Name: Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikropęcherzyków lipidowych i ich znakowania radioizotopowego z wydajnością powyżej 95% bez konieczności oczyszczania. Ta technika zachowuje właściwości fizykochemiczne cząstek i umożliwia tworzenie mikropęcherzyków multimodalnych do zastosowań w obrazowaniu i terapii nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Deborah Scollard i Teesha Komal (program University Health Network Spatio-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response (STTARR), Toronto, Ontario) za ich usługi techniczne i wskazówki. Dziękujemy również Markowi Zhengowi i dr Alexowi Dhaliwalowi za ich pomoc techniczną podczas mikroskopii konfokalnej oraz Zakładowi Zaawansowanej Mikroskopii Optycznej (Toronto, Ontario) za dostarczenie odpowiedniego sprzętu. Wymieniamy nasze źródła finansowania: Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Instytut Badawczy Terry'ego Foxa, Kanadyjska Rada ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych, Kanadyjska Fundacja na rzecz Innowacji, Fundacja Księżniczki Małgorzaty na rzecz Raka, Kanadyjski Program Katedr Badawczych, Centrum McLaughlin, Program Stypendialny Vanier, Program Stypendialny dla Absolwentów Ontario, Kanadyjski Rak Prostaty oraz Fundacja Charytatywna Peterborough K. M. Hunter.

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Obecny protokół znakowania radiochemicznego mikropęcherzyków lipidowych osiąga czystość radiochemiczną >95%, skuteczność chelatacji >95% i zachowanie właściwości fizykochemicznych mikropęcherzyków bez konieczności oczyszczania po znakowaniu. Osiągnięcia te reprezentują postępy, które wcześniej nie zostały osiągnięte dla istniejących protokołów etykietowania. Brak etapów oczyszczania pozwala na szybsze wykorzystanie izotopów promieniotwórczych (w tym przypadku miedzi-64), a co za tym idzie, zmniejszenie nieefektywnych str...

Mikropęcherzyki to supramolekularne środki teranostyczne o rozmiarach mikrometrycznych, posiadające rdzeń gazowy stabilizowany przez otoczkę białkową, polimerową lub, w większości przypadków, lipidową (Rycina 1A). Po wstrzyknięciu do krwiobiegu mikropęcherzyki utrzymują granice faz gaz-ciecz, które są wykrywalne za pomocą ultradźwięków przez kilka minut przed rozpuszczeniem ich rdzeni gazowych1,2. W konsekwencji pierwszym zastosowaniem klinicznym mikropęcherzyków było wykorzystanie ich jako środków kontrastowych w obrazowaniu ultradźwiękowym w czasie rzeczywistym3. Wynalezienie terapeutycznego ultradźwiękowego skupiania wiązki (FUS) rozszerzyło możliwości kliniczne mikropęcherzyków. Pod wpływem niskoczęstotliwościowego FUS mikropęcherzyki oscylują i generują ukierunkowane, regulowane siły mechaniczne, prowadzące od przejściowej permeabilizacji naczyń po ogniskową ablację tkanki4,5. W rezultacie w ciągu ostatnich 20 lat badano zastosowanie metody mikropęcherzyki-FUS w otwieraniu bariery krew-mózg (BBB), dostarczaniu leków i sond obrazujących do guzów (np. raka trzustki, mózgu i przerzutowego raka wątroby), terapii chorób neurodegeneracyjnych oraz ablacji nowotworów6,7,8,9,10,11.
Arsenał teranostyczny mikropęcherzyków wciąż rozwija się w nowych i ekscytujących kierunkach. Konwencjonalne zastosowania dostarczania substancji za pomocą mikropęcherzyków i ukierunkowanego ultradźwiękowego skupienia (FUS) opierają się na jednoczesnym podawaniu ładunku terapeutycznego lub obrazującego wraz z komercyjnymi mikropęcherzykami. Rośnie zainteresowanie zwiększaniem możliwości dostarczania za pomocą mikropęcherzyków-FUS poprzez zrozumienie oddziaływań między powłoką mikropęcherzyka a organizmem, badanie niestandardowych, niekomercyjnych formulacji mikropęcherzyków oraz tworzenie zintegrowanych mikropęcherzyków teranostycznych z ładunkiem osadzonym bezpośrednio na powłoce12,13,14. W rzeczywistości około 40% badań nad dostarczaniem leków za pomocą lipidowych mikropęcherzyków wykorzystuje takie mikropęcherzyki z ładunkiem w powłoce15. Poza obrazowaniem i dostarczaniem leków, metoda mikropęcherzyków-FUS wykazuje również potencjał w usprawnianiu radioterapii nowotworów16 oraz aktywowaniu przeciwnowotworowych efektów łagodnych zazwyczaj czynników osadzonych w powłoce poprzez terapię sonodynamiczną17,18.
