Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Zakres naszych badań koncentruje się głównie na rozwoju ludzkich komórek iPSC CAR NK o ulepszonej aktywności przeciwnowotworowej i trwałości in vivo, aby lepiej leczyć różne nowotwory. Dzięki temu nowatorskiemu protokołowi generowania CAR iPSC NK staramy się odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób komórki te mogą przezwyciężyć oporność guza na mikro środowisko i poprawić skuteczność oraz zapewnić bezpieczną i skalowalną produkcję. Główne wyzwania eksperymentalne związane z opracowaniem komórek CAR NK pochodzących z iPSC obejmują osiągnięcie spójnego i skutecznego różnicowania iPSC w funkcjonalne w przypadkach, zapewniając stabilną ekspresję CAR bez żadnych działań niepożądanych i poprawiając trwałość in vivo.

Ponadto naukowcy stoją przed wyzwaniami związanymi ze skalowalnością, odrzuceniem immunologicznym i uchwytami regulatorowymi do zastosowań klinicznych. Znacząco posunęliśmy naprzód badania nad komórkami CAR NK pochodzącymi z iPSC, ustanawiając wydajną, niewirusową integrację genów CAR za pomocą modyfikacji genów opartych na transpozonach. Dodatkowo zoptymalizowaliśmy CRISPR-Cas9 na poziomie iPSC, aby usunąć immunologiczne punkty kontrolne, czynniki TMA w celu poprawy i przypadków komórek i skuteczności guza oraz trwałości in vivo w modelach guzów litych.

Dzięki naszemu protokołowi wykorzystującemu niewirusową ekspresję genu CAR za pośrednictwem wektora piggyback, mamy na celu wypełnienie luki w opracowaniu bezpiecznej, wydajnej i skalowalnej modyfikacji genów dla komórek iPSC CAR NK, metoda ta zmniejsza ryzyko mutagenezy insercyjnej, zwiększa odtwarzalność i opłacalność generowania komórek CAR NK do immunoterapii nowotworów. W przyszłości nasze laboratorium skupi się na rozwoju nowatorskich zmodyfikowanych komórek NK pochodzących z iPSC, ukierunkowanych na immunologiczne punkty kontrolne. Będziemy również badać celowanie w różne mikroczynniki środowiskowe guza za pomocą przeciwciał bispecyficznych lub trójspecyficznych w celu zwiększenia swoistości in vivo, trwałości i aktywności przeciwnowotworowej.

Aby rozpocząć przejście tworzenia ciała zarodka wirowego lub EB, około 200 000 zmodyfikowanych iPSC CAR na studzienkę w sześciodołkowej wstępnie zakodowanej płytce z matrycą błony podstawnej zawierającej nadwyżkę MT, inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, po dwóch dniach usunąć pożywkę hodowlaną i odłączyć komórki, inkubując z jednym mililitrem wstępnie ogrzanego TrypLE Select w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie ostrożnie rozdziel agregaty komórkowe na zawiesinę pojedynczej komórki i przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj trzy mililitry PBS, aby zatrzymać reakcję dysocjacji.

Następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce MK SR-plus i przefiltrować je przez sitko o średnicy 70 mikrometrów w celu usunięcia agregatów. Odwirować komórki. Przemyj granulki pięcioma mililitrami PBS, a następnie ponownie zawiesij je w jednym mililitrze pożywki formującej EB.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do odpowiedniej gęstości za pomocą pożywki do tworzenia EB zawierającej cytokiny i 10 mikromolowy inhibitor ROCK. Za pomocą wielokanałowej pipety nasiać od 3000 do 10 000 komórek na dołek w 100 mikrolitrach pożywki EB na płytce 96-dołkowej. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć dni.

Aby sprawdzić jakość ciała zarodka, najpierw przygotuj cztery mililitry wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny z 0,4% surowicy kurczaka w celu dysocjacji EB. po sześciu dniach przenieś 10 do 30 EB do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj roztwór surowicy kurczaka trypsyny do EB i inkubuj je w łaźni wodnej.

Wirowanie EB podczas dysocjacji co trzy do pięciu minut przez 10 minut. Odpipetować trypsynizowane EB, mieszając kilkakrotnie w górę iw dół, aby zapewnić dokładną dysocjację. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS, aby zatrzymać proces trypsynizacji.

Przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej stożkowej rurki. Następnie odwiruj komórki o sile 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w trzech do pięciu mililitrach świeżej pożywki EB. Po zliczeniu wybarwić komórki typowymi markerami EB.

