Name: Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metodę generowania komórek NK z receptorem chimerycznym z iPSC w celu immunoterapii przeciwnowotworowej. Protokół obejmuje niwiralną integrację genu CAR i optymalizację różnicowania dla zwiększenia aktywności antynowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Kaufmana za wsparcie, naukowe spostrzeżenia i dyskusje. Badania te były wspierane przez granty NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (suplement administracyjny) oraz Sanford Stem Cell Institute na UCSD. JT: pisanie i korekta manuskryptu. DSK: zrecenzował i zredagował manuskrypt.

DSK jest współzałożycielem i doradcą Shoreline Biosciences i posiada udziały w spółce. DSK doradza również firmom Therabest i RedC Bio, z których tytułu otrzymuje dochody i/lub kapitał własny. Warunki tych ustaleń zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten przedstawia ustandaryzowane i powtarzalne podejście do generowania komórek NK pochodzących z iPSC z ekspresją CAR ze spójnego źródła komórkowego, mające na celu ułatwienie ukierunkowanej "gotowej" immunoterapii nowotworów. Liczne badania przedkliniczne i kliniczne wykazały skuteczność adoptywnej immunoterapii opartej na komórkach NK w leczeniu nowotworów przy jednoczesnej minimalizacji toksyczności, takiej jak choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) lub zespół uwalniania cytokin (CRS)<sup class="xre...

Komórki NK, rodzaj limfocytów w obrębie wrodzonego układu odpornościowego, odgrywają kluczową rolę we wczesnej obronie przed nowotworami i komórkami zakażonymi wirusem1,2,3. W przeciwieństwie do limfocytów T, komórki NK nie wymagają prezentacji antygenu za pomocą cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Zamiast tego komórki NK mają repertuar receptorów aktywujących i hamujących, które regulują ich aktywność3. Aktywność cytotoksyczna za pośrednictwem komórek NK wykorzystuje różne mechanizmy, w tym uwalnianie perforyny i granzymów, angażowanie receptorów śmierci i wytwarzanie cytokin prozapalnych, takich jak IFN-γ i TNF-α. Ten unikalny sposób działania pozycjonuje komórki NK jako atrakcyjnego kandydata do immunoterapii nowotworów, szczególnie w leczeniu nowotworów litych, w których unikanie odpowiedzi immunologicznej jest istotną przeszkodą1,2,3,4.
Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych form raka wątroby na świecie5. Tradycyjne podejścia terapeutyczne, w tym chirurgia, chemioterapia i radioterapia, zazwyczaj zapewniają ograniczone korzyści kliniczne i skutkują wysokimi wskaźnikami nawrotów6,7. Ostatnie postępy w immunoterapii i terapii celowanej znacząco wpłynęły na leczenie HCC8,9. Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak niwolumab i pembrolizumab, wykazały obiecujące wyniki, wzmacniając odpowiedź komórek odpornościowych przeciwko komórkom nowotworowym10,11. Terapie te doprowadziły do poprawy wskaźników przeżycia i lepszej jakości życia niektórych pacjentów. Mogą jednak również powodować działania niepożądane związane z odpornością, co może ograniczać ich stosowanie u niektórych pacjentów12. Terapie celowane, takie jak sorafenib i lenwatynib, w szczególności hamują szlaki promujące wzrost komórek