Te konwencjonalne i rozszerzone kierunki zastosowań mikropęcherzyków w onkologii mogą zostać bardziej strategicznie rozwinięte poprzez znakowanie powłok mikropęcherzyków znacznikami radioaktywnymi. W obszarze wielofunkcyjnych mikropęcherzyków z ładunkiem, takie radioznakowanie 1) ułatwia złotym standardem prowadzoną ilościową ocenę biodystrybucji tych załadowanych powłok mikropęcherzyków w obszarach docelowych i poza nimi, 2) pozwala wyznaczyć farmakokinetyczne zależności struktura-aktywność, które pomagają w optymalnym doborze składu mikropęcherzyków w celu maksymalizacji dostarczania do celu oraz 3) kieruje strategicznym i odpowiednim planowaniem aplikacji oraz leczenia pod kontrolą obrazową (np. rodzaje tkanek docelowych, dozymetria, dobór leków w celu ograniczenia problemów z bezpieczeństwem poza obszarem docelowym, użyteczność w porównaniu z konwencjonalnymi paradygmatami współleczenia) wielofunkcyjnych systemów z ładunkiem15,19. Na etapie przedklinicznym takie zrozumienie losów powłoki mikropęcherzyka może również wyjaśnić szersze mechanizmy działania układu mikropęcherzyki-FUS. Na przykład wykazano, że transfer lipidów z powłok mikropęcherzyków do komórek docelowych wpływa na sonoporację indukowaną przez FUS12,20. Zrozumienie i optymalizacja takiego transferu może zatem wspomóc przedkliniczne i kliniczne terapie z wykorzystaniem mikropęcherzyków i FUS, w których zaangażowana jest sonoporacja (transfekcja in vitro, dostarczanie leków, ablacja guzów, radiodyfuzyjna sensytyzacja oraz terapia sonodynamiczna20,21,22,23,24,25). Możliwości podwójnego obrazowania ultradźwiękowego i radiologicznego umożliwiłyby również otwieranie naczyń za pomocą FUS i monitorowanie leczenia (np. kinetykę otwierania BBB) przy użyciu jednego środka, zamiast konwencjonalnych projektów opartych na dwóch różnych środkach26. W podobnym duchu, radioznakowanie lipidowych mikropęcherzyków mogłoby służyć jako wielofunkcyjna, jednoskładnikowa alternatywa mikropęcherzyki-FUS/radioterapia dla platform współdostarczania mikropęcherzyków-FUS i radiofarmaceutyków27.
Kruchość mikropęcherzyków stanowi istotne wyzwanie w procesie takiego znakowania. Wszystkie istniejące strategie znakowania radioaktywnego są ograniczone przez metodologie oczyszczania, o których wiadomo, że zaburzają stabilność i rozmiar mikropęcherzyków, podczas gdy niektóre z nich charakteryzują się również nieefektywnym i niestabilnym znakowaniem radioaktywnym28,29,30,31,32. Wymogi dotyczące oczyszczania prowadzą również do wydłużenia protokołów. W połączeniu z zastosowaniem krótkożyciowych izotopów promieniotwórczych (np. 18F t1/2 1,8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,32 68Ga t1/2 1 h31), powoduje to nieefektywność związaną z rozpadem izotopów i ogranicza ramy czasowe obrazowania radioizotopowego oraz planowania leczenia. Łącznie ograniczenia te stwarzają ryzyko pozyskania skróconych i niereprezentatywnych obrazów radioizotopowych, niedokładnych danych farmakokinetycznych oraz nieefektywnego dostarczania radioizotopów do guza.
