Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

Mikropęcherzyki to wypełnione gazem cząstki wrażliwe na ultradźwięki o wyjątkowych możliwościach obrazowania i terapii raka. Ich rozwijające się narzędzia mogą być strategicznie rozwijane poprzez tworzenie sterowanych przez aplikacje identyfikowalnych mikropęcherzyków. Naszym celem jest ułatwienie osiągnięcia tego celu poprzez opracowanie protokołu wytwarzania mikropęcherzyków lipidowych, który pozwala na konfigurowalne generowanie mikropęcherzyków nieznakowanych, znakowanych radioaktywnie, fluorescencyjnych i multimodalnych.

Osiągnięcie wydajnego i stabilnego etykietowania radiowego za pomocą mikropęcherzyków jest nietrywialnym wyzwaniem. Mikropęcherzyki lipidowe są delikatne, a zatem poddawanie ich etapom podgrzewania, czasu i oczyszczania w postprodukcyjnym procesie znakowania radiowego może zaburzyć ich właściwości fizyczne i stabilność. Z drugiej strony, prefabrykowane znakowanie radiowe wymaga specjalistycznego sprzętu i zwiększonego narażenia na promieniowanie.

Radzimy sobie z tymi wyzwaniami, opracowując nowy protokół hybrydowy, w którym chelatacja radioizotopów zachodzi przed aktywacją mikropęcherzyków, ale po utworzeniu zawiesiny lipidowej. To jednoetapowe podejście po raz pierwszy ułatwia wysokowydajne, niewymagające oczyszczania mikropęcherzykowe etykietowanie radiowe, które zachowuje właściwości fizykochemiczne cząstek. Kluczową dodatkową zaletą jest wszechstronność protokołów. Może być włączony podczas zmielonej produkcji niestandardowych mikropęcherzyków i dostosowany do wstępnie uformowanych zawiesin lipidowych mikropęcherzyków, takich jak te dostępne na rynku. Może być z powodzeniem stosowany w różnych mikropęcherzykach, składach lipidowych i chelatatorach, a także może generować dostosowane do potrzeb mikropęcherzyki radioaktywne, fluorescencyjne lub trimodalne.

Łącznie właściwości te umożliwiają multimodalne, reprezentatywne śledzenie mikropęcherzykowych otoczek lipidowych, co może przyczynić się do pogłębienia wiedzy mechanistycznej i wspierania postępu terapii ultradźwiękowych skoncentrowanych na mikropęcherzykach w wielu dziedzinach, w tym w badaniu farmakokinetyki mikropęcherzyków, obrazowaniu multimodalnym, planowaniu leczenia i umożliwianiu terapii synergicznych.

