Name: Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj respirometrię wysokorozdzielczą w małej komorze 0,5 mL do analizy funkcji mitochondrialnych. Ta metoda zapewnia dokładne pomiary przy czterokrotnie mniejszej objętości próbki, wspierając badania nad chorobami mitochondrialnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Manueli Passrugger za zebranie danych na temat izolowanych mitochondriów, Patrizii Guerth za wsparcie techniczne przy testowaniu prędkości obrotowej mieszania oraz Mateusowi Gringsowi za analizę stałej czasowej z testów mieszadeł. Dziękujemy naszemu partnerowi, firmie WGT Elektronik GmbH & Co KG, Kolsass, Austria, za informacje na temat danych technicznych szklanych komór, korków i natężenia pola magnetycznego. Dziękujemy Luizie HD Cardoso, Alejandrze Romero-Martinez, Ondrejowi Sobotce, Albie Timon-Gomez i Jaime Willisowi za komentarze. Praca ta została częściowo sfinansowana przez program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o grant nr 859770, projekt NextGen-O2k. Wkład w działanie COST CA15203 MitoEAGLE przy wsparciu finansowym Krótkoterminowych Misji Naukowych (LFGS, LR).

W badaniu nad ludzkimi płytkami krwi ośmioro ochotników wyraziło pisemną zgodę na udział w badaniu, które zostało zatwierdzone przez Szwedzki Urząd Przeglądu Etycznego (Nr 2013/181). Dwie linie komórek fibroblastów skóry ludzkiej pochodzące od noworodków płci męskiej zostały zakupione z ATCC i wykorzystane zgodnie z zatwierdzeniem etycznym Ministerstwa Zdrowia Republiki Czeskiej (projekt: AZV MZ CR NU22-07-00474). Procedury z udziałem myszy przeprowadzono zgodnie z Austriacką ustawą o eksperymentach na zwierzętach oraz zgodnie z Europejską konwencją dotyczącą ochrony zwierząt kręgowców wykorzystywanych do celów naukowych i innych celów eksperymentalnych (Tierversuchsgesetz 2012; Dyrektywa 2010/63/EU; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Zastosowano zasadę 3R w celu zminimalizowania liczby zwierząt doświadczalnych.
1. Kalibracja objętości
<ol>
	<li>Zamontuj komory o małej objętości (sV) lub komory o klasycznej objętości (cV) w urządzeniu Oroboros&#160;(Rysunek 1A,B; Tabela 1).</li>
	<li>Włącz urządzenie Oroboros&#160;i połącz je z programem DatLab.</li>
	<li>Osusz komory.</li>
	<li>Pipetuj 0,54 mL H2O do sV&#160; (0,50 mL efektywnej objętości eksperymentalnej oraz 0,04 mL objętości martwej kapilary) lub 2,07 mL H2O do cV&#160; (2,00 mL objętości efektywnej oraz 0,07 mL objętości martwej kapilary). 
	UWAGA: Aby uniknąć utraty cieczy między górną częścią szklanego cylindra a uchwytem komory wykonanym z polioksymetylenu (POM), wprowadź końcówkę pipety wystarczająco głęboko, aby dotknęła ścianki szklanej komory.</li>
	<li>Włącz mieszadła.</li>
	<li>Przed zamknięciem komory nawilż pierścienie O-ringowe korków, dbając o to, aby ich kapilary pozostały suche. Poluzuj pierścienie do kalibracji objętości i wsuwaj korki w dół, aż ciecz wypełni kapilarę korka i mała kropla pojawi się w zbiorniczku na górnym końcu kapilary (Tabela 1).</li>
	<li>Dokręć pierścienie do kalibracji objętości, aby ustalić ich pozycję w taki sposób, by przy kolejnych wkładaniach korków uzyskiwana była skalibrowana objętość.</li>
</ol>
2. Ogólne ustawienia&#160; Oroboros
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie DatLab.</li>
	<li>Ustaw temperaturę eksperymentalną (37 °C) oraz prędkość obrotową mieszania na 550 rpm (9,2 Hz lub obrotów na s) w komorze sV lub 750 rpm (12,5 Hz) w komorze cV. Ustaw interwał próbkowania danych na 2 s z wygładzaniem w zakresie 80 s (40 punktów danych) podczas testów tła instrumentalnego O2&#160;lub 40 s (20 punktów danych) w przypadku respirometrii. 
	UWAGA: Magnetyczne mieszadła (AlNiCo powlekane polifluorkiem winylidenu [PVDF]; Tabela 1) są wprawiane w ruch przez pulsacyjne obrotowe pole magnetyczne o natężeniu 3,5 mT na poziomie mieszadła w komorze.</li>
	<li>Wykonaj kalibrację powietrzną28 w MiR05 lub w tym samym medium inkubacyjnym, które będzie stosowane w kolejnych eksperymentach.</li>
	<li>Okazjonalnie wykonuj kalibracje zerowe tlenu, jednak nigdy bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentów.
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży roztwór stokowy ditionianu sodu, rozpuszczając proszek O2-Zero w 50 mM buforze fosforanowym (pH 8.0) do stężenia 2,5 mM dla komór sV lub 10 mM dla komór cV.</li>
		<li>Miarej ditionian sodu z nadmiarem, aby uzyskać surowy sygnał R0 lub prąd zerowy [µA] przy stężeniu O2&#160; wynoszącym 0 µM14,28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test tła aparatowego O2
<ol>
	<li>Komora sV
	<ol>
		<li>Po kalibracji powietrzem zamknąć komorę. Monitorować sygnał tlenu przez około 60 min, aż stężenie O2&#160; spadnie z nasycenia powietrzem do około 150 µM. Wyznaczyć cztery punkty J°1&#160;do J°4&#160; na wykresie „O2&#160;slope negative”. 
