Stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego
10 stycznia 2025
Ten protokół opisuje rozwój modelu myszy z nadwrażliwością na kaszel, który może służyć jako idealny model do badania mechanizmów przewlekłego kaszlu.
Przewlekły kaszel znacznie pogarsza jakość życia, powodując naglący wygląd i znaczne obciążenie ekonomiczne. Skupiamy się na uporczywości kaszlu, a zwłaszcza na mechanizmie nadwrażliwości na kaszel. Ustalamy mysi model z nadwrażliwością na kaszel, który zostanie wykorzystany do dalszych badań nad mechanizmem przewlekłego kaszlu. W porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, zwłaszcza świnkami morskimi, łatwiejszy w utrzymaniu, bardziej opłacalny i podatny na manipulacje genetyczne. Nasz protokół jest prosty w obsłudze. Model jest łatwiejszy do skontrastowania. MA jest bardziej wykonalne. Model ten będzie również cenny dla dalszych badań nad mechanizmem i potencjalnymi nowymi metodami leczenia przewlekłego kaszlu.
[Narrator] Na początek umieść myszy w dwóch niezależnych komorach, z których każda jest podłączona do nebulizatora ultradźwiękowego. Wystaw grupę modelową na działanie 0,1 molowego aerozolu kwasu cytrynowego, a grupę kontrolną na 0,9% normalnego aerozolu soli fizjologicznej. Ustaw szybkość atomizacji na maksymalną wartość trzech mililitrów na minutę i dostosuj ekspozycję do dwóch godzin dziennie przez dwa tygodnie. Po każdej sesji umieść myszy z powrotem w odpowiednich klatkach. Skonfiguruj nieinwazyjny system pletyzmografii całego ciała, aby zmierzyć wrażliwość na kaszel. Podłącz komory, przetworniki przepływu, przepływ polaryzacyjny i inne elementy. Skalibruj system, klikając przycisk Kalibruj, aby zapewnić dokładne pomiary. Następnie utwórz nowe badanie kaszlu w oprogramowaniu systemowym dla myszy. Skonfiguruj parametry badania tak, aby zapewnić jedną minutę na aklimatyzację, 10 minut na czas odpowiedzi i 10 minut na dostarczenie roztworu chemicznego. Następnie umieść każdą przytomną mysz w osobnych komorach, upewniając się, że tylko jedna mysz na komorę. Następnie dodaj jeden mililitr odpowiedniego roztworu chemicznego, takiego jak sól fizjologiczna, kwas cytrynowy lub kapsaicyna do nebulizatora, aby zarejestrować liczbę przypadków kaszlu po rozpoczęciu zabiegu. Przygotuj przyrządy do pomiaru nadreaktywności dróg oddechowych. Utwórz badanie odpowiedzi na dawkę w oprogramowaniu systemowym dla myszy. Skonfiguruj parametry pomiaru i sekwencję zadań. Jedna minuta na aklimatyzację, 30 sekund na dostarczenie metacholiny, trzy minuty na czas reakcji i jedna minuta na regenerację. Umieść każdą przytomną mysz w osobnych komorach, upewniając się, że na komorę przypada tylko jedna mysz. Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS lub metacholiny do nebulizatora i rozpocznij badanie. Zapisać wartość Penh, która wskazuje na zwężenie oskrzeli w odpowiedzi na rosnące stężenie metacholiny. Wrażliwość na kaszel znacznie wzrosła w grupie modelowej po tygodniu i utrzymywała się przez cały okres ekspozycji. W trakcie badania nie zaobserwowano śmiertelności ani w grupie modelowej, ani w grupie kontrolnej. Po ekspozycji liczba spontanicznych epizodów kaszlu była istotnie wyższa w grupie modelowej niż w grupie kontrolnej. Wrażliwość na kaszel wywołana zwykłą solą fizjologiczną, kwasem cytrynowym i kapsaicyną była również istotnie wyższa w grupie modelowej po ekspozycji. Nadreaktywność dróg oddechowych pozostała porównywalna między obiema grupami, bez istotnej różnicy po modelowaniu. Na początek zbierz krew z zatoki oczodołowej myszy poddanej eutanazji do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umieść probówkę na lodzie, odwiruj krew o sile 3000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety zebrać supernatant i podzielić go na porcje. Następnie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić tchawicę i włóż igłę o rozmiarze 22 do tchawicy. Przepłukać tchawicę trzykrotnie 0,5 mililitra wstępnie schłodzonego PBS i zebrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Następnie odwirować zebrany płyn o sile 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant, podwielokrotnić go i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach PBS. Otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i ostrożnie usuń tkanki płucne. Pobrane tkanki płucne umieścić w fiolkach kriogenicznych. Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami w całkowitej liczbie komórek zapalnych i różnicowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje opracowanie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel, który może służyć jako idealny model do badania mechanizmów kaszlu przewlekłego. Model ten jest łatwiejszy w utrzymaniu i bardziej efektywny kosztowo w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fizjologia układu oddechowego
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Przewlekły kaszel znacząco pogarsza jakość życia.
