Name: Stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego. Ten protokół umożliwia badanie mechanizmów przewlekłego kaszlu i testowanie nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 82100034), Guangzhou Science and Technology Planning Project (202102010168).

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (20230656). W badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6 wolne od specyficznych patogenów w wieku 8-10 tygodni i o wadze 20-25 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie odczynnika chemicznego
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu kwasu cytrynowego (CA)
	<ol>
		<li>W celu oceny kaszlu należy przygotować 0,4 M roztwór, rozpuszczając 3,84 g kwasu cytrynowego w proszku w zwykłej soli fizjologicznej do końcowej objętości 50 ml.</li>
		<li>Do leczenia zwierząt należy przygotować 0,1 M roztwór, rozpuszczając 9,6 g proszku kwasu cytrynowego w roztworze soli fizjologicznej do końcowej objętości 500 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu kapsaicyny
	<ol>
		<li>Rozpuścić 30,5 mg kapsaicyny w proszku w PBS zawierającym 10% etanolu i 10% Tween-80, aby uzyskać 10 mM roztwór podstawowy.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1:100 w roztworze soli fizjologicznej, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 100 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu metacholiny
	<ol>
		<li>Rozpuścić 100 mg proszku metacholiny w PBS do końcowej objętości 2 ml w celu uzyskania roztworu o stężeniu 50 mg/ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć ten roztwór PBS, aby uzyskać stężenia 25 mg/ml, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/ml i 3,125 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Warunki mieszkaniowe
	<ol>
		<li>Myszy domowe w klatkach ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody, utrzymywane w temperaturze 22 ± 1 °C ze standardowym 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Manipulacje eksperymentalne przeprowadzono po 1 tygodniu od aklimatyzacji do środowiska żywieniowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aklimatyzacja
	<ol>
		<li>Pozwól myszom zaaklimatyzować się w środowisku żywieniowym przez 1 tydzień przed przeprowadzeniem eksperymentalnych manipulacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozwój modelu
<ol>
	<li>Przypisanie do grupy
	<ol>
		<li>Losowo podziel myszy na grupę modelową i grupę kontrolną, po 8 myszy w każdej grupie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienie ekspozycji
	<ol>
		<li>Umieść myszy w dwóch niezależnych komorach (jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1), każda podłączona do nebulizatora ultradźwiękowego.</li>
		<li>Wystaw grupę modelową na działanie 0,1 M aerozolu kwasu cytrynowego (CA), a grupę kontrolną na 0,9% aerozolu soli fizjologicznej (NS) z szybkością rozpylania 3 ml / min przez 2 godziny dziennie przez 2 tygodnie (jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Wróć myszy do klatek po każdej ekspozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena wrażliwości na kaszel
	<ol>
		<li>Po ostatniej ekspozycji oceń wrażliwość na kaszel, oceniając kaszel odruchowy (prowokowany NS, CA (0,4 M) i kapsaicyną (100 μM)) oraz kaszel spontaniczny (bez żadnej prowokacji). 
		UWAGA: Aby monitorować dynamiczne zmiany wrażliwości na kaszel podczas opracowywania modelu, oceń wrażliwość na kaszel w dniach 0, 3, 7 i 10 za pomocą prowokacji CA (0,4 M).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena wrażliwości na kaszel
<ol>
	<li>Przygotowanie instrumentu
	<ol>
		<li>Użyj nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) do pomiaru wrażliwości na kaszel. Podłączyć komory, przetworniki przepływu, przepływ polaryzacyjny i inne elementy zgodnie z instrukcją aplikacji (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przeprowadź proces kalibracji, aby zapewnić dokładne pomiary, klikając przycisk Kalibruj. Na ekranie stanu zostanie wyświetlony postęp, a gdy pasek stanu osiągnie 100%, kalibracja zostanie zakończona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie kaszlu