		UWAGA: Ten instrumentalny test tła O2&#160; należy przeprowadzać każdego dnia przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>OPCJONALNIE: Za pomocą strzykawki Hamiltona miareczkować dodawaniem Na-ditionitu przygotowanego zgodnie z krokiem 2.4.1, aby osiągnąć stężenie O2&#160; wynoszące 100 µM (Rysunek 1C). 
		UWAGA: W innym protokole Na-ditionit jest miareczkowany do&#160;komory przy użyciu mikropompy miareczkująco-wtryskującej (TIP2k; Rycina uzupełniająca 1 oraz Rycina uzupełniająca 2) w celu porównania ze standardową metodą wyznaczania instrumentalnego tła strumienia O2&#160;28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komora cV
	<ol>
		<li>Po kalibracji powietrzem zamknąć komorę, odczekać do stabilizacji nachylenia krzywej O2&#160; i wyznaczyć punkt J°1&#160; na wykresie „O2 slope neg.”28. Za pomocą strzykawki Hamiltona miareczkować Na-ditionit przygotowany zgodnie z krokiem 2.4.1 w krokach 0,7 µL, aby dostosować reżim tlenowy do komory sV i obniżyć stężenie O2&#160; do 150 µM.</li>
		<li>Wykonać kolejny krok miareczkowania Na-ditionitem (ok. 7 µL), aby obniżyć stężenie O2&#160; do 100 µM (Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych instrumentalnego tła O2&#160;
	<ol>
		<li>Obliczyć nachylenie instrumentalnego tła O2&#160; w programie DatLab28. Z górnego menu wybrać Flux/Slope.</li>
		<li>Otworzyć okno O2 background correction. Jako źródło tła O2 wybrać Active File i wskazać punkty J°, które mają zostać użyte do obliczenia regresji liniowej. Zastosować korekcję tła O2&#160; (Apply).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg" /> 
Rycina 1Mała objętość (sV) i klasycznej objętości (cVkomory i aparatura O2&#160;test tła (A) Komora sV. (B) Komora cV. (C) Reprezentatywne zapisy&#160;nachylenie ujemne i J&#176;1&#160;znacznik, sV (0,5 ml; zielony) oraz cV (2,0 ml; niebieski). (D) Odpowiednie stężenie tlenu i oznaczenia R1. Trzy manualne dodaniaDitlenku sodu&#160;miareczkowania (ok. 0.7 &#181;L, roztwór zapasowy 10 mM; cV) oraz końcowy 7.0 &#181;L miareczkowanie 2,5 mM i 10 mM&#160;zapas w sV oraz cV odpowiednio komory. Wyeliminowano piki spowodowane mianowaniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
4. Dodawanie próbek do komór Oroboros
UWAGA: Próbkę można wprowadzić do komory dwiema metodami: poprzez częściową wymianę objętości (płytki krwi i fibroblasty w niniejszym badaniu) lub całkowitą wymianę objętości (izolowane mitochondria w niniejszym badaniu).
<ol>
	<li>Częściowa wymiana objętości
	<ol>
		<li>Wyjmij całkowicie włożony korek. Odpipetuj i odrzuć objętość Vout medium MiR05. Vout wynosi 60-70 µL dla płytek krwi i 80-150 µL dla fibroblastów, obliczając ją zgodnie z koncentracjami komórek w zawiesinie komórkowej zapasie.</li>
		<li>Wprowadź do komory objętość VJ.i zawiesiny komórkowej zapasie (o znanej koncentracji komórek) równą objętości Vout (Rycina 2).</li>
		<li>Oblicz eksperymentalną koncentrację komórek w rzeczywistej objętości V' (0,54 mL i 2,07 mL), która jest większa od efektywnej objętości eksperymentalnej V (0,5 mL i 2,0 mL). 
		UWAGA: Koncentracje zawiesiny komórkowej zapasie oraz eksperymentalna koncentracja komórek powinny być zaplanowane tak, aby uzyskać objętości VJ.i = Vout kompatybilne z niewielkim błędem miareczkowania. W eksperymentach z płytkami krwi do komory sV użyto prototypowego korka z martwą objętością kapilary wynoszącą 0,05 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowita wymiana objętości
	<ol>
		<li>Odsyj całe medium z komory i zastąp je co najmniej 0,54 mL lub 2,07 mL roztworu zapasu izolowanych mitochondriów o eksperymentalnym stężeniu próbki w komorach sV lub cV&#160; odpowiednio.</li>
		<li>Zamknij komorę i odsysz nadmiar roztworu zapasu mitochondriów z gniazda korka. 
		UWAGA: Całkowita wymiana objętości eliminuje zmienność stężenia mitochondriów, która może wystąpić podczas miareczkowania do zamkniętej&#160;komory przez kapilarę korka za pomocą strzykawki Hamiltona. Ta druga metoda jest możliwa do zastosowania w przypadku próbek o małej średnicy przygotowanych w stężonych zawiesinach zapasowych (np. izolowane mitochondria); jednak naraża ona delikatne komórki na potencjalne uszkodzenie błon plazmatycznych przez siły ścinające występujące w igle strzykawki Hamiltona o długości 51 mm (średnica wewnętrzna 0,41 mm). Unika się tego poprzez wyjęcie korka i wprowadzanie próbki do komory metodą częściowej lub całkowitej wymiany objętości. Badano trzy rodzaje preparatów mitochondrialnych. Przygotowanie próbek opisano w Pliku uzupełniającym 11,26,29,30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żywe komórki: ludzkie płytki krwi
	<ol>
		<li>Włóż probówki kriogeniczne zawierające płytki krwi do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i odmrażaj zawartość, aż pozostanie niewielka ilość lodu.</li>
