Name: Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji sialilowanych glikokoniugatów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej. Technika ta zwiększa rozdzielczość przestrzenną bez konieczności stosowania drogiego sprzętu do mikroskopii superrozdzielczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy obiektom TisBio i platformie PLBS za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tej pracy. Prace te były wspierane przez granty CNRS i Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Chcielibyśmy podziękować dr François Foulquierowi, dr Zoé Durin, pani Dorothée Vicogne i pani Céline Schulz za inspirację do dyskusji i dostarczenie nam linii komórkowej Fibroblast 533T i podstawowego przeciwciała GM130.

Expansion Microscopy for Visualizing Intracellular Sialylated Glycans via MOE

<ol><li>De Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+at+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light microscopy at the limit.</a> Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).</li>
<li>Tam, J., Merino, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29+in+comparison+with+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+and+other+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods.</a> J Neurochem. 135, 643-658 (2015).</li>
<li>Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+STED+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for STED optical nanoscopy.</a> Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543548(2015).</li>
<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+a+thermally+adjustable+expansion+factor+using+thermoresponsive+biospecimen-hydrogel+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).</li>
<li>Dube, D., Bertozzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+oligosaccharide+engineering+as+a+tool+for+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).</li>
<li>Scache, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+azide+and+alkyne+tags+on+bioorthogonal+reporters+in+metabolic+labeling+of+sialylated+glycoconjugates%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study.</a> Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).</li>
<li>Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+characteristics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Glycosylation characteristics of colorectal cancer.</a> Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).</li>
<li>Boyaval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycomic+signature+of+stage+II+colorectal+cancer+and+its+association+with+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).</li>
<li>Ferreira, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+gastric+and+colorectal+cancers%3A+Toward+cancer+detection+and+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics.</a> Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).</li>
<li>Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacteria+utilize+sialic+acid+during+interactions+with+the+host%3A+snip%2C+snatch%2C+dispatch%2C+match+and+attach%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach.</a> Microbiology. 168 (3), 001157(2022).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Vanbeselaere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkynyl+monosaccharide+analogues+as+a+tool+for+evaluating+Golgi+glycosylation+efficiency%3A+application+to+Congenital+Disorders+of+Glycosylation+%28CDG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG).</a> Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+glycomics+enrichment%3A+imaging+the+recycling+of+sialic+acid+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells.</a> J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).</li>
<li>Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+view+your+biomolecule%2C+click+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">To view your biomolecule, click inside the cell.</a> Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cysteine+S-glycosylation+induced+by+per-O-acetylated+unnatural+monosaccharides+during+metabolic+Glycan+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling.</a> Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).</li>
<li>Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glyco-modification+through+an+elimination-addition+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism.</a> J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+Copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide%E2%88%92alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).</li>
<li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne-azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+Fast+bioconjugation+based+on+inverse-electron-demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity.</a> J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+Application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).</li>
<li>Bird, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry and its applications.</a> Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).</li>
<li>Slade, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+CHO+secretome+using+mucin-type+O-linked+glycosylation+and+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry.</a> J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).</li>
<li>Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM).</a> Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Santiago, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+swelling+behaviour+of+poly%28sodium+acrylate%29%2Fsepiolite+superabsorbent+composites+and+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Polym+Int%22%5BJournal%5D)">Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites.</a> Polym Int. 55 (8), 843848(2006).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+expansion+microscopy%3A+Chemical+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications.</a> Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).</li>
<li>Drelich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high+spatially+resolved+proteomics+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy.</a> Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+multifunctional+polymer+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with multifunctional polymer dots.</a> Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Obecny protokół znakowania CuAAC nie zawiera aminoguanidyny w buforze reakcyjnym. Ponieważ jest on nakierowany na wizualizację wewnątrzkomórkowych glikokonjugatów, przeprowadza się go na komórkach utrwalonych po etapie metabolicznej inkorporacji, aby uniknąć problemów związanych z cytotoksycznością i poprawić pobieranie układu katalitycznego. Stosowanie aminoguanidyny jest zazwyczaj zalecane przy znakowaniu powierzchni komórek żywych, aby zapobiec reakcjom bocznym między dehydroaskorbinianem a resztami argininy, histydyn...