	<ol>
		<li>Utwórz badanie kaszlu dla myszy i skonfiguruj parametry dla 1 minuty aklimatyzacji, 10 minut czasu odpowiedzi i 10 minut dostarczania roztworu chemicznego.</li>
		<li>Umieść przytomne myszy w osobnych komorach, upewniając się, że w każdej komorze jest tylko jedna mysz. 
		UWAGA: Upewnij się, że mysz jest całkowicie w komorze przed zamknięciem pokrywy, aby uniknąć uszkodzenia jej ogona i palców.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworów chemicznych (NS, CA lub kapsaicyny) do nebulizatora. 
		UWAGA: Liczba przypadków kaszlu - z których każda składa się z trzech faz: wdechowej, uciskowej i wydalającej15 (jak pokazano w Rysunek 3)- zostanie zarejestrowana po rozpoczęciu badania. Po 10 minutach nagrywania wykrywanie kaszlu zostanie zakończone. Wyczyść komorę po wykryciu każdego zwierzęcia, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar nadreaktywności dróg oddechowych (AHR)
<ol>
	<li>Przygotowanie instrumentu
	<ol>
		<li>Przygotuj instrumenty zgodnie z opisem w kroku 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar AHR
	<ol>
		<li>Utwórz badanie dawka-odpowiedź dla myszy, konfigurując typy pomiarów, parametry i sekwencję zadań: 1 minuta na aklimatyzację, 30 s na dostarczenie roztworu metacholiny, 3 minuty na czas odpowiedzi i 1 minuta na powrót do zdrowia.</li>
		<li>Umieść przytomne myszy w indywidualnych komorach, upewniając się, że w każdej komorze jest tylko jedna mysz.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworów chemicznych (PBS lub metacholiny) do nebulizatora i rozpocząć badanie.</li>
		<li>Zapisz wartość Penh, wskaźnika zwężenia oskrzeli, w odpowiedzi na różne stężenia metacholiny (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kolekcja płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
<ol>
	<li>poświęcenie
	<ol>
		<li>Uśmierc myszy za pomocą znieczulenia z pentobarbitalem sodowym (50 mg / kg) podawanym we wstrzyknięciu dootrzewnowym (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Zbierz krew z zatoki oczodołowej myszy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie umieść probówkę na lodzie. Odwirować krew o stężeniu 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Za pomocą pipety zebrać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Zebrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), otwierając klatkę piersiową w celu odsłonięcia tchawicy, wprowadzając igłę o sile 22 G do tchawicy, a następnie trzykrotnie przepłukując 0,5 ml wstępnie schłodzonego PBS i zbierając płyn.</li>
		<li>Po zebraniu należy odwirować BALF przy stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zawiesić osad w 100 μl PBS i przygotować rozmazy komórek do dalszej analizy.</li>
		<li>Zbierz tkanki płucne, otwierając klatkę piersiową, aby odsłonić płuca, usuwając tkanki płucne i umieszczając je w fiolkach kriogenicznych. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C do przyszłych badań.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Ekstrahuj całkowite RNA z tkanki płucnej za pomocą odczynnika TRIzol. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przeprowadzanie PCR w ilościowym systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zielonej fluorescencji SYBR. Znormalizuj kwantyfikację względnej ekspresji mRNA SP i CGRP do wyrażenia β-Actin9.</li>
</ol>
8. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przedstaw dane jako średnią ± SEM. Użyj testu t, aby porównać dane między dwiema grupami, uznając P < 0,05 za statystycznie istotne. Przeprowadzaj wszystkie analizy statystyczne za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego.</li>
</ol>