W niniejszym raporcie ograniczenia te zostały przezwyciężone dzięki wykorzystaniu silnych i stabilnych właściwości chelatujących metale porfiryn. Porfiryny są organicznymi, heterocyklicznymi makrocząsteczkami o silnie sprzężonym pierścieniu płaskim i centralnym miejscu koordynacyjnym, które może pomieścić różne metale. Obejmuje to radioizotopy o dłuższym okresie półtrwania, takie jak miedź-64 (t1/2 12,7 h), radiofarmaceutyk umożliwiający obrazowanie w pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) oraz pomiary γ33. Po sprzężeniu z lipidowym szkieletem porfiryny mogą być łatwo włączone w struktury supramolekularne, a następnie szybko znakowane miedzią-64 z wysoką wydajnością chelatowania i stabilnością w surowicy, przy jednoczesnym zachowaniu właściwości wyjściowych nieznakowanych cząsteczek33,34. Ponadto porfiryny wykazują aktywność fluorescencyjną z modułowym samogaszeniem w nanocząsteczkach i mikrocząsteczkach, które zostaje przywrócone po rozpadzie cząsteczek; stanowi to komplementarną metodę odczytu względem PET i pomiarów γ, co ułatwia analizę losów otoczki zarówno w skali masowej, jak i mikroskopowej (Rysunek 1A)15.
Wykorzystując porfirynę lipidową jako chelatorem, właściwości te zostały użyte do opracowania nowej, jednopułkowej (one-pot) metody znakowania radiologicznego mikropęcherzyków, która nie wymaga oczyszczania (Rysunek 1B,C) i pozwala pokonać ograniczenia związane z istniejącymi metodami znakowania radiologicznego mikropęcherzyków. Protokół ten pozwala osiągnąć wydajność chelatacji miedzi-64 &gt;95%, nie wymaga oczyszczania po znakowaniu i zachowuje fizykochemiczne właściwości mikropęcherzyków. Może on zostać łatwo zintegrowany z procesem wytwarzania lipidowych mikropęcherzyków od podstaw przed ich aktywacją (Rysunek 1B). Metoda ta jest wszechstronna i może być z powodzeniem stosowana w przypadku niestandardowych i komercyjnych formulacji mikropęcherzyków o różnej długości łańcucha acylowego lipidów (C16 do C22), ładunku (neutralnym i anionowym) oraz składach porfirynowo-lipidowych (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%), co pozwala na otrzymanie mikropęcherzyków o aktywności radiologicznej i fluorescencyjnej. Możliwości adaptacji wykraczają również poza porfiryny. Protokół jednopułkowy może zostać zmodyfikowany w celu wykorzystania alternatywnych, dostępnych komercyjnie chelatorów (np. lipidowego pięciooctanodietylenotriaminy (DTPA)) i fluoroforów (np. DiI). Można go również zmodyfikować, aby znakować gotowe formulacje mikropęcherzyków poprzez metodę „spikingu”. W związku z tym metoda ta umożliwia produkcję dostosowanych, śledzalnych (aktywnych radiologicznie, fluorescencyjnie lub dwuparametrycznie – radiologicznie i fluorescencyjnie) mikropęcherzyków, przydatnych w rozwoju mechanistycznych, obrazowych i terapeutycznych zastosowań mikropęcherzyków w połączeniu z FUS. Poniższy protokół opisuje wytwarzanie lipidowych mikropęcherzyków, zastosowanie jednopułkowego protokołu znakowania radiologicznego, niezbędną charakterystykę znakowania radiologicznego i właściwości fizykochemicznych oraz potencjalne modyfikacje.