Mikroskopia fluorescencyjna, choć jest powszechnie stosowana do znakowania i wizualizacji specyficznych cząsteczek wewnątrz komórek, jest z natury ograniczona w rozdzielczości przez limit dyfrakcyjny Abbe1, który ogranicza możliwość rozróżnienia obiektów oddalonych od siebie o mniej niż około 200-250 nm. Ograniczenie to wynika z falowej natury światła oraz apertury numerycznej obiektywu mikroskopu, co stanowi wyzwanie podczas obrazowania struktur podkomórkowych. Przełamanie tych ograniczeń pozwala na lepsze zrozumienie określonych procesów biologicznych w skali nanometrycznej.
Aby przekroczyć limit dyfrakcyjny światła, opracowano techniki mikroskopii super-rozdzielczej, takie jak STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) oraz STED (Stimulated Emission Depletion)2,3. Metoda STORM opiera się na stochastycznej aktywacji fluoroforów, co pozwala na obrazowanie jedynie rzadkiego podzbioru z nich w danym czasie. Umożliwia to precyzyjną lokalizację poszczególnych fluoroforów, co pozwala na rekonstrukcję obrazu o wysokiej rozdzielczości. Z kolei metoda STED poprawia rozdzielczość poprzez zastosowanie lasera wygaszającego, który selektywnie tłumi fluorescencję na obrzeżach plamki wzbudzenia, skutecznie zwężając funkcję rozproszenia punktu.
Podejścia te kontrastują z mikroskopią szerokopolową lub konfokalną, w której wszystkie fluorofory są wykrywane jednocześnie, co skutkuje obrazem łączącym wszystkie wzory dyfrakcyjne i uniemożliwia rozróżnienie blisko położonych pojedynczych fluoroforów, prowadząc do utraty rozdzielczości. Jednak metody superrozdzielcze wymagają bardzo specyficznych źródeł światła, sprzętu, przygotowania próbek i/lub fluoroforów, co sprawia, że technologie te są kosztowne, trudno dostępne w większości laboratoriów i wymagające w implementacji w rutynowych eksperymentach. Ograniczenia te skłoniły społeczność naukową do poszukiwania alternatywnych rozwiązań pozwalających na osiągnięcie wyższej rozdzielczości, które byłyby kompatybilne z powszechnie dostępnym sprzętem mikroskopowym i rutynowymi protokołami barwienia. W 2015 roku Boyden i współpracownicy opracowali metodę obejścia ograniczeń mikroskopii optycznej poprzez fizyczne powiększenie próbki, nazwaną mikroskopią ekspansyjną (Expansion Microscopy, ExM)4.
ExM to trzystopniowa metoda, która pozwala na uzyskanie szczegółów próbek biologicznych w skali nanometrycznej bez przekraczania granicy dyfrakcyjnej światła (Rysunek 1). Zamiast tego wykorzystuje ona konwencjonalne mikroskopy ograniczone dyfrakcją do obrazowania próbek, które zostały fizycznie powiększone w sposób izotropowy. Pierwszy krok, nazywany żelowaniem, polega na zatopieniu próbki biologicznej, zazwyczaj utrwalonych komórek lub tkanek, w pęczniejącym polielektrolitowym hydrożelu na bazie akrylanu sodu i akryloamidu. Następnie próbka biologiczna poddawana jest działaniu enzymów w celu częściowej degradacji niektórych składników, takich jak białka lub membrany, oraz rozbicia gęstych struktur komórkowych, aby zapewnić równomierne rozszerzanie się komórek. Krok ten, nazywany trawieniem, pomaga osiągnąć ten cel poprzez homogenizację komponentów strukturalnych próbki pod względem właściwości mechanicznych, co zapobiega różnicowemu rozszerzaniu, które mogłoby prowadzić do zniekształcenia próbki. W ostatnim kroku, zwanym ekspansją, zatopiona w hydrożelu i poddana trawieniu próbka jest umieszczana w wodzie dejonizowanej, co powoduje jej pęcznienie. Dzięki tej technologii próbka powiększa się o liniowy współczynnik powiększenia wynoszący około 4-5x w każdym wymiarze, co umożliwia wizualizację drobnych szczegółów komórkowych przy użyciu standardowych technik mikroskopowych. Ze względu na izotropowy charakter ekspansji, próbka biologiczna powiększona wewnątrz macierzy żelowej zachowuje swoje trójwymiarowe szczegóły geometryczne oraz relacje przestrzenne między różnymi komponentami strukturalnymi. Informacje przestrzenne są zatem zachowane podczas pęcznienia, podczas gdy odległość między zakotwiczonymi w żelu znacznikami fluorescencyjnymi lub biomolekułami zwiększa się równomiernie we wszystkich kierunkach. Pozwala to na lepszą separację sygnałów, co skutkuje zwiększoną rozdzielczością.
