Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

W tym badaniu chcemy zbadać, czy komora o małej objętości skalibrowana do 0,5 mililitra może być używana w testach respirometrycznych bez uszczerbku dla dokładności uzyskanej dla klasycznej objętości dwóch mililitrów na platformie Oroboros.

Opracowanie komory o małej objętości i ocena za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości z rygorystyczną kontrolą jakości przy użyciu precyzyjnej analizy OXPHOS utorowały drogę do rozwoju, nowych innowacji, czyli po pierwsze, 12-komorowego respirometru O2k, po drugie, robota do automatycznego miareczkowania substancji w złożonych protokołach stosowanych do analizy OXPHOS. Zastosowania te będą miały kluczowe znaczenie w dalszym rozwoju w kierunku analizy mitochondrialnej, diagnostyki chorób mitochondrialnych, oceny opracowywanych leków, koncentrując się zarówno na korzyściach płynących z leków dla funkcji mitochondriów, jak i na efektach niedocelowych, które mimowolnie zakłócają funkcję mitochondriów. Kiedy mój zespół opracował respirometrię o wysokiej rozdzielczości ponad 30 lat temu, istniał paradygmat, że mitochondria, mitochondria, mitochondria. Może była różnica między mitochondriami mięśni i wątroby, ale to było to. Nikt tak naprawdę nie interesował się mitochondriami poza tymi paradygmatami. Dzięki naszym protokołom opracowanym do respirometrii o wysokiej rozdzielczości wykazaliśmy ogromną różnorodność funkcji mitochondriów. To pozwala nam ocenić mitochondrialną kontrolę oddechową w różnych typach komórek, tkankach i gatunkach z nowym okiem. Przez 30 lat temu było około 10 publikacji, które to doceniały. Obecnie mamy w naszym instrumencie ponad 1500 urządzeń korzystających z tych protokołów.

W komorze o małej objętości potrzeba czterokrotnie mniej próbki w porównaniu z klasyczną komorą o pojemności dwóch mililitrów. W przypadku próbki o niskiej częstości oddechów, ta sama ilość próbki może być użyta do zwiększenia objętościowych strumieni tlenu w celu zmniejszenia niepewności pomiaru.

Nasza praca w Laboratorium Badawczo-Rozwojowym Oroboros koncentruje się na połączeniu rozwoju instrumentalnego i badań akademickich. Oceniamy mitochondrialną funkcję oddechową i profilowanie biogenetyczne za pomocą analizy wielosensorowej. Polega to na pomiarze oddychania, potencjałów redoks, potencjału błonowego, wychwytu wapnia, produkcji nadtlenku wodoru i różnych innych parametrów, które pozwalają nam uzyskać głębszy wgląd w profil biogenetyczny oraz funkcję i dysfunkcję mitochondriów.