[Narrator] Aby rozpocząć korzystanie z mikropipety, dodaj jeden mililitr roztworu AA-PGG wzdłuż krawędzi wybranego filmu lipidowego mikropęcherzyków w fiolce, unikając tworzenia się pęcherzyków. Częściowo zakryć otwór fiolki nakrętką, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na wprowadzenie przewodu perfluoropentanu lub PFP. Wlać PFP do przestrzeni nad fiolką na 20 sekund nad płynem i zamknąć fiolkę. Zanurz dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza na jedną minutę. Następnie sonikować fiolkę przez 30 sekund w kąpieli sonicyjnej o temperaturze 69 stopni Celsjusza. Po sonikacji wytrzeć fiolkę i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Uzupełnić przestrzeń nad fiolką gazem PFP. Następnie zakryć fiolkę i uszczelnić brzegi preparatem Parafilm. Aby ustawić łaźnię wodną o temperaturze 60 stopni Celsjusza w naczyniu krystalizującym, umieść w naczyniu mieszadło magnetyczne i umieść je na gorącej płycie mieszającej o kontrolowanej temperaturze. Włóż sondę termiczną do wody, aby monitorować temperaturę i dostosować prędkość mieszania, aby utworzyć słaby, ale widoczny lejek. Za pomocą kleszczy przenieść szczelnie zamkniętą fiolkę zawierającą miedź 64 w postaci chlorku miedzi w 0,1 zwykłego kwasu solnego do kalibratora dawki. Zapisz aktywność miedzi 64 i czas. Za pomocą kleszczy wyjąć fiolkę z kalibratora dawki i umieścić ją w ołowianym pojemniku. Aby obliczyć wartość w megabekereliach na mililitr, należy podzielić aktywność odnotowaną na kalibratorze dawki przez objętość miedzi 64. Odkręcić zawiesinę lipidową i umieścić ją w uchwycie na fiolkę. Następnie odkręć fiolkę z miedzią 64, dotykając fiolki kleszczami. Za pomocą mikropipety przenieść objętość roztworu miedzi 64 odpowiadającą 40 do 250 megabekereli aktywności do zawiesiny lipidowej. Używając płaskich kleszczyków z gumową końcówką, obróć radioaktywną zawiesinę lipidową w górę iw dół co najmniej pięć razy, aby wymieszać miedź 64 z zawiesiną. Gdy fiolka jest skierowana prawą stroną do góry, delikatnie przesunąć nakrętkę, jednocześnie stabilizując fiolkę. Ostrożnie, częściowo odkręcić fiolkę i wprowadzić linię PFP wyposażoną w igłę. Wypełnić przestrzeń nad fiolką PFP przez 20 sekund. Następnie zakryć i zapieczętować fiolkę parafilmem. Zmierzyć aktywność fiolki za pomocą kalibratora dawki i zapisać czas. Następnie umieścić fiolkę w piankowym uchwycie na fiolkę tak, aby dolna połowa fiolki była wystawiona na działanie ciepła. Zanurz uchwyt w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza i podgrzewaj przez godzinę. W międzyczasie, aby przygotować paski iTLC, pokrój bibułę chromatograficzną z mikrofibry szklanej na paski. Podgrzej paski w szklanym piecu do suszenia o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby się aktywowały. Po godzinie wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i przetrzeć jej brzegi bibułą. Obracać fiolkę w górę i w dół za pomocą kleszczyków z gumową końcówką. Gdy fiolka znajduje się w pozycji pionowej, należy przesunąć nakrętkę, jednocześnie stabilizując fiolkę. Usuń parafilm i przetrzyj wokół nakrętki, aby usunąć uwięzioną wodę. Umieść jeden do dwóch mikrolitrów zawiesiny lipidowej w odległości jednego centymetra od dolnej środkowej części aktywowanego paska iTLC. Pozostaw miejsce do wyschnięcia. Za pomocą mikropipety dodaj 200 mikrolitrów eluentu iTLC na dno 10-mililitrowej probówki. Umieść rurkę w ołowianym pojemniku. Dodaj nakrapiany pasek iTLC do probówki i pozwól mu się rozwinąć, aż eluent osiągnie około jednego centymetra od górnej części paska. Następnie za pomocą kleszczy usuń rozwinięty pasek i przytrzymaj go pionowo. Pokrój pasek na trzy części nad pięciomililitrowymi plastikowymi rurkami kompatybilnymi z licznikiem gamma. Włóż zaślepki do rurek. Zmierz pasek zawierający probówki i pustą probówkę kontrolną za pomocą licznika gamma, aby wykryć aktywność miedzi 64. Zapisz zliczenia na minutę i odejmij aktywność rurki kontrolnej od innych odczytów, aby skorygować promieniowanie tła. Następnie oblicz czystość chemiczną radiową na podstawie skorygowanych zliczeń na minutę. Następnie odkręć fiolkę z zawiesiną lipidową znakowaną radiowo i dodaj 8,89 mikrolitra jednego normalnego wodorotlenku sodu do zawiesiny. Po zamknięciu i obróceniu fiolki, delikatnie postukać w fiolkę, aby usunąć zawiesinę uwięzioną w przestrzeni nakrętki i napełnić przestrzeń nad głową gazem PFP. Umieścić fiolkę na wytrząsarce mechanicznej i aktywować ją na 45 sekund przy 4 530 obr./min, aby wytworzyć mleczną zawiesinę mikropęcherzyków. Po pasywnym schłodzeniu do temperatury pokojowej delikatnie odwrócić fiolkę w celu ponownego zawieszenia zawiesiny mikropęcherzyków. Ustawić fiolkę na płaskiej powierzchni i odczekać dwie minuty. W międzyczasie wyposaż plastikową strzykawkę o pojemności jednego mililitra w igłę o rozmiarze 18 i odpowietrz strzykawkę, zasysając i zanurzając powietrze do wewnątrz i na zewnątrz. Po dwóch minutach szybko odkręć fiolkę i pobierz od 400 do 550 mikrolitrów zawiesiny z dna fiolki. Ostrożnie wytrzeć krawędzie igły i przenieść zawiesinę mikropęcherzyków do probówki z mikropęcherzykami. Po zamknięciu probówki zmierz aktywność końcowego produktu z mikropęcherzykami na kalibratorze dawki i zanotuj czas. Podzielić wartość aktywności przez objętość zdekantowaną, aby uzyskać aktywność w megabekereliach na mililitr. Na początek dodaj od 10 do 200 mikrolitrów zawiesiny mikropęcherzyków do 0,5 mililitra i 30 000 mas cząsteczkowych filtra wirówkowego w kompatybilnej probówce do mikrowirówek. Odwirować zawiesinę o stężeniu 12 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć połączenie między rurką mikrowirówki a jej nasadką. Umieść nakrętkę w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej oznaczonej CAPS. Przenieś jednostkę filtrującą do nowej probówki mikrowirówki oznaczonej PROBÓWKA 2. Umieść pierwszą probówkę do mikrowirówki zawierającą podnatant w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej oznaczonej PROBÓWKĄ 1. Dodaj 200 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do jednostki filtrującej w RURZE 2. Ponownie odwirować jednostkę filtrującą przy sile 12 000 G przez 10 minut. Po ostatnim przeniesieniu jednostki filtrującej dodać 200 mikrolitrów wody destylowanej do jednostki filtrującej w PROBÓWCE 3 i odwirować. Po odwirowaniu odetnij nakrętkę probówki, dodając ją do fiolki scyntylacyjnej z nasadką i przenieś jednostkę filtrującą do nowej 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej oznaczonej jako UNIT. Umieść probówkę 3 w nowej szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 mililitrów. Zakryć pięć fiolek scyntylacyjnych i przygotować jedną pustą i zakrytą fiolkę scyntylacyjną jako ślepą próbę. Zmierz sześć fiolek scyntylacyjnych na liczniku gamma, aby wykryć aktywność miedzi 64. Odjąć ślepą próbę kontrolną od innych pomiarów fiolki. Oblicz skuteczność etykietowania radiowego lub chelatacji.