- Zrozumienie nadwrażliwości na kaszel jest kluczowe dla opracowania metod leczenia.
- Modele mysie oferują korzyści w zakresie manipulacji genetycznych.
- Celem niniejszego badania jest stworzenie wiarygodnego modelu do celów badawczych.
Cel badania
- Opracowanie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel.
- Zbadanie mechanizmów leżących u podłoża przewlekłego kaszlu.
- Ocena potencjalnych metod leczenia przewlekłego kaszlu.
Zastosowane metody
- Ekspozycja myszy na aerozol z kwasu cytrynowego oraz sól fizjologiczną.
- Pomiar wrażliwości na kaszel przy użyciu pletyzmografii całego ciała.
- Ocena nadreaktywności dróg oddechowych z użyciem metacholiny.
- Pobranie płynu z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego oraz tkanek płuc do analizy.
Główne wyniki
- Wrażliwość na kaszel znacznie wzrosła w grupie modelowej.
- W żadnej z grup nie odnotowano śmiertelności podczas badania.
- W grupie modelowej zaobserwowano większą liczbę spontanicznych napadów kaszlu.
- Nadreaktywność dróg oddechowych pozostała na porównywalnym poziomie w obu grupach.
Wnioski
- Ustanowiony model mysi jest skuteczny w badaniu przewlekłego kaszlu.
- Wyniki wspierają dalsze badania nad mechanizmami kaszlu.
- Model ten może pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie powtarzalnego modelu nadwrażliwości na kaszel u myszy poprzez inhalację kwasu cytrynowego wypełnia krytyczną lukę w badaniach nad chorobami układu oddechowego, umożliwiając prowadzenie badań mechanistycznych z możliwością modyfikacji genetycznych. Model ten zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz minimalizuje ryzyko we wczesnych etapach opracowywania leków na schorzenia dróg oddechowych. Jego operacyjna prostota i skalowalność ułatwiają szerokie zastosowanie w badaniach nad przewlekłym kaszlem oraz nadwrażliwością dróg oddechowych w ramach całych portfeli badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów nadwrażliwości na kaszel w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie reakcji kaszlowych na określone bodźce.
- Ułatwia biologiczną ocenę ryzyka dla celów terapeutycznych w leczeniu przewlekłego kaszlu przed etapem optymalizacji wiodących związków.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę in vivo do oceny kandydatów na leki przeciwkaszlowe.
- Dostarcza ilościowych wyników zdarzeń kaszlowych, odpowiednich do porównawczej oceny związków.
- Umożliwia skalowalność testów i powtarzalność między badaniami dzięki nieinwazyjnej pletyzmografii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu przewlekłego kaszlu i nadwrażliwości dróg oddechowych.
- Wspiera ciągłość przejścia od odkryć mechanistycznych do przedklinicznej oceny skuteczności.
- Umożliwia integrację analizy biomarkerów i tkanek w celu uzyskania wglądu translacyjnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten plasuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między badaniami mechanicznymi a walidacją translacyjną w odniesieniu do wskazań dotyczących układu oddechowego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków kaszlu i przebudowy nerwów sensorycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary wrażliwości na kaszel w celu selekcji związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie zdarzeń kaszlowych i reaktywności dróg oddechowych pomiędzy grupami.
- Badania translacyjne: Ułatwia pozyskiwanie biomarkerów i tkanek do dalszych analiz.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, podatną na modyfikacje genetyczne platformę dla różnorodnych programów badań nad układem oddechowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad przewlekłym kaszlem.
- Wartość operacyjna: Dostarcza znormalizowane, powtarzalne i kosztowo efektywne testy in vivo.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału w portfelach badawczych dotyczących układu oddechowego.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację celów i kandydatów w leczeniu przewlekłego kaszlu z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się ze zwierzętami oraz w fizjologii układu oddechowego.
- Wymaga dostępu do systemów pletyzmografii i aparatury do podawania aerozoli.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekspozycji i pomiarów pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do manipulacji genetycznych i farmakologicznych u myszy.
- Ograniczone do punktów końcowych i bodźców zwalidowanych w ramach systemu modelowego.