		<li>Otwórz probówki kriogeniczne i powoli, kroplami, dodaj 1 mL uprzednio ogrzanego medium (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C).</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj płytki krwi i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL z całkowitą objętością 10 mL uprzednio ogrzanego medium (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Wirować przy 1000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT) przy użyciu rotora z kątowym wyjściem gondoli (przyspieszenie 6, hamowanie 2).</li>
		<li>Resuspenduj płytki krwi w 0,25 mL DPBS + 10 mM EGTA (RT) i wprowadź je do komór metodą częściowej wymiany objętości do początkowej eksperymentalnej koncentracji komórek w zakresie od 157&#160;·&#160;106 do 210&#160;·&#160;106 x·mL-1 w komorze 0,5-mL oraz od 164&#160;·&#160;106 do 220&#160;·&#160;106 x·mL-1 w komorze 2,0-mL (szczegóły dotyczące jednostki elementarnej x patrz w31). 
		UWAGA: Jedno urządzenie Oroboros wyposażono w komory sV i cV w pozycjach A i B odpowiednio, używając go równolegle z innym urządzeniem Oroboros&#160; wyposażonym w komory sV i cV w pozycjach B i A odpowiednio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki permeabilizowane: ludzkie fibroblasty
	<ol>
		<li>Wprowadź komórki do komór Oroboros&#160; metodą częściowej wymiany objętości do nominalnej koncentracji komórek 0,75 · 106 x·mL-1&#160;w obu typach komór i oblicz rzeczywistą koncentrację (krok 4.1.3). 
		UWAGA: Równolegle używano różnych instrumentów Oroboros&#160;, z których każdy był wyposażony albo w komory sV, albo cV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowane mitochondria: serce myszy
	<ol>
		<li>Dodaj 15 µL zawiesiny mitochondrialnej do 5985 µL medium do respiracji mitochondrialnej (MiR05), co daje stężenie białka mitochondrialnego w zapasie w zakresie 0,013-0,026 mg∙mL-1.</li>
		<li>Wprowadź zawiesinę mitochondrialną do komór Oroboros&#160; metodą całkowitej wymiany objętości. 
		UWAGA: Jedno urządzenie Oroboros&#160; wyposażono w komory sV i cV w pozycjach A i B odpowiednio, używając go równolegle z innym urządzeniem Oroboros&#160; wyposażonym w komory sV i cV w pozycjach B i A odpowiednio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg" /> 
Rysunek 2Dodanie zawiesiny komórkowej poprzez częściową wymianę objętości. (A)&#160;Dodawanie do komory 0,5 mlV i (B) komora o pojemności 2,0 ml cV. (1) Zamknięta komora z objętościami medium oddechowego V i wypełniona kapilara z korkiem Vstc, do pomiaru tła instrumentalnego O2&#160;strumień JO2&#176;. (2) Usunięto korek, Vstc odprowadzono do komory, co doprowadziło do uzyskania objętości całkowitej V'= V+Vstc. (3) Częściowe usunięcie medium Vna zewnątrz = -VJ.i. Objętość V''= V'+Vna zewnątrz pozostaje w komorze. (4) Pipetowanie podpróbki o objętości VJ.i zawiesiny komórek do pomiaru respirometrycznego do komory, co daje objętość całkowitą V# = V+Vstc rozcieńczonej zawiesiny komórek. (5) Zamknięta komora z wypełnioną kapilarą z korkiem (objętość martwa Vstc) do pomiaru swoistego dla objętości O2&#160;strumień JV,O2&#160;w objętości doświadczalnej VRysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rycina 2A Liczba komórek i normalizacja w HRR41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Protokoły SUIT
<ol>
	<li>Przenieść roztwory zapasowe substancji chemicznych wymienionych w Tabeli uzupełniającej 1 do komór za pomocą mikrostrzykawek Hamiltona, dostosowując objętości miareczkowania w celu uzyskania tych samych stężeń eksperymentalnych w komorach sV oraz cV (patrz legendy do ryc. 6, 8, 10).</li>
	<li>Wybrać protokół SUIT-003_D01832,33 (dla płytek krwi w niniejszym badaniu).</li>
	<li>Wybrać protokoły SUIT-001_D0044,15,34,35 oraz SUIT-002_D0074,15,35,36 (dla fibroblastów w niniejszym badaniu).</li>
	<li>Wybrać protokół SUIT-002_D0054,15,35,37 (dla izolowanych mitochondriów w niniejszym badaniu).</li>
</ol>
6. Analiza danych SUIT
<ol>
	<li>W programie DatLab ustaw znaczniki w celu zdefiniowania sekcji wybranych działek.</li>
	<li>Wybierz Strumień/Nachylenie w górnym menu. Otwórz Strumień/Nachylenie okno. Nanieść korekta objętości miareczkowania do rozcieńczania zawiesin próbek przed każdym miareczkowaniem w protokole SUIT.</li>
	<li>Wybierz Znaczniki z górnego menu. Otwórz Statystyki ocen aby przedstawić medianę zaznaczonych punktów danych po korekcie linii bazowej poprzez odjęcie resztkowego zużycia tlenu (rox).</li>
	<li>Oblicz punkt przecięcia i nachylenie między parami wyników uzyskanych w sV oraz cV komory za pomocą analizy regresji odwróconej25,28 przy użyciu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Porównaj częstotliwość oddychania w rox&#160;stan (minimum O2&#160;strumienie) w sV i cV komory za pomocą testu t Studenta dla prób zależnych z wykorzystaniem oprogramowania jamovi 2.3.1338. 
	UWAGA: Ponieważ dwie komory w urządzeniu Oroboros&#160;instrumenty są funkcjonalnie niezależne (z wyjątkiem temperatury i odstępów czasu rejestracji w programie DatLab), pomiary w każdym&#160;komorę można rozważać oddzielnie, podobnie jak w przypadku stosowania różnych&#160;przyrządów. Wyniki końcowe mogą być przedstawione jako mediany lub średnie z wielu komór wraz z informacją o ich zmienności.</li>
</ol>