<img alt="Schemat mikroskopii ekspansyjnej: żelowanie, trawienie, ekspansja; matryca polimerowa, wizualizacja biomolekuł." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd protokołu ExM. (a) Żelowanie: Próbka biologiczna zostaje zakotwiczona i zatopiona w pęczniejącym hydrożelu polielektrolitowym. (b) Trawienie: Właściwości mechaniczne próbki zostają ujednolicone przy użyciu enzymów i detergentów, co prowadzi do rozkładu białek i błon lipidowych, które w przeciwnym razie ograniczałyby ekspansję i powodowały zniekształcenia. (c) Ekspansja: Hydrożel zostaje zanurzony w wodzie dejonizowanej, co powoduje jego izotropową ekspansję. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Od 2015 roku w metodzie ExM wprowadzono znaczące ulepszenia technologiczne w zakresie zachowania informacji przestrzennych. W szczególności zaprojektowano różne kotwice molekularne, które pozwalają na kowalencyjne przytwierdzenie biomolekuł bezpośrednio do pęczniejącego hydrożelu5,6. W niniejszym protokole zastosowano N-akryloylosukcynimid (NAS), który reaguje z wolnymi grupami aminowymi biomolekuł (zazwyczaj resztami lizyny lub pozycjami N-końcowymi białek), aby biokoniugować grupę akryloylową do białek komórkowych, w tym glikoprotein. Grupa akryloylowa ta reaguje następnie z innymi monomerami poprzez reakcje sieciowania podczas żelowania, kotwicząc te biomolekuły bezpośrednio w polimerze.
ExM jest kompatybilna z szeroką gamą metod znakowania, w tym z metaboliczną inżynierią oligosacharydów (MOE). MOE to potężne narzędzie umożliwiające znakowanie glikanów poprzez włączanie analogów prekursorów metabolicznych wyposażonych w bioortogonalny uchwyt chemiczny7. Analogi te, znane jako reportery chemiczne, wbudowują się w szlaki metaboliczne, nie wywołując toksyczności. W podejściu MOE monosacharydy reporterowe są przetwarzane metabolicznie w aktywowane cukry nukleotydowe, a następnie przenoszone na powstające glikokonjugaty. Naszym głównym celem jest badanie sjalilacji, w szczególności wewnątrzkomórkowej dynamiki i transportu sjalilowanych N-glikoprotein, co jest kluczowe w kontekście zdrowia i chorób ze względu na ich rolę w interakcjach międzykomórkowych, regulacji odporności oraz rozwoju. Nieprawidłowa sjalilacja jest zaangażowana w choroby takie jak nowotwory8,9,10,11, choroby zakaźne12 oraz zaburzenia genetyczne13,14,15, co czyni ją kluczowym celem dla rozwoju terapii i odkrywania biomarkerów. Zrozumienie sjalilacji pogłębia wiedzę na temat glikobiologii i mechanizmów chorobowych.