[Narrator] Aby rozpocząć, zamontuj Małą Objętość lub komorę SV na Oroborosie. Następnie włącz Oroboros i kliknij Połącz, aby połączyć Oroboros z oprogramowaniem DatLab. Po całkowitym wysuszeniu komór za pomocą pipety dodaj 0,54 mililitra wody do komory SV. Następnie włącz mieszadła. Przed zamknięciem komory należy zwilżyć O-ringi korków, utrzymując kapilarnę w suchości. Poluzuj pierścień kalibracji objętości, a następnie włóż korek w dół, aż płyn wypełni kapilar korka i menisk utworzy się w pojemniku na górnym końcu kapilary. Dokręć pierścień kalibracji objętości, aby zabezpieczyć jego pozycję, zapewniając skalibrowaną spójność objętości dla kolejnych włożeni. Aby rozpocząć, napełnij komory medium oddechowym MiR05 Uruchom oprogramowanie DatLab. Wybierz odpowiedni protokół dla instrumentalnego testu tła. Ustaw prędkość obrotową mieszania na 550 obr./min, objętość komory na 0,5 mililitra, interwał zapisu danych na dwie sekundy, a temperaturę eksperymentalną na 37 stopni Celsjusza. Uruchom test mieszadła i kalibrację powietrza. Ustaw znak R1 na wykresie stężenia tlenu, przesuwając kursor przytrzymując Shift. Od czasu do czasu przeprowadzaj kalibracje tlenu zerowego. Podczas kalibracji powietrza należy przygotować świeży roztwór podstawowy ditionianu sodu, rozpuszczając proszek O2-Zero w 50-milimolowym buforze fosforanowym do stężenia 2,5 milimolowego dla SV. Po zakończeniu kalibracji powietrza zamknij komorę. Monitoruj sygnał tlenu przez około 60 do 120 minut, pozwalając na zmniejszenie stężenia tlenu od nasycenia powietrzem do około 150 mikromolowych. Ustaw cztery znaczniki oznaczone od J01 do J04 na wykresie ujemnym nachylenia tlenu. Opcjonalnie, za pomocą strzykawki Hamiltona, miareczkować roztwór ditionianu sodu, aby dostosować stężenie tlenu do 100 mikromolów i ustawić znak J05. Aby obliczyć instrumentalne nachylenie tła tlenu w DatLab, wybierz Nachylenie strumienia. Następnie otwórz okno korekcji tła tlenu i wybierz Aktywny plik jako źródło danych tła tlenu. Sprawdź, czy wszystkie znaki J0 są używane do obliczania regresji liniowej. Następnie kliknij Zastosuj, aby uzyskać korekcję tła tlenu. Na początek umyj komory Oroborosa wodą dejonizowaną i dodaj do komory świeżą pożywkę MiR05. Po instrumentalnym teście tła otwórz nową zakładkę DatLab i wybierz protokół SUIT-003 do eksperymentów z ludzkimi płytkami krwi. Korzystając z przeglądu protokołu DatLab, który pojawia się na pasku bocznym Protokół, wybierz podstawowe roztwory chemiczne. Następnie wybierz strzykawki Hamilton zgodnie z chemikaliami. Umieścić strzykawki na stojaku na strzykawki z etykietami w kolejności zgodnej z protokołem SUIT. W celu częściowej wymiany objętości należy obliczyć objętość V jako równoważną objętości V usuniętej z rzeczywistej objętości w otwartej komorze, biorąc pod uwagę martwą objętość kapilarną. Następnie wyjmij całkowicie włożony korek i umieść go na stojaku. Usunąć obliczoną objętość V z MiR05 z komory w oparciu o typ komórki i stężenie zawiesiny komórek podstawowych. Teraz należy odpipetować do komory równoważną objętość zawiesiny komórek podstawowych o znanym stężeniu komórek. W przeciwieństwie do tego, aby całkowicie wymienić objętość, należy odsysać całe medium z komory. Dodaj 0,54 mililitra zapasu izolowanych mitochondriów serca do komory SV. Zamknąć komorę i odsysać nadmiar roztworu próbki z pojemnika z korkiem. Aby uruchomić protokół miareczkowania inhibitora rozprzęgania substratu (SUIT), otwórz okno Zdarzenie w DatLab, aby zobrazować objętości miareczkowania. Za pomocą mikrostrzykawki Hamilton miareczkować podstawowe roztwory chemiczne do komory. Następnie ustaw zdarzenie w DatLab. Pozostawić do ustabilizowania strumienia po miareczkowaniu. W celu analizy danych należy ustawić znak na reprezentatywnej i stabilnej części działki. Strumień tlenu tła przy nasyceniu powietrza był 3,9 razy wyższy w komorze o pojemności 0,5 mililitra w porównaniu z komorą o pojemności 2,0 mililitra, co jest zgodne z teoretycznie oczekiwaną czterokrotną różnicą w objętościowym strumieniu tlenu tła właściwego. Zmienność instrumentalnych strumieni tła była niemal identyczna w obu tomach komorowych. Częstość oddechów żywych płytek krwi, przepuszczalnych fibroblastów i izolowanych mitochondriów była ściśle skorelowana w obu typach komór, gdy zastosowano odpowiednią korekcję tła. Strumień tlenu ustabilizował się szybciej w komorze dwumililitrowej niż w komorze 0,5 mililitra po ponownym natlenieniu. Szczątkowe zużycie tlenu po zahamowaniu kompleksu III było spójne między dwiema komorami, dostosowując się do instrumentalnej granicy wykrywalności.