nowotworowych i angiogenezę13. Terapie te mają znaną skuteczność w kontrolowaniu postępu choroby i przedłużaniu przeżycia8,14. Niemniej jednak, oporność na terapie celowane zwykle się rozwija, a skutki uboczne leczenia są powszechne15,16. Wśród obiecujących kierunków w strategiach immunoterapeutycznych nowotworów, pojawienie się limfocytów T CAR z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) zrewolucjonizowało leczenie nowotworów, zwłaszcza w leczeniu nowotworów hematologicznych, takich jak chłoniak i szpiczak mnogi17,18,19.
Komórki NK wykazujące ekspresję CAR, łączące wrodzoną aktywność cytotoksyczną komórek NK z precyzyjnym celowaniem technologii CAR, reprezentują innowacyjne i potencjalnie transformacyjne podejście do guzów litych, takich jak HCC20,21,22,23,24. Komórki zmodyfikowane przez CAR mogą specyficznie rozpoznawać i zabijać komórki nowotworowe wyrażające docelowy antygen, oszczędzając normalne tkanki, zmniejszając w ten sposób ryzyko wystąpienia efektów niepożądanych związanych z konwencjonalnymi terapiami25,26,27. Komórki CAR-NK wytworzone z komórek NK wyizolowanych z krwi obwodowej lub krwi pępowinowej są zwykle wytwarzane przez transdukcję komórek NK za pomocą konstruktów CAR, które składają się z zewnątrzkomórkowej domeny rozpoznawania antygenu, domeny transbłonowej i wewnątrzkomórkowych domen sygnalizacyjnych niezbędnych do aktywacji i proliferacji28,29,30.
Wyzwanie polegające na stworzeniu stabilnej i jednorodnej populacji funkcjonalnie zmodyfikowanych komórek NK do leczenia klinicznego można rozwiązać poprzez zastosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)31,32. Inżynieria ludzkich iPSC z CAR zoptymalizowanymi pod kątem komórek NK zapewnia ulepszony sygnał aktywacji i proliferacji komórek NK oraz zapewnia niewyczerpaną i jednorodną populację komórek NK wykazujących ekspresję CAR jako standaryzowaną, "gotową terapię"20,33. W tym protokole genetyczna modyfikacja iPSC w celu wytworzenia komórek NK pochodzących z iPSC wykazujących ekspresję CAR polega na integracji zoptymalizowanego konstruktu CAR komórki NK, który obejmuje domeny transbłonowe i sygnałowe pochodzące z komórek NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) oraz scFv anty-glipikan-3 (GPC3), jak opisano w naszych poprzednich badaniach23. Genetycznie zmodyfikowane iPSC są następnie różnicowane i namnażane za pomocą opracowanego wcześniej protokołu różnicowania komórek NK34. Te zmodyfikowane komórki NK pochodzące z iPSC wykazujące ekspresję CAR mają zdolność rozpoznawania i eliminowania HCC i innych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję specyficznych antygenów związanych z nowotworem, takich jak Glypican 3 (GPC3), który ulega nadekspresji w HCC i innych nowotworach złośliwych35,36,37,38.
Zastosowanie komórek CAR-NK pochodzących z iPSC do leczenia różnych nowotworów jest bardzo obiecujące30,39,40; wiele z tych komórek CAR-NK pochodzących z iPSC jest obecnie w fazie badań klinicznych41,42,43. Aby ułatwić postęp w tej dziedzinie, protokół ten umożliwia wydajną produkcję zmodyfikowanych komórek CAR-NK pochodzących z iPSC, od inżynierii komórkowej po różnicowanie do dojrzałych komórek NK i ekspansję in vitro.