Exploring Chamber Volumes for Mitochondrial High-Resolution Respirometry

<ol><li>Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+respiratory+activity+in+attached+and+suspended+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts.</a> PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).</li>
<li>Schöpf, B., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32198407/">OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation.</a> Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).</li>
<li>Meszaros, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predictive+value+of+graft+viability+and+bioenergetics+testing+towards+the+outcome+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation.</a> Transplant International. 37, 12380(2024).</li>
<li>Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8746845/">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14713113/">Oxygen Conformance of Cellular Respiration.</a> Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).</li>
<li>Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+redox+states+and+respiratory+control+in+mouse+and+beef+heart+mitochondria+at+steady-state+levels+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia.</a> J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/komlodi_2021_q">Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria.</a> Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).</li>
<li>Suomalainen, A., Nunnari, J. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38788685/">Mitochondria at the crossroads of health and disease.</a> Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).</li>
<li>Cardoso, L. H. D., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39424161/">Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11718759/">Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply.</a> Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://books.google.at/books?id=JMlo1CuofE4C&dq=Gnaiger+E+(2008)+Polarographic+oxygen+sensors,+the+oxygraph+and+high-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function.+In:+Mitochondrial+dysfunction+in+drug-induced+toxicity+(Dykens+JA,+Will+Y,+eds)+John+Wiley+%26+Sons,+Inc,+Hoboken,+NJ:327-52.&lr=&source=gbs_navlinks_s">Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function.</a> Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/gnaiger_2020_mitopathways">Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis.</a> Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).</li>
<li>Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+LDL-C%2C+high+blood+pressure%2C+and+low+peak+VO%E2%82%82+associate+with+platelet+mitochondria+function+in+children-The+Arkansas+Active+Kids+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study.</a> Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).</li>
<li>Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25893255/">Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients.</a> J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).</li>
<li>Heimler, S., et al. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/heimler_2022">Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women.</a> Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).</li>
<li>Palacka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+bioenergetics+reprogramming+in+patients+with+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+in+response+to+iron+deficiency+anemia%3A+Comparison+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver.</a> Metabolites. 12 (3), 270(2022).</li>
<li>JedIicka, J., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36647911/">Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs.</a> Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).</li>
<li>Westerlund, E., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38439844/">Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers.</a> Heliyon. 10 (5), e26745(2024).</li>
<li>Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+changes+in+respiration+and+oxidative+phosphorylation+in+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts.</a> Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).</li>
<li>Yépez, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCR-Stats%3A+Robust+estimation+and+statistical+testing+of+mitochondrial+respiration+activities+using+Seahorse+XF+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer.</a> PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/Gnaiger_2021_MitoFit_BCA">Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts.</a> MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).</li>
<li>Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/925018/">Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle.</a> J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).</li>
<li>Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/baglivo_2024">Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry.</a> Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).</li>
<li>Mela, L., Seitz, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/007668797955006X?via%3Dihub">Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.</a> Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).</li>
<li>Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/cardoso_2021_mgg">Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration.</a> Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26124/becprep.2025-0004">The elementary unit — count and numbers in the International System of Units.</a> BEC preprints. , (2025).</li>
<li>Vernerova, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34944675/">Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods.</a> Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018</a> (2024).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004</a> (2024).</li>
<li>Timón-Gómez, A., et al. <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1113/EP092792">Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation.</a> Exp Physiol. , 1-33 (2025).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007</a> (2024).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005</a> (2024).</li>
<li>The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , 
 <a target="_blank" href="https://www.jamovi.org/">https://www.jamovi.org/</a> (2024).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/images/3/3f/Gnaiger_1983_POS_preface.pdf">Preface: A biologist´s view.</a> Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).</li>
<li>Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).</li>
<li>Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR">https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR</a> (2020).</li>
<li>Williams, O., Sergent, S. R. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/article/nbk/nbk557800">Histology Platelets</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).</li>
<li>Donnelly, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/donnelly_2022">The ABC of hypoxia - what is the norm.</a> Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).</li>
<li>Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+model+of+the+inhibition+of+respiration+by+endogenous+nitric+oxide+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).</li>
</ol>

EL jest pracownikiem firmy Oroboros Instruments. EG jest założycielem i dyrektorem generalnym Oroboros Instruments.
W trakcie realizacji projektu LFGS został zatrudniony przez firmę Oroboros Instruments. EÅF i EE są pracownikami firmy Abliva AB z siedzibą w Lund w Szwecji, która zawarła umowę handlową z Oroboros Instruments.
LR deklaruje, że nie występuje w konflikcie interesów.