<img alt="Schemat tworzenia mikropęcherzyków porfiryna-lipid; proces fluorescencji, ultradźwięków i znakowania radiacyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół wytwarzania i znakowania radiacyjnego mikropęcherzyków. (A) Porfiryna-lipid, w formie pyrofeoforbidu-a-lipidu, służy w tym protokole jako wielomodalny chelator. Jako monomer chelatowany miedzią-64 (i), posiada zdolność do obrazowania PET i wizualizacji. Jego fluorescencja jest wygaszona w formie cząsteczkowej (mikropęcherzyki (ii) oraz ich nanopochodne po rozpuszczeniu (iii)) i zostaje przywrócona po zniszczeniu cząsteczek (iv). (B) Opisany w niniejszym raporcie protokół hydratacji/aktywacji filmu lipidowego w celu generowania mikropęcherzyków lipidowych od podstaw oraz (C) integracja znakowania radiacyjnego metodą „one-pot” pomiędzy formowaniem zawiesiny lipidowej a aktywacją mikropęcherzyków. Rysunek opracowano za zgodą autorów Rajora et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of Radiology</td><td>N/A</td><td>Zamówienie w małej objętości (< 10 &mikro; L) rozpuszczony w 0,1 N HCl</td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>&ge; 95% czystości</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Czystość: &ge; 98%</td></tr><tr><td>Równowaga - analityczna</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Możliwość pomiaru do 0,1 mg</td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Może być podgrzany do 69 oC</td></tr><tr><td>Otwór CC - 30 mikronów</td><td>Beckman Coulter</td><td>A36391</td><td>Zakres średnic cząstek: 0,6-18 um</td></tr><tr><td>Elektrolit CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td>Rozcieńczalnik Isoton II</td></tr><tr><td>CC Oprogramowanie</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>Wirówki filtrujące (0,5 ml 30 000 MWCO) z kompatybilnymi probówkami do mikrowirówek</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0,5 ml</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe - 15 ml z nakrętkami</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Czystość: &ge; 99,8%&nbsp;</td></tr><tr><td>Licznik redlic</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e Licznik redlic</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR Micro cover glass</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Upewnij się, że nie utlenione</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuweta - kwarty, długość ścieżki 1 cm</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuwety - 10 ml tworzywa sztucznego do pomiarów CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A35471</td><td>Coulter Counter Accuvette</td></tr><tr><td>ST ddH2O</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Można uzyskać za pomocą ultraczystego systemu oczyszczania wody</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanina)</td> <td>Dowolna firma</td><td></td><td>Forma proszku</td></tr><tr><td>Kalibrator dawki</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Potrafi odczytać miedź-64</td></tr><tr><td>DPPA (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosforan (sól sodowa))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>Forma proszku</td></tr><tr><td>DPPC (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>Forma proszku</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (sól amonowa)))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>Postać proszku</td></tr><tr><td>DTPA-lipid (kwas 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-dietytylenotriaminopentaoctowy (sól amonowa))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>Proszek w postaci</td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik gamma</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Potrafi odczytać miedź-64</td></tr><tr><td>Nasadki do zliczania rurek zliczających gamma</td><td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>Kołnierzowe zaślepki do probówek 12 mm</td></tr><tr><td>Probówki liczące gamma</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>Zlewka szklana - 250 mL</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Wytrzymuje temperatury do 100 oC</td></tr><tr><td>Piec do suszenia szkła</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Może być podgrzewany do 80 oC</td></tr><tr><td>Szklane strzykawki mikrolitrowe - 25, 50, 100, 1000 &mikro; L</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Kompatybilny z rozpuszczalnikami organicznymi</td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne - 20 ml</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg; Fiolki scyntylacyjne, ze szkła borokrzemianowego, z nakrętkami, z wkładką z folii celulozowej</td></tr><tr><td>Fiolki szklane - 0,5 dram</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR Fiolka 1/2 dram, z czarną fenolową nakrętką i wkładką z masy celulozowej pokrytej poliwinylem</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td>Czystość:&nbsp; &ge; 99.0%&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta z podziałką/pistolet</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta</td><td></td><td></td> gorąca/mieszająca <td>Wyposażona w sondę temperatury do automatycznej kontroli temperatury</td></tr><tr><td>Kwas solny - 0,1 N</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki iTLC</td><td>Agilent</td><td>A120B12</td><td>&nbsp; Bibuła chromatograficzna