<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>Dziekan A. Lee lab&nbsp;</td><td>Pożywka hodowlana N/A</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Kot#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-DYKDDDDK (znacznik FLAGA)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Kot#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-anty-ludzki TRA-1-81&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD Nauki biologiczne&nbsp;</td><td>Nr kat.#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD Nauki biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania zielonego CellEvent Caspase-3/7&nbsp;</td><td>Rybak termiczny&nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Zestaw do proliferacji fioletowych komórek&nbsp;</td><td>Rybak termiczny&nbsp;</td><td>Kot#C34571</td><td>Barwnik fluorescencyjny do śledzenia komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie CryoStor&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>Pożywka do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander Medium</td><td>Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich komórek NK EasySep&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Kot#19055</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Kategoria# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kat#555888</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#555029</td><td></td></tr><tr><td>GolgiStop&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza F-12 szynki, suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>surowica dla koni&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Kot#16050130</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie Surowica&nbsp;</td><td>AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td> Zestaw Nucleofector" <td></td></tr><tr><td>z ludzkich komórek macierzystych&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>Kot# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek: Komórki HePG2&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Kot#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek: komórki HePG2-td-pomidora-luca&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek: komórki iPS&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek: Ogniwa SNU-449&nbsp;</td><td>Kot ATCC</td><td># CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek: SNU-449-td-tomato-luc cells&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A IncuCyte</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3/7 Test zielonej apoptozy&nbsp;</td><td>Essenbioscience&nbsp;</td><td>Kat#4440</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; Surowica ludzka, typ AB</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NovoExpress&nbsp;</td><td>ACEA Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 przeciwciało anty-ludzkie SSEA-4&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD Nauki biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>Kot BioLegend</td><td># 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ligand PE-FAS&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>Kat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD Nauki biologiczne&nbsp;</td><td>Nr kat.#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obwodowa krwioodporna sierść kożuchowa&nbsp;</td><td>Bank Krwi w San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td>Nie dotyczy szlaku</td><td></td></tr><tr><td>PE&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>Kot#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>Laboratorium Branden Moriarity&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pMAX-GFP</td><td>Lonza N</td><td>/A</td><td>GFP kontrola pozytywna&nbsp;</td></tr><tr><td>Pryzmat 9</td><td>Graphpad&nbsp;</td><td>Wersja 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki bFGF podstawowy&nbsp;</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>Kot#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek BMP-4&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki ligand FLT-3&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-15&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-3&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek IL-7&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko węzłowe</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>Kot#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek SCF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-&beta; 1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki VEGF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td> RPMI1640 Gibco 11875093 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>5270</td><td>EB Podłoże formacyjne</td></tr><tr><td>STEMdiff APEL2 Średnie&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac Wektor ekspresji transpozazy</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADzaawansowany zestaw do barwienia martwych komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Zestaw roztworu do barwienia martwych komórek</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach nk wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Komórki NK to wrodzone komórki odpornościowe, które odgrywają kluczową rolę w obronie organizmu przed nowotworami i infekcjami wirusowymi. Wytwarzanie ludzkiego indukowanego pluripotencjalnego receptora antygenu macierzystego (CAR) pochodzącego z chimerycznego receptora antygenowego (CAR) eksprymującego komórki NK okazało się obiecującą drogą dla "gotowej" immunoterapii nowotworów. W tym przypadku wykorzystaliśmy zoptymalizowany pod kątem komórek NK konstrukt CAR, który obejmuje domenę transbłonową NKG2D, domenę kostymulującą 2B4 i domenę sygnalizacyjną CD3ζ, która, jak wykazano, stymuluje silną aktywność przeciwnowotworową za pośrednictwem komórek NK specyficznych dla antygenu. Zastosowanie iPSC do generowania komórek CAR NK ma kilka zalet, w tym jednorodną ekspresję CAR, skalowalność, odtwarzalność i potencjał do zastosowań klinicznych. Ten szczegółowy protokół krok po kroku od inżynierii komórkowej do różnicowania umożliwia generowanie komórek NK zoptymalizowanych pod kątem komórek NK, pochodzących z iPSC, eksprymujących CAR, zapewniając standaryzowaną i celowaną immunoterapię nowotworów o ulepszonej aktywności przeciwnowotworowej i podkreślając ich potencjał jako obiecującej opcji leczenia różnych nowotworów złośliwych.