Ilość próbki dostępnej do respirometrii jest często ograniczona, np. w badaniach biopsji, komórek pierwotnych lub wolno rosnących kultur komórkowych o niskiej liczbie komórek1. Co więcej, aktywność układu oddechowego jest obniżona z powodu urazów mitochondrialnych11 lub podczas badania szlaków mitochondrialnych o niskiej wydajności, takich jak utlenianie kwasów tłuszczowych12. W takich przypadkach niska objętość komory respirometrycznej zapewnia korzyści w zakresie rozdzielczości strumieniaO2. Jednak instrumentalne strumienie tłaO2 zwiększają się przy niższych objętościach komory i wywołują błędy, gdy nie są mierzone wiarygodnie i nie są odpowiednio korygowane w funkcji stężeniaO2. Powtarzalność instrumentalnych testów tłaO2 i korekcji tła są szczególnie ważne w przypadku małych objętości komory. Prawie identyczne wartości teoretycznego (J°R1) i eksperymentalnego (J°air) strumieniaO2 dostarczają dowodów na dokładność pomiaru polarograficznego z 4 e-/O2 w reakcji katodowej POS. Różnica między J°R1 i J°air wynosiła 1,64 ± 0,43 i 0,22 ± 0,31 pmol∙s-1∙mL-1 odpowiednio w komorze sV i cV, co wskazuje na precyzję pomiarów, która mieści się w granicy wykrywalności komory 2,0 ml (±1 pmol∙s-1∙mL-1)28. Przy tym samym typie polarograficznych czujników tlenu w komorze 2,0 ml i 0,5 ml, strumień tła o objętości O2 wzrósł 4-krotnie odwrotnie proporcjonalnie do objętości komory, a zmienność była prawie identyczna w dwóch objętościach komory, z SD wynoszącym 0,5 i 0,3 pmol∙s-1∙mL-1 dla J°air oraz 0,9 i 0,8 pmol∙s-1∙mL-1 dla J°50 odpowiednio w komorze sV i cV (tabela 2). Przy minimalnych czynnościach oddechowych - do których zaprojektowano komorę o małej objętości - nawet niewielkie efekty tła stają się znaczące (tabela uzupełniająca 3; Rysunek uzupełniający 2). W związku z tym wymagana jest rutynowa ocena strumienia O2 w tle instrumentalnym (rysunek 1) w celu zastosowania właściwej korekcji28.
Wysokie i ciągłe mieszanie pożywki jest wymagane do utrzymania jednorodnego systemu i zagwarantowania stabilnego sygnału tlenowego. Prędkość mieszania 750 obr./min ustalono dla komory o pojemności 2,0 ml, ale optymalna prędkość nie była znana w komorze o pojemności 0,5 ml. Różne geometrie szklanej komory i mieszadła (tabela 2) wymagają niezależnej oceny optymalnej prędkości mieszania. Czujniki tlenu reagowały na zmiany prędkości mieszania w zakresie od 550 obr./min do 950 obr./min, z niewielkim odchyleniem od sygnału O2 R1 przy 750 obr./min, niezależnie od objętości komory. Wykładnicza stała czasowa τ obliczona dla komorys V była zgodna z τ zgłoszoną dla komory 2,0 ml przy tej samej prędkości mieszania13. Wyniki te sugerują, że mieszanie jest równie skuteczne w obu geometriach komory i że domyślna prędkość mieszania 750 obr./min (komora 2,0 ml) może być zastosowana do komory 0,5 ml. Zarówno w konfiguracji komory "otwartej", jak i "zamkniętej", komora o pojemności 0,5 ml miała wyższy stosunek sygnału do szumu, co sugeruje wyższą dokładność jako zaletę komory o pojemności 0,5 ml (ilustracja 5), chociaż nie można wykluczyć wpływu zmienności poszczególnych punktów sprzedaży. Ponieważ hałas nie wzrastał przy zmniejszaniu prędkości mieszania z 750 obr./min do 550 obr./min, zmniejszenie prędkości mieszania do 550 obr./min w komorze 0,5 ml może być korzystne dla zminimalizowania naprężeń ścinających bez uszczerbku dla stosunku sygnału do szumu.
Prawie identyczne wskaźniki zużyciaO2 mierzono w komorach 0,5 ml i 2,0 ml w trzech modelach eksperymentalnych, gdy zastosowano odpowiednią korekcję tła. Wyniki uzyskane z małymi płytkami krwi o średnicy 2 μm42, żywymi i przepuszczalnymi fibroblastami oraz izolowanymi mitochondriami sugerują, że można oczekiwać uzyskania stałej częstości oddechów w komorach 0,5 ml i 2,0 ml w szerokim zakresie typów komórek i preparatów mitochondrialnych. Przepuszczalne włókna mięśniowe nie zostały jednak przetestowane w niniejszym badaniu. Dokładny pomiar rox wymaga kontroli poziomu tlenu40 i wysokiej rozdzielczości instrumentalnej1. Specyficzny objętościowo strumień O2 rox może być tak niski, jak granica wykrywalności. Reoksygenacja nie jest konieczna, gdy w eksperymencie używa się małej liczby komórek lub ogólnie niewielkich ilości próbek. W razie potrzeby zaleca się jednak wykonanie reoksygenacji w stanach oddechowych o niskim strumieniuO2, aby uniknąć gwałtownego spadku stężeniaO2 w okresie wymaganym do stabilizacji strumieniaO2. Stabilizacja strumieniaO2 po ponownym natlenieniu trwa dłużej w komorze 0,5 ml.
W celu zapewnienia kontroli jakości należy zwrócić szczególną uwagę na rozcieńczenie próbki w zawiesinie podczas częściowej wymiany objętości. Po wyjęciu całkowicie włożonego korka, całkowita objętość V' medium oddechowego w komorze jest podawana przez eksperymentalną objętość V i objętość kapilary V stc zatyczki (tabela 2). W związku z tym objętość materiału wyjściowego V J.i rozcieńcza się w rzeczywistej objętości V', która jest większa niż V, co daje współczynnik rozcieńczenia V/V' wynoszący 0,5/0,54 = 0,926 i 2,0/2,07 = 0,966 odpowiednio w komorach 0,5 ml i 2,0 ml (rysunek 2). W eksperymentach z płytkami krwi zastosowano prototypowy korek do komory V o martwej objętości kapilarnej 0,05 ml, co odpowiada współczynnikowi rozcieńczenia 0,909.
W komorze 0,5 ml wymagana jest prawie czterokrotnie mniejsza ilość żywych komórek, komórek przepuszczalnych i izolowanych mitochondriów niż w komorze 2,0 ml przy identycznych stężeniach próbki (ilość na objętość), co daje ilościowo porównywalne wyniki zużycia O2 w oddychaniu znormalizowane dla liczby komórek lub masy białka. Wskazuje to, że komora V jest cennym narzędziem do badań, w których ilość dostępnych próbek jest ograniczona. Z drugiej strony, zastosowanie identycznej ilości próbki w komorzes V zwiększa objętościowy strumieńO2, a tym samym zmniejsza niepewność pomiarów, gdy aktywność oddechowa jest niska.
Reżim tlenowy w niniejszym badaniu był ograniczony do zakresu nasycenia powietrzaO2 do 30 μM. Zastosowanie przy poziomach tlenu poza tym zakresem wymaga dalszej oceny w celu zbadania funkcji mitochondriów w normoksji tkankowej lub hipoksji43 i przepuszczalnych tkanek w hiperoksji9. Kilka konfiguracji wielosensorowych modułów NADH i Q firmy Oroboros; Elektrody pH, NO i TPP+ 10,44 - nie mogą być umieszczone w komorzeV i wymagają komory 2,0 ml.