iTLC-SA</td></tr><tr><td>Tkanki laboratoryjne</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media Jednostka filtracji próżniowej</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>0,22 mikrona wielkość porów, membrana PES, pojemność lejka 500 ml</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Czystość:&nbsp; &ge; 99,8%, klasa HPLC, spełnia specyfikacje ACS</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek niesterylne - 1,5 ml</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek sterylne - 1,5 ml</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety - p1000, p200, p20, p10</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Upewnij się, że są skalibrowane</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe Wstępnie oczyszczone</td></tr><tr><td>igły - 18 G</td><td></td><td></td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS, modyfikowany, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>Czystość:&nbsp; &ge; 99,8%</td></tr> <tr><td>Linia PFP</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Wąż plastikowy o średnicy 1/4 cala o długości około 50 cm</td></tr><tr><td>Regulator PFP</td><td>Swagelok</td><td>SS-1RF4 i SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzorce pH 4 i 7</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do p1000, p200, p10 - niesterylne</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do p1000, p200, p10 - sterylne</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka plastikowa - 1 ml</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>Glikol</td> <td>propylenowyBioShop</td><td>PRO888.500</td><td>Czystość:&nbsp; &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Pirolipid</td><td>N/A</td><td></td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Kleszcze z gumową końcówką</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Zalecana mieszanka krawędzi z cienką końcówką i płaskimi/kwadratowymi</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu - 1 N</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu - 10 N</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Zdolny do wzbudzenia 410 nm i emisji 600-850 nm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do spektrofluorometrii</td><td>Spektrometr Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka - 1 ml</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Jednorazowe, plastikowe, sterylne</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe - wielkość porów 0,2 mikrona</td><td>Dowolna Firma</td><td></td><td>Materiał membrany: PES lub inny kompatybilny z octanem amonu/kwasem octowym i PBS</td></tr><tr><td>Probówka - 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy / próżnia</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Obrazowanie medyczne</td><td>515030-0508</td><td>Określany w protokole jako mechaniczna wytrząsarka do fiolek</td></tr><tr><td>Waga papier</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>Aby uniknąć utraty produktu, zaleca się cięcie papieru o wymiarach 3x3 cm</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

Mikropęcherzyki to wypełnione lipidami, wypełnione gazem cząsteczki, które przekształciły się z ultradźwiękowych środków kontrastowych do rewolucyjnych platform terapii raka. W połączeniu z terapeutycznymi skoncentrowanymi ultradźwiękami (FUS) mogą bezpiecznie i miejscowo pokonywać bariery fizjologiczne (np. barierę krew-mózg), dostarczać leki na niedostępne w inny sposób nowotwory (np. glejaka i raka trzustki) oraz leczyć choroby neurodegeneracyjne. Arsenał terapeutyczny microbubble-FUS rozwija się w nowych kierunkach, w tym w synergicznej radioterapii skojarzonej, obrazowaniu multimodalnym oraz kompleksowym ładowaniu i dostarczaniu leków z otoczek mikropęcherzykowych.
Oznaczanie mikropęcherzyków za pomocą radioznaczników jest kluczem do ustanowienia tych rozszerzonych możliwości teranostycznych. Jednak istniejące strategie znakowania radioaktywnego mikropęcherzyków opierają się na metodologiach oczyszczania, o których wiadomo, że zaburzają właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków, wykorzystują krótkożyciowe izotopy promieniotwórcze i nie zawsze zapewniają stabilną chelatację. Łącznie stwarza to niejasności co do dokładności obrazowania radiologicznego mikropęcherzyków i skuteczności dostarczania radioizotopów guza.
Ten protokół opisuje nową, jednogarnkową, nieoczyszczającą metodologię znakowania mikropęcherzyków, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków, osiągając jednocześnie >95% skuteczności chelatacji radioizotopów. Jest wszechstronny i może być z powodzeniem stosowany w niestandardowych i komercyjnych preparatach mikropęcherzykowych o różnej długości łańcucha lipidowego acylowego, ładunku i składzie chelatora/sondy (porfiryna, DTPA, DiI). Może być stosowany adaptacyjnie podczas zmielonego wytwarzania mikropęcherzyków oraz do gotowych preparatów mikropęcherzykowych z modułową możliwością dostosowania właściwości fluorescencyjnych i multimodalnych fluorescencji/radioaktywnych. W związku z tym ta elastyczna metoda umożliwia produkcję dostosowanych, identyfikowalnych (radio, fluorescencyjnych lub radio/fluorescencyjnych aktywnych) multimodalnych mikropęcherzyków, które są przydatne w rozwoju mechanistycznych, obrazowych i terapeutycznych zastosowań mikropęcherzyków-FUS.

