematy przedstawiają wyniki dla populacji komórek, żywotności i ekspresji EGFR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Efektywność transfekcji oceniana poprzez barwienie markera transfekcyjnego EGFR. W 5. dniu po elektroporacji komórki NK-92 barwiono 7-AAD oraz przeciwciałem anty-EGFR. Wyniki przedstawiono dla jednego reprezentatywnego eksperymentu dla (A) komórek Mock oraz (B) komórek Af-CAR NK-92. Lewa kolumna przedstawia wykresy kropkowe wielkości komórek względem ziarnistości komórek; bramka została ustawiona na komórki NK-92. Martwe komórki wykluczono za pomocą znakowania 7-AAD (druga kolumna). Procent żyjących komórek EGFR+ pokazano w trzeciej kolumnie. Skróty: EGFR = receptor naskórkowego czynnika wzrostu; 7-AAD = 7-aminoaktynomycyna D; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Histogramy cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję EGFR w komórkach Mock-NK-92 w porównaniu do komórek Af-CAR-NK-92." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki barwienia powierzchni komórek po wzbogaceniu populacji komórek NK-92 wykazujących ekspresję transgenu. Po lewej stronie przedstawiono komórki Mock. Po prawej stronie przedstawiono komórki Af-CAR-NK. Czerwone histogramy reprezentują komórki niebarwione. Niebieskie histogramy reprezentują odpowiadające im komórki barwione. Bramka została ustawiona na komórki EGFR+; liczby wskazują procent komórek pozytywnych. Skróty: EGFR = receptor epidermalnego czynnika wzrostu; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy wydzielania IFNγ; Mock vs Af-CAR; wyniki badań immunologicznych, porównanie pg/ml." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wydzielanie cytokin przez komórki NK aktywowane przez rurki kiełkowe Aspergillus fumigatus. Diagramy przedstawiają wyniki wydzielania IFN-ɣ przez komórki Af-CAR i Mock w koanalizie z grzybem, zmierzone za pomocą testu ELISA po 6 h koanalizy. Przedstawione dane to średnia ± SD z trzech niezależnie przeprowadzonych eksperymentów (n = 3). Wartość P obliczona testem t Welcha przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 10, * p &lt; 0,05. Skróty: NK = natural killer (komórki NK); IFN-ɣ = interferon gamma; CAR = chimeric antigen receptor (chimeryczny receptor antygenowy); ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay (test immunosorpcyjny z enzymem). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpozaza</td>
			<td>SB100X Mini Circle</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>1 µg/µL</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpozon</td>
			<td>plazmid Af-CAR</td>
			<td>Wytworzone wewnątrz jednostki</td>
			<td>1 µg/µL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: DNA wykorzystane w tym protokole.
Rycina dodatkowa S1: Mapa plazmidu transpozonu Af-CAR: Schemat wektora plazmidowego i konstrukcji transpozonu CAR. Skróty: EF1 = promotor czynnika elongacyjnego-1 alfa; ORI = bakteryjna sekwencja początku replikacji; LIR = lewa powtórka odwrócona; RIR: prawa powtórka odwrócona; Cyto = cytoplazmatyczny; Tm = transbłonowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy protokół transfekcji do produkcji komórek CAR-NK (chimeryczny receptor antygenu i naturalnego zabójcy) ukierunkowanych na patogeny grzybowe za pomocą niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny. Aby ocenić aktywację specyficzną dla antygenu, przeprowadziliśmy wspólną hodowlę zmodyfikowanych komórek z probówkami rozrodczymi Aspergillus fumigatus i zmierzyliśmy wydzielanie IFN-γ.

Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny

Chimeric antigen receptor (CAR)-based cell therapies have shown impressive efficacy in the treatment of hematological malignancies. Recently, these ...