Badanie mitochondrialnych szlaków oddechowych jest kluczem do rzucenia światła na mechanizmy metaboliczne leżące u podstaw różnych chorób, starzenia się lub reakcji na stres, dostarczając tym samym potencjalnych celów dla interwencji terapeutycznych i poprawiając możliwości diagnostyczne1,2,3. Respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) pozwala na szczegółową analizę kontroli szlaku mitochondrialnego i sprzężenia w fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w różnych typach próbek i preparatach4. Objętość komory doświadczalnej jest podstawową cechą konstrukcyjną przyrządów respirometrycznych. Poprzednio ustalona objętość komory wynosi 2,0 ml w Oroboros. Objętość ta została zoptymalizowana tak, aby zapewnić niski strumień tła O2 i zapewnić jednorodność mieszanego medium. Są to jedne z kluczowych kryteriów jakości dla dokładnego pomiaru oddychania w warunkach niskiej zawartości tlenu i hiperoksyki, wymaganych odpowiednio dla kinetyki tlenu mitochondrialnego i przepuszczalnych włókien mięśniowych5,6,7,8,9. Ponadto kilka wstawek wielosensorowych 10 wymaga przestrzeni w komorze o pojemności 2,0 ml (tabela 1).
W obecnym badaniu zbadaliśmy możliwość zmniejszenia objętości komory dla HRR z 2,0 ml do 0,5 ml. Czy w testach respirometrycznych można zastosować mniejszą liczbę komórek lub ilość tkanki w mniejszych testach bez uszczerbku dla dokładności? Wyjaśnienie tego pytania jest ważne dla badania ludzkich biopsji tkanek i płynów, komórek pierwotnych i wolno rosnących kultur komórkowych1. Podobnie, zmniejszenie objętości komory jest potencjalnie korzystne w badaniach próbek o niskiej aktywności oddechowej w wadliwych mitochondriach11 i szlakach mitochondrialnych o z natury niskich pojemnościach, takich jak utlenianie kwasów tłuszczowych w mózgu12. Jednak rozdzielczość może być zmniejszona przy małym rozmiarze komory z powodu nieproporcjonalnie rosnących artefaktów dyfuzji wstecznejO2 i niedokładnej kalibracji objętości13,14. Dlatego przeanalizowaliśmy instrumentalną wydajność Oroborosa z komorą o małej objętości (sV) skalibrowaną na minimalną eksperymentalną objętość 0,5 ml, w porównaniu z klasyczną komorą objętościową (cV) skalibrowaną na 2,0 ml. W szczególności przeanalizowaliśmy instrumentalny strumień tła O2 i optymalną prędkość mieszania.
Protokoły miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor (SUIT) są używane do oceny częstości oddechów i stanów w analizie OXPHOS. Protokoły SUIT obejmowały od 14 do 20 miareczkowania na test respirometryczny i obejmowały strumienie oddechowe O2 w zakresie od kilku pmol∙s-1∙mL-1 do setek pmol∙s-1∙mL-1. Stany sprzężenia-kontroli obejmują szybkość nieszczelności L, tj. rozpraszający składnik oddychania, który nie jest dostępny do fosforylacji adenozyno-5'-difosforanu (ADP) do adenozyno-5'-trifosforanu (ATP) i wynika z wycieku protonów, poślizgu protonów, cykli kationów i wycieku elektronów. Pojemność P OXPHOS odpowiada za oddychanie mitochondriów, gdy transfer elektronów mierzony jako zużycieO2 (utlenianie) jest sprzężony z syntezą ATP (fosforylacją) w obecności ADP. Zdolność przenoszenia elektronów E w stanie rozprzężonym określa się ilościowo przez miareczkowanie protonoforu w obecności substratów mitochondrialnych15. Zużycie tlenu resztkowego rox określa się po dodaniu inhibitorów kompleksu I i kompleksu III: rotenonu i antymycyny A.
Zmierzyliśmy oddychanie komórek i preparatów mitochondrialnych w komorach sV i cV. Płytki krwi są bezjądrzastymi fragmentami cytoplazmatycznym megakariocytów i stanowią łatwo dostępne źródło ludzkich mitochondriów. W związku z tym płytki krwi zastosowano jako model dla żywych komórek (lub cząstek komórkowych) z nienaruszonymi błonami plazmatycznymi. Oddychanie komórek krwi służy jako biomarker ogólnoustrojowych chorób mitochondrialnych i koreluje ze sprawnością bioenergetyczną metabolicznie aktywnych narządów16,17,18,19, chociaż tych wyników nie można uogólnić20,21,22. Ludzkie fibroblasty zostały wybrane do ich zastosowania jako model komórkowy dysfunkcji mitochondriów1,23,24,25. Nienaruszona zawartość błon plazmatycznych jest niezbędna do żywotności komórki, ale jej selektywna przepuszczalność pozwala na wymianę cząsteczek między cytozolem a otaczającym go podłożem. W związku z tym badano fibroblasty z chemicznie przepuszczalnymi błonami plazmatycznymi jako przykład przepuszczalnych komórek, w porównaniu z izolowanymi mitochondriami używanymi do oceny funkcji mitochondriów i wymaganymi do oddzielenia subpopulacji mitochondrialnych26,27.

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td> <td>software</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Niemcy</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki-leki przeciwgrzybicze 100x</td><td>Biosera, Francja</td><td>XC-A4110</td><td>UWAGA H317 Może powodować reakcję alergiczną skóry</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A8674</td><td>UWAGA H300&nbsp; Połknięcie grozi śmiercią, H400 krótkotrwałe (ostre) zagrożenie dla środowiska wodnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone&</td><td>nbsp; A 2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA bez kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A 6003</td><td>albumina surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C2759</td><td>cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon UWAGA H301 + H311 + H331 Działa toksycznie po połknięciu, w kontakcie ze skórą lub w następstwie wdychania</td></tr><tr><td>Hrabina Automatyczny licznik komórek&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone</td><td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Wersja 7.4 Oprogramowanie</td><td>do akwizycji i analizy danych</td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Wersja 8.1 Oprogramowanie</td><td>do pozyskiwania i analizy danych</td></tr><tr><td>Test białka DC</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>5000112</td><td>Zestaw do oznaczania białek; UWAGA H314 Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D5628</td><td>UWAGA H301 Działa toksycznie po połknięciu</td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D 0632</td><td>UWAGA H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech, Niemcy</td><td>P04-05551</td><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D2650</td><td>dimetylosulfotlenek</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience, Szwajcaria</td><td>LONBE17-512F</td><td>Bez wapnia Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>A5256701</td><td>płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, USA&</td><td>nbsp; G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Glicerofosforan</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Wirówka</td><td>HM3S</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&nbsp;</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Niemcy</td><td>1701</td><td>wirówka</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Honeywell Fluka, Austria</td><td>56750</td><td>UWAGA H302 Działa szkodliwie po połknięciu, H314 Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, H360D Może uszkodzić nienarodzone dziecko</td></tr><tr><td>jamovi&nbsp;</td><td>Projekt jamovi</td><td>Wersja 2.3.13</td><td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>K+-MES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Leucosep&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>Z642843-300EA</td><td>probówka wirówkowa z barierą polietylenową</td></tr><tr><td>Malate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M1000</td><td>UWAGA H319 Działa drażniąco na oczy.</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Scharlau, Hiszpania</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-Kit</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>60101-01</td><td>mitochondrialne podłoże oddechowe</td></tr><tr><td>Mikser&nbsp;</td><td>Swelab Instruments, Szwecja</td><td>Stół bujany</td><td>440S</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>5100-0001</td><td>pojemnik do zamrażania</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td></td><td>NextGen-O2k i O2k są określane zbiorczo terminem " Oroborosa</td></tr><tr><td>Komora Oroboros cV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>23100-01</td><td>klasyczna komora objętościowa</td></tr><tr><td>Komora Oroboros sV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>33100-01</td><td>komora o małej objętości</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-Module</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>11100-03</td><td>Mikropompa miareczkowo-wtryskowa</td></tr><tr><td>O2-Zero Powder</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>26600-02</td><td>&nbsp; Na-ditionit UWAGA H251 Samonagrzewanie się: może się zapalić, H302 Działa szkodliwie po połknięciu, H319 Działa drażniąco na oczy</td></tr><tr><td>oktanoilokarnityna</td><td>Biotrend - APExBIO Technology, Niemcy</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatyna</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P2256</td><td>UWAGA H317 Może powodować reakcję alergiczną skóry</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R8875</td><td>UWAGA H300 Połknięcie grozi śmiercią</td></tr><tr><td>Linie komórkowe fibroblastów skóry&nbsp;</td><td>&nbsp; ATCC, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2002</td><td>UWAGA H300 + H310 + H330 Śmiertelne w przypadku połknięcia, kontaktu ze skórą lub wdychania</td></tr><tr><td>Subtylizyna A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P 5380</td><td>UWAGA H318 - Powoduje poważne uszkodzenie oczu, H334 - Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania</td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek krwi Swelab Alfa&nbsp;</td><td>Boule Diagnostics AB, Szwecja</td><td>1420041</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>Tecan, Szwajcaria</td><td></td><td>spektrofotometr</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T3134</td><td>Dichlorowodorek N,N,N',N'-tetrametylo-p-fenylenodiaminy UWAGA H315 Działa drażniąco na skórę, H319 Działa drażniąco na oczy</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4799</td><td>UWAGA H334 Wdychanie może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