Citric Acid-Induced Mouse Model for Cough Hypersensitivity

<ol><li>Morice, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+cough%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of cough.</a> Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).</li>
<li>Lai, K., Long, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+future+directions+of+chronic+cough+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Current status and future directions of chronic cough in China.</a> Lung. 198 (1), 23-29 (2020).</li>
<li>Zeiger, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-reported+burden+of+chronic+cough+in+a+managed+care+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol+Pract%22%5BJournal%5D)">Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization.</a> J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).</li>
<li>Chamberlain, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chronic+cough%3A+A+cross-sectional+European+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey.</a> Lung. 193 (3), 401-408 (2015).</li>
<li>Morice, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+opinion+on+the+cough+hypersensitivity+syndrome+in+respiratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine.</a> Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).</li>
<li>Mazzone, S. B., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+afferent+innervation+of+the+airways+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Vagal afferent innervation of the airways in health and disease.</a> Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).</li>
<li>Shapiro, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+sensory+nerve+density+is+increased+in+chronic+cough%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Airway sensory nerve density is increased in chronic cough.</a> Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).</li>
<li>Ando, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+cough+hypersensitivity+in+humans%3A+Evidence+for+central+sensitization+and+dysfunctional+inhibitory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control.</a> Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).</li>
<li>Plevkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cough%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cough.</a> Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656(2021).</li>
<li>Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitussive+effects+of+memantine+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Antitussive effects of memantine in guinea pigs.</a> Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).</li>
<li>Hewitt, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+bradykinin-evoked+coughing+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs.</a> J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitussive+activity+of+the+Schisandra+chinensis+fruit+polysaccharide+%28SCFP-1%29+in+guinea+pigs+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models.</a> J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Schisandra+chinensis+extracts+on+cough+and+pulmonary+inflammation+in+a+cough+hypersensitivity+guinea+pig+model+induced+by+cigarette+smoke+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure.</a> J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Shiwei+longdanhua+formula+on+LPS-induced+airway+mucus+hypersecretion%2C+cough+hypersensitivity%2C+oxidative+stress+and+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation.</a> Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).</li>
<li>Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mouse+cough+based+on+sound+monitoring+and+respiratory+airflow+waveforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms.</a> PLoS One. 8 (3), e59263(2013).</li>
<li>Gibson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+unexplained+chronic+cough%3A+Chest+guideline+and+expert+panel+report%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report.</a> Chest. 149 (1), 27-44 (2016).</li>
<li>Nakaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+remodeling+associated+with+cough+hypersensitivity+as+a+consequence+of+persistent+cough%3A+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Investig%22%5BJournal%5D)">Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study.</a> Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+cough+hypersensitivity+with+tracheal+trpv1+activation+and+neurogenic+inflammation+in+a+novel+guinea+pig+model+of+citric+acid-induced+chronic+cough%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough.</a> J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).</li>
<li>Iwata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+postnasal+drip+evokes+cough%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough.</a> PLoS One. 10 (11), e0141823(2015).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+mouse+model+with+all+four+clinical+features+of+eosinophilic+bronchitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis.</a> Sci Rep. 10 (1), 10557(2020).</li>
<li>Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cough+and+expiration+reflexes+elicited+by+inhaled+irritant+gases+are+intensified+in+ovalbumin-sensitized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).</li>
<li>Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citric+acid+bioproduction%3A+The+technological+innovation+change%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Citric acid bioproduction: The technological innovation change.</a> Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).</li>
<li>Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+and+future+prospects+for+enhancing+microbial+production+of+citric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).</li>
<li>Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cough+challenge+in+the+assessment+of+cough+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cough challenge in the assessment of cough reflex.</a> Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu udało się ustalić model mysi z nadwrażliwością na kaszel poprzez ciągłe wdychanie kwasu cytrynowego (CA). Model ten wykazał wiarygodny wzrost wrażliwości na kaszel zarówno w przypadku kaszlu spontanicznego, jak i odruchowego wywołanego przez kwas cytrynowy i kapsaicynę. Kwas cytrynowy i kapsaicyna są szeroko stosowane do oceny wrażliwości odruchu kaszlowego16.
Kilka krytycznych kroków w tym ...