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu gotowej terapii komórkowej CAR dla inwazyjnych infekcji grzybiczych. Naszym celem jest zidentyfikowanie najlepszych celów, projektów CAR i kombinacji komórek odpornościowych, aby osiągnąć optymalne wyniki terapeutyczne. Ostatnie osiągnięcia, w tym nasze własne prace, koncentrują się na opracowaniu terapii limfocytami T CAR ukierunkowanych na Aspergillus fumigatus.Te zmodyfikowane komórki wykazały obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych, znacznie zmniejszając obciążenie grzybami, kontrolując odporność przeciwgrzybiczą i poprawiając całkowite przeżycie. Obecnie większość badań w tej dziedzinie koncentruje się na wytwarzaniu limfocytów T CAR specyficznych dla bardzo ograniczonego zestawu celów przy użyciu wektorów wirusowych lub systemu transpozonów śpiącej królewny. Główne wyzwania polegają na zidentyfikowaniu optymalnych celów grzybów i wytworzeniu gotowego do użycia produktu komórkowego, który jest zarówno skuteczny, jak i skalowalny do zastosowań klinicznych.Dzięki temu protokołowi odpowiadamy na zapotrzebowanie na opłacalne i skalowalne metody generowania niewirusowych komórek CAR-NK. Stanowi ona przystępne podejście do badań przesiewowych nowych celów przeciwgrzybiczych, stanowiąc fundamentalny krok w kierunku gotowej terapii komórkowej CAR-NK w przypadku infekcji grzybiczych. Na początek sprawdź komórki NK-92 pod mikroskopem pod kątem klastrów na przezroczystym tle, dodaj 2 mililitry pożywki do hodowli komórkowej na dołek dla każdego stanu na sześciodołkową płytkę i umieść płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Przenieś 8 razy 10 do mocy 6 komórek NK-92 do 15-mililitrowej stożkowej probówki dolnej i odwiruj probówkę przy 200 G przez pięć minut z przyspieszeniem i opóźnieniem 3. Po odrzuceniu supernatantu napełnić probówkę zawierającą osad komórkowy do 15 mililitrami wstępnie podgrzanego PBS i ponownie odwirować. Podczas wirowania należy odpipetować 8 mikrogramów plazmidowego DNA Af-CAR i 4 mikrogramy minikoła SB100X do jednej probówki reakcyjnej i pozostawić DNA drugiej probówki wolne, aby służyło jako pozorowana kontrola.W przypadku systemu transfekcji dodaj 3 mililitry buforu elektrolitycznego do pierwszej probówki i umieść ją w stacji pipetowej. Po odwirowaniu delikatnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu do rezaspensji. Następnie dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z dwóch probówek reakcyjnych i delikatnie wymieszać.Odpipetować mieszaninę komórek DNA z pierwszej probówki reakcyjnej za pomocą pipety systemu transfekcji, a następnie włożyć pipetę do transfekcji pionowo do probówki w stacji pipetowej. Ustaw pierwszy impuls na 1 650 woltów i czas impulsu na 20 milisekund przed naciśnięciem startu, aby zainicjować impuls. Po pierwszym impulsie ustaw drugi impuls na 500 woltów, a czas impulsu na 100 milisekund i zainicjuj drugi impuls.Po zakończeniu drugiego impulsu powoli wyjmij pipetę ze stacji pipetowej. Natychmiast przenieś komórki do jednego dołka przygotowanej płytki hodowlanej zawierającej 2 mililitry wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i delikatnie przesuwaj płytkę ruchami okrężnymi, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po 30 minutach inkubacji dodać interleukinę-2 do studzienek w końcowym stężeniu 150 jednostek międzynarodowych na mililitr. Aby rozpocząć, przetransfekuj komórki NK-92 żądanym plazmidem. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Następnie odwirować komórki i rozcieńczyć je do stężenia 1 do 2 razy 10 do mocy 6 komórek na 100 mikrolitrów za pomocą buforu. Dodaj jeden mikrolitr biotyny anty EGFR-T na 1 razy 10 do mocy 6 komórek i delikatnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu. Inkubować probówkę przez 25 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Po inkubacji napełnij probówkę do 10 mililitrami buforu. Następnie odwirować probówkę o sile 200 G przez pięć minut z przyspieszeniem i opóźnieniem 3, a po odwirowaniu odrzucić supernatant. Następnie dodaj 8 mikrolitrów zimnego buforu, a następnie dwa mikrolitry kulek magnetycznych antybiotyny na 1 razy 10 do mocy 6 komórek.Inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby umyć komórki, napełnij probówkę do 10 mililitrami buforu i odwirówki. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu.Umieść kolumnę LS w maksymalnym magnesie i umyj ją 3 mililitrami buforu. Dodaj zawiesinę komórki, gdy bufor całkowicie przeprowadzi się przez kolumnę. Po umyciu kolumny wyjmij ją z magnesu i umieść w czystej stożkowej rurze dolnej o pojemności 15 mililitrów.Dodaj 5 mililitrów buforu do kolumny i użyj tłoka, aby jak najszybciej wypłukać dodatnie komórki EGF-R. Wydajność transfekcji po wyzdrowieniu osiągnęła od 10 do 20%, a maksymalne wzbogacenie zwiększyło czystość komórek Af-CAR-NK-92 do ponad 95%Na początek uzyskaj wzbogacone komórki NK-92 z ekspresją transgenu za pomocą techniki sortowania komórek aktywowanych magnetycznie. Następnie przygotować zawiesinę konidiów Aspergillus fumigatus o stężeniu 2,5 razy 10 do mocy 5 konidiów na mililitr w pożywce.Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny konidiów do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Drugiego dnia przemyć makietę i transfekowane plazmidem komórki NK-92 dwukrotnie pożywką i dodać 5 razy 10 do mocy 4 komórek NK-92 w 100 mikrolitrach pożywki na studzienkę płytki zawierającej grzyba do kohodowli. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla przez co najmniej 6 godzin.Po odwirowaniu płytki o sile 300 G przez pięć minut, zebrać 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki, nie dotykając dna. Na koniec przenieś supernatanty do probówek reakcyjnych w celu przeprowadzenia testu ELISA. Komórki Af-CAR-NK-92 wykazywały znacznie wyższe wydzielanie interferonu gamma w porównaniu z pozorowanymi komórkami NK-92 podczas kohodowli z rurkami rozrodczymi Aspergillus.

engineering-chimeric-antigen-receptor-natural-killer-cells-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę genetycznej modyfikacji komórek NK za pośrednictwem rybonukleoproteiny Cas9. Rybonukleoproteina Cas9, składająca się z endonukleazy Cas9 związanej z przewodnikiem RNA (gRNA) utworzonego przez parowanie zasad CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego crRNA (tracrRNA), jest wprowadzana do pierwotnych komórek NK za pomocą elektroporacji. Rybonukleoproteina atakuje i rozszczepia DNA gospodarza w miejscu docelowym, prowadząc do nokautu genu poprzez modyfikację genu...

Technika edycji genów w komórkach NK przy użyciu CRISPR Cas9

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Celem tego badania było sformułowanie technologii, które pozwalają na skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach NK (natural killer). Transdukcja lentiwirusowa ludzkich lub mysich pierwotnych komórek NK za pośrednictwem dekstranu skutkuje wyższą wydajnością ekspresji genów. Ta metoda transdukcji genów znacznie poprawi manipulację genetyczną komórkami NK.

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj inżynierię komórek CAR-NK ukierunkowanych na Aspergillus fumigatus przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny. Ta metoda umożliwia skalowalną terapię przeciwgrzybiczą.

Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny

Przeglądaj więcej filmów