Sjalilację można badać za pomocą MOE, wykorzystując analogi kwasu N-acetylneuraminowego (Neu5Ac), najliczniejszego kwasu sjalowego u ludzi, lub analogi N-acetylmannozaminy (ManNAc), metabolicznego prekursora Neu5Ac, posiadające uchwyt bioortogonalny8,16. ManNAc jest przekształcany w Neu5Ac w cytozolu, a następnie aktywowany do cytydyno-5′-monofosfo-N-kwasu neuraminowego (CMP-Neu5Ac) w jądrze komórkowym. Po aktywacji do cukru nukleotydowego, sjalilotransferazy w aparacie Golgiego przenoszą jednostki Neu5Ac na pozycje terminalne rosnących łańcuchów glikanów (Rysunek 2). Po metabolicznej inkorporacji nienaturalnych pochodnych ManNAc, znakowane sjalilowane glikany mogą zostać kowalencyjnie połączone z fluorophorem posiadającym grupę reaktywną komplementarną do uchwytu reporterowego za pomocą bioortogonalnej chemii klik. Umożliwia to bezpośrednią obserwację glikokonjugatów in vivo lub ex vivo.
W przypadku większości reporterów monosacharydowych, do przenikania przez błonę plazmatyczną drogą dyfuzji biernej wymagana jest forma peracetylowana. Wykazano jednak, że zarówno reportery peracetylowane, jak i niechronione, skutecznie badają sialylację16. Niechronione reportery sialylacji są w stanie wnikać do komórek poprzez mechanizmy transportu aktywnego, a mianowicie pinocytozę w przypadku analogów Neu5Ac oraz za pomocą nieznanego jeszcze transportera dla ManNAc. Choć cukry niechronione wymagają wyższego stężenia (zazwyczaj 100-500 µM), aby osiągnąć porównywalne efekty, po dostaniu się do wnętrza komórki mogą one bezpośrednio wejść na szlak metaboliczny kwasu sialowego. Z kolei cukry peracetylowane muszą zostać całkowicie deacetylowane przez wewnątrzkomórkowe nieswoiste esterazy, zanim staną się metabolicznie aktywne. Mimo że można je stosować w niższych stężeniach (zazwyczaj 10-50 µM), niepełna deacetylacja może zakłócać aktywność enzymów lub prowadzić do wbudowania częściowo acetylowanych analogów kwasu sialowego, co potencjalnie może zafałszować analizę końcową. Dodatkowo uwalnianie kwasu octowego może lokalnie wpływać na pH, co potencjalnie oddziałuje na funkcje komórkowe. Chen i współpracownicy wykazali również, że cukry per-O-acetylowane reagują z wolnymi resztami cysteiny w białkach poprzez mechanizm nieenzymatyczny, co prowadzi do nieswoistego wbudowania i zwiększenia sygnału tła17,18. W niniejszym protokole stosujemy zatem niechronione reportery ManNAc.