Kaszel jest kluczowym odruchem obronnym, który pomaga usunąć wydzieliny z dróg oddechowych lub ciała obce z dróg oddechowych. Jest to jednak również jeden z najczęstszych objawów wielu chorób układu oddechowego, często skłaniający pacjentów do szukania pomocy medycznej1. Przewlekły kaszel, definiowany jako uporczywy kaszel trwający dłużej niż 8 tygodni u dorosłych, znacząco wpływa na jakość życia, powodując problemy, takie jak nietrzymanie moczu, bezsenność, refluks i inne nieprzyjemne doświadczenia, a także znaczne obciążenie ekonomiczne2,3,4. Powszechnie uważa się, że zwiększona wrażliwość na kaszel jest patofizjologiczną cechą charakterystyczną przewlekłego kaszlu, gdzie niski poziom termicznych, mechanicznych i chemicznych czynników drażniących może wywołać kaszel5. Nadwrażliwość na kaszel jest związana z zapaleniem dróg oddechowych6, przebudową nerwów czuciowych dróg oddechowych7 oraz zmianami w ośrodkowym układzie nerwowym8, chociaż dokładne mechanizmy molekularne pozostają niejasne i wymagają dalszego wyjaśnienia za pomocą odpowiednich modeli zwierzęcych.
Różne zwierzęta, w tym świnki morskie, koty, króliki, psy i świnie, zostały wykorzystane do badania mechanizmów kaszlu9. Świnki morskie są tradycyjnie uznawane za najbardziej odpowiedni model do badania mechanizmów kaszlu i skuteczności leków przeciwkaszlowych9,10,11,12. Modele te mają jednak kilka ograniczeń eksperymentalnych, w tym wysokie koszty, brak narzędzi transgenicznych i niedobór komercyjnych odczynników. Ponadto świnki morskie często wykazują słabą tolerancję środowiskową i wysoką śmiertelność pod wpływem bodźców. W przeciwieństwie do tego, myszy są mniejsze, łatwiejsze w utrzymaniu, bardziej opłacalne i podatne na manipulacje genetyczne, co czyni je bardziej odpowiednimi do badań mechanistycznych. Wcześniejsze badania nad modelami kaszlu koncentrowały się przede wszystkim na kaszlu wywołanym zapaleniem dróg oddechowych, używanym głównie do oceny skuteczności leków przeciwkaszlowych i mechanizmów obwodowych13,14. Obecnie brakuje modeli zwierzęcych nadwrażliwości na kaszel.
W odpowiedzi wprowadzamy metodę tworzenia mysiego modelu nadwrażliwości na kaszel poprzez ciągłe wdychanie kwasu cytrynowego (CA). Ten model jest prostszy, łatwiejszy do skonstruowania i bardziej wykonalny w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi.

<table><tbody><tr><td>0,9% sól fizjologiczna</td><td>Biosharp</td><td>BL158A</td><td></td></tr><tr><td>Kapsaicyna</td><td>Kajman chemiczna</td><td>92350</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie</td><td>GSHB15-AR-0,5L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA</td><td>TransGen Biotech</td><td>AT341</td><td></td></tr><tr><td>Metacholina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2251</td><td></td></tr><tr><td>Nieinwazyjny system pletyzmografii całego ciała (WBP)</td><td>DSI</td><td>601-1400-001</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>Merk</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>PerfectStart Green qPCR SuperMix</td><td>TransGen Biotech</td><td>AQ601</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Meilunbio</td><td>MA0015</td><td></td></tr><tr><td>W czasie rzeczywistym&nbsp; ilościowe&nbsp; PCR&nbsp; Wykrywanie&nbsp; system</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>Sterownik CFX&nbsp; Connect</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Solarbio</td><td>T8360-100</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizator ultradźwiękowy</td><td>Yuwell</td><td>402AI</td><td></td></tr></tbody></table>

stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego

Establishment of a Mouse Model with Cough Hypersensitivity via Inhalation of Citric Acid