Kluczowymi mierzalnymi wynikami podczas wytwarzania znakowanych radiologicznie mikropęcherzyków są czystość radiochemiczna oraz wydajność znakowania radiologicznego. W niniejszym protokole do ich charakterystyki wykorzystano odpowiednio iTLC oraz zwalidowaną procedurę odwirowywania. Rycina 2A pokazuje, że osiągnięto średnią czystość radiochemiczną i wydajność na poziomie ≥95% we wszystkich komercyjnych formulacjach naśladujących mikropęcherzyki, w których lipid gospodarza zastąpiono pirolipi...

Ten protokół opisuje wytwarzanie mikropęcherzyków lipidowych i kompatybilną metodę radioznakowania mikropęcherzyków w jednym garnku z nieoczyszczającą >95% skutecznością znakowania, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków. Metoda ta jest skuteczna w przypadku różnych preparatów mikropęcherzyków lipidowych i może być dostosowana do generowania mikropęcherzyków radioaktywnych i/lub fluorescencyjnych.

Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

Mikropęcherzyki to wypełnione gazem cząstki wrażliwe na ultradźwięki o wyjątkowych możliwościach obrazowania i terapii raka. Ich rozwijające się narzędzia mogą być strategicznie rozwijane poprzez tworzenie sterowanych przez aplikacje identyfikowalnych mikropęcherzyków. Naszym celem jest ułatwienie osiągnięcia tego celu poprzez opracowanie protokołu wytwarzania mikropęcherzyków lipidowych, który pozwala na konfigurowalne generowanie mikropęcherzyków nieznakowanych, znakowanych radioaktywnie, fluorescencyjnych i multimodalnych.Osiągnięcie wydajnego i stabilnego etykietowania radiowego za pomocą mikropęcherzyków jest nietrywialnym wyzwaniem. Mikropęcherzyki lipidowe są delikatne, a zatem poddawanie ich etapom podgrzewania, czasu i oczyszczania w postprodukcyjnym procesie znakowania radiowego może zaburzyć ich właściwości fizyczne i stabilność. Z drugiej strony, prefabrykowane znakowanie radiowe wymaga specjalistycznego sprzętu i zwiększonego narażenia na promieniowanie.Radzimy sobie z tymi wyzwaniami, opracowując nowy protokół hybrydowy, w którym chelatacja radioizotopów zachodzi przed aktywacją mikropęcherzyków, ale po utworzeniu zawiesiny lipidowej. To jednoetapowe podejście po raz pierwszy ułatwia wysokowydajne, niewymagające oczyszczania mikropęcherzykowe etykietowanie radiowe, które zachowuje właściwości fizykochemiczne cząstek. Kluczową dodatkową zaletą jest wszechstronność protokołów. Może być włączony podczas zmielonej produkcji niestandardowych mikropęcherzyków i dostosowany do wstępnie uformowanych zawiesin lipidowych mikropęcherzyków, takich jak te dostępne na rynku. Może być z powodzeniem stosowany w różnych mikropęcherzykach, składach lipidowych i chelatatorach, a także może generować dostosowane do potrzeb mikropęcherzyki radioaktywne, fluorescencyjne lub trimodalne.Łącznie właściwości te umożliwiają multimodalne, reprezentatywne śledzenie mikropęcherzykowych otoczek lipidowych, co może przyczynić się do pogłębienia wiedzy mechanistycznej i wspierania postępu terapii ultradźwiękowych skoncentrowanych na mikropęcherzykach w wielu dziedzinach, w tym w badaniu farmakokinetyki mikropęcherzyków, obrazowaniu multimodalnym, planowaniu leczenia i umożliwianiu terapii synergicznych.[Narrator] Aby rozpocząć korzystanie z mikropipety, dodaj jeden mililitr roztworu AA-PGG wzdłuż krawędzi wybranego filmu lipidowego mikropęcherzyków w fiolce, unikając tworzenia się pęcherzyków. Częściowo zakryć otwór fiolki nakrętką, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na wprowadzenie przewodu perfluoropentanu lub PFP. Wlać PFP do przestrzeni nad fiolką na 20 sekund nad płynem i zamknąć fiolkę. Zanurz dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza na jedną minutę. Następnie sonikować fiolkę przez 30 sekund w kąpieli sonicyjnej o temperaturze 69 stopni Celsjusza. Po sonikacji wytrzeć fiolkę