<img alt="Schemat szlaku metabolicznego; biosynteza glikanów, reakcja CuAAC, aparat Golgiego, szlak wydzielniczy, komórka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Metaboliczna inżynieria oligosacharydów i znakowanie kwasów sialowych. UDP-GlcNAc jest przekształcany w ManNAc przez domenę 2-epimerazy UDP-GlcNAc białka GNE/MNK w cytozolu. Następnie ManNAc jest fosforylowany w cytozolu przez domenę 6-kinazy ManNAc białka GNE/MNK, w wyniku czego powstaje ManNAc-6-fosforan. N-Syntaza acetylneuraminianu katalizuje kondensację ManNAc-6-P z fosfoenolopirogronianem w celu otrzymania Neu5Ac-9-fosforanu, który jest następnie defosforylowany przez fosfatazę kwasu sialowego, prowadząc do powstania Neu5Ac. Neu5Ac może być również dostarczany poprzez szlak odzyskiwania w procesie endocytozy i recyklingu lizosomalnego.8Po transporcie do jądra komórkowego jest ono przekształcane w CMP-Neu5Ac przez syntetazę kwasu sjalowego CMP. W aparacie Golgiego CMP-NeuAc stanowi substrat dla sjalilotransferaz, które wprowadzają resztę Neu5Ac w pozycjach końcowych glikanów w dojrzewających glikokonjugatach, które ostatecznie są ekspresjonowane w błonie komórkowej lub wydzielane. Chemiczne reportery ManNAz posiadające uchwyt bioortogonalny mogą przenikać do komórki poprzez nieoznaczony transporter aktywny i wchodzić w szlak metaboliczny. Znakowane jednostki Neu5Az włączone w glikany po biosyntezie są następnie znakowane poprzez konjugację sondy fluorescencyjnej za pośrednictwem reakcji CuAAC. Skróty: NAc = N-acetylowy; UDP-GlcNAc = urydynodifosforan N-acetyloglukozamina; ManNAc = N-acetylmannozamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimeraza; MNK = ManNAc 6-kinaza; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosforan; NANS = N-syntaza acetylneuraminianu; PEP = fosfoenolopirogronian; Neu5Ac = N-kwas N-acetylneuraminowy; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosforan; NANP = fosfataza kwasu sialowego; CMP = cytydyna-5′-monofosforan; CMAS = syntetaza CMP-kwasu sialowego; STs = sialylotransferazy; ManNAz = N-azydoacetylmannozamina; Neu5Az = kwas N-azydoacetyloneuraminowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Spośród możliwych reakcji bioortogonalnych skupiliśmy naszą uwagę na miedziowo katalizowanej cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC)16,19. Z naszego doświadczenia wynika, że CuAAC jest najlepszą opcją do znakowania glikanów wewnątrzkomórkowych w utrwalonych komórkach. Reakcja ta jest dobrze ugruntowana, gruntownie zbadana w chemii bioortogonalnej i została zestandaryzowana do stosowania w złożonych środowiskach biologicznych, co zapewnia solidną podstawę wiedzy oraz zoptymalizowane protokoły. Jej szybka kinetyka zapewnia wysoką wydajność i specyficzność reakcji; wykorzystuje ona grupy azydowe i alkinowe, które są łatwe w syntezie, stabilne, nie występują w układach żywych i są obojętne wobec rodzimych biomolekuł, co czyni ją idealną do zastosowań w utrwalonych komórkach, gdzie toksyczność miedzi nie stanowi problemu. Cykloaddycja alkinowo-azydkowa sterowana naprężeniem pierścienia (SPAAC)20,21, choć pozwala uniknąć toksyczności miedzi, charakteryzuje się wolniejszą kinetyką i bardziej rozbudowanymi sondami, co w zastosowaniach wewnątrzkomórkowych ma tendencję do prowadzenia do wyższego sygnału tła i zmniejszonego stosunku sygnału do szumu z powodu pułapkowania hydrofobowego. Z kolei reakcja Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronowym (IEDDA)22,23, mimo że jest szybka i nie wymaga miedzi, wiąże się z bardziej złożoną syntezą sond i wymaga większych grup raportujących, które nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane w zastosowaniach MOE. Ponieważ ExM wymaga wyłącznie utrwalonych komórek, CuAAC oferuje niezawodne i wydajne rozwiązanie do znakowania bioortogonalnego.
Niniejsza praca przedstawia protokół wizualizacji wewnątrzkomórkowych glikoprotein sialilowanych w komórkach, łączący znakowanie metaboliczne, bioortogonalną chemię klik oraz mikroskopię ekspansyjną. W opisanych w pracy procedurach eksperymentalnych wykorzystano N-azyd acetylmannozaminę (ManNAz) jako reporter chemiczny, a ligację małych organicznych fluoroforów metodą CuAAC przeprowadzono przed procedurą ekspansji. Glikoproteiny są kotwiczone do hydrożelu za pomocą NAS przed żelacją, trawieniem i ekspansją. Znakowanie kwasów sialowych metodą MOE może być powiązane z podejściem immunofluorescencyjnym w celu oceny kolokalizacji, co zilustrowano tutaj za pomocą mysiego przeciwciała pierwszorzędowego anty-GM130 zlokalizowanego w aparacie Golgiego w części cis. Protokół ten można stosować do komórek w stanie fizjologicznym lub do komórek poddanych działaniu czynników chemicznych. W tym celu wykorzystano chlorochinę do zahamowania funkcji lizosomalnych, co wpływa na procesy przetwarzania i transportu glikoprotein wewnątrz komórek. Barwienie jąder komórkowych służy jako punkt odniesienia, nie tylko do lokalizacji komórek, ale także jako wskaźnik jakości procesu ExM. Współczynnik ekspansji można w rzeczywistości zmierzyć, porównując wielkość jądra przed ekspansją (preExM) i po ekspansji (postExM).