Schemat różnicowania i ekspansji komórek NK pochodzących z iPSC z przeciwciałem CAR przeciwko GPC3 
Schemat przedstawia różnicowanie in vitro zmodyfikowanych komórek NK z przeciwciałem CAR przeciwko GPC3, pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs), oraz schematyczną reprezentację wektora piggyBac niosącego konstrukt CAR GPC3. Początkowo niezmodyfikowane iPSCs są transfekowane wektorem piggyBac kodującym CAR GPC3 (chimeryczny receptor antygenowy). Po ...

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

Zakres naszych badań koncentruje się głównie na rozwoju ludzkich komórek iPSC CAR NK o ulepszonej aktywności przeciwnowotworowej i trwałości in vivo, aby lepiej leczyć różne nowotwory. Dzięki temu nowatorskiemu protokołowi generowania CAR iPSC NK staramy się odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób komórki te mogą przezwyciężyć oporność guza na mikro środowisko i poprawić skuteczność oraz zapewnić bezpieczną i skalowalną produkcję. Główne wyzwania eksperymentalne związane z opracowaniem komórek CAR NK pochodzących z iPSC obejmują osiągnięcie spójnego i skutecznego różnicowania iPSC w funkcjonalne w przypadkach, zapewniając stabilną ekspresję CAR bez żadnych działań niepożądanych i poprawiając trwałość in vivo.Ponadto naukowcy stoją przed wyzwaniami związanymi ze skalowalnością, odrzuceniem immunologicznym i uchwytami regulatorowymi do zastosowań klinicznych. Znacząco posunęliśmy naprzód badania nad komórkami CAR NK pochodzącymi z iPSC, ustanawiając wydajną, niewirusową integrację genów CAR za pomocą modyfikacji genów opartych na transpozonach. Dodatkowo zoptymalizowaliśmy CRISPR-Cas9 na poziomie iPSC, aby usunąć immunologiczne punkty kontrolne, czynniki TMA w celu poprawy i przypadków komórek i skuteczności guza oraz trwałości in vivo w modelach guzów litych.Dzięki naszemu protokołowi wykorzystującemu niewirusową ekspresję genu CAR za pośrednictwem wektora piggyback, mamy na celu wypełnienie luki w opracowaniu bezpiecznej, wydajnej i skalowalnej modyfikacji genów dla komórek iPSC CAR NK, metoda ta zmniejsza ryzyko mutagenezy insercyjnej, zwiększa odtwarzalność i opłacalność generowania komórek CAR NK do immunoterapii nowotworów. W przyszłości nasze laboratorium skupi się na rozwoju nowatorskich zmodyfikowanych komórek NK pochodzących z iPSC, ukierunkowanych na immunologiczne punkty kontrolne. Będziemy również badać celowanie w różne mikroczynniki środowiskowe guza za pomocą przeciwciał bispecyficznych lub trójspecyficznych w celu zwiększenia swoistości in vivo, trwałości i aktywności przeciwnowotworowej.Aby rozpocząć przejście tworzenia ciała zarodka wirowego lub EB, około 200 000 zmodyfikowanych iPSC CAR na studzienkę w sześciodołkowej wstępnie zakodowanej płytce z matrycą błony podstawnej zawierającej nadwyżkę MT, inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, po dwóch dniach usunąć pożywkę hodowlaną i odłączyć komórki, inkubując z jednym mililitrem wstępnie ogrzanego TrypLE Select w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie ostrożnie rozdziel agregaty komórkowe na zawiesinę pojedynczej komórki i przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj trzy mililitry PBS, aby zatrzymać reakcję dysocjacji.Następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce MK SR-plus i przefiltrować je przez sitko o średnicy 70 mikrometrów w celu usunięcia agregatów. Odwirować komórki. Przemyj granulki pięcioma mililitrami PBS, a następnie ponownie zawiesij je w jednym mililitrze pożywki formującej EB.Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do odpowiedniej gęstości za pomocą pożywki do tworzenia EB zawierającej cytokiny i 10 mikromolowy inhibitor ROCK. Za pomocą wielokanałowej pipety nasiać od 3000 do 10 000 komórek na dołek w 100 mikrolitrach pożywki EB na płytce 96-dołkowej. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć dni.Aby sprawdzić jakość ciała zarodka, najpierw przygotuj cztery mililitry wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny z 0,4% surowicy kurczaka w celu dysocjacji EB. po sześciu dniach przenieś 10 do 30 EB do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj roztwór surowicy kurczaka trypsyny do EB i inkubuj je w łaźni wodnej.Wirowanie EB podczas dysocjacji co trzy do pięciu minut przez 10 minut. Odpipetować trypsynizowane EB, mieszając kilkakrotnie w górę iw dół, aby zapewnić dokładną dysocjację. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS, aby zatrzymać proces trypsynizacji.Przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej stożkowej rurki. Następnie odwiruj komórki o sile 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w trzech do pięciu mililitrach świeżej pożywki EB. Po zliczeniu wybarwić komórki typowymi markerami EB.Dodać zalecaną objętość przeciwciał do każdej probówki zawierającej zdysocjowane pojedyncze komórki EB w 100 mikrolitrach buforu przepływowego i inkubować na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji dwukrotnie przemyć komórki buforem przepływowym. Dodaj niebieską żywą martwą plamę SYTOX i przeanalizuj za pomocą analizy cytometrii przepływowej.Zacznij od zakodowania każdej studzienki sześciodołkowej płytki pięcioma do 10 mikrolitrami 2% sterylizowanego roztworu żelatyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji odessać pozostały roztwór żelatyny i dodać trzy mililitry pożywki do różnicowania metodą natural killer lub pożywki różnicującej NK zawierającej cytokiny do każdej studzienki pokrytej żelatyną płytki sześciodołkowej.Następnie, za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, ostrożnie przenieś spinowe EB pochodzące z zaprojektowanych iPSC CAR do 10-centymetrowej szalki. Dodaj trzy mililitry pożywki różnicującej NK zawierającej cytokiny do każdego dołka z sześciodołkowej płytki. Za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra rozprowadza od 16 do 20 EB w każdym dołku sześciodołkowej płytki i inkubuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech tygodni.Po inkubacji ocenić ekspresję markerów komórek NK CD45 dodatnich i CD56 dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej na komórkach zawiesinowych. Gdy ponad 80% komórek zawiesiny wyraża CD45 dodatnie i CD56-dodatnie. Zbierz komórki, przepuszczając je przez filtr o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć grudki.Przed wspólną hodowlą sztucznych komórek prezentujących antygen lub sztucznych APC w komórkach NK należy napromieniować sztuczne APC 100 szarymi i zachować je jako zamrożone łodygi. Po zebraniu komórek NK hoduj je w gęstości pięć razy 10 do mocy pięciu komórek na mililitr w pożywce ekspansyjnej NK uzupełnionej 50 jednostkami na mililitr interleukiny-2 i interleukiny-15. Dodać napromieniowane sztuczne APC do komórek NK w stosunku jeden do jednego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Aby rozpocząć, włącz cytometr przepływowy. Oceń ekspresję receptora aktywacji NK na komórkach NK pochodzących z anty GPC3 CAR iPSC, aby określić aktywność komórek przypadku samochodu i stan dojrzewania. Do testów kaspazy-3/7.Policz komórki docelowe w komórkach NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC i wstępnie wybarwić je barwnikiem CellTrace Violet o końcowym stężeniu pięciu mikromolów w PBS pod ochroną świetlną przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj wybarwione komórki docelowe w kompletnej pożywce hodowlanej Przed jednoczesną hodowlą z CAR iPSC uzyskano komórki NK w różnych proporcjach efektorowych do docelowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech godzinach i 30 minutach wspólnej hodowli.Dodaj zielony odczynnik do wykrywania kaspazy-3/7 i inkubuj przez kolejne 30 minut. Dodaj roztwór do barwienia martwych komórek SYTOX podczas ostatnich pięciu minut barwienia i delikatnie wymieszaj. Przeanalizuj wybarwione komórki za pomocą cytometrii przepływowej.Powstawanie spinowych EB z IPC zaprojektowanych przez GPC3 CAR zaobserwowano szóstego dnia. Potwierdzenie wczesnego różnicowania. Zróżnicowane komórki NK lub NK z GPC3 CAR IPC wykazywały odrębną morfologię na różnych etapach od trzeciego dnia do 28 dnia.Analiza cytometrii przepływowej wykazuje ekspresję antygenów krwiotwórczych CD34 i CD31, a także niewielką ilość CD43, ale jeszcze nie wykazującą ekspresji CD45 zarówno w pinie EB iPSC typu dzikiego, jak i GPC3 CAR w szóstym dniu. W tym przypadku specyficzne markery wykryto w dojrzałym typie dzikim w komórkach NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC w 35 dniu. Potwierdzenie pomyślnego różnicowania się w komórki NK.Rozszerzone komórki NK pochodzące z iPSC typu dzikiego i anty GPC3 CAR iPSC wykazywały różne markery aktywacji, wykazując dojrzewanie komórek NK. Ekspresję antygenu GPC3 potwierdzono na liniach komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej, potwierdzając docelową swoistość dla komórek NK pochodzących z anty GPC3 CAR iPSC. Komórki NK pochodzące z anty GPC3 CAR iPSC wykazywały wyższą aktywność cytotoksyczną wobec linii komórkowych GKC3 eksprymujących HepG2, SNU-449, CAL 27 i SKOV3 w porównaniu z komórkami NK iPSC typu dzikiego.

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Przedstawiamy protokół transfekcji do produkcji komórek CAR-NK (chimeryczny receptor antygenu i naturalnego zabójcy) ukierunkowanych na patogeny grzybowe za pomocą niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny. Aby ocenić aktywację specyficzną dla antygenu, przeprowadziliśmy wspólną hodowlę zmodyfikowanych komórek z probówkami rozrodczymi Aspergillus fumigatus i zmierzyliśmy wydzielanie IFN-γ.

Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę generowania komórek NK z receptorem chimerycznym z iPSC w celu immunoterapii przeciwnowotworowej. Protokół obejmuje niwiralną integrację genu CAR i optymalizację różnicowania dla zwiększenia aktywności antynowotworowej.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego (Wideo) | JoVE Journal

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Przeglądaj więcej filmów