i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Uzupełnić przestrzeń nad fiolką gazem PFP. Następnie zakryć fiolkę i uszczelnić brzegi preparatem Parafilm. Aby ustawić łaźnię wodną o temperaturze 60 stopni Celsjusza w naczyniu krystalizującym, umieść w naczyniu mieszadło magnetyczne i umieść je na gorącej płycie mieszającej o kontrolowanej temperaturze. Włóż sondę termiczną do wody, aby monitorować temperaturę i dostosować prędkość mieszania, aby utworzyć słaby, ale widoczny lejek. Za pomocą kleszczy przenieść szczelnie zamkniętą fiolkę zawierającą miedź 64 w postaci chlorku miedzi w 0,1 zwykłego kwasu solnego do kalibratora dawki. Zapisz aktywność miedzi 64 i czas. Za pomocą kleszczy wyjąć fiolkę z kalibratora dawki i umieścić ją w ołowianym pojemniku. Aby obliczyć wartość w megabekereliach na mililitr, należy podzielić aktywność odnotowaną na kalibratorze dawki przez objętość miedzi 64. Odkręcić zawiesinę lipidową i umieścić ją w uchwycie na fiolkę. Następnie odkręć fiolkę z miedzią 64, dotykając fiolki kleszczami. Za pomocą mikropipety przenieść objętość roztworu miedzi 64 odpowiadającą 40 do 250 megabekereli aktywności do zawiesiny lipidowej. Używając płaskich kleszczyków z gumową końcówką, obróć radioaktywną zawiesinę lipidową w górę iw dół co najmniej pięć razy, aby wymieszać miedź 64 z zawiesiną. Gdy fiolka jest skierowana prawą stroną do góry, delikatnie przesunąć nakrętkę, jednocześnie stabilizując fiolkę. Ostrożnie, częściowo odkręcić fiolkę i wprowadzić linię PFP wyposażoną w igłę. Wypełnić przestrzeń nad fiolką PFP przez 20 sekund. Następnie zakryć i zapieczętować fiolkę parafilmem. Zmierzyć aktywność fiolki za pomocą kalibratora dawki i zapisać czas. Następnie umieścić fiolkę w piankowym uchwycie na fiolkę tak, aby dolna połowa fiolki była wystawiona na działanie ciepła. Zanurz uchwyt w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza i podgrzewaj przez godzinę. W międzyczasie, aby przygotować paski iTLC, pokrój bibułę chromatograficzną z mikrofibry szklanej na paski. Podgrzej paski w szklanym piecu do suszenia o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby się aktywowały. Po godzinie wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i przetrzeć jej brzegi bibułą. Obracać fiolkę w górę i w dół za pomocą kleszczyków z gumową końcówką. Gdy fiolka znajduje się w pozycji pionowej, należy przesunąć nakrętkę, jednocześnie stabilizując fiolkę. Usuń parafilm i przetrzyj wokół nakrętki, aby usunąć uwięzioną wodę. Umieść jeden do dwóch mikrolitrów zawiesiny lipidowej w odległości jednego centymetra od dolnej środkowej części aktywowanego paska iTLC. Pozostaw miejsce do wyschnięcia. Za pomocą mikropipety dodaj 200 mikrolitrów eluentu iTLC na dno 10-mililitrowej probówki. Umieść rurkę w ołowianym pojemniku. Dodaj nakrapiany pasek iTLC do probówki i pozwól mu się rozwinąć, aż eluent osiągnie około jednego centymetra od górnej części paska. Następnie za pomocą kleszczy usuń rozwinięty pasek i przytrzymaj go pionowo. Pokrój pasek na trzy części nad pięciomililitrowymi plastikowymi rurkami kompatybilnymi z licznikiem gamma. Włóż zaślepki do rurek. Zmierz pasek zawierający probówki i pustą probówkę kontrolną za pomocą licznika gamma, aby wykryć aktywność miedzi 64. Zapisz zliczenia na minutę i odejmij aktywność rurki kontrolnej od innych odczytów, aby skorygować promieniowanie tła. Następnie oblicz czystość chemiczną radiową na podstawie skorygowanych zliczeń na minutę. Następnie odkręć fiolkę z zawiesiną lipidową znakowaną radiowo i dodaj 8,89 mikrolitra jednego normalnego wodorotlenku sodu do zawiesiny. Po zamknięciu i obróceniu fiolki, delikatnie postukać w fiolkę, aby usunąć zawiesinę uwięzioną w przestrzeni nakrętki i napełnić przestrzeń nad głową gazem PFP. Umieścić fiolkę na wytrząsarce mechanicznej i aktywować ją na 45 sekund przy 