<table><tbody><tr><td>(+) L-askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Ester N-hydroksysukcynimidu kwasu akrylowego&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 alkin&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 kozi anty-mysi IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 2 ml</td><td>EPPENDORF</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Sól difosforanu chlorochiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 12 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00120RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 32 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00320RA140MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokim poziomie glukozy średni&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (PBS)&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast 533T</td> <td>-</td><td></td> <td>Pobrane od zdrowej osoby</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Żelatyna</td><td>Bio-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>Guanidyna HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td>Bezwodna</td></tr><tr><td>mikroskopia konfokalna LSM 780&nbsp;</td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylmannosamine (ManNAc)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td></td></tr><tr><td>N-azydoacetylomannosamina (ManNAz)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>z&nbsp; Tritirachium album</td></tr><tr><td>oczyszczone mysie przeciwciało GM130</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 & mikro; g</td></tr><tr><td>Akrylan sodu&nbsp;</td><td>Kolba Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>tris Octan EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Trypsina-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Techniki znakowania metabolicznego pozwalają na włączenie bioortogonalnych reporterów do glikanów, umożliwiając ukierunkowaną biokoniugację barwników molekularnych w komórkach poprzez kliknięcie i chemię bioortogonalną. Metaboliczna inżynieria oligosacharydowa (MOE) cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na istotną rolę glikozylacji w wielu procesach biologicznych, które obejmują rozpoznawanie molekularne, oraz jej wpływ na patologie, od raka, przez zaburzenia genetyczne, po infekcje wirusowe i bakteryjne.
Chociaż MOE jest bardziej znany z wykrywania glikokoniugatów na powierzchni komórek, jest również bardzo ważną metodologią do badania wewnątrzkomórkowych glikanów w kontekstach fizjologicznych i patologicznych. Takie badania bardzo korzystnie korzystają z wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Jednak mikroskopia superrozdzielcza nie jest łatwo dostępna w większości laboratoriów i stanowi wyzwanie dla codziennego wdrażania. Mikroskopia ekspansywacyjna jest najnowszą alternatywą, która zwiększa rozdzielczość mikroskopii poprzez fizyczne powiększanie próbek biologicznych znakowanych markerami fluorescencyjnymi. Poprzez zatopienie próbki w pęczniejącym żelu i spowodowanie jej izotropowej ekspansji poprzez obróbkę chemiczną, struktury subkomórkowe mogą być wizualizowane ze zwiększoną precyzją i rozdzielczością bez potrzeby stosowania technik superrozdzielczości.
W tej pracy ilustrujemy zdolność mikroskopii ekspansywnej do wizualizacji wewnątrzkomórkowych glikanów sjalowanych poprzez połączone użycie MOE i chemii kliknięć. W szczególności proponujemy procedurę bioortogonalnego znakowania i mikroskopii ekspansyjnej, która wykorzystuje reporter ukierunkowany na sialilację, co może być związane z immunofluorescencją w badaniach kolokalizacyjnych. Protokół ten umożliwia badania lokalizacyjne biosyntezy koniugatu sjalokonatycznego, transportu wewnątrzkomórkowego i recyklingu.