Badanie strumieni oddechowych ma decydujące znaczenie dla zrozumienia złożonych zależności między procesami metabolicznymi. Badania komórek i tkanek o ograniczonej dostępności próbek i niskiej częstości oddechów mogą przynieść korzyści z małych objętości eksperymentalnych. Sprawdziliśmy, czy komora o pojemności 0,5 ml daje wyniki zgodne z komorą o pojemności 2,0 ml przy identycznych stężeniach próbki stosowanych w respirometrii o wysokiej rozdzielczości z użyciem Oroboros. Strumień tłaO2 był 4-krotnie wyższy w komorach o pojemności 0,5 ml niż w komorach o pojemności 2,0 ml przy nasyceniu powietrzem, ale był powtarzalny, co pozwalało na dokładną korekcję tła. Optymalna prędkość mieszania wynosiła od 550 obrotów na minutę (rpm) do 750 obr./min w komorze 0,5 ml. Strumienie oddechowe w żywych komórkach, komórkach przepuszczalnych i izolowanych mitochondriach mierzono równolegle w komorach 0,5 ml i 2,0 ml, przy użyciu protokołów miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor z 14 do 20 miareczkowaniami. Strumienie Ø2 w różnych typach komór były identyczne w granicach wykrywalności. Komora o pojemności 0,5 ml, wymagająca blisko czterokrotnie mniejszej próbki niż komora o pojemności 2,0 ml, stanowi istotną zaletę w badaniach z ograniczoną ilością próbki lub niską pojemnością oddechową.

Tutaj pokazujemy, że komora 0,5 ml do respirometrii o wysokiej rozdzielczości pokazuje wyniki, które są zgodne z komorą 2,0 ml, jeśli zastosuje się odpowiednią instrumentalną korekcję tłaO2. Wymaga mniejszej próbki, co jest korzystne w przypadku badań o ograniczonej dostępności lub niskiej wydolności oddechowej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

Investigating respiratory fluxes is decisive for understanding the complex interplay between metabolic processes. Studies of cells and tissues with ...

