Name: Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Odkryj metody molekularnego dokowania i sondy deubikwitynacji do identyfikacji inhibitorów UCHL3 z tradycyjnej medycyny chińskiej. Poznaj zastosowanie bioinformatyki w badaniach farmakologicznych związków naturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie [numer grantu 7244498].

Virtual Screening and Validation of UCHL3 Inhibitors Using Molecular Docking

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

DUB odgrywają kluczową rolę w regulacji homeostazy całego układu ubikwityny poprzez usuwanie ubikwityny z substratów lub łańcuchów poliubikwityny37. W ostatnich latach enzymy te przyciągnęły również wiele uwagi jako cele rozwoju leków13. Istnieją jednak wyzwania związane z procesem opracowywania leków małocząsteczkowych. Na przykład wysokoprzepustowe badania przesiewowe obejmujące dziesiątki tysięcy bibliotek małych cząsteczek wiążą się z wysokimi kosztami i znacznym obciąż...

Ubikwitynacja to potranslacyjna modyfikacja białek, proces, w którym enzymy aktywujące ubikwitynę E1, enzymy sprzężone ubikwityny E2 i ligazy ubikwityny E3 przyłączają ubikwitynę do białka docelowego, a cały proces ubikwitynacji może być odwrócony przez enzymy deubikwitynujące (DUBs)1,2,3,4. Ze względu na ich ważną rolę fizjologiczną i patologiczną, DUB są uważane za ważne cele dla odkrywania leków5,6.
U ludzi zidentyfikowano ponad 100 DUB-ów7,8. Zazwyczaj funkcjonują jako izopeptydaza odpowiedzialna za rozszczepienie wiązania izopeptydowego między C-końcem ubikwityny a resztą lizyny w substracie lub innej cząsteczce ubikwityny9,10. Obecnie są one przede wszystkim podzielone na siedem głównych rodzin, a mianowicie: peptydazy specyficzne dla ubikwityny (USP), proteazy nowotworowe jajnika (OTU), proteazy N-końcowe + domenowe Jab1 / Mov34 / Mpr1 Pad 1 (JAMM), motywy oddziałujące z nowymi proteazami z rodziny DUB zawierającymi ubikwitynę (MINDY), C-końcowe hydroksylazy ubikwityny (UCH), proteazy domeny Machado-Josephiny (MJD) i peptydaza ubikwityny zawierająca palec cynkowy 1 (ZUP1)9. Oprócz JAMM, które należą do rodziny metaloproteazy11, pozostałe DUB to proteazy cysteinowe charakteryzujące się katalityczną triadą składającą się z katalitycznej cysteiny, histydyny i trzeciej reszty kwasowej12,13. Ta specyfika otwiera możliwości rozwoju małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na miejsce aktywne enzymu lub pobliskie kieszenie allosteryczne.
W dziedzinie badań nad enzymami deubikwitynującymi, istnieje poważne wyzwanie związane z charakteryzacją ich aktywności14,15. Charakterystyka oparta na aktywnych sondach służy jako kluczowe podejście do badania inhibitorów DUB16. Wykonując testy konkurencyjne z sondami i inhibitorami opartymi na aktywności w lizatach komórkowych lub rekombinowanych białkach, można scharakteryzować aktywność DUB, ułatwiając rozwój małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na te enzymy. Ub-AMC to wczesna sonda używana do wykrywania aktywności DUB, która ma grupę fluorescencyjną przyłączoną do C-końcowego końca ubikwityny17,18. Kiedy DUB wywierają swoją aktywność katalityczną, AMC jest uwalniany w dużych ilościach, a intensywność fluorescencji wykrytego światła jest odpowiednio zwiększana. Sonda ta jest szeroko stosowana w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych inhibitorów DUB19,20. Sonda HA-Ub-VS jest również używana do pomiaru aktywności DUB21. Ma grupę sulfonu winylu na C-końcu ubikwityny, co czyni go samobójczym substratem dla DUB. Po oddzieleniu elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu (SDS-PAGE) aktywne DUB można wykryć za pomocą western blotting22,23,24.
Tradycyjna medycyna chińska (TCM) używa roślin leczniczych od ponad 2000 lat. Opracowywanie nowych leków z produktów naturalnych ma ogromne znaczenie medyczne, z kluczowym naciskiem na identyfikację składników aktywnych i wyjaśnienie ich mechanizmów25. Szałwia miltiorrhiza Bge to zioło szeroko stosowane w leczeniu różnych chorób, w tym raka, układu krążenia, wątroby i neurologicznego26. Obecnie zawiera znane małe cząsteczki, takie jak tanshinone27, Danshensu28, kwas tanshininowy29 itp. Związki te wykazują różnorodne działania biologiczne, takie jak działanie przeciwzakrzepowe, przeciwutleniające i przeciwnowotworowe, co czyni je bardzo cennymi dla badań26. Ostatnie badania zidentyfikowały Danshensu jako kowalencyjny inhibitor proteazy podobnej do 3-chymotrypsyny (3CLpro) SARS-CoV-230. Wykazano, że tworzy wiązanie kowalencyjne z resztą miejsca aktywnego C145 3CLpro, co wskazuje na obecność potencjalnych małocząsteczkowych inhibitorów proteazy w Salvia miltiorrhiza Bge.
Hydrolaza C-Końcowa Ubikwityny L3 (UCHL3) należy do proteaz cysteinowych z rodziny DUBs. Opiera się na konserwatywnych resztach, takich jak cysteina95, histydyna169 i kwas asparaginowy184, aby skutecznie katalizować swoje funkcje31,32. Odgrywa kluczową rolę w wielu szlakach molekularnych, w tym w cyklu komórkowym, rekombinacji homologicznej i naprawie pęknięć DNA sprzężonego z białkami33. Dodatkowo jest regulowany w górę w różnych nowotworach, takich jak rak jajnika, prostaty, trzustki, jelita grubego i niedrobnokomórkowy rak płuc34. Na podstawie tych badań UCHL3 wydaje się być obiecującym celem w leczeniu chorób. Zidentyfikowano kilka małocząsteczkowych inhibitorów UCHL3, które są w trakcie opracowywania w kierunku zastosowania klinicznego35,36.
W tym badaniu, dokowanie molekularne zostało przeprowadzone w celu zbadania interakcji między małymi cząsteczkami z Salvia miltiorrhiza Bge i UCHL3. Następnie w eksperymencie in vitro z użyciem sond Ub-AMC i HA-Ub-VS specyficznych dla DUB zidentyfikowano Danshensu jako małocząsteczkowy inhibitor UCHL3. Dokowanie molekularne pozwoliło również przewidzieć potencjalne miejsca wiązania Danshensu, co sugeruje mechanizm jego działania.