Poniżej przedstawiono zastosowanie protokołu do wizualizacji glikoprotein sjalilowanych w komórkach HeLa (Rysunek 3A) oraz komórkach MCF7 (Rysunek 3B), z pominięciem traktowania CQ (sekcja 2 protokołu) oraz barwienia współlokalizacji immunofluorescencyjnej (krok 5.3 protokołu).
<img alt="Eksperyment mikroskopowy przedstawiający komórki HeLa i MCF7 przed i po ExM; znakowanie DNA i kontrola." c...

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji wewnątrzkomórkowych sjalowanych glikokoniugatów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, eliminujący konieczność stosowania specjalistycznego sprzętu. Metoda ta ułatwia badanie biosyntezy, transportu i recyklingu w różnych kontekstach patologicznych. Aby to osiągnąć, łączymy znakowanie metaboliczne, chemię kliknięć i mikroskopię ekspandacyjną.Techniki mikroskopii superrozdzielczej, takie jak STED i STORM, pozwalają naukowcom przekroczyć barierę dyfrakcyjną, ale wymagają drogiego sprzętu. Ostatnio mikroskop ekspansywny stał się bardziej dostępną alternatywą, która poprawia rozdzielczość poprzez fizyczne powiększenie próbki. Metoda ta może być stosowana z dowolnymi rutynowymi mikroskopami o pełnych zasobach.Nie wymaga mikroskopów super rozdzielczych, które są kosztowne, czasochłonne, trudno dostępne i wymagają rozległej optymalizacji. Dlatego tę metodę można łatwo przenieść do większości laboratoriów. Na początek dodaj jeden mililitr pożywki uzupełnionej 500 mikromolową N-azydoacetylomannozaminą do przygotowanych komórek i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla.Następnie umyj próbki jednym mililitrem PBS. Używając 500 mikrolitrów 5% paraformaldehydu, utrwal komórki na każdym szkiełku nakrywkowym i pozwól im odpocząć przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj niestandardową wilgotną komorę za pomocą nieprzezroczystego pudełka z pokrywką.Umieść mokry kawałek bibuły na dole, a następnie połóż warstwę parafilmu na wierzchu. Umieść szkiełka nakrywkowe na parafilmie komórkami skierowanymi do góry. W celu przepuszczalności komórek dodaj 200 mikrolitrów 0,5% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS. Przygotować bufor reakcyjny CuAAC do oznaczania zmodyfikowanych azydem glikanów sjalowanych zaprojektowanych przy użyciu podanych składników. Aby zainicjować reakcję, dodać 200 mikrolitrów buforu CuAAC do każdego szkiełka nakrywkowego i dokładnie przykryć próbkę.Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS, aby zatrzymać reakcję i usunąć nadmiar sondy i odczynników. Inkubować próbki przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 200 mikrolitrach buforu blokującego BSA. Dodać 70 mikrolitrów roztworu zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.Następnie dodać 100 mikrolitrów fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Po trzykrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych PBS, przenieść szkiełka nakrywkowe na płytkę sześciodołkową i przechowywać próbki w dwóch mililitrach PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni, chroniąc je przed światłem. Na początek inkubuj komórki immunostainowe z n-akryloilsukcynimidem w stężeniu 3,2 miligrama na mililitr w PBS na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie umyj próbki trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Teraz umieść kroplę roztworu monomeru o pojemności 70 mikrolitrów na kawałku parafilmu. Dodaj 1,4 mikrolitra 10% N, N, N'N'Tetrametyloetylenodiaminy i 10% nadsiarczanu amonu, a następnie wymieszaj je z kroplą.Szybko umieść szkiełko nakrywkowe na roztworze komórkami skierowanymi w dół. Pozostawić roztwór do polimeryzacji przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Następnie dodaj jeden mililitr buforu wytrawiającego do hydrożelu i pozwól trawieniu postępować przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce mechanicznej.Po usunięciu buforu wytrawiającego należy przemyć żel trzykrotnie dwoma mililitrami wody dejonizowanej. Teraz pozostaw hydrożel do rozprężenia się w trzech mililitrach wody dejonizowanej na dwie godziny, zmieniając wodę co 30 minut. Aby rozpocząć, włącz mikroskop i upewnij się, że źródła światła są rozgrzane.Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji bioobrazowania. Aby utworzyć kanały, wybierz długości fal wzbudzenia lasera odpowiadające fluoroforom i odpowiednio aktywuj lasery. Wybierz odpowiednią soczewkę obiektywową, taką jak obiektyw immersyjny z olejkiem 63x z aperturą numeryczną 1,4 lub jej odpowiednikiem.Teraz umieść i zabezpiecz szkiełko nakrywkowe o średnicy 32 milimetrów w uchwycie dostosowanym do mikroskopu. Umieść próbkę komórek barwnika immunologicznego komórkami skierowanymi w dół na 32-milimetrowym szkiełku nakrywkowym i dodaj kroplę wody dejonizowanej, aby zapobiec wysychaniu próbki. Następnie umieść uchwyt z szkiełkiem nakrywkowym na stoliku mikroskopu nad obiektywem.W przypadku obrazowania po rozprężaniu umieść hydrożel na szkiełku nakrywkowym i wykonaj skanowanie płytki. Użyj trybu jasnego pola lub fluorescencji o niskiej intensywności lasera, aby zlokalizować obszar zainteresowania i ustawić na nim ostrość. Następnie ustaw parametry akwizycji obrazu, takie jak prędkość skanowania, liczba uśredniania, kierunek, tryb skanowania, metoda i rozmiar otworka, aby uzyskać żądaną obserwację.Teraz wizualizuj komórki w oprogramowaniu w trybie fluorescencji na żywo. Stopniowo zwiększaj moc lasera i dostosuj wzmocnienie i przesunięcie detektora, aby wzmocnić sygnał bez wprowadzania nadmiernego szumu, zapewniając wyraźną wizualizację fluorescencji bez nadmiernej ekspozycji. Na koniec wykonaj akwizycję obrazu i zapisz dane w żądanym formacie, upewniając się, że zawierają odpowiednie metadane do wykorzystania w przyszłości.Po zakończeniu akwizycji dodaj niewielką ilość wody dejonizowanej, aby ułatwić transfer za pomocą pęsety i przenieś próbkę z powrotem do płytki sześciodołkowej. Średnia średnica jądra Feret wzrosła z 17,7 mikrometra przed ekspansją do 70,3 mikrometra po ekspansji, co wskazuje na współczynnik rozszerzalności wynoszący cztery. Wzór znakowania fibroblastów przed mikroskopią ekspandacyjną wykazał wyraźną czerwoną i zieloną fluorescencję wskazującą na subkomórkowe szczegóły w aparacie Golgiego, ale z ograniczoną rozdzielczością, co uniemożliwiało analizę w trakcie śmierci.Po mikroskopii ekspansywnej zaobserwowano znacznie zwiększoną rozdzielczość przestrzenną struktur subkomórkowych z bardziej skomplikowanymi zielonymi i czerwonymi pęcherzykami widocznymi w komórkach fibroblastów.

visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

W tym filmie demonstrujemy wykrywanie kwasów sjalowych, kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolylneuraminowego, za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, HPLC, po derywatyzacji odpowiednim odczynnikiem do znakowania fluorescencyjnego, aby pomóc w wykrywaniu fluorescencji.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami: solidna metoda oznaczania ilościowego znakowanych fluorescencyjnie i derywatyzowanych kwasów sjalowych wyizolowanych z wątroby myszy

Ten film demonstruje biotynylację i fluorescencyjne znakowanie zmodyfikowanych sialoglykoprotein w pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych i progenitorowych, a także neuronach, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie immunofluorescencyjne sialoglykoprotein w neuronalnych komórkach progenitorowych i neuronach

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Poznaj metodę wizualizacji sialilowanych glikokoniugatów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej. Technika ta zwiększa rozdzielczość przestrzenną bez konieczności stosowania drogiego sprzętu do mikroskopii superrozdzielczej.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Przeglądaj więcej filmów