W tym badaniu chcemy zbadać, czy komora o małej objętości skalibrowana do 0,5 mililitra może być używana w testach respirometrycznych bez uszczerbku dla dokładności uzyskanej dla klasycznej objętości dwóch mililitrów na platformie Oroboros.Opracowanie komory o małej objętości i ocena za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości z rygorystyczną kontrolą jakości przy użyciu precyzyjnej analizy OXPHOS utorowały drogę do rozwoju, nowych innowacji, czyli po pierwsze, 12-komorowego respirometru O2k, po drugie, robota do automatycznego miareczkowania substancji w złożonych protokołach stosowanych do analizy OXPHOS. Zastosowania te będą miały kluczowe znaczenie w dalszym rozwoju w kierunku analizy mitochondrialnej, diagnostyki chorób mitochondrialnych, oceny opracowywanych leków, koncentrując się zarówno na korzyściach płynących z leków dla funkcji mitochondriów, jak i na efektach niedocelowych, które mimowolnie zakłócają funkcję mitochondriów. Kiedy mój zespół opracował respirometrię o wysokiej rozdzielczości ponad 30 lat temu, istniał paradygmat, że mitochondria, mitochondria, mitochondria. Może była różnica między mitochondriami mięśni i wątroby, ale to było to. Nikt tak naprawdę nie interesował się mitochondriami poza tymi paradygmatami. Dzięki naszym protokołom opracowanym do respirometrii o wysokiej rozdzielczości wykazaliśmy ogromną różnorodność funkcji mitochondriów. To pozwala nam ocenić mitochondrialną kontrolę oddechową w różnych typach komórek, tkankach i gatunkach z nowym okiem. Przez 30 lat temu było około 10 publikacji, które to doceniały. Obecnie mamy w naszym instrumencie ponad 1500 urządzeń korzystających z tych protokołów.W komorze o małej objętości potrzeba czterokrotnie mniej próbki w porównaniu z klasyczną komorą o pojemności dwóch mililitrów. W przypadku próbki o niskiej częstości oddechów, ta sama ilość próbki może być użyta do zwiększenia objętościowych strumieni tlenu w celu zmniejszenia niepewności pomiaru.Nasza praca w Laboratorium Badawczo-Rozwojowym Oroboros koncentruje się na połączeniu rozwoju instrumentalnego i badań akademickich. Oceniamy mitochondrialną funkcję oddechową i profilowanie biogenetyczne za pomocą analizy wielosensorowej. Polega to na pomiarze oddychania, potencjałów redoks, potencjału błonowego, wychwytu wapnia, produkcji nadtlenku wodoru i różnych innych parametrów, które pozwalają nam uzyskać głębszy wgląd w profil biogenetyczny oraz funkcję i dysfunkcję mitochondriów.[Narrator] Aby rozpocząć, zamontuj Małą Objętość lub komorę SV na Oroborosie. Następnie włącz Oroboros i kliknij Połącz, aby połączyć Oroboros z oprogramowaniem DatLab. Po całkowitym wysuszeniu komór za pomocą pipety dodaj 0,54 mililitra wody do komory SV. Następnie włącz mieszadła. Przed zamknięciem komory należy zwilżyć O-ringi korków, utrzymując kapilarnę w suchości. Poluzuj pierścień kalibracji objętości, a następnie włóż korek w dół, aż płyn wypełni kapilar korka i menisk utworzy się w pojemniku na górnym końcu kapilary. Dokręć pierścień kalibracji objętości, aby zabezpieczyć jego pozycję, zapewniając skalibrowaną spójność objętości dla kolejnych włożeni. Aby rozpocząć, napełnij komory medium oddechowym MiR05 Uruchom oprogramowanie DatLab. Wybierz odpowiedni protokół dla instrumentalnego testu tła. Ustaw prędkość obrotową mieszania na 550 obr./min, objętość komory na 0,5 mililitra, interwał zapisu danych na dwie sekundy, a temperaturę eksperymentalną na 37 stopni Celsjusza. Uruchom test mieszadła i kalibrację powietrza. Ustaw znak R1 na wykresie stężenia tlenu, przesuwając kursor przytrzymując Shift. Od czasu do czasu przeprowadzaj kalibracje tlenu zerowego. Podczas kalibracji powietrza należy przygotować świeży roztwór podstawowy ditionianu sodu, rozpuszczając proszek O2-Zero w 50-milimolowym buforze fosforanowym do stężenia 2,5 milimolowego dla SV. Po zakończeniu kalibracji powietrza zamknij komorę. Monitoruj sygnał tlenu przez około 60 do 120 minut, pozwalając na zmniejszenie stężenia tlenu od nasycenia powietrzem do około 150 mikromolowych. Ustaw cztery znaczniki oznaczone od J01 do J04 na wykresie ujemnym nachylenia tlenu. Opcjonalnie, za pomocą strzykawki Hamiltona, miareczkować roztwór ditionianu sodu, aby dostosować stężenie tlenu do 100 mikromolów i ustawić znak J05. Aby obliczyć instrumentalne nachylenie tła tlenu w DatLab, wybierz Nachylenie strumienia. Następnie otwórz okno korekcji tła tlenu i wybierz Aktywny plik jako źródło danych tła tlenu. Sprawdź, czy wszystkie znaki J0 są używane do obliczania regresji liniowej. Następnie kliknij Zastosuj, aby uzyskać korekcję tła tlenu. Na początek umyj komory Oroborosa wodą dejonizowaną i dodaj do komory świeżą pożywkę MiR05. Po instrumentalnym teście tła otwórz nową zakładkę DatLab i wybierz protokół SUIT-003 do eksperymentów z ludzkimi płytkami krwi. Korzystając z przeglądu protokołu DatLab, który pojawia się na pasku bocznym Protokół, wybierz podstawowe roztwory chemiczne. Następnie wybierz strzykawki Hamilton zgodnie z chemikaliami. Umieścić strzykawki na stojaku na strzykawki z etykietami w kolejności zgodnej z protokołem SUIT. W celu częściowej wymiany objętości należy obliczyć objętość V jako równoważną objętości V usuniętej z rzeczywistej objętości w otwartej komorze, biorąc pod uwagę martwą objętość kapilarną. Następnie wyjmij całkowicie włożony korek i umieść go na stojaku. Usunąć obliczoną objętość V z MiR05 z komory w oparciu o typ komórki i stężenie zawiesiny komórek podstawowych. Teraz należy odpipetować do komory równoważną objętość zawiesiny komórek podstawowych o znanym stężeniu komórek. W przeciwieństwie do tego, aby całkowicie wymienić objętość, należy odsysać całe medium z komory. Dodaj 0,54 mililitra zapasu izolowanych mitochondriów serca do komory SV. Zamknąć komorę i odsysać nadmiar roztworu próbki z pojemnika z korkiem. Aby uruchomić protokół miareczkowania inhibitora rozprzęgania substratu (SUIT), otwórz okno Zdarzenie w DatLab, aby zobrazować objętości miareczkowania. Za pomocą mikrostrzykawki Hamilton miareczkować podstawowe roztwory chemiczne do komory. Następnie ustaw zdarzenie w DatLab. Pozostawić do ustabilizowania strumienia po miareczkowaniu. W celu analizy danych należy ustawić znak na reprezentatywnej i stabilnej części działki. Strumień tlenu tła przy nasyceniu powietrza był 3,9 razy wyższy w komorze o pojemności 0,5 mililitra w porównaniu z komorą o pojemności 2,0 mililitra, co jest zgodne z teoretycznie oczekiwaną czterokrotną różnicą w objętościowym strumieniu tlenu tła właściwego. Zmienność instrumentalnych strumieni tła była niemal identyczna w obu tomach komorowych. Częstość oddechów żywych płytek krwi, przepuszczalnych fibroblastów i izolowanych mitochondriów była ściśle skorelowana w obu typach komór, gdy zastosowano odpowiednią korekcję tła. Strumień tlenu ustabilizował się szybciej w komorze dwumililitrowej niż w komorze 0,5 mililitra po ponownym natlenieniu. Szczątkowe zużycie tlenu po zahamowaniu kompleksu III było spójne między dwiema komorami, dostosowując się do instrumentalnej granicy wykrywalności.

high-resolution-respirometry-in-a-small-volume-chamber

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Celem tego protokołu jest zmierzenie wpływu zmian w oddychaniu mitochondrialnym za pośrednictwem glukozy w obecności naturalnych związków na nienaruszone komórki beta 832/13 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Ten protokół przedstawia budowę i wykorzystanie uproszczonego aparatu do pletyzmografii całego ciała do nieinwazyjnego monitorowania postępu bakteryjnej choroby układu oddechowego.

Uproszczona pletyzmografia całego ciała w celu scharakteryzowania funkcji płuc podczas melioidozy oddechowej

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Ten protokół opisuje budowę i działanie systemu mikro-respirometrii, który może być wykorzystany do zbadania fizjologicznych cech holobiontu koralowca.

Fizjologiczna charakterystyka holobionta koralowca przy użyciu nowego narzędzia do mikrorespirometrii

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Poznaj respirometrię wysokorozdzielczą w małej komorze 0,5 mL do analizy funkcji mitochondrialnych. Ta metoda zapewnia dokładne pomiary przy czterokrotnie mniejszej objętości próbki, wspierając badania nad chorobami mitochondrialnymi.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

Przeglądaj więcej filmów