Kaszel jest jednym z najczęstszych objawów wielu chorób układu oddechowego. Przewlekły kaszel znacząco wpływa na jakość życia i stanowi znaczne obciążenie ekonomiczne. Zwiększona wrażliwość na kaszel jest patofizjologiczną cechą charakterystyczną przewlekłego kaszlu. Zaobserwowano, że nadwrażliwość na kaszel jest związana z zapaleniem dróg oddechowych, przebudową nerwów czuciowych dróg oddechowych i zmianami w ośrodkowym układzie nerwowym. Jednak dokładne mechanizmy molekularne pozostają niejasne i wymagają dalszych wyjaśnień przy użyciu odpowiednich modeli zwierzęcych. Poprzednie badania wykorzystywały świnki morskie jako modele do badania kaszlu, ale modele te mają kilka ograniczeń eksperymentalnych, w tym wysokie koszty, brak narzędzi transgenicznych i niedobór komercyjnych odczynników. Ponadto świnki morskie zazwyczaj wykazują słabą tolerancję środowiskową i wysoką śmiertelność pod wpływem bodźców. W przeciwieństwie do tego, myszy są mniejsze, łatwiejsze w utrzymaniu, bardziej opłacalne i podatne na manipulacje genetyczne, co czyni je bardziej odpowiednimi do badań mechanistycznych. W tym badaniu ustaliliśmy model myszy z nadwrażliwością na kaszel via ciągłym wdychaniu kwasu cytrynowego (CA). Model ten jest prosty w obsłudze i daje powtarzalne wyniki, co czyni go cennym narzędziem do dalszych badań nad mechanizmami i potencjalnymi nowymi metodami leczenia przewlekłego kaszlu.

Jak pokazano w Rycina 4Awrażliwość na kaszel w grupie modelowej (grupa CA) znacznie wzrosła po 1 tygodniu ekspozycji w porównaniu z grupą kontrolną (grupa NS), a zwiększona wrażliwość utrzymywała się przez cały okres ekspozycji. W grupie kontrolnej, jak i w grupie modelowej, nie odnotowano śmiertelności myszy podczas procesu modelowania (Rysunek 4B). Rysunek 4C i Rycina 4D wykazano, że liczba spontanicznych epizodów kaszlu istot...

Ten protokół opisuje rozwój modelu myszy z nadwrażliwością na kaszel, który może służyć jako idealny model do badania mechanizmów przewlekłego kaszlu.

Stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego

Cough is one of the most common symptoms of many respiratory diseases. Chronic cough significantly impacts quality of life and imposes a considerable ...