Dodać zalecaną objętość przeciwciał do każdej probówki zawierającej zdysocjowane pojedyncze komórki EB w 100 mikrolitrach buforu przepływowego i inkubować na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji dwukrotnie przemyć komórki buforem przepływowym. Dodaj niebieską żywą martwą plamę SYTOX i przeanalizuj za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Zacznij od zakodowania każdej studzienki sześciodołkowej płytki pięcioma do 10 mikrolitrami 2% sterylizowanego roztworu żelatyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji odessać pozostały roztwór żelatyny i dodać trzy mililitry pożywki do różnicowania metodą natural killer lub pożywki różnicującej NK zawierającej cytokiny do każdej studzienki pokrytej żelatyną płytki sześciodołkowej.

Następnie, za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, ostrożnie przenieś spinowe EB pochodzące z zaprojektowanych iPSC CAR do 10-centymetrowej szalki. Dodaj trzy mililitry pożywki różnicującej NK zawierającej cytokiny do każdego dołka z sześciodołkowej płytki. Za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra rozprowadza od 16 do 20 EB w każdym dołku sześciodołkowej płytki i inkubuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech tygodni.

Po inkubacji ocenić ekspresję markerów komórek NK CD45 dodatnich i CD56 dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej na komórkach zawiesinowych. Gdy ponad 80% komórek zawiesiny wyraża CD45 dodatnie i CD56-dodatnie. Zbierz komórki, przepuszczając je przez filtr o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć grudki.

Przed wspólną hodowlą sztucznych komórek prezentujących antygen lub sztucznych APC w komórkach NK należy napromieniować sztuczne APC 100 szarymi i zachować je jako zamrożone łodygi. Po zebraniu komórek NK hoduj je w gęstości pięć razy 10 do mocy pięciu komórek na mililitr w pożywce ekspansyjnej NK uzupełnionej 50 jednostkami na mililitr interleukiny-2 i interleukiny-15. Dodać napromieniowane sztuczne APC do komórek NK w stosunku jeden do jednego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Aby rozpocząć, włącz cytometr przepływowy. Oceń ekspresję receptora aktywacji NK na komórkach NK pochodzących z anty GPC3 CAR iPSC, aby określić aktywność komórek przypadku samochodu i stan dojrzewania. Do testów kaspazy-3/7.

Policz komórki docelowe w komórkach NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC i wstępnie wybarwić je barwnikiem CellTrace Violet o końcowym stężeniu pięciu mikromolów w PBS pod ochroną świetlną przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj wybarwione komórki docelowe w kompletnej pożywce hodowlanej Przed jednoczesną hodowlą z CAR iPSC uzyskano komórki NK w różnych proporcjach efektorowych do docelowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech godzinach i 30 minutach wspólnej hodowli.

Dodaj zielony odczynnik do wykrywania kaspazy-3/7 i inkubuj przez kolejne 30 minut. Dodaj roztwór do barwienia martwych komórek SYTOX podczas ostatnich pięciu minut barwienia i delikatnie wymieszaj. Przeanalizuj wybarwione komórki za pomocą cytometrii przepływowej.

Powstawanie spinowych EB z IPC zaprojektowanych przez GPC3 CAR zaobserwowano szóstego dnia. Potwierdzenie wczesnego różnicowania. Zróżnicowane komórki NK lub NK z GPC3 CAR IPC wykazywały odrębną morfologię na różnych etapach od trzeciego dnia do 28 dnia.

Analiza cytometrii przepływowej wykazuje ekspresję antygenów krwiotwórczych CD34 i CD31, a także niewielką ilość CD43, ale jeszcze nie wykazującą ekspresji CD45 zarówno w pinie EB iPSC typu dzikiego, jak i GPC3 CAR w szóstym dniu. W tym przypadku specyficzne markery wykryto w dojrzałym typie dzikim w komórkach NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC w 35 dniu. Potwierdzenie pomyślnego różnicowania się w komórki NK.

Rozszerzone komórki NK pochodzące z iPSC typu dzikiego i anty GPC3 CAR iPSC wykazywały różne markery aktywacji, wykazując dojrzewanie komórek NK. Ekspresję antygenu GPC3 potwierdzono na liniach komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej, potwierdzając docelową swoistość dla komórek NK pochodzących z anty GPC3 CAR iPSC. Komórki NK pochodzące z anty GPC3 CAR iPSC wykazywały wyższą aktywność cytotoksyczną wobec linii komórkowych GKC3 eksprymujących HepG2, SNU-449, CAL 27 i SKOV3 w porównaniu z komórkami NK iPSC typu dzikiego.