4 530 obr./min, aby wytworzyć mleczną zawiesinę mikropęcherzyków. Po pasywnym schłodzeniu do temperatury pokojowej delikatnie odwrócić fiolkę w celu ponownego zawieszenia zawiesiny mikropęcherzyków. Ustawić fiolkę na płaskiej powierzchni i odczekać dwie minuty. W międzyczasie wyposaż plastikową strzykawkę o pojemności jednego mililitra w igłę o rozmiarze 18 i odpowietrz strzykawkę, zasysając i zanurzając powietrze do wewnątrz i na zewnątrz. Po dwóch minutach szybko odkręć fiolkę i pobierz od 400 do 550 mikrolitrów zawiesiny z dna fiolki. Ostrożnie wytrzeć krawędzie igły i przenieść zawiesinę mikropęcherzyków do probówki z mikropęcherzykami. Po zamknięciu probówki zmierz aktywność końcowego produktu z mikropęcherzykami na kalibratorze dawki i zanotuj czas. Podzielić wartość aktywności przez objętość zdekantowaną, aby uzyskać aktywność w megabekereliach na mililitr. Na początek dodaj od 10 do 200 mikrolitrów zawiesiny mikropęcherzyków do 0,5 mililitra i 30 000 mas cząsteczkowych filtra wirówkowego w kompatybilnej probówce do mikrowirówek. Odwirować zawiesinę o stężeniu 12 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć połączenie między rurką mikrowirówki a jej nasadką. Umieść nakrętkę w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej oznaczonej CAPS. Przenieś jednostkę filtrującą do nowej probówki mikrowirówki oznaczonej PROBÓWKA 2. Umieść pierwszą probówkę do mikrowirówki zawierającą podnatant w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej oznaczonej PROBÓWKĄ 1. Dodaj 200 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do jednostki filtrującej w RURZE 2. Ponownie odwirować jednostkę filtrującą przy sile 12 000 G przez 10 minut. Po ostatnim przeniesieniu jednostki filtrującej dodać 200 mikrolitrów wody destylowanej do jednostki filtrującej w PROBÓWCE 3 i odwirować. Po odwirowaniu odetnij nakrętkę probówki, dodając ją do fiolki scyntylacyjnej z nasadką i przenieś jednostkę filtrującą do nowej 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej oznaczonej jako UNIT. Umieść probówkę 3 w nowej szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 mililitrów. Zakryć pięć fiolek scyntylacyjnych i przygotować jedną pustą i zakrytą fiolkę scyntylacyjną jako ślepą próbę. Zmierz sześć fiolek scyntylacyjnych na liczniku gamma, aby wykryć aktywność miedzi 64. Odjąć ślepą próbę kontrolną od innych pomiarów fiolki. Oblicz skuteczność etykietowania radiowego lub chelatacji.

fabricating-labeling-microbubbles-with-fluorescent-radioactive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Laparoskopowa pankreatoduodenctomia (LPD) może oferować korzyści w porównaniu z otwartą pankreatoduodenektomią, w tym wczesną mobilizację pooperacyjną, mniej opóźnione opróżnianie żołądka i krótszy pobyt w szpitalu. Jednak LPD jest technicznie trudne i nie jest dobrze ustandaryzowane, zwłaszcza w odniesieniu do zespolenia trzustki. Opisujemy standaryzowaną technikę zespolenia trzustki podczas LPD: zmodyfikowaną pankreatynojejunostomię Blumgart.

Laparoskopowa pankreatodenektomia ze zmodyfikowaną pankreatykojejunostomią Blumgart

Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.

Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Tutaj przedstawiono protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym. Fosfomorfometria przepływowa to potężne podejście do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.

Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Poznaj metodę wytwarzania mikropęcherzyków lipidowych i ich znakowania radioizotopowego z wydajnością powyżej 95% bez konieczności oczyszczania. Ta technika zachowuje właściwości fizykochemiczne cząstek i umożliwia tworzenie mikropęcherzyków multimodalnych do zastosowań w obrazowaniu i terapii nowotworów.

Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

Przeglądaj więcej filmów