Przewlekły kaszel znacznie pogarsza jakość życia, powodując naglący wygląd i znaczne obciążenie ekonomiczne. Skupiamy się na uporczywości kaszlu, a zwłaszcza na mechanizmie nadwrażliwości na kaszel. Ustalamy mysi model z nadwrażliwością na kaszel, który zostanie wykorzystany do dalszych badań nad mechanizmem przewlekłego kaszlu. W porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, zwłaszcza świnkami morskimi, łatwiejszy w utrzymaniu, bardziej opłacalny i podatny na manipulacje genetyczne. Nasz protokół jest prosty w obsłudze. Model jest łatwiejszy do skontrastowania. MA jest bardziej wykonalne. Model ten będzie również cenny dla dalszych badań nad mechanizmem i potencjalnymi nowymi metodami leczenia przewlekłego kaszlu.[Narrator] Na początek umieść myszy w dwóch niezależnych komorach, z których każda jest podłączona do nebulizatora ultradźwiękowego. Wystaw grupę modelową na działanie 0,1 molowego aerozolu kwasu cytrynowego, a grupę kontrolną na 0,9% normalnego aerozolu soli fizjologicznej. Ustaw szybkość atomizacji na maksymalną wartość trzech mililitrów na minutę i dostosuj ekspozycję do dwóch godzin dziennie przez dwa tygodnie. Po każdej sesji umieść myszy z powrotem w odpowiednich klatkach. Skonfiguruj nieinwazyjny system pletyzmografii całego ciała, aby zmierzyć wrażliwość na kaszel. Podłącz komory, przetworniki przepływu, przepływ polaryzacyjny i inne elementy. Skalibruj system, klikając przycisk Kalibruj, aby zapewnić dokładne pomiary. Następnie utwórz nowe badanie kaszlu w oprogramowaniu systemowym dla myszy. Skonfiguruj parametry badania tak, aby zapewnić jedną minutę na aklimatyzację, 10 minut na czas odpowiedzi i 10 minut na dostarczenie roztworu chemicznego. Następnie umieść każdą przytomną mysz w osobnych komorach, upewniając się, że tylko jedna mysz na komorę. Następnie dodaj jeden mililitr odpowiedniego roztworu chemicznego, takiego jak sól fizjologiczna, kwas cytrynowy lub kapsaicyna do nebulizatora, aby zarejestrować liczbę przypadków kaszlu po rozpoczęciu zabiegu. Przygotuj przyrządy do pomiaru nadreaktywności dróg oddechowych. Utwórz badanie odpowiedzi na dawkę w oprogramowaniu systemowym dla myszy. Skonfiguruj parametry pomiaru i sekwencję zadań. Jedna minuta na aklimatyzację, 30 sekund na dostarczenie metacholiny, trzy minuty na czas reakcji i jedna minuta na regenerację. Umieść każdą przytomną mysz w osobnych komorach, upewniając się, że na komorę przypada tylko jedna mysz. Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS lub metacholiny do nebulizatora i rozpocznij badanie. Zapisać wartość Penh, która wskazuje na zwężenie oskrzeli w odpowiedzi na rosnące stężenie metacholiny. Wrażliwość na kaszel znacznie wzrosła w grupie modelowej po tygodniu i utrzymywała się przez cały okres ekspozycji. W trakcie badania nie zaobserwowano śmiertelności ani w grupie modelowej, ani w grupie kontrolnej. Po ekspozycji liczba spontanicznych epizodów kaszlu była istotnie wyższa w grupie modelowej niż w grupie kontrolnej. Wrażliwość na kaszel wywołana zwykłą solą fizjologiczną, kwasem cytrynowym i kapsaicyną była również istotnie wyższa w grupie modelowej po ekspozycji. Nadreaktywność dróg oddechowych pozostała porównywalna między obiema grupami, bez istotnej różnicy po modelowaniu. Na początek zbierz krew z zatoki oczodołowej myszy poddanej eutanazji do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umieść probówkę na lodzie, odwiruj krew o sile 3000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety zebrać supernatant i podzielić go na porcje. Następnie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić tchawicę i włóż igłę o rozmiarze 22 do tchawicy. Przepłukać tchawicę trzykrotnie 0,5 mililitra wstępnie schłodzonego PBS i zebrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Następnie odwirować zebrany płyn o sile 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant, podwielokrotnić go i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach PBS. Otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i ostrożnie usuń tkanki płucne. Pobrane tkanki płucne umieścić w fiolkach kriogenicznych. Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami w całkowitej liczbie komórek zapalnych i różnicowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

establishment-mouse-model-with-cough-hypersensitivity-via-inhalation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Ten protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu krzemicy poprzez wielokrotne wystawienie na działanie zawiesin krzemionki za pomocą kroplówki z nosa. Model ten może wydajnie, wygodnie i elastycznie naśladować patologiczny proces krzemicy u ludzi z wysoką powtarzalnością i oszczędnością.

Mysi model krzemicy utworzony przez wielokrotne wdychanie krystalicznego pyłu krzemionkowego

Ten artykuł przedstawia uproszczony protokół tworzenia modelu zapalenia miazgi u myszy za pomocą innowacyjnego knebla ustnego, po którym następuje analiza histologiczna.

Opracowanie modelu ekspozycji miazgi mysiej z nowatorskim kneblem do badań nad zapaleniem miazgi

Tutaj opisujemy pomiar kaszlu za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym oraz procedury normatywne pobierania próbek tkanek myszy i wprowadzamy pewne metody oceny stanu zapalnego dróg oddechowych.

Metody wykrywania kaszlu i zapalenia dróg oddechowych u myszy

Badanie to ustanowiło modele kaszlu i kichania u myszy poprzez zastosowanie specyficznych bodźców do tchawicy i jamy nosowej oraz opracowało metodę opartą na dźwięku do rozróżniania kaszlu od kichania myszy poprzez analizę różnic w ich sygnałach akustycznych.<br...

Precyzyjna indukcja i rozróżnienie odruchów kaszlu i kichania u myszy

Poznaj metodę tworzenia modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego. Ten protokół umożliwia badanie mechanizmów przewlekłego kaszlu i testowanie nowych terapii.

Stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego

Przeglądaj więcej filmów