<table><tbody><tr><td>30% akrylamid</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd</td><td>A3291</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>China National Medicines Corporation Ltd</td><td>10002616</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi IgG, przeciwciało sprzężone z HRP&nbsp;#7074</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Plus</td><td>Beyotime</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>do oznaczania białek BradfordBeyotime</td><td>P0006</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step Klonowanie Zestaw</td><td>Vazyme</td><td>C115-01</td><td></td></tr><tr><td>Danshensu</td><td>Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd</td><td>B20254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Ameresco, Inc.</td><td>21K2356571</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy</td><td>Liuyi Biotechnology</td><td>112-0630</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania białek z tagiem His-tagged (kulki magnetyczne z agarozy NTA-Ni)</td><td>Beyotime</td><td>P2247S Membrana</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immun-Blot, rolka, 26 cm x 3,3 m</td><td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl alkohol</td><td>Macklin</td><td>I811925</td><td></td></tr><tr><td>M5 Prestained Protein Ladder</td><td>Mei5 Biotechnology Co.Ltd</td><td>MF-212-01</td><td></td></tr><tr><td>Maestro</td><td>Schr&ouml; dinger" s</td><td>https://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/</td><td></td></tr> <tr><td>Alkohol metylowy</td><td>China National Medicines Corporation Ltd</td><td>10014108</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>MyFug&nbsp; mini wirówka</td><td>Sigma</td><td>Z764183</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Free Rapid Gold BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>A55860</td><td></td></tr><tr><td>PR-619</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>26065S</td> Podstawowy bufor rozcieńczający przeciwciała <td></td></tr><tr><td>dla Western Blot</td><td>Macklin</td><td>P917820</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko HA-ubikwityny z sulfonu winylu, CF</td><td>R& D Systems</td><td>U-212-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko ubikwityny AMC, CF</td><td>R& D Systems</td><td>U-550-050</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td> <td>Ameresco, Inc.</td><td>205-788-1</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Ameresco, Inc.</td><td>2545C134</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd</td><td>0777-1</td><td></td></tr><tr><td>UCHL3 (D25E6) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>8141T</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności uchl3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Screening Traditional Chinese Medicine Compounds for Inhibiting UCHL3 Activity Based on Molecular Docking and Deubiquitinating Enzyme Probe Technology

Enzymy deubikwitynujące (DUB) odgrywają kluczową rolę w modulowaniu homeostazy ubikwitynacji, a UCHL3 jest archetypem cysteiny DUB misternie zaangażowanym w niezliczone procesy fizjologiczne i patologiczne. Dlatego opracowanie małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na C-końcową hydrolazę L3 ubikwityny (UCHL3) ma ogromne znaczenie. Protokół ten ma na celu ustanowienie procesu wirtualnych badań przesiewowych i walidacji in vitro małocząsteczkowych inhibitorów cysteiny DUB reprezentowanych przez UCHL3. Po pierwsze, potencjalne inhibitory UCHL3 są wirtualnie badane przy użyciu technologii dokowania molekularnego, a interakcja między lekami a celami białkowymi jest wizualizowana. Następnie skuteczność badanego leku, Danshensu, jest weryfikowana za pomocą testów hamowania aktywności in vitro. Ubikwityna-7-amino-4-metylokoumaryna (Ub-AMC) i hemaglutynina-ubikwityna-sulfosulfon winylu (HA-Ub-VS) są używane jako sondy do testowania aktywności in vitro, ponieważ mogą konkurencyjnie wiązać się z DUB z inhibitorami małocząsteczkowymi w celu oceny aktywności UCHL3. Wyniki wskazują, że Danshensu ma dobre powinowactwo do wiązania z UCHL3 w dokowaniu molekularnym i może konkurencyjnie hamować aktywność UCHL3 z HA-Ub-VS. Odkrycia te stanowią ważne punkty odniesienia dla dalszych badań i rozwoju leków terapeutycznych ukierunkowanych na UCHL3.

W celu wyselekcjonowania małych cząsteczek w Salvia miltiorrhiza Aby zidentyfikować cząsteczki Bge, które mogą skutecznie hamować UCHL3, przeprowadzono dokowanie molekularne małych cząsteczek pobranych z witryny TCMSP z białkiem UCHL3. 30 najlepszych małych cząsteczek z wyników dokowania oraz ich oceny zostały przedstawione w Tabela 1Wyniki dokowania dla wszystkich małych cząsteczek przedstawiono w Tabela uzupełniająca 1Wybrano danshensunu jako reprezentatywną małą cząsteczkę do...

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z technologiami sond do przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami tradycyjnej medycyny chińskiej a celami białkowymi.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Deubiquitinating enzymes&#160;(DUBs) play a pivotal role in modulating ubiquitination homeostasis, with UCHL3 being an archetypal cysteine DUB intricately ...

Nasze badania koncentrują się na badaniach przesiewowych aktywnych małych cząsteczek z produktów naturalnych w tradycyjnej medycynie chińskiej. Zbadaliśmy, jak zidentyfikować małocząsteczkowe inhibitory enzymów deubikwitynujących z Salvia miltiorrhiza, wykorzystać rekwizyty i technologię bioinformatyczną. Rekwizyty do scharakteryzowania aktywności enzymów deubikwitynujących obejmują Ub-TAMRA, Ub-RHO, Ub-VME, Ub-PA i inne.Po raz pierwszy zidentyfikowaliśmy Danshensu jako małocząsteczkowy inhibitor enzymu deubikwitynującego UCHL3.[Narrator] Aby rozpocząć, na komputerze otwórz bazę danych TCMSP. Wprowadź nazwę zioła Danshen. Następnie naciśnij Szukaj i kliknij Radik Salvae z listy wyników. Kliknij na każdy element i pobierz jego dwuwymiarową strukturę jeden po drugim. Zapisz dwuwymiarową strukturę w formacie .mol2. Następnie otwórz bazę danych PDB i wprowadź UCHL3. Następnie naciśnij Szukaj. Kliknij Homo sapiens, a następnie naciśnij Szukaj w uściśleniach. Wybierz strukturę 1XD3 z kokrystalizacją białek małocząsteczkowych, a następnie kliknij Pobierz pliki i wybierz Format PDB. Otwórz folder dokowania danshen UCHL3, zawierający zapisane związki Salvia miltiorrhiza Bge i struktury UCHL

screening-traditional-chinese-medicine-compounds-for-inhibiting-uchl3

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Protokół ten opisuje zastosowanie ultrawydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu z hybrydową spektrometrią mas kwadrupolowo-Orbitrap o wysokiej rozdzielczości (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), połączoną z farmakologią sieciową i dokowaniem molekularnym, w celu przewidywania i walidacji podstaw materialnych wzoru Yiqi Qingjie (YQQJ) w leczeniu nefropatii IgA (IgAN).

Wyjaśnienie materialnych podstaw formuły Yiqi Qingjie wobec nefropatii IgA z wykorzystaniem UHPLC-Q-Orbitrap HRMS zintegrowanego z farmakologią sieciową

Lewatywa to rodzaj terapii tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) stosowanej w leczeniu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP). Terapia polega na wkraplaniu płynu TCM do odbytnicy i okrężnicy przez odbyt, aby utrzymać płyn w jelicie, wchłaniając się przez błonę śluzową jelit. Badanie to ma na celu standaryzację procedury lewatywy dla pacjentów z SAP.

Lewatywa Tradycyjnej Medycyny Chińskiej dla pacjentów z ciężkim ostrym zapaleniem trzustki

W tym badaniu przedstawiono szereg metod przygotowania próbek DESI-MSI z roślin, a procedura instalacji montażu DESI, pozyskiwania i przetwarzania danych MSI jest szczegółowo opisana. Protokół ten może być stosowany w kilku warunkach do pozyskiwania informacji o metabolomie przestrzennym u roślin.

Wizualizacja metabolitów zidentyfikowanych w metabolomie przestrzennym tradycyjnej medycyny chińskiej przy użyciu DESI-MSI

Odkryj metody molekularnego dokowania i sondy deubikwitynacji do identyfikacji inhibitorów UCHL3 z tradycyjnej medycyny chińskiej. Poznaj zastosowanie bioinformatyki w badaniach farmakologicznych związków naturalnych.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej (Wideo) | JoVE Journal

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